JPH11335296A - 組換えミコバクテリアのワクチン - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 汎用性ある組換えミコバクテリアのワクチン
に関する。 【解決手段】 少なくとも1つの蛋白質抗原をコードす
る外来DNAを発現する培養しうる組換えミコバクテリ
アを含んでなるワクチン。
に関する。 【解決手段】 少なくとも1つの蛋白質抗原をコードす
る外来DNAを発現する培養しうる組換えミコバクテリ
アを含んでなるワクチン。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は導入された外来のD
NAを発現しうる組換えミコバクテリアのワクチンに関
する。
NAを発現しうる組換えミコバクテリアのワクチンに関
する。
【0002】
【背景の技術】免疫感作 外来抗原(例えば病原菌又は毒素)に対する免疫は受動ト
ランスフア(transfer)又は能動誘導によつて付
与することができる。前者の場合には、外来の蛋白質病
原体に対する抗体を個体に注射し、結果として短期間の
保護が付与される。後者の場合には、病原体の無害な
(無毒の)形態、病原体の一成分、又は毒素の改変形態
(変性毒素)の注射が個体の免疫系を刺激し、長期の保護
を付与する。
ランスフア(transfer)又は能動誘導によつて付
与することができる。前者の場合には、外来の蛋白質病
原体に対する抗体を個体に注射し、結果として短期間の
保護が付与される。後者の場合には、病原体の無害な
(無毒の)形態、病原体の一成分、又は毒素の改変形態
(変性毒素)の注射が個体の免疫系を刺激し、長期の保護
を付与する。
【0003】能動免疫は、個体の免疫系が十分であるな
らば適当な抗原を用いて免疫系を刺激することによつて
誘導することができる。例えばこの方法で病原体の無毒
の又は弱毒化した形態を用いて免疫感作(予防免疫接種)
することにより、直接的な免疫応答並びに免疫学的「記
憶」がもたらされ、斯くして長期の保護も付与される。
一般にワクチンは、病原体の抗原決定基を含み且つ斯く
して免疫応答を引き出す病原体又は感染因子の不活性化
された、非病原性の又は弱体化された形態を含む。同様
に微生物、植物及び動物によつて産生される抗原物質で
ある毒素は変性毒素に転化することができる。即ちそれ
らはその毒性を破壊するがその抗原性を保持するように
改変することができ、結果として抗毒素抗体の産生を刺
激し、能動免疫を作り出す。そのような変性毒素は毒素
に対するワクチンとして使用することができる。
らば適当な抗原を用いて免疫系を刺激することによつて
誘導することができる。例えばこの方法で病原体の無毒
の又は弱毒化した形態を用いて免疫感作(予防免疫接種)
することにより、直接的な免疫応答並びに免疫学的「記
憶」がもたらされ、斯くして長期の保護も付与される。
一般にワクチンは、病原体の抗原決定基を含み且つ斯く
して免疫応答を引き出す病原体又は感染因子の不活性化
された、非病原性の又は弱体化された形態を含む。同様
に微生物、植物及び動物によつて産生される抗原物質で
ある毒素は変性毒素に転化することができる。即ちそれ
らはその毒性を破壊するがその抗原性を保持するように
改変することができ、結果として抗毒素抗体の産生を刺
激し、能動免疫を作り出す。そのような変性毒素は毒素
に対するワクチンとして使用することができる。
【0004】感染性病原体の変形された形態の投与によ
る免疫応答の刺激を含む場合及び変性毒素の投与を含む
場合の双方において、現存する方法は一般に効果的であ
るが、ワクチンによる副作用及び死の起こることが知ら
れている。
る免疫応答の刺激を含む場合及び変性毒素の投与を含む
場合の双方において、現存する方法は一般に効果的であ
るが、ワクチンによる副作用及び死の起こることが知ら
れている。
【0005】今や病原体の抗原決定基のより良い知識と
遺伝子工学/組換えDNA技術の適用によつて、より安
全なワクチンが開発されつつある。例えば免疫応答を引
き出すことが知られている蛋白質抗原の一成分(例えば
抗原決定基)であるポリペプチドを(例えば問題のポリペ
プチドをコードするDNAの化学合成又は発現により)
作ることが可能である。ポリペプチドの宿主への投与に
続いて、宿主は抗原決定基に免疫応答する。そのような
ポリペプチドの使用は生の又は弱体化したワクチンの使
用に付随する感染の危険が伴なわない。
遺伝子工学/組換えDNA技術の適用によつて、より安
全なワクチンが開発されつつある。例えば免疫応答を引
き出すことが知られている蛋白質抗原の一成分(例えば
抗原決定基)であるポリペプチドを(例えば問題のポリペ
プチドをコードするDNAの化学合成又は発現により)
作ることが可能である。ポリペプチドの宿主への投与に
続いて、宿主は抗原決定基に免疫応答する。そのような
ポリペプチドの使用は生の又は弱体化したワクチンの使
用に付随する感染の危険が伴なわない。
【0006】免疫感作(ワクチンの投与)は通常の及び広
く行なわれている方法であり、用いるワクチンはウイル
ス種の死んだ微生物、弱体化した種の生きた微生物、及
び微生物、菌、植物、原生動物或いは後生動物の誘導体
又は産生物の調製物を含めて、本質的に「活性な免疫学
的予防に対して意図されたいずれかの調製物」であつて
よい。ステツドマンの図解医学辞典(Stedman's
Illustrated Medical Dict
ionary)(第24版)、ウイリアムズ・アンド・ウ
イルキンス(Williams & Wilkins,
Baltimore)、1526頁(1982)。多くの
場合、ワクチンは効果的な保護を誘導するために1個よ
りも多く投与しなければならない。例えば公知の抗毒素
ワクチンは多数回の投薬量で与えなければならない。
く行なわれている方法であり、用いるワクチンはウイル
ス種の死んだ微生物、弱体化した種の生きた微生物、及
び微生物、菌、植物、原生動物或いは後生動物の誘導体
又は産生物の調製物を含めて、本質的に「活性な免疫学
的予防に対して意図されたいずれかの調製物」であつて
よい。ステツドマンの図解医学辞典(Stedman's
Illustrated Medical Dict
ionary)(第24版)、ウイリアムズ・アンド・ウ
イルキンス(Williams & Wilkins,
Baltimore)、1526頁(1982)。多くの
場合、ワクチンは効果的な保護を誘導するために1個よ
りも多く投与しなければならない。例えば公知の抗毒素
ワクチンは多数回の投薬量で与えなければならない。
【0007】子供の時代の予防接種は普通のことであ
り、一般に健康のサービスが容易に受けられる且つ多数
回の予防接種(例えば多数の病原体に対する免疫感作及
び単一の病原菌に対する連続的な又は多数の免疫感作)
が可能である発達した国々において成功している。発展
途上の世界では、予防接種はかなり一般的なものでな
く、またかなり問題を含んでいる。例えば発展途上の世
界で毎年生れる100万人の子供の約20%だけがジフ
テリヤ、百日咳、破傷風、風疹、小児マヒ、及び結核に
対して予防接種されているにすぎない。毎年発展途上国
では5百万人の子供が死に且つ他の5百万人の子供は適
当な免疫感作が可能であるならば防げたこれらの病気に
よつて肉体的に又は精神的にかたわになつている。1回
の投与で長期間の免疫を付与することのできる効果的な
ワクチンが存在すれば、勿論発達した及び発展途上の双
方の国々において有用であろう。
り、一般に健康のサービスが容易に受けられる且つ多数
回の予防接種(例えば多数の病原体に対する免疫感作及
び単一の病原菌に対する連続的な又は多数の免疫感作)
が可能である発達した国々において成功している。発展
途上の世界では、予防接種はかなり一般的なものでな
く、またかなり問題を含んでいる。例えば発展途上の世
界で毎年生れる100万人の子供の約20%だけがジフ
テリヤ、百日咳、破傷風、風疹、小児マヒ、及び結核に
対して予防接種されているにすぎない。毎年発展途上国
では5百万人の子供が死に且つ他の5百万人の子供は適
当な免疫感作が可能であるならば防げたこれらの病気に
よつて肉体的に又は精神的にかたわになつている。1回
の投与で長期間の免疫を付与することのできる効果的な
ワクチンが存在すれば、勿論発達した及び発展途上の双
方の国々において有用であろう。
【0008】成人の予防接種も成人の多くの病気を防ぐ
ために役立つが、子供の場合と同様に、発展途上国では
特に多数回の免疫感作が必要であるが、それを行なうの
が困難である。中でもハンセン病、マラリヤ、結核、及
び小児マヒのような病気は、アフリカ、アジア、及びラ
テンアメリカにおいて成人の間で高い発病率を示し、年
々数千の死者を出している。
ために役立つが、子供の場合と同様に、発展途上国では
特に多数回の免疫感作が必要であるが、それを行なうの
が困難である。中でもハンセン病、マラリヤ、結核、及
び小児マヒのような病気は、アフリカ、アジア、及びラ
テンアメリカにおいて成人の間で高い発病率を示し、年
々数千の死者を出している。
【0009】主な病気に対するワクチンを開発するのに
多くの努力が費やされ、最近外来の遺伝子を発現する組
換えワクチン・ビヒクル(vehicles)(例えば遺
伝子工学で処理されたウイルス)が考慮されている。例
えばウイルス抗原がワクシニア・ウイルス中に挿入され
た組換えワクシニア・ウイルスが開発された。例えばB
型肝炎遺伝子、インフルエンザ・ウイルス遺伝子又は狂
犬病ウイルス抗原をコードするDNAはワクチンを製造
するための努力においてワクシニア・ウイルスDNAに
スプライシング(splice)された。パニカリ(Pa
nicali)、D.ら、国立科学アカデミー紀要(Pr
oceedings of the National
Academy of Science)、USA、
80、5364〜5368(1983);オーア(Or
r)、T.、遺伝子工学ニユース(Genetic En
gineering News)、17頁(1985年3
月);パオレツチ(Paoletti)、E.及びD.パ
ニカリ、米国特許第4,603,112号。
多くの努力が費やされ、最近外来の遺伝子を発現する組
換えワクチン・ビヒクル(vehicles)(例えば遺
伝子工学で処理されたウイルス)が考慮されている。例
えばウイルス抗原がワクシニア・ウイルス中に挿入され
た組換えワクシニア・ウイルスが開発された。例えばB
型肝炎遺伝子、インフルエンザ・ウイルス遺伝子又は狂
犬病ウイルス抗原をコードするDNAはワクチンを製造
するための努力においてワクシニア・ウイルスDNAに
スプライシング(splice)された。パニカリ(Pa
nicali)、D.ら、国立科学アカデミー紀要(Pr
oceedings of the National
Academy of Science)、USA、
80、5364〜5368(1983);オーア(Or
r)、T.、遺伝子工学ニユース(Genetic En
gineering News)、17頁(1985年3
月);パオレツチ(Paoletti)、E.及びD.パ
ニカリ、米国特許第4,603,112号。
【0010】しかしながら、そのような組換えワクシニ
ア・ウイルスがワクチンとして少くとも2つの重要な欠
点をもつているということは広く同意されている。第1
に、処置できないワクシニア・ウイルスと関連した重大
な死亡及び死亡率(1:100,000)が見られる。第
2に、ワクシニア・ウイルスに予じめ露呈された個体の
組換えワクシニアの予防接種は満足しうる免疫感作値を
与えるのにしばしば失敗した。フエンナー(Fenne
r)、F.、ワクチン開発への新手法(NewAppro
aches to Vaccine Developm
ent)、R.ベル(Bell)及びG.トリギアニ(To
rrigiani)編、シユワベ社(Schwabe &
Co.)、187頁(1984)。
ア・ウイルスがワクチンとして少くとも2つの重要な欠
点をもつているということは広く同意されている。第1
に、処置できないワクシニア・ウイルスと関連した重大
な死亡及び死亡率(1:100,000)が見られる。第
2に、ワクシニア・ウイルスに予じめ露呈された個体の
組換えワクシニアの予防接種は満足しうる免疫感作値を
与えるのにしばしば失敗した。フエンナー(Fenne
r)、F.、ワクチン開発への新手法(NewAppro
aches to Vaccine Developm
ent)、R.ベル(Bell)及びG.トリギアニ(To
rrigiani)編、シユワベ社(Schwabe &
Co.)、187頁(1984)。
【0011】今日まで、与えられた病原体に対する免疫
を誘導する多くの場合に有効であるけれども、1回以上
投与しなければならない、また長期間の基準において病
原体から保護することができないワクチンが開発されて
きた。更に多くの場合(例えばハンセン病、マラリヤな
ど)、効果的なワクチンが依然として開発されなければ
ならない。
を誘導する多くの場合に有効であるけれども、1回以上
投与しなければならない、また長期間の基準において病
原体から保護することができないワクチンが開発されて
きた。更に多くの場合(例えばハンセン病、マラリヤな
ど)、効果的なワクチンが依然として開発されなければ
ならない。
【0012】ミコバクテリア ミコバクテリア(Mycobacteria)は人間及び
動物の主たる病原体である。例えば結核は一般に人間の
場合にミコバクテリウム・ツバーキユロシス(Myco
bacterium(M.)tuberculosis)に
より、また家畜の場合に(これは人間及び他の動物に伝
染しえて、その結核を誘発する)ミコバクテリウム・ボ
ビス(bovis)により引き起こされる。結核は広く存
在しており、特に発展途上国の場合重要な公衆の健康問
題である。世界では約千万の結核例があり、年々3百万
人が死亡する。結核に対する国際連合及び世界健康機構
の合同研究グループ、ツバークル(Tubercle)、
63、157〜169(1982)。
動物の主たる病原体である。例えば結核は一般に人間の
場合にミコバクテリウム・ツバーキユロシス(Myco
bacterium(M.)tuberculosis)に
より、また家畜の場合に(これは人間及び他の動物に伝
染しえて、その結核を誘発する)ミコバクテリウム・ボ
ビス(bovis)により引き起こされる。結核は広く存
在しており、特に発展途上国の場合重要な公衆の健康問
題である。世界では約千万の結核例があり、年々3百万
人が死亡する。結核に対する国際連合及び世界健康機構
の合同研究グループ、ツバークル(Tubercle)、
63、157〜169(1982)。
【0013】M.レプラエ(leprae)により引き起
こされるハンセン病は主に発展途上国において千万人の
人間を苦しませている。ブルーム(Bloom)、B.
P.及びT.ゴーダル(Godal)、感染病総覧(Re
view of Infections Diseas
es)、5、657〜679(1984)。アビウム(av
ium)-インターセルラレ(intercellula
re)-スクロフラセウム(scrofulaceum)
(MAIS)群の結核及びミコバクテリアは免疫不全症
(エイズ)をもつ患者の主にかかりやすい病原体である。
病気駆除センター(Centers for Dise
ase Control)、死亡率及び死亡週報(Mor
bility and Mortality Week
ly Report)、34、774(1986)。M.
プシユードツバーキユロシス(pseudotuber
culosis)は家畜の主な病原体である。
こされるハンセン病は主に発展途上国において千万人の
人間を苦しませている。ブルーム(Bloom)、B.
P.及びT.ゴーダル(Godal)、感染病総覧(Re
view of Infections Diseas
es)、5、657〜679(1984)。アビウム(av
ium)-インターセルラレ(intercellula
re)-スクロフラセウム(scrofulaceum)
(MAIS)群の結核及びミコバクテリアは免疫不全症
(エイズ)をもつ患者の主にかかりやすい病原体である。
病気駆除センター(Centers for Dise
ase Control)、死亡率及び死亡週報(Mor
bility and Mortality Week
ly Report)、34、774(1986)。M.
プシユードツバーキユロシス(pseudotuber
culosis)は家畜の主な病原体である。
【0014】一方M.ボビスの無毒性種であるバシル・
カルメツト-グエリン(Bacille Calmett
e-Guerin、BCG)は世界中で最も広く使用され
ている人間のワクチンであり、50年以上にわたつて生
ワクチンとして使用されてきた。過去35年において、
それは5億人以上の人間に投与されたが、副作用は稀で
あつた(例えば推定死亡60人/億人)。BCGは多くの
研究において結核に対して保護効果を有することが発見
されている。しかしながら最近、それが南インドにおい
て結核を防止するのに有効でないことが発見された。結
核防止の試み、マドラス、インデイアン・ジヤーナル・
オブ・メデイカル・リサーチ(Indian Jour
nal of Medical Research)、
72、1〜74(1980)。
カルメツト-グエリン(Bacille Calmett
e-Guerin、BCG)は世界中で最も広く使用され
ている人間のワクチンであり、50年以上にわたつて生
ワクチンとして使用されてきた。過去35年において、
それは5億人以上の人間に投与されたが、副作用は稀で
あつた(例えば推定死亡60人/億人)。BCGは多くの
研究において結核に対して保護効果を有することが発見
されている。しかしながら最近、それが南インドにおい
て結核を防止するのに有効でないことが発見された。結
核防止の試み、マドラス、インデイアン・ジヤーナル・
オブ・メデイカル・リサーチ(Indian Jour
nal of Medical Research)、
72、1〜74(1980)。
【0015】
【発明が解決しようとする課題】即ちBCGを含めて多
くのワクチンは存在するけれど、それらは限られた免疫
応答を誘導し、多数回投薬しなければならず、及び/又
は副作用があるから価値が限定される。他の事例(例え
ばハンセン病、マラリア)において、ワクチンは単純に
は入手することができない。関連する病原体に対するワ
クチン、即ち副作用なしに病原体から保護するのに十分
な免疫を長期間刺激するワクチンが入手できるならば、
それは非常に有用である。
くのワクチンは存在するけれど、それらは限られた免疫
応答を誘導し、多数回投薬しなければならず、及び/又
は副作用があるから価値が限定される。他の事例(例え
ばハンセン病、マラリア)において、ワクチンは単純に
は入手することができない。関連する病原体に対するワ
クチン、即ち副作用なしに病原体から保護するのに十分
な免疫を長期間刺激するワクチンが入手できるならば、
それは非常に有用である。
【0016】
【課題を解決するための手段】本発明は遺伝子工学の技
術を用いて導入された興味あるDNAを発現する遺伝子
組換えの(遺伝子工学的に処理した)培養しうるミコバク
テリアに関し、そしてDNAをミコバクテリアに導入し
て遺伝子組換えミコバクテリアを生産する方法に関す
る。得られる遺伝子組換えミコバクテリアは、問題のD
NAを発現しうるビヒクルとして、例えば保護抗原(即
ち宿主の免疫応答を引き出しうる抗原)を発現するワク
チン・ビヒクル、例えば問題の病原体の1種又はそれ以
上に対するもの或いは抗繁殖性ワクチン・ビヒクルを生
産するのに有用なものとして特に有用である。興味ある
病原体はウイルス、微生物、或いは病気を引き起こす他
の有機体又は物質(例えば毒素又は変性毒素)を含む。
術を用いて導入された興味あるDNAを発現する遺伝子
組換えの(遺伝子工学的に処理した)培養しうるミコバク
テリアに関し、そしてDNAをミコバクテリアに導入し
て遺伝子組換えミコバクテリアを生産する方法に関す
る。得られる遺伝子組換えミコバクテリアは、問題のD
NAを発現しうるビヒクルとして、例えば保護抗原(即
ち宿主の免疫応答を引き出しうる抗原)を発現するワク
チン・ビヒクル、例えば問題の病原体の1種又はそれ以
上に対するもの或いは抗繁殖性ワクチン・ビヒクルを生
産するのに有用なものとして特に有用である。興味ある
病原体はウイルス、微生物、或いは病気を引き起こす他
の有機体又は物質(例えば毒素又は変性毒素)を含む。
【0017】更に本発明は、宿主の保護免疫を引き出す
ために宿主に組換えミコバクテリウムを予防接種する方
法に関する。更に本発明は異なる微生物属間で遺伝物質
を伝達する方法に関し、そして異なる微生物属間での遺
伝物質の伝達に有用なシヤトル・ファスミド(phas
mid)として言及される遺伝子工学によるベクターに
関する。シヤトル・ファスミドはバクテリア(例えば大
腸菌)においてプラスミドとして、またミコバクテリア
においてフアージとして複製する。これはミコバクテリ
ア例えばミコバクテリウム・スメグマチス(M.sme
gmatis)、及びミコバクテリウム・ボビス-BCG
(BCG)中に、他の起源(例えばM.スメグマチス又は
BCG以外の起源)からのDNAを導入することを可能
にした。更に、本発明は組換えの培養しうるミコバクテ
リウムによつて発現される抗原の、ワクチンとしての或
いは診断試剤に対する使用法に関する。
ために宿主に組換えミコバクテリウムを予防接種する方
法に関する。更に本発明は異なる微生物属間で遺伝物質
を伝達する方法に関し、そして異なる微生物属間での遺
伝物質の伝達に有用なシヤトル・ファスミド(phas
mid)として言及される遺伝子工学によるベクターに
関する。シヤトル・ファスミドはバクテリア(例えば大
腸菌)においてプラスミドとして、またミコバクテリア
においてフアージとして複製する。これはミコバクテリ
ア例えばミコバクテリウム・スメグマチス(M.sme
gmatis)、及びミコバクテリウム・ボビス-BCG
(BCG)中に、他の起源(例えばM.スメグマチス又は
BCG以外の起源)からのDNAを導入することを可能
にした。更に、本発明は組換えの培養しうるミコバクテ
リウムによつて発現される抗原の、ワクチンとしての或
いは診断試剤に対する使用法に関する。
【0018】特に本発明は、問題の病原体(ウイルス、
微生物或いは病気を誘導する他の有機体又は物質のいず
れか)1種又はそれ以上をコードしたワクチン・ビヒク
ル以外の起源からのDNA(外来DNAと言及)を発現す
る遺伝子組換えBCG又は遺伝子組換えM.スメグマチ
スであるワクチン・ビヒクルに関する。本発明のワクチ
ン・ビヒクルは受精を妨害する(例えば受胎調節剤とし
て有用なワクチン)のに有用な抗原をコードするDNA
も発現する。
微生物或いは病気を誘導する他の有機体又は物質のいず
れか)1種又はそれ以上をコードしたワクチン・ビヒク
ル以外の起源からのDNA(外来DNAと言及)を発現す
る遺伝子組換えBCG又は遺伝子組換えM.スメグマチ
スであるワクチン・ビヒクルに関する。本発明のワクチ
ン・ビヒクルは受精を妨害する(例えば受胎調節剤とし
て有用なワクチン)のに有用な抗原をコードするDNA
も発現する。
【0019】保護抗原が組換えワクチンによつて発現し
うる病原体は、ミコバクテリウム・レプラエ(Myco
bacterium leprae)、ミコバクテリウ
ム・ツバーキユロシス(Mycobacterium
tuberculosis)、ミコバクテリウム・イン
トラセルラレ(Mycobacterium intr
acellulare)、ミコバクテリウム・アフリカ
ナム(Mycobacterium africanu
m)、ミコバクテリウム・アビウム(Mycobacte
rium avium)、マラリア・スポロゾイテス(m
alaria sporozoites)及びメロゾイ
テス(merozoites)、ジフテリア変性毒素、破
傷風変性毒素、リーシユマニア(Leishmani
a)、サルモネラ、いくつかのトレポネマ(Trepon
ema)属、百日咳変性毒素及び他の抗原決定基、ウイ
ルス[風疹、耳下腺炎、インフルエンザ、住血吸虫性皮
膚炎(Schistosoma)、赤痢、ナイセリア(N
eisseria)、ボレリア(Borrelia)、狂
犬病、小児マヒウイルス、人間の免疫不全ウイルス(H
IV)、HILV−I、HILV−II、並びに蛇及び
昆虫の毒液を含むが、これに限定されるものでない。
うる病原体は、ミコバクテリウム・レプラエ(Myco
bacterium leprae)、ミコバクテリウ
ム・ツバーキユロシス(Mycobacterium
tuberculosis)、ミコバクテリウム・イン
トラセルラレ(Mycobacterium intr
acellulare)、ミコバクテリウム・アフリカ
ナム(Mycobacterium africanu
m)、ミコバクテリウム・アビウム(Mycobacte
rium avium)、マラリア・スポロゾイテス(m
alaria sporozoites)及びメロゾイ
テス(merozoites)、ジフテリア変性毒素、破
傷風変性毒素、リーシユマニア(Leishmani
a)、サルモネラ、いくつかのトレポネマ(Trepon
ema)属、百日咳変性毒素及び他の抗原決定基、ウイ
ルス[風疹、耳下腺炎、インフルエンザ、住血吸虫性皮
膚炎(Schistosoma)、赤痢、ナイセリア(N
eisseria)、ボレリア(Borrelia)、狂
犬病、小児マヒウイルス、人間の免疫不全ウイルス(H
IV)、HILV−I、HILV−II、並びに蛇及び
昆虫の毒液を含むが、これに限定されるものでない。
【0020】本発明の1つの具体例において、そのよう
な保護抗原をコードする外来のDNAを発現しうる組換
えミコバクテリアは、問題の保護抗原をコードする遺伝
子(単数又は複数)をミコバクテリアのゲノム中に組込む
ことによつて生産される。単一の抗原をコードする遺伝
子或いはそれぞれ抗原をコードする2つ又はそれ以上の
遺伝子を、ミコバクテリウムの複製に必須でないミコバ
クテリアのゲノム領域に挿入する。それぞれ問題の抗原
をコードする1つ又はそれ以上の遺伝子を、ミコバクテ
リアへの導入後にミコバクテリアの染色体中に組込み、
続いて染色体DNAで発現することのできる溶原性のバ
クテリオフアージ中に挿入することも可能である。他に
問題の抗原をコードする遺伝子を、遺伝子の発現が染色
体外的に(例えばエピソーム的に)起こるようにミコバク
テリア中に挿入することができる。例えば問題の遺伝子
をミコバクテリアのプラスミド中へクローン化し、そし
て培養しうるミコバクテリア中に導入する。この結果そ
れはエピソーム的複写(染色体外的複写)を受ける。
な保護抗原をコードする外来のDNAを発現しうる組換
えミコバクテリアは、問題の保護抗原をコードする遺伝
子(単数又は複数)をミコバクテリアのゲノム中に組込む
ことによつて生産される。単一の抗原をコードする遺伝
子或いはそれぞれ抗原をコードする2つ又はそれ以上の
遺伝子を、ミコバクテリウムの複製に必須でないミコバ
クテリアのゲノム領域に挿入する。それぞれ問題の抗原
をコードする1つ又はそれ以上の遺伝子を、ミコバクテ
リアへの導入後にミコバクテリアの染色体中に組込み、
続いて染色体DNAで発現することのできる溶原性のバ
クテリオフアージ中に挿入することも可能である。他に
問題の抗原をコードする遺伝子を、遺伝子の発現が染色
体外的に(例えばエピソーム的に)起こるようにミコバク
テリア中に挿入することができる。例えば問題の遺伝子
をミコバクテリアのプラスミド中へクローン化し、そし
て培養しうるミコバクテリア中に導入する。この結果そ
れはエピソーム的複写(染色体外的複写)を受ける。
【0021】本発明のワクチンは現存するワクチンより
も重要な利点を有する。第一にミコバクテリアは最も良
く知られたものの中でアジユバント(adjuvant)
性を有し、従つて受体免疫系を、大きな効果でもつて他
の抗原に応答すべく刺激する。これは、それが細胞介在
の免疫性を誘導し且つ斯くして細胞介在免疫性が耐性に
対して決定的であるように見える場合に病原体に対する
免疫性を提供するのに特に有用であるであろうから、ワ
クチンの特に有用な観点である。第二に、ミコバクテリ
アは長期間の記憶又は免疫を刺激する。結果として、蛋
白質抗原に対して長期間の敏感性を作り出すために、単
一(一回)の接種で済ますことができる。即ち単一の接種
は感性が5〜50年間持続しうる。本発明のワクチン・
ビヒクルを用いることにより、長期に持続するT細胞の
記憶の発火点とすることができ、これが感染性因子又は
毒素を中和する2次的な抗体応答を刺激する。これは例
えば破傷風及びジフテリヤの毒素、百日咳、マラリア、
インフルエンザ、疱疹ウイルス及び蛇の毒液に対して有
用である。
も重要な利点を有する。第一にミコバクテリアは最も良
く知られたものの中でアジユバント(adjuvant)
性を有し、従つて受体免疫系を、大きな効果でもつて他
の抗原に応答すべく刺激する。これは、それが細胞介在
の免疫性を誘導し且つ斯くして細胞介在免疫性が耐性に
対して決定的であるように見える場合に病原体に対する
免疫性を提供するのに特に有用であるであろうから、ワ
クチンの特に有用な観点である。第二に、ミコバクテリ
アは長期間の記憶又は免疫を刺激する。結果として、蛋
白質抗原に対して長期間の敏感性を作り出すために、単
一(一回)の接種で済ますことができる。即ち単一の接種
は感性が5〜50年間持続しうる。本発明のワクチン・
ビヒクルを用いることにより、長期に持続するT細胞の
記憶の発火点とすることができ、これが感染性因子又は
毒素を中和する2次的な抗体応答を刺激する。これは例
えば破傷風及びジフテリヤの毒素、百日咳、マラリア、
インフルエンザ、疱疹ウイルス及び蛇の毒液に対して有
用である。
【0022】BCGは特に、1)それが誕生時に現在投
与されている小児時代だけのワクチンである;2)過去
40年において、それは結核に対するワクチンとして投
与した時副作用の例が非常に低かつた;及び3)それが
個体に繰返し(例えば多数回の形態で)使用できる、とい
う点でワクチン・ビヒクルとして重要な利点を有する。
与されている小児時代だけのワクチンである;2)過去
40年において、それは結核に対するワクチンとして投
与した時副作用の例が非常に低かつた;及び3)それが
個体に繰返し(例えば多数回の形態で)使用できる、とい
う点でワクチン・ビヒクルとして重要な利点を有する。
【0023】特にBCG並びに一般にミコバクテリアの
更なる利点は、ゲノムの大きさが大きいことである(長
さが約4×106hp)。ゲノムが大きいから、それは新
しい(即ち外来の)DNAを多量に保有することができ、
斯くしてマルチ-ワクチン・ビヒクル(即ち1つよりも多
い病原体に対する保護抗原をコードする外来のDNAを
保持するもの)を作るために使用できる。
更なる利点は、ゲノムの大きさが大きいことである(長
さが約4×106hp)。ゲノムが大きいから、それは新
しい(即ち外来の)DNAを多量に保有することができ、
斯くしてマルチ-ワクチン・ビヒクル(即ち1つよりも多
い病原体に対する保護抗原をコードする外来のDNAを
保持するもの)を作るために使用できる。
【0024】本発明の遺伝子工学によるベクターは、異
なる微生物属間で遺伝物質を伝達することに用いる点で
独特である。特にベクターは遺伝子的にミコバクテリオ
フアージに継ぎ込まれたバクテリア・プラスミドからの
DNAを含んでなる。得られる組換えシヤトル・ベクタ
ーは、大腸菌のコスミド[ラムダ付着末端部位(COS)
を含む大腸菌プラスミド]がクローン化された頭部を切
つたミコバクテリオフアージDNA分子を含む。これは
その大腸菌におけるプラスミド(この場合それは薬剤例
えばアンピシリン耐性を発現する)としての及びミコバ
クテリアにおけるフアージとしての複製能力が故にファ
スミドとして称される。例えば大腸菌からのプラスミド
のDNAは遺伝的にミコバクテリオフアージTM4に継
ぎ込まれ、その結果シヤトル・ファスミドphAE1を
産生する。シヤトル・ファスミドの使用は大腸菌におい
て遺伝物質を取り扱うことを可能にし、次いでこれを効
果的に培養しうるミコバクテリア(例えばBCG、M.
スメグマチス)中に伝達することを可能にする。斯くし
て第一に外来DNAを感染によつてミコバクテリアに導
入することができる。
なる微生物属間で遺伝物質を伝達することに用いる点で
独特である。特にベクターは遺伝子的にミコバクテリオ
フアージに継ぎ込まれたバクテリア・プラスミドからの
DNAを含んでなる。得られる組換えシヤトル・ベクタ
ーは、大腸菌のコスミド[ラムダ付着末端部位(COS)
を含む大腸菌プラスミド]がクローン化された頭部を切
つたミコバクテリオフアージDNA分子を含む。これは
その大腸菌におけるプラスミド(この場合それは薬剤例
えばアンピシリン耐性を発現する)としての及びミコバ
クテリアにおけるフアージとしての複製能力が故にファ
スミドとして称される。例えば大腸菌からのプラスミド
のDNAは遺伝的にミコバクテリオフアージTM4に継
ぎ込まれ、その結果シヤトル・ファスミドphAE1を
産生する。シヤトル・ファスミドの使用は大腸菌におい
て遺伝物質を取り扱うことを可能にし、次いでこれを効
果的に培養しうるミコバクテリア(例えばBCG、M.
スメグマチス)中に伝達することを可能にする。斯くし
て第一に外来DNAを感染によつてミコバクテリアに導
入することができる。
【0025】問題の病原体をコードする遺伝子或いは1
つより多い問題の病原体をコードする1つより多い遺伝
子を、それらが発現されるミコバクテリア例えばBCG
及びM.スメグマチス中に導入することにより、現存す
るワクチンと異なつて1つ又はそれ以上の病原体に対し
て長期間の免疫を提供することの出来るワクチンを製造
することが可能である。この長期間の免疫は1回の予防
接種で及び接種したものに副作用が非常に起こりにくい
状態で付与することができる。
つより多い問題の病原体をコードする1つより多い遺伝
子を、それらが発現されるミコバクテリア例えばBCG
及びM.スメグマチス中に導入することにより、現存す
るワクチンと異なつて1つ又はそれ以上の病原体に対し
て長期間の免疫を提供することの出来るワクチンを製造
することが可能である。この長期間の免疫は1回の予防
接種で及び接種したものに副作用が非常に起こりにくい
状態で付与することができる。
【0026】以下、図面を参照しながら、本発明をさら
に具体的に説明する。
に具体的に説明する。
【0027】図1はミコバクテリウム・スメグマチスの
スフエロプラストの、ミコバクテリオフアージD29D
NAでのトランスフエクシヨンの結果を示す。
スフエロプラストの、ミコバクテリオフアージD29D
NAでのトランスフエクシヨンの結果を示す。
【0028】図2は、シヤトル・ファスミドphAE1の
製造の概略図である。
製造の概略図である。
【0029】図3はミコバクテリオフアージTM4DN
A及びKpnIで消化されたシヤトル・ファスミドphAE
1DNAの、エチジウム・ブロマイドで染色した0.7
%アガロースゲル(パネルA)及びpHC79をプロー
ブとして用いることによるファスミドphAE1のサザー
ン・ブロット(Southern blot)分析(パネルB)を
示す。
A及びKpnIで消化されたシヤトル・ファスミドphAE
1DNAの、エチジウム・ブロマイドで染色した0.7
%アガロースゲル(パネルA)及びpHC79をプロー
ブとして用いることによるファスミドphAE1のサザー
ン・ブロット(Southern blot)分析(パネルB)を
示す。
【0030】パネルAにおいて、レーン1はHindII
Iで消化したラムダDNAを含み;レーン2及び3はK
pnIで消化切断する前に連結してない(レーン2)又は
連結した(レーン3)TM4DNAを含み;レーン4及
び5はM.スメグマチス上で増殖されたフアージ粒子か
ら単離されたphAE1DNA(レーン4)及びプラスミ
ドとしての大腸菌細胞から単離されたphAE1(レーン
4)を含む。ここに矢印は付着端(cohesive end)で
連結した時に3.9Kbフラグメントを形成する2.1Kb
及び1.8Kbフラグメントを指していることを特記す
る。
Iで消化したラムダDNAを含み;レーン2及び3はK
pnIで消化切断する前に連結してない(レーン2)又は
連結した(レーン3)TM4DNAを含み;レーン4及
び5はM.スメグマチス上で増殖されたフアージ粒子か
ら単離されたphAE1DNA(レーン4)及びプラスミ
ドとしての大腸菌細胞から単離されたphAE1(レーン
4)を含む。ここに矢印は付着端(cohesive end)で
連結した時に3.9Kbフラグメントを形成する2.1Kb
及び1.8Kbフラグメントを指していることを特記す
る。
【0031】パネルBにおいて、バイオトランス(Bio
trans)ナイロン膜(ICN)上に浸みこませ且つ32P
−dCTPでニック・トランスレーシヨン(nick trans
lation)したpHC79DNAで検出した後のパネルA
のオートラジオグラフを示す。
trans)ナイロン膜(ICN)上に浸みこませ且つ32P
−dCTPでニック・トランスレーシヨン(nick trans
lation)したpHC79DNAで検出した後のパネルA
のオートラジオグラフを示す。
【0032】図4はphAE1のBCG上での複製を示
す。これは、他のミコバクテリア上でなくて結核菌及び
BCG上でのプラーク(plaque)に対して公知のミコバ
クテリオフアージであるDS6A;M.スメグマチスで
あってBCGでないプラークに対して公知のフアージ3
3D;及び両種のプラークに対して公知のフアージTM
4によるBCGのグラクソ(Glaxo)ワクチン種の溶解
を比較する。
す。これは、他のミコバクテリア上でなくて結核菌及び
BCG上でのプラーク(plaque)に対して公知のミコバ
クテリオフアージであるDS6A;M.スメグマチスで
あってBCGでないプラークに対して公知のフアージ3
3D;及び両種のプラークに対して公知のフアージTM
4によるBCGのグラクソ(Glaxo)ワクチン種の溶解
を比較する。
【0033】パネルAは各フアージによるBCGの溶解
を示す。10-1希釈で用いたフアージの力価(pfu/m
l)は、結核菌H37Ra上でDS6a、2×106;M.
スメグマチスmc26上で33D、2×106;及びmc26
上でTM4、3×108;及びmc 26上でphAE1、3×
108であった。フアージの希釈物(5ul)を、108個
のBCG細胞を含む軟い寒天の上層上にスポットした。
37℃で10日間の培養後の得られた溶解を写真にし
た。
を示す。10-1希釈で用いたフアージの力価(pfu/m
l)は、結核菌H37Ra上でDS6a、2×106;M.
スメグマチスmc26上で33D、2×106;及びmc26
上でTM4、3×108;及びmc 26上でphAE1、3×
108であった。フアージの希釈物(5ul)を、108個
のBCG細胞を含む軟い寒天の上層上にスポットした。
37℃で10日間の培養後の得られた溶解を写真にし
た。
【0034】パネルBはphAE1におけるコスミドDN
Aの存在物を示す。これらのプレート上プラーク・リフ
ト(lift)は下記の如く行ない、そして32Pで標識した
pHC79DNAとハイブリダイズし、次いでオートラ
ジオグラフイーにかけた。
Aの存在物を示す。これらのプレート上プラーク・リフ
ト(lift)は下記の如く行ない、そして32Pで標識した
pHC79DNAとハイブリダイズし、次いでオートラ
ジオグラフイーにかけた。
【0035】パネルCはシヤトル・ファスミドのphAE
1フアージ粒子の電子顕微鏡図である。CsClグラジエ
ントにより精製したフアージ粒子を、カーボンを被覆し
且つパーロイドン(Parloidon)を被覆したグリッド上
に置き、1%ホスホタングステン酸1滴を落し、洗浄し
た。電子顕微鏡写真はJEOL 1200EX電子顕微
鏡を80kV、30000Xで用いて撮った。
1フアージ粒子の電子顕微鏡図である。CsClグラジエ
ントにより精製したフアージ粒子を、カーボンを被覆し
且つパーロイドン(Parloidon)を被覆したグリッド上
に置き、1%ホスホタングステン酸1滴を落し、洗浄し
た。電子顕微鏡写真はJEOL 1200EX電子顕微
鏡を80kV、30000Xで用いて撮った。
【0036】ミコバクテリウム・ボビス‐BCG(BC
G)は世界中で広く使用されている無毒のM.ボビス誘
導体であり、そしてその効果が最近問題になってきたけ
れども、結核からの保護のために通常使用されている。
ミコバクテリウム・スメグマチスは、BCGと抗原性及
びアジユバンド性を共有する非病原体杆菌である。両方
とも培養で容易に生長せしめうる。
G)は世界中で広く使用されている無毒のM.ボビス誘
導体であり、そしてその効果が最近問題になってきたけ
れども、結核からの保護のために通常使用されている。
ミコバクテリウム・スメグマチスは、BCGと抗原性及
びアジユバンド性を共有する非病原体杆菌である。両方
とも培養で容易に生長せしめうる。
【0037】両ミコバクテリアは細胞媒介性の免疫の誘
導に対して優秀なアジユバンド活性を有し、長期の記憶
(免疫)を刺激し、そしてその使用と関連した死亡の低
さが故に、組換えワクチンとして優秀な候補者である。
即ちそれらは問題の遺伝物質(免疫応答が求められてい
る1つ又はそれ以上の抗原体をコードするDNA)が挿
入でき且つ続いて発現できるビヒクル(ワクチン・ビヒ
クル)として用いるのに優秀な候補者である。遺伝子の
すべて又は一部であってよい且つミコバクテリアに導入
されるそのようなDNAは本明細書において外来のDN
Aとして言及される。そのようなビヒクルは、抗原が外
来DNAでコードされている病原体に対して免疫を与え
るワクチンとして使用することができる。またそれらは
抗受精「ワクチン」ビヒクルとしても使用しうる。例え
ば人間の生殖腺刺激ホルモン(HGH)フラグメントの
ような抗原をコードしているDNAを含むミコバクテリ
アは抗受精ワクチンとして使用でき、また受胎調節剤と
して投与することができる。外来DNAは、このDNA
を導入するミコバクテリア以外の起源からのDNA(例
えばBCGの場合、BCG以外のDNA)である。病原
体はウイルス、微生物、或いは病気を引き起こす他の微
生物又は物質である。ミコバクテリアは、大きいゲノム
(例えばBCGのゲノムは長さが約4×106bpであ
る)を有するから、多量の新しい(外来の)DNAを保
持することができ、従ってマルチ‐ワクチン・ビヒクル
として役立つ。
導に対して優秀なアジユバンド活性を有し、長期の記憶
(免疫)を刺激し、そしてその使用と関連した死亡の低
さが故に、組換えワクチンとして優秀な候補者である。
即ちそれらは問題の遺伝物質(免疫応答が求められてい
る1つ又はそれ以上の抗原体をコードするDNA)が挿
入でき且つ続いて発現できるビヒクル(ワクチン・ビヒ
クル)として用いるのに優秀な候補者である。遺伝子の
すべて又は一部であってよい且つミコバクテリアに導入
されるそのようなDNAは本明細書において外来のDN
Aとして言及される。そのようなビヒクルは、抗原が外
来DNAでコードされている病原体に対して免疫を与え
るワクチンとして使用することができる。またそれらは
抗受精「ワクチン」ビヒクルとしても使用しうる。例え
ば人間の生殖腺刺激ホルモン(HGH)フラグメントの
ような抗原をコードしているDNAを含むミコバクテリ
アは抗受精ワクチンとして使用でき、また受胎調節剤と
して投与することができる。外来DNAは、このDNA
を導入するミコバクテリア以外の起源からのDNA(例
えばBCGの場合、BCG以外のDNA)である。病原
体はウイルス、微生物、或いは病気を引き起こす他の微
生物又は物質である。ミコバクテリアは、大きいゲノム
(例えばBCGのゲノムは長さが約4×106bpであ
る)を有するから、多量の新しい(外来の)DNAを保
持することができ、従ってマルチ‐ワクチン・ビヒクル
として役立つ。
【0038】しかしながら今日まで、プラスミドDNA
を用いてミコバクテリアを形質転換することは可能でな
かった。これは、溶原性(即ちミコバリテリア自体の溶
解なしに、他の種の一般的な溶解を培養中に誘導するこ
と)及びトランスフエクシヨンがいくつかの種について
記述されており且つ多種類のミコバクリオフアージが存
在するにもかかわらず、分子生物学の知識及びミコバク
リアの遺伝学が多くの微生物類のそれよりも多分に進歩
していなかったということに一部原因しよう。
を用いてミコバクテリアを形質転換することは可能でな
かった。これは、溶原性(即ちミコバリテリア自体の溶
解なしに、他の種の一般的な溶解を培養中に誘導するこ
と)及びトランスフエクシヨンがいくつかの種について
記述されており且つ多種類のミコバクリオフアージが存
在するにもかかわらず、分子生物学の知識及びミコバク
リアの遺伝学が多くの微生物類のそれよりも多分に進歩
していなかったということに一部原因しよう。
【0039】ワクチン・ビヒクルとして使用すべき組換
えミコバクテリウムの開発研究の主な目的は、産生物が
1つ又はそれ以上の病原体に対する保護にとって重要で
ある遺伝子の発現を指示するDNAベクターをミコバク
リアに導入することである。今や本発明の方法及びシヤ
トル・ベクターを用いることにより、外来のDNAを培
養しうるミコバクテリアに導入することが可能である。
ここに外来のDNAは問題の抗原1つ又はそれ以上をコ
ードするDNAを含んでなる。本発明のシヤトル・ベク
ターは、それがバクテリアにおけるプラスミドとして及
びミコバクテリアにおけるフアージとして複製すること
に独自性がある。特別な具体例において、シヤトル・フ
ァスミドとして言及されるシヤトル・ベクターは特異的
な付着端(又はCos部位)の2つの種を含む:1つは大
腸菌において機能するラムダフアージ及び1つはミクロ
バクテリア(例えばミコバクテリアにおいて機能するミ
コバクテリオフアージTM)に対するもの。即ちそれは
2組の付着端を含む。それはラムダに対して1組及びミ
コバクテリアに対して1組を含むから、両方に導入する
ことができる。ラムダCOSシーケンス存在は、大きい
DNA分子を大腸菌へ効果的にクローン化するためにラ
ムダ試験管内パッケージ(packaging)系を利用するコ
スミド・クローン化の効果的な技術を用いることも可能
にする。更にシヤトル・ベクターは、抗原をコードする
DNAを挿入することができる独特なEcoRI部位を有
する。斯くしてベクターは組換えDNA分子のミコバク
テリアへの導入を許容するトランスフエクシヨン系を開
発することを可能にした。
えミコバクテリウムの開発研究の主な目的は、産生物が
1つ又はそれ以上の病原体に対する保護にとって重要で
ある遺伝子の発現を指示するDNAベクターをミコバク
リアに導入することである。今や本発明の方法及びシヤ
トル・ベクターを用いることにより、外来のDNAを培
養しうるミコバクテリアに導入することが可能である。
ここに外来のDNAは問題の抗原1つ又はそれ以上をコ
ードするDNAを含んでなる。本発明のシヤトル・ベク
ターは、それがバクテリアにおけるプラスミドとして及
びミコバクテリアにおけるフアージとして複製すること
に独自性がある。特別な具体例において、シヤトル・フ
ァスミドとして言及されるシヤトル・ベクターは特異的
な付着端(又はCos部位)の2つの種を含む:1つは大
腸菌において機能するラムダフアージ及び1つはミクロ
バクテリア(例えばミコバクテリアにおいて機能するミ
コバクテリオフアージTM)に対するもの。即ちそれは
2組の付着端を含む。それはラムダに対して1組及びミ
コバクテリアに対して1組を含むから、両方に導入する
ことができる。ラムダCOSシーケンス存在は、大きい
DNA分子を大腸菌へ効果的にクローン化するためにラ
ムダ試験管内パッケージ(packaging)系を利用するコ
スミド・クローン化の効果的な技術を用いることも可能
にする。更にシヤトル・ベクターは、抗原をコードする
DNAを挿入することができる独特なEcoRI部位を有
する。斯くしてベクターは組換えDNA分子のミコバク
テリアへの導入を許容するトランスフエクシヨン系を開
発することを可能にした。
【0040】問題の遺伝子物質をミコバクテリア中に導
入して本発明の組換えミコバクテリアを生産するにはい
くつかの手段がある。例えば問題のDNAは、シヤトル
・ファスミド、特に溶原性のシヤトル・ファスミド(例
えば細胞を溶原化しうるフアージ)中にクローン化する
ことによってミコバクテリア細胞中に安定に導入するこ
とができる。この方法による問題のDNA(外来DN
A)の導入は、そのDNAの、ミコバクテリアの染色体
中への組込みをもたらす。他にプラスミド・ベクターを
用いて、外来DNAを、そのDNAが染色体外的に発現
されるミコバクテリア中に導入することができる。
入して本発明の組換えミコバクテリアを生産するにはい
くつかの手段がある。例えば問題のDNAは、シヤトル
・ファスミド、特に溶原性のシヤトル・ファスミド(例
えば細胞を溶原化しうるフアージ)中にクローン化する
ことによってミコバクテリア細胞中に安定に導入するこ
とができる。この方法による問題のDNA(外来DN
A)の導入は、そのDNAの、ミコバクテリアの染色体
中への組込みをもたらす。他にプラスミド・ベクターを
用いて、外来DNAを、そのDNAが染色体外的に発現
されるミコバクテリア中に導入することができる。
【0041】外来DNAを導入し且つこれをフアージな
しに宿主染色体中に組み込むことも可能である。例えば
これは相同組換え、部位特異的組換え、又は非相同組換
えにより(例えば宿主の染色体物質中へのランダムな挿
入をもたらすトランスポソンを用いることにより)達成
することができる。
しに宿主染色体中に組み込むことも可能である。例えば
これは相同組換え、部位特異的組換え、又は非相同組換
えにより(例えば宿主の染色体物質中へのランダムな挿
入をもたらすトランスポソンを用いることにより)達成
することができる。
【0042】本発明のシヤトル・ベクターを用いること
によって外来のDNA(即ち問題の病原体1つ又はそれ
以上に対する抗原1つ又はそれ以上をコードするDN
A)をミコバクテリア例えばBCG中に成功裏に導入す
るために、次の一般的な手法に従う。以下はM.スメグ
マチス及びBCGに関して記述されるけれども、それは
異質のDNAを他のミコバクテリア中に導入するために
も使用することができ且つ外来DNAを含有するこれら
の他のミコバクテリアはワクチン・ビヒクルとしても使
用しうることが理解される。ワクチン・ビヒクルとして
使用すべきミコバクテリア(例えばBCG及び結核菌)
がゆっくり生長する場合、M.スメグマチスを介し(即
ちこれに問題の抗原をコードするDNAを導入し)、続
いてBCGに導入することが特に有用である。
によって外来のDNA(即ち問題の病原体1つ又はそれ
以上に対する抗原1つ又はそれ以上をコードするDN
A)をミコバクテリア例えばBCG中に成功裏に導入す
るために、次の一般的な手法に従う。以下はM.スメグ
マチス及びBCGに関して記述されるけれども、それは
異質のDNAを他のミコバクテリア中に導入するために
も使用することができ且つ外来DNAを含有するこれら
の他のミコバクテリアはワクチン・ビヒクルとしても使
用しうることが理解される。ワクチン・ビヒクルとして
使用すべきミコバクテリア(例えばBCG及び結核菌)
がゆっくり生長する場合、M.スメグマチスを介し(即
ちこれに問題の抗原をコードするDNAを導入し)、続
いてBCGに導入することが特に有用である。
【0043】DNAをミコバクテリアに伝達するための
シヤトル・ベクターの開発ミコバクテリオフアージDN
Aの、M.スメグマチスへのトランスフエクシヨン ミコバクテリア中でのDNAの取扱いを可能にする系を
開発するためには、最初にDNAを杆菌に伝達する効果
的な手段を開発することが必要であった。用いた技術
は、ストレプトマイシス(Streptomyces)に対するス
フエロプラスト(Spheroplast)の製造に関してオカニ
シ及びホプウツド(Hopwood)に記述されているものの
改変法であった。ストレプトマイシスはミコバクテリア
のようにアクチノマイセタレス(Actinomycetales)で
ある。オカニシ、M.ら、マイクロバイオロジー(Micr
obiology)、80、389〜400(1974);ホプ
ウツド、D.A.及びH.M.ライト(Wright)、モレキ
ユラー・ジエネテイクス(Molecular Gentics)、1
62、307〜317(1978)。M.スメグマチス
に関して用いるためのこの技術の改変は、DNA分子
の、バクテリア・スフエロプラスト中への組込みを容易
にするためにポリエチレングリコールの添加と組合せる
ことであった。
シヤトル・ベクターの開発ミコバクテリオフアージDN
Aの、M.スメグマチスへのトランスフエクシヨン ミコバクテリア中でのDNAの取扱いを可能にする系を
開発するためには、最初にDNAを杆菌に伝達する効果
的な手段を開発することが必要であった。用いた技術
は、ストレプトマイシス(Streptomyces)に対するス
フエロプラスト(Spheroplast)の製造に関してオカニ
シ及びホプウツド(Hopwood)に記述されているものの
改変法であった。ストレプトマイシスはミコバクテリア
のようにアクチノマイセタレス(Actinomycetales)で
ある。オカニシ、M.ら、マイクロバイオロジー(Micr
obiology)、80、389〜400(1974);ホプ
ウツド、D.A.及びH.M.ライト(Wright)、モレキ
ユラー・ジエネテイクス(Molecular Gentics)、1
62、307〜317(1978)。M.スメグマチス
に関して用いるためのこの技術の改変は、DNA分子
の、バクテリア・スフエロプラスト中への組込みを容易
にするためにポリエチレングリコールの添加と組合せる
ことであった。
【0044】ミコバクテリアを変性するためのプラスミ
ドにおいて有用な選択しうる抗生物質耐性マーカーが存
在しないから、DNAのミコバクテリアへの伝達に対し
て最適な条件を評価するために選択した系は溶菌性のミ
コバクテリアフアージからのDNAのトランスフエクシ
ヨンであった。そのような系の2つの利点は、得られる
結果が定量的であり且つ24時間以内にプラークとして
容易に可視化しうることである。
ドにおいて有用な選択しうる抗生物質耐性マーカーが存
在しないから、DNAのミコバクテリアへの伝達に対し
て最適な条件を評価するために選択した系は溶菌性のミ
コバクテリアフアージからのDNAのトランスフエクシ
ヨンであった。そのような系の2つの利点は、得られる
結果が定量的であり且つ24時間以内にプラークとして
容易に可視化しうることである。
【0045】ミクロバクテリオフアージDNAの、M.
スメグマチスへのトランスフエクシヨンは実施例1に詳
細に記述される。概述すると、最初にポリエチレングリ
コールを用いることにより細胞壁のすべて又は一部が除
去されたミクロバクテリア(即ち原形質体又はスフエロ
プラスト)中にDNAを導入した。トランスフエクシヨ
ンの実験をミコバクテリオフアージD29からのDNA
を用いて開始した。これは多種のミコバクテリア上で増
殖して、M.スメグマチス上に大きい透明なプラークを
生成した。M.スメグマチス上で調製されたD29フア
ージのプレート溶解物は一貫して溶解物1ml当り1011
pfu(プラーク生成単位)以上を生成した。収穫したフ
アージをCsCl平衡グラジエント上で2回精製した。そ
れは平衡浮揚密度1.51にバンドを形成した。フアー
ジDNAをプロテイナーゼKでの処理及びフエノール‐
クロロホルムでの抽出により抽出した。連結した及び連
結してないD29DNAの制限(restriction)分析
は、フアージのゲノムDNAが二重ら線であり、寸法が
50kbであり、そして付着端を有することを示した。
スメグマチスへのトランスフエクシヨンは実施例1に詳
細に記述される。概述すると、最初にポリエチレングリ
コールを用いることにより細胞壁のすべて又は一部が除
去されたミクロバクテリア(即ち原形質体又はスフエロ
プラスト)中にDNAを導入した。トランスフエクシヨ
ンの実験をミコバクテリオフアージD29からのDNA
を用いて開始した。これは多種のミコバクテリア上で増
殖して、M.スメグマチス上に大きい透明なプラークを
生成した。M.スメグマチス上で調製されたD29フア
ージのプレート溶解物は一貫して溶解物1ml当り1011
pfu(プラーク生成単位)以上を生成した。収穫したフ
アージをCsCl平衡グラジエント上で2回精製した。そ
れは平衡浮揚密度1.51にバンドを形成した。フアー
ジDNAをプロテイナーゼKでの処理及びフエノール‐
クロロホルムでの抽出により抽出した。連結した及び連
結してないD29DNAの制限(restriction)分析
は、フアージのゲノムDNAが二重ら線であり、寸法が
50kbであり、そして付着端を有することを示した。
【0046】M.スメグマチスのスフエロプラストの、
ミコバクテリオフアージD29DNAによるトランスフ
エクシヨンの結果を図1に示す。103〜104pfu/D
29DNAugの効率が得られた。即ちこれはミコバクテ
リアに対する最初の有効なトランスフエクシヨン系を示
す。これらのプラークがM.スメグマチスのトランスフ
エクシヨンの結果であるということは、次のことによっ
て示された:(i)トランスフエクシヨンがDNアーゼに
より壊滅された;(ii)処理した細胞の滲透圧シヨツク
が産生的トランスフエクシヨンを妨害した;そして(i
ii)M.スメグマチスのD29フアージ耐性変異体に由
来するスフエロプラストが親種に匹敵する頻度でトラン
スフエクシヨンした。これらの技術の更なる向上は、1
05pfu/D29DNAug以上の頻度を得ることを可能に
した。
ミコバクテリオフアージD29DNAによるトランスフ
エクシヨンの結果を図1に示す。103〜104pfu/D
29DNAugの効率が得られた。即ちこれはミコバクテ
リアに対する最初の有効なトランスフエクシヨン系を示
す。これらのプラークがM.スメグマチスのトランスフ
エクシヨンの結果であるということは、次のことによっ
て示された:(i)トランスフエクシヨンがDNアーゼに
より壊滅された;(ii)処理した細胞の滲透圧シヨツク
が産生的トランスフエクシヨンを妨害した;そして(i
ii)M.スメグマチスのD29フアージ耐性変異体に由
来するスフエロプラストが親種に匹敵する頻度でトラン
スフエクシヨンした。これらの技術の更なる向上は、1
05pfu/D29DNAug以上の頻度を得ることを可能に
した。
【0047】外来DNAのミコバクテリア中への導入 重要な工程は、大腸菌におけるミコバクテリアのDNA
構築物(constructs)の取扱い及び増殖並びに続くミコ
バクテリア中への転写及びそこでの複写の双方を可能に
するベクターの開発であった。特に外来のDNAを、迅
速に生長する非病原性ミコバクテリア(例えばM.スメ
グマチス)、並びにゆっくり生長するミコバクテリア
(例えばBCG及び結核菌)中に導入する可能性をもつ
ことは非常に望しい。プラスミドはMAIS複合体中の
いくつかのミコバクテリア種中に及びM.フオルツイタ
ム(fortuitum)中に見出されているけれど、M.スメグ
マチス、BCG、又は結核菌内で複製するものは未だに
記述されていない。1つの例外はあるが、これらのプラ
スミドはいずれもが選別しうるマーカーを有さない。ク
ロウフオード(Crawford),J.T.及びJ.H.ベイツ
(Bates)、インフエクシヨンズ・アンド・イミユニテ
イー(Infections and Immunity)24,979〜9
81(1979);ミズグチ,Y.ら、ジヤーナル・オ
ブ・バクテリオロジー(Journal of Bacteriolog
y),146,656〜659(1981);マイスナ
ー(Meissner),P.S.及びJ.O.フアルキンハム
(Falkinham),ジヤーナル・オブ・バクテリオロジ
ー,157,669〜672(1984)。これに対
し、M.スメグマチス、BCG、及び結核菌中で複製す
る種々のフアージが単離物の型別のために記述され且つ
使用されてきた。
構築物(constructs)の取扱い及び増殖並びに続くミコ
バクテリア中への転写及びそこでの複写の双方を可能に
するベクターの開発であった。特に外来のDNAを、迅
速に生長する非病原性ミコバクテリア(例えばM.スメ
グマチス)、並びにゆっくり生長するミコバクテリア
(例えばBCG及び結核菌)中に導入する可能性をもつ
ことは非常に望しい。プラスミドはMAIS複合体中の
いくつかのミコバクテリア種中に及びM.フオルツイタ
ム(fortuitum)中に見出されているけれど、M.スメグ
マチス、BCG、又は結核菌内で複製するものは未だに
記述されていない。1つの例外はあるが、これらのプラ
スミドはいずれもが選別しうるマーカーを有さない。ク
ロウフオード(Crawford),J.T.及びJ.H.ベイツ
(Bates)、インフエクシヨンズ・アンド・イミユニテ
イー(Infections and Immunity)24,979〜9
81(1979);ミズグチ,Y.ら、ジヤーナル・オ
ブ・バクテリオロジー(Journal of Bacteriolog
y),146,656〜659(1981);マイスナ
ー(Meissner),P.S.及びJ.O.フアルキンハム
(Falkinham),ジヤーナル・オブ・バクテリオロジ
ー,157,669〜672(1984)。これに対
し、M.スメグマチス、BCG、及び結核菌中で複製す
る種々のフアージが単離物の型別のために記述され且つ
使用されてきた。
【0048】用いた方策は、大腸菌中でプラスミドとし
て及びミコバクテリア中でフアージとして複製するベク
ターを構築することであった。このシヤトル・ファスミ
ドの開発を達成する1つの方法は、ミコバクテリアDN
Aが大腸菌中で良好に発現されないから、大腸菌宿主を
溶解しないであろう機能的ミコバクテリオフアージのゲ
ノムをプラスミド・ベクター中にクローン化することが
可能である筈であるという考えに基づいた。斯くしてそ
れは両種の有機体中で複製しうるであろう。M.スメグ
マチスのトランスフエクシヨンはミコバクテリオフアー
ジ粒子を生成するであろうから、外来DNAの、ゆつく
り生長するミコバクテリア(例えばBCG)中への導入
はフアージの感染により達成できた。ストレプトマイシ
スに対する2機能性ベクターは、スアレズ(Suarez)
によって記述されている。スアレズ、J.E.及びK.
F.チヤター(Chater)、ネーチヤー(Nature),2
86,527〜529(1980)。大腸菌において二
重の性質をもつラムダーCo1E1ベクターはブレンナ
ー(Brenner)及び共同研究者によってプラスミドとし
て言及された。ブレンナー,S.ら、ジエン(Gen
e),17,27〜44(1982)。
て及びミコバクテリア中でフアージとして複製するベク
ターを構築することであった。このシヤトル・ファスミ
ドの開発を達成する1つの方法は、ミコバクテリアDN
Aが大腸菌中で良好に発現されないから、大腸菌宿主を
溶解しないであろう機能的ミコバクテリオフアージのゲ
ノムをプラスミド・ベクター中にクローン化することが
可能である筈であるという考えに基づいた。斯くしてそ
れは両種の有機体中で複製しうるであろう。M.スメグ
マチスのトランスフエクシヨンはミコバクテリオフアー
ジ粒子を生成するであろうから、外来DNAの、ゆつく
り生長するミコバクテリア(例えばBCG)中への導入
はフアージの感染により達成できた。ストレプトマイシ
スに対する2機能性ベクターは、スアレズ(Suarez)
によって記述されている。スアレズ、J.E.及びK.
F.チヤター(Chater)、ネーチヤー(Nature),2
86,527〜529(1980)。大腸菌において二
重の性質をもつラムダーCo1E1ベクターはブレンナ
ー(Brenner)及び共同研究者によってプラスミドとし
て言及された。ブレンナー,S.ら、ジエン(Gen
e),17,27〜44(1982)。
【0049】この目的のために、ミコバクテリオフアー
ジTM4を用いた。TM4はM.アビウムから単離され
る溶原性フアージであると報告されている。チンメ(T
imme),T.L.及びP.J.ブレンナン(Brenna
n),ジヤーナル・オブ・ジエネラル・マイクロバイオ
ロジー(Journal of General Microbiology),13
0,2059〜2066(1984)。それはM.スメ
グマチスを溶解するフアージであると特徴づけられた。
それはM.スメグマチス、BCG、及び結核菌中で複製
することが示され、そして溶原性であると報告された。
このフアージも50kbの二重ら線のDNAゲノムを有
し、そして付着端をもつ。しかしながら、同様の特性を
もつ他のミコバクテリオフアージを用いることも可能で
ある。TM4で使用されるものとして記述される次の方
法はベクターを構築するに際してそのような他のミコバ
クテリオフアージで使用することも可能である。
ジTM4を用いた。TM4はM.アビウムから単離され
る溶原性フアージであると報告されている。チンメ(T
imme),T.L.及びP.J.ブレンナン(Brenna
n),ジヤーナル・オブ・ジエネラル・マイクロバイオ
ロジー(Journal of General Microbiology),13
0,2059〜2066(1984)。それはM.スメ
グマチスを溶解するフアージであると特徴づけられた。
それはM.スメグマチス、BCG、及び結核菌中で複製
することが示され、そして溶原性であると報告された。
このフアージも50kbの二重ら線のDNAゲノムを有
し、そして付着端をもつ。しかしながら、同様の特性を
もつ他のミコバクテリオフアージを用いることも可能で
ある。TM4で使用されるものとして記述される次の方
法はベクターを構築するに際してそのような他のミコバ
クテリオフアージで使用することも可能である。
【0050】大腸菌中でプラスミドとして及びミコバク
テリア中でフアージとして複製するベクターを生じさせ
るために大腸菌のプラスミド・レプリコンをフアージT
M4に導入すべく用いた方策を図2に系統的に示す。D
29フアージに対して記述したように、プレート原料溶
解物及びTM4フアージのゲノムDNAを準備する(実
施例1参照)。TM4・DNAを高濃度で連結して長い
コンカテマーを生成させ、その付着端をアニーリングし
た。連続したDNAをSau3Aで部分的に消化した。
テリア中でフアージとして複製するベクターを生じさせ
るために大腸菌のプラスミド・レプリコンをフアージT
M4に導入すべく用いた方策を図2に系統的に示す。D
29フアージに対して記述したように、プレート原料溶
解物及びTM4フアージのゲノムDNAを準備する(実
施例1参照)。TM4・DNAを高濃度で連結して長い
コンカテマーを生成させ、その付着端をアニーリングし
た。連続したDNAをSau3Aで部分的に消化した。
【0051】Sau3AはTM4ゲノムを頻度よく(例
えば平均300bpごとに1回)、寸法30〜50kb
のフラグメントに切断する。これは、長さが完全なTM
4ゲノム又は小さな欠落をもつTM4ゲノムのそれであ
ったDNAフラグメントの組を生じ、ゲノム内のSau
3A部位のいずれかにおいて開裂せしめる。これらのD
NAフラグメントを、BamHIで開裂された6.5kb
コスミドpHC79に連結させた。ホーン(Hohn),
B.及びJ.コリンズ(Collins),ジエン,9,29
1〜298(1980)。適当な寸法の組換え分子を選
別するために、連結混合物を試験管内でバクテリオフア
ージのラムダ頭部にパツケージした。これはラムダco
s部位を含み且つ寸法が38〜53kbであるDNAフ
ラグメントを選別した。得られるフアージ粒子を大腸菌
に形質導入し、そしてpHC79:TM4DNA分子を
含むコロニーをアンピシリンを含有する媒体上で選別し
た。プラスミドの共有結合的に閉じた環状DNAを4
0,000の貯留したアンピシリン耐性(ampr)コロニ
ーから単離した。バーンボイム(Birnboim),H.及
びドリー(Doly),ジヤーナル・オブ・ヌクレイツク
・アシツド・リサーチ(Journal of Nucleic Acid
Research),7,1513〜1525(1979)。
えば平均300bpごとに1回)、寸法30〜50kb
のフラグメントに切断する。これは、長さが完全なTM
4ゲノム又は小さな欠落をもつTM4ゲノムのそれであ
ったDNAフラグメントの組を生じ、ゲノム内のSau
3A部位のいずれかにおいて開裂せしめる。これらのD
NAフラグメントを、BamHIで開裂された6.5kb
コスミドpHC79に連結させた。ホーン(Hohn),
B.及びJ.コリンズ(Collins),ジエン,9,29
1〜298(1980)。適当な寸法の組換え分子を選
別するために、連結混合物を試験管内でバクテリオフア
ージのラムダ頭部にパツケージした。これはラムダco
s部位を含み且つ寸法が38〜53kbであるDNAフ
ラグメントを選別した。得られるフアージ粒子を大腸菌
に形質導入し、そしてpHC79:TM4DNA分子を
含むコロニーをアンピシリンを含有する媒体上で選別し
た。プラスミドの共有結合的に閉じた環状DNAを4
0,000の貯留したアンピシリン耐性(ampr)コロニ
ーから単離した。バーンボイム(Birnboim),H.及
びドリー(Doly),ジヤーナル・オブ・ヌクレイツク
・アシツド・リサーチ(Journal of Nucleic Acid
Research),7,1513〜1525(1979)。
【0052】このライブラリー(library)は、pHC
79コスミドDNAがTM4ゲノムの周囲のSau3A
部位にランダムに導入されたTM4ゲノムの組換え分子
を含む。これをM.スメグマチスのスフエロプラスト中
にトランスフエクシヨンして、pHC79が必須でない
領域に挿入されたTM4フアージを選別した。斯くして
そのようなフアージはシャトル・ファスミドである。こ
のトランスフエクシヨンは100プラーク形成単位(p
fu)/プラスミドDNAugを生成した。プラーク・
リフトを用いて32Pで標識したpHC79DNAへの交
雑を選別した。4000のプラークのうち10だけが標
識したpHC79に交雑した。
79コスミドDNAがTM4ゲノムの周囲のSau3A
部位にランダムに導入されたTM4ゲノムの組換え分子
を含む。これをM.スメグマチスのスフエロプラスト中
にトランスフエクシヨンして、pHC79が必須でない
領域に挿入されたTM4フアージを選別した。斯くして
そのようなフアージはシャトル・ファスミドである。こ
のトランスフエクシヨンは100プラーク形成単位(p
fu)/プラスミドDNAugを生成した。プラーク・
リフトを用いて32Pで標識したpHC79DNAへの交
雑を選別した。4000のプラークのうち10だけが標
識したpHC79に交雑した。
【0053】プラークの精製およびM.スメグマチス細
胞上での増殖後、1つのそのようなフアージを詳細に検
討し、そしてプラークphAE1として表示した。ファ
スミドphAE1は寄託番号40306のもとにアメリ
カン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン(American
Type Culture Collection,Rockville,MD)に寄託
した(1986年2月26日)。DNAはM.スメグマ
チス上で生長させたphAE1フアージ粒子から単離さ
れ、CsClグラジエント上で精製し、コンカタマーを
生成するために連結し、そして試験管内でバクテリオフ
アージラムダ頭部中にパツケージした。得られる粒子は
アンピシリン耐性を大腸菌細胞に転写し、そしてトラン
スフエクシヨンした時M.スメグマチス上にプラークを
生成した。これはphAE1がシヤトル・ベクターとし
て機能する証拠であった。
胞上での増殖後、1つのそのようなフアージを詳細に検
討し、そしてプラークphAE1として表示した。ファ
スミドphAE1は寄託番号40306のもとにアメリ
カン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン(American
Type Culture Collection,Rockville,MD)に寄託
した(1986年2月26日)。DNAはM.スメグマ
チス上で生長させたphAE1フアージ粒子から単離さ
れ、CsClグラジエント上で精製し、コンカタマーを
生成するために連結し、そして試験管内でバクテリオフ
アージラムダ頭部中にパツケージした。得られる粒子は
アンピシリン耐性を大腸菌細胞に転写し、そしてトラン
スフエクシヨンした時M.スメグマチス上にプラークを
生成した。これはphAE1がシヤトル・ベクターとし
て機能する証拠であった。
【0054】M.スメグマチス上で増殖されたフアージ
粒子から単離されたphAE1 DNAの及び大腸菌か
ら単離されたプラスミドDNAとして単離されたphA
E1DNAの制限消化物は、フアージDNA調製物に見
られる付着端によって一緒に保持されたアニーリングさ
れてないフラグメントの存在を除いて同一のパターンを
示した(図3のA)。サザーン分析は、コスミドpHC
79がTM4ゲノムの2つの11kbKpnI制限フラ
グメントの1つ内にクローン化されているということを
示した(図3のB)。電子顕微鏡により、phAE1粒
子は平均の直径50umである6辺形の頭部を有するバ
クテリオフアージラムダに似ていた。しかしながら、こ
れらの粒子はテール(tail)上に多く存在する円板状の
ベースプレート(baseplate)をもつ長いテール(長さ
180〜220um)を有する(図4のC)。この構造
は親のTM4フアージのそれに非常に類似している。チ
ンメ(Timme),T.L.及びP.J.ブレンナン(B
rennan),ジヤーナル・オブ・ジエン・ミクロバイオロジー
(Journal of Gen-Micro-biology),130,20
5〜209(1984)。
粒子から単離されたphAE1 DNAの及び大腸菌か
ら単離されたプラスミドDNAとして単離されたphA
E1DNAの制限消化物は、フアージDNA調製物に見
られる付着端によって一緒に保持されたアニーリングさ
れてないフラグメントの存在を除いて同一のパターンを
示した(図3のA)。サザーン分析は、コスミドpHC
79がTM4ゲノムの2つの11kbKpnI制限フラ
グメントの1つ内にクローン化されているということを
示した(図3のB)。電子顕微鏡により、phAE1粒
子は平均の直径50umである6辺形の頭部を有するバ
クテリオフアージラムダに似ていた。しかしながら、こ
れらの粒子はテール(tail)上に多く存在する円板状の
ベースプレート(baseplate)をもつ長いテール(長さ
180〜220um)を有する(図4のC)。この構造
は親のTM4フアージのそれに非常に類似している。チ
ンメ(Timme),T.L.及びP.J.ブレンナン(B
rennan),ジヤーナル・オブ・ジエン・ミクロバイオロジー
(Journal of Gen-Micro-biology),130,20
5〜209(1984)。
【0055】pHC79に交雑しなかったM.スメグマ
チスへのpHC79::TM4ライブラリーのトランス
フエクシヨンに由来する単離されたフアージからのDN
Aの制限分析は、それらが同一であることを示した。フ
アージは2つ又はそれ以上のpHC79::TM4分子
を含むトランスフエクシヨンした細胞に起こる組換えに
由来して、野生種のTM4ゲノムを生成するように見え
る。
チスへのpHC79::TM4ライブラリーのトランス
フエクシヨンに由来する単離されたフアージからのDN
Aの制限分析は、それらが同一であることを示した。フ
アージは2つ又はそれ以上のpHC79::TM4分子
を含むトランスフエクシヨンした細胞に起こる組換えに
由来して、野生種のTM4ゲノムを生成するように見え
る。
【0056】特に興味あるのは、M.スメグマチスから
得られたシヤトル・ファスミドphAE1が、試験した
3つの異なるM.ボビス−BCGワクチン種、即ちグラ
クソ,パスツール、及びダニツシユBCGに感染し且つ
複製しうる親のTM4に類似している。これらの結果は
図4のA及び図4のBに示される。
得られたシヤトル・ファスミドphAE1が、試験した
3つの異なるM.ボビス−BCGワクチン種、即ちグラ
クソ,パスツール、及びダニツシユBCGに感染し且つ
複製しうる親のTM4に類似している。これらの結果は
図4のA及び図4のBに示される。
【0057】即ちこれは、大腸菌中においてプラスミド
として及びミコバクテリア中においてフアージとして複
製する能力を有するばかりでなく、バクテリオフアージ
のラムダ頭部に又はミコバクテリオフアージ粒子にパツ
ケージする能力を有する組換えDNA分子である大腸菌
ミコバクテリアのシヤトル・ファスミドの成功裏の構築
を示す。またそれは組換えDNAが速く生長するミコバ
クテリア(M.スメグマチス)及びゆっくり生長するミ
コバクテリア(M.ボビス−BCG)の双方に導入され
たことを示す。これはBCGワクチン種をシヤトル・フ
ァスミドで感染し、斯くしてクローン化された遺伝子を
ミコバクテリア中に導入することを可能にする。斯くし
てこれはBCGに対するトランスフエクシヨン系を開発
する必要がなくなる。即ち大腸菌のミコバクテリアのシ
ヤトル・ファスミドがミコバクテリア中にトランスフエ
クシヨンした時にミコバクテリア粒子中にパツケージさ
れるから、外来のDNAはトランスフエクシヨンよりも
むしろ形質導入によってゆっくり生長するミコバクテリ
ア(例えばBCG)中に導入することができる。現在ま
でこれは行なわれえなかったし、またそれは問題の抗原
1つ又はそれ以上に対して免疫化するために使用しうる
組換えミコバクテリアのワクチン・ビヒクルを生産する
ことを可能せしめる。
として及びミコバクテリア中においてフアージとして複
製する能力を有するばかりでなく、バクテリオフアージ
のラムダ頭部に又はミコバクテリオフアージ粒子にパツ
ケージする能力を有する組換えDNA分子である大腸菌
ミコバクテリアのシヤトル・ファスミドの成功裏の構築
を示す。またそれは組換えDNAが速く生長するミコバ
クテリア(M.スメグマチス)及びゆっくり生長するミ
コバクテリア(M.ボビス−BCG)の双方に導入され
たことを示す。これはBCGワクチン種をシヤトル・フ
ァスミドで感染し、斯くしてクローン化された遺伝子を
ミコバクテリア中に導入することを可能にする。斯くし
てこれはBCGに対するトランスフエクシヨン系を開発
する必要がなくなる。即ち大腸菌のミコバクテリアのシ
ヤトル・ファスミドがミコバクテリア中にトランスフエ
クシヨンした時にミコバクテリア粒子中にパツケージさ
れるから、外来のDNAはトランスフエクシヨンよりも
むしろ形質導入によってゆっくり生長するミコバクテリ
ア(例えばBCG)中に導入することができる。現在ま
でこれは行なわれえなかったし、またそれは問題の抗原
1つ又はそれ以上に対して免疫化するために使用しうる
組換えミコバクテリアのワクチン・ビヒクルを生産する
ことを可能せしめる。
【0058】これらのファスミドを構築するための試験
管内パッケージの使用は、パッケージ系の寸法の制限を
越えない限りにおいて、遺伝子(例えば免疫応答が所望
の1つ又はそれ以上の病原体に対する抗原をコードする
遺伝子又は外来遺伝子)の、これらベクターへのクロー
ン化に対する効果的な方策として拡張することができ
る。更なるTM4::pHC79組換えファスミドを選
別することにより、フアージから欠落しうるDNAの最
大量を決定すること及びDNAが挿入できるフアージの
ゲノムの必須でない更なる領域を決定することも可能で
ある。
管内パッケージの使用は、パッケージ系の寸法の制限を
越えない限りにおいて、遺伝子(例えば免疫応答が所望
の1つ又はそれ以上の病原体に対する抗原をコードする
遺伝子又は外来遺伝子)の、これらベクターへのクロー
ン化に対する効果的な方策として拡張することができ
る。更なるTM4::pHC79組換えファスミドを選
別することにより、フアージから欠落しうるDNAの最
大量を決定すること及びDNAが挿入できるフアージの
ゲノムの必須でない更なる領域を決定することも可能で
ある。
【0059】シヤトル・ファスミドを用いることによる
新しい遺伝子(例えば外来DNAをコードする抗原)の
ミコバクテリアの導入は、DNAフラグメントの、大腸
菌中のシヤトル・ファスミドへのクローン化及び続くそ
れらのM.スメグマチスのスフエロプラストへのトラン
スフエクシヨンを含む。これはクローン化された遺伝子
を含む組換えフアージ粒子を生成する。組換えフアージ
を含む得られるM.スメグマチスのスフエロプラストを
用いることにより、BCGを高効率(凡そ100%の効
率)で感染させることが可能であり、斯くして組換えフ
アージ中に含まれる外来のDNAをBCG中に導入でき
る。ミコバクテリア細胞において外来の遺伝子を安定に
発現するための、溶原性又は組換えを確立する条件の開
発は非常に望ましい。
新しい遺伝子(例えば外来DNAをコードする抗原)の
ミコバクテリアの導入は、DNAフラグメントの、大腸
菌中のシヤトル・ファスミドへのクローン化及び続くそ
れらのM.スメグマチスのスフエロプラストへのトラン
スフエクシヨンを含む。これはクローン化された遺伝子
を含む組換えフアージ粒子を生成する。組換えフアージ
を含む得られるM.スメグマチスのスフエロプラストを
用いることにより、BCGを高効率(凡そ100%の効
率)で感染させることが可能であり、斯くして組換えフ
アージ中に含まれる外来のDNAをBCG中に導入でき
る。ミコバクテリア細胞において外来の遺伝子を安定に
発現するための、溶原性又は組換えを確立する条件の開
発は非常に望ましい。
【0060】外来DNAのミコバクテリア細胞への導入 上述したシヤトル・ベクター(ファスミド)は、問題の
病原体1つ又はそれ以上に対する抗原1つ又はそれ以上
をコードする外来のDNAをミコバクテリア例えばBC
G又はM.スメグマチス中に導入するために使用するこ
とができる。またそれは抗受精ワクチンを製造するため
に適当な抗原例えば人間のゴナドトロピン・ホルモン
(HGH)のフラグメントをコードするDNAをミコバ
クテリア中に導入することによって使用することもでき
る。シヤトル・ファスミドは現在まで可能でなかったも
の、即ち組換えDNA構築物をバクテリア(例えば大腸
菌、ストレプトマイシス、杆菌)、又は他の有機体(例
えばイースト菌)中での取り扱い及び増殖、続くミコバ
クテリアへの転写及びそこでの複製を達成する手段を提
供する。
病原体1つ又はそれ以上に対する抗原1つ又はそれ以上
をコードする外来のDNAをミコバクテリア例えばBC
G又はM.スメグマチス中に導入するために使用するこ
とができる。またそれは抗受精ワクチンを製造するため
に適当な抗原例えば人間のゴナドトロピン・ホルモン
(HGH)のフラグメントをコードするDNAをミコバ
クテリア中に導入することによって使用することもでき
る。シヤトル・ファスミドは現在まで可能でなかったも
の、即ち組換えDNA構築物をバクテリア(例えば大腸
菌、ストレプトマイシス、杆菌)、又は他の有機体(例
えばイースト菌)中での取り扱い及び増殖、続くミコバ
クテリアへの転写及びそこでの複製を達成する手段を提
供する。
【0061】結果として、個体を例えばハンセン病、結
核、マラリア、ジフテリア、破傷風、リーシユマニア、
サルモネラ、住血吸虫性皮膚炎、風疹、耳下腺炎、疱
疹、及びインフルエンザに対して免疫にするために使用
しうる組換えミコバクテリア・ワクチンを製造すること
が可能である。1つ又はそれ以上の病気を引き起こす病
原体に対する1つ又はそれ以上の保護抗原をコードする
遺伝子はミコバクテリア中に導入することができる。T
細胞の記憶又はエフエクター機能を必要とする病原体の
抗原をコードする遺伝子を導入しうることは特に有用で
ある。得られる組換えミコバクテリア・ワクチンの宿主
への投与は、宿主の免疫系を刺激して保護免疫応答を作
り出す。
核、マラリア、ジフテリア、破傷風、リーシユマニア、
サルモネラ、住血吸虫性皮膚炎、風疹、耳下腺炎、疱
疹、及びインフルエンザに対して免疫にするために使用
しうる組換えミコバクテリア・ワクチンを製造すること
が可能である。1つ又はそれ以上の病気を引き起こす病
原体に対する1つ又はそれ以上の保護抗原をコードする
遺伝子はミコバクテリア中に導入することができる。T
細胞の記憶又はエフエクター機能を必要とする病原体の
抗原をコードする遺伝子を導入しうることは特に有用で
ある。得られる組換えミコバクテリア・ワクチンの宿主
への投与は、宿主の免疫系を刺激して保護免疫応答を作
り出す。
【0062】また相同組換えにより、1つの遺伝子を他
の遺伝子と交換し、そしてミコバクテリアの毒性に対す
る遺伝子に挿入変異を作り、毒性に必要な遺伝子を、そ
の存在が無毒性有機体をもたらす遺伝子で代替すること
も可能である。この方法で、抗原性をコードする遺伝子
を保持し、一方で有機体の毒性をコードする又は毒性と
関連する遺伝子を除去することが可能である。
の遺伝子と交換し、そしてミコバクテリアの毒性に対す
る遺伝子に挿入変異を作り、毒性に必要な遺伝子を、そ
の存在が無毒性有機体をもたらす遺伝子で代替すること
も可能である。この方法で、抗原性をコードする遺伝子
を保持し、一方で有機体の毒性をコードする又は毒性と
関連する遺伝子を除去することが可能である。
【0063】病原体又は毒素に対するワクチンは次の方
法で製造しうる:保護が望ましい病原体又は毒素に対す
る抗原(単数又は複数)をコードするDNAを得る。こ
のDNAは(例えば病原有機体又は毒素を産生する有機
体からの)天然に産するDNAを単離することにより;
公知の遺伝子工学の技術を用いることによって問題のD
NAシーケンスをクローン化し且つ増殖することにより
[参照、例えばマニアチス(Maniatis)、T.ら、分子
クローン化(Molecular Cloning):研究所マニユア
ル(A Laboratory Manual)、コールド・スプリン
グ・ハーバー(Cold Spring Harbor、N.Y.)
(1982)];或いは機械的合成により得ることがで
きる。
法で製造しうる:保護が望ましい病原体又は毒素に対す
る抗原(単数又は複数)をコードするDNAを得る。こ
のDNAは(例えば病原有機体又は毒素を産生する有機
体からの)天然に産するDNAを単離することにより;
公知の遺伝子工学の技術を用いることによって問題のD
NAシーケンスをクローン化し且つ増殖することにより
[参照、例えばマニアチス(Maniatis)、T.ら、分子
クローン化(Molecular Cloning):研究所マニユア
ル(A Laboratory Manual)、コールド・スプリン
グ・ハーバー(Cold Spring Harbor、N.Y.)
(1982)];或いは機械的合成により得ることがで
きる。
【0064】次の方法により、問題の(即ち免疫が所望
される抗原1つ又はそれ以上をコードする)遺伝子をシ
ヤトル・ファスミド中にクローン化する。これはシヤト
ル・ファスミドを系統的に表示する図2を参照にして説
明することができる。シヤトル・ファスミドの付着端を
公知の技術によって連結する。得られるシヤトル・ファ
スミド物質を独特な制限酵素(例えばシヤトル・ファス
ミド中の独特な部位例えばEcoRI及びEcoRVで切断
する制限酵素)で切断(消化)する。この方法で作られ
た切断への別法は、他の制限酵素で有用である(切断し
うる)ポリリンカー(polylinker)(オリゴヌクレチオ
ドシーケンス)の(連結による)付加である。この場
合、このリンカーは選択した制限酵素で開裂され、外来
DNAが挿入できる部位を生成する。
される抗原1つ又はそれ以上をコードする)遺伝子をシ
ヤトル・ファスミド中にクローン化する。これはシヤト
ル・ファスミドを系統的に表示する図2を参照にして説
明することができる。シヤトル・ファスミドの付着端を
公知の技術によって連結する。得られるシヤトル・ファ
スミド物質を独特な制限酵素(例えばシヤトル・ファス
ミド中の独特な部位例えばEcoRI及びEcoRVで切断
する制限酵素)で切断(消化)する。この方法で作られ
た切断への別法は、他の制限酵素で有用である(切断し
うる)ポリリンカー(polylinker)(オリゴヌクレチオ
ドシーケンス)の(連結による)付加である。この場
合、このリンカーは選択した制限酵素で開裂され、外来
DNAが挿入できる部位を生成する。
【0065】第1の場合(独特な制限酵素を用いて切断
する場合)、結果は一度切断された且つ外来のDNAが
挿入しうるシヤトル・ファスミドである。第2の場合に
は、DNAが挿入できる少くとも1つの部位も存在す
る。抗生物質耐性をコードする遺伝子(例えばアンピシ
リン耐性をコードする遺伝子)及び免疫が望しい抗原1
つ又はそれ以上をコードするDNAは公知の技術によ
り、制限部位で連結することができる。挿入されるDN
A及びシヤトル・ファスミドDNAは一般に等モル量で
連結される。
する場合)、結果は一度切断された且つ外来のDNAが
挿入しうるシヤトル・ファスミドである。第2の場合に
は、DNAが挿入できる少くとも1つの部位も存在す
る。抗生物質耐性をコードする遺伝子(例えばアンピシ
リン耐性をコードする遺伝子)及び免疫が望しい抗原1
つ又はそれ以上をコードするDNAは公知の技術によ
り、制限部位で連結することができる。挿入されるDN
A及びシヤトル・ファスミドDNAは一般に等モル量で
連結される。
【0066】この場合シヤトル・ファスミドDNA、抗
生物質耐性遺伝子及び抗原コードするDNAを含む得ら
れる連結したDNAを、ラムダ試験管内パッケージ混合
物を用いてバクテリアフアージのラムダ頭部中へパッケ
ージする。続いて大腸菌にこのフアージで形質導入す
る。この結果、抗生物質耐性をコードする遺伝子及び抗
原をコードするDNAを含むコロニーを(抗生物質を含
む媒体を用いて)選別することが可能である。
生物質耐性遺伝子及び抗原コードするDNAを含む得ら
れる連結したDNAを、ラムダ試験管内パッケージ混合
物を用いてバクテリアフアージのラムダ頭部中へパッケ
ージする。続いて大腸菌にこのフアージで形質導入す
る。この結果、抗生物質耐性をコードする遺伝子及び抗
原をコードするDNAを含むコロニーを(抗生物質を含
む媒体を用いて)選別することが可能である。
【0067】得られる「ライブラリー」をM.スメグマ
チスのスフエロプラスト中にトランスフエクシヨン(感
染)し、クローン化された挿入DNAを有するシヤトル
・ファスミドを含むプラークを選別する。続いて、組換
えM.スメグマチスのスフエロプラストを用いて培養し
うるミコバクテリア例えばBCGを高効率で感染させる
ことができる。結果として抗原をコードしたDNAがミ
コバクテリアのゲノムDNA中に導入され、そこでそれ
が発現されることになろう。
チスのスフエロプラスト中にトランスフエクシヨン(感
染)し、クローン化された挿入DNAを有するシヤトル
・ファスミドを含むプラークを選別する。続いて、組換
えM.スメグマチスのスフエロプラストを用いて培養し
うるミコバクテリア例えばBCGを高効率で感染させる
ことができる。結果として抗原をコードしたDNAがミ
コバクテリアのゲノムDNA中に導入され、そこでそれ
が発現されることになろう。
【0068】ゲノムDNA中に組込まれた1つ又はそれ
以上の抗原をコードするDNAを含有するBCGの選択
は選択しうるマーカーを用いて行なうことができる。組
換えフアージでの感染によって導入された1つ又はそれ
以上の抗原をコードするDNAを含むBCGの1つの選
別法は、抗生物質耐性遺伝子である選択しうるマーカー
の使用に基づく。この場合ファスミドは例えばカナマシ
イン耐性、ビオマイシン耐性、チオストレプトン耐性、
ヒグロマイシン耐性、又はブレオマイシン耐性をコード
する遺伝子を含む。
以上の抗原をコードするDNAを含有するBCGの選択
は選択しうるマーカーを用いて行なうことができる。組
換えフアージでの感染によって導入された1つ又はそれ
以上の抗原をコードするDNAを含むBCGの1つの選
別法は、抗生物質耐性遺伝子である選択しうるマーカー
の使用に基づく。この場合ファスミドは例えばカナマシ
イン耐性、ビオマイシン耐性、チオストレプトン耐性、
ヒグロマイシン耐性、又はブレオマイシン耐性をコード
する遺伝子を含む。
【0069】問題のDNAを含むBCGを選択するため
に選別しうるマーカーを用いる第2の方法は、栄養要求
方策(即ち変異体の元の有機体が必要とないある栄養又
は物質を必要とする変異体微生体の使用に基づくもの)
である。この場合、変異を有するミコバクテリアを使用
し、消失した又は変性した機能をコードする遺伝子を
(抗原コードしたDNAも含む)シヤトル・ファスミド
中に導入する。即ち抗原をコードするDNAを含むミコ
バクテリアの選別は、シヤトル・ファスミドが成功裏に
導入されたミコバクテリアの、適当な媒体上で生育した
時に生き残る能力に基づく。
に選別しうるマーカーを用いる第2の方法は、栄養要求
方策(即ち変異体の元の有機体が必要とないある栄養又
は物質を必要とする変異体微生体の使用に基づくもの)
である。この場合、変異を有するミコバクテリアを使用
し、消失した又は変性した機能をコードする遺伝子を
(抗原コードしたDNAも含む)シヤトル・ファスミド
中に導入する。即ち抗原をコードするDNAを含むミコ
バクテリアの選別は、シヤトル・ファスミドが成功裏に
導入されたミコバクテリアの、適当な媒体上で生育した
時に生き残る能力に基づく。
【0070】例えば宿主変異体(例えばM.スメグマチ
ス、BCG)及び変異を補足する選別しうるマーカーを
含む系を使用することができる。そのような系はpyrF-
BCG変異体である宿主変異体及び抗原をコードするD
NAを(変異体)BCG中に導入するために用いたファ
スミドのシヤトル・ベクター中に存在する選別しうるマ
ーカー例えばpyrF+遺伝子を含むことができる。この場
合、ファスミドはコスミドDNA中に挿入された抗原を
コードするDNAの他に、pyrF+遺伝子を含む。即ちフ
ァスミドが感染によって導入されたBCG変異体は最小
媒体(minimalmedia)上での培養により選択することが
できる。別の方法は2‐デオキシグルコース耐性の変異
体を使用することである。この場合、ミコバクテリアの
グルコキナーゼ遺伝子がファスミド中にクローン化さ
れ、pyrFに対して上述したように選別に使用される。
ス、BCG)及び変異を補足する選別しうるマーカーを
含む系を使用することができる。そのような系はpyrF-
BCG変異体である宿主変異体及び抗原をコードするD
NAを(変異体)BCG中に導入するために用いたファ
スミドのシヤトル・ベクター中に存在する選別しうるマ
ーカー例えばpyrF+遺伝子を含むことができる。この場
合、ファスミドはコスミドDNA中に挿入された抗原を
コードするDNAの他に、pyrF+遺伝子を含む。即ちフ
ァスミドが感染によって導入されたBCG変異体は最小
媒体(minimalmedia)上での培養により選択することが
できる。別の方法は2‐デオキシグルコース耐性の変異
体を使用することである。この場合、ミコバクテリアの
グルコキナーゼ遺伝子がファスミド中にクローン化さ
れ、pyrFに対して上述したように選別に使用される。
【0071】この基準での選別は、抗原をコードするD
NAがゲノムDNA中に安定に組込まれ且つ杆菌によっ
て発現されるBCGをもたらすであろう。このために、
遺伝子の発現シグナル(例えばプロモーター、リボソー
ム結合部位)が外来の(抗原をコードする)DNAの上
流に含まれて、抗原をコードするDNAを含むBCG
(変性BCG)が、この変性BCGを投与した宿主に免
疫応答を誘導するのに十分な程度でそれを発現すること
を可能にする。
NAがゲノムDNA中に安定に組込まれ且つ杆菌によっ
て発現されるBCGをもたらすであろう。このために、
遺伝子の発現シグナル(例えばプロモーター、リボソー
ム結合部位)が外来の(抗原をコードする)DNAの上
流に含まれて、抗原をコードするDNAを含むBCG
(変性BCG)が、この変性BCGを投与した宿主に免
疫応答を誘導するのに十分な程度でそれを発現すること
を可能にする。
【0072】モノクローナル抗体を用いることにより、
1つ又はそれ以上の抗原をコードするDNAを含むBC
Gを選別することも可能である。この場合、モノクロー
ナル抗体が有効である抗原(例えばM.レプラエ又は結
核菌)の1つ又はそれ以上のエピトープをコードする遺
伝子又は遺伝子フラグメントをミコバクテリア中に導入
する。そのようなモノクローナル抗体は、これらのエピ
トープの1つ又はそれ以上をコードする遺伝子(単数又
は複数)を含む組換えBCGを選別するために使用され
る。この方法で導入された抗原遺伝子はプロモーター・
シーケンス及び他の調節シーケンスを含む。結果とし
て、遺伝子工学の技術により、(例えば他の抗原をコー
ドする)更なるシリーズをフレーム(frame)中に付加
することができ、斯くして1つの抗原に対するモノクロ
ーナル抗体によって同定される組換えBCGがそのよう
に導入された他の外来の抗原をコードするDNAも発現
するであろう。
1つ又はそれ以上の抗原をコードするDNAを含むBC
Gを選別することも可能である。この場合、モノクロー
ナル抗体が有効である抗原(例えばM.レプラエ又は結
核菌)の1つ又はそれ以上のエピトープをコードする遺
伝子又は遺伝子フラグメントをミコバクテリア中に導入
する。そのようなモノクローナル抗体は、これらのエピ
トープの1つ又はそれ以上をコードする遺伝子(単数又
は複数)を含む組換えBCGを選別するために使用され
る。この方法で導入された抗原遺伝子はプロモーター・
シーケンス及び他の調節シーケンスを含む。結果とし
て、遺伝子工学の技術により、(例えば他の抗原をコー
ドする)更なるシリーズをフレーム(frame)中に付加
することができ、斯くして1つの抗原に対するモノクロ
ーナル抗体によって同定される組換えBCGがそのよう
に導入された他の外来の抗原をコードするDNAも発現
するであろう。
【0073】抗原をコードするDNAを培養しうるミコ
バクテリア中に導入するためにプラスミドを利用し且つ
DNAのエピソーム(即ち染色体外性)発現をもたらす
平行的な方策も、ワクチン・ビヒクルを製造するために
使用しうる。
バクテリア中に導入するためにプラスミドを利用し且つ
DNAのエピソーム(即ち染色体外性)発現をもたらす
平行的な方策も、ワクチン・ビヒクルを製造するために
使用しうる。
【0074】この場合、抗原をコードするDNAを含む
細胞を選別することを可能にする選別しうるマーカーが
必要とされる。選別しうるマーカーは例えば抗生物質耐
性をコードする遺伝子又は栄養要求性変異体において消
失しているものを補う遺伝子であつてよい。例えばカナ
マイシン耐性、ビオマイシン耐性、チオストレプトン耐
性、ニグロマイシン耐性又はブレオマイシン耐性をコー
ドする遺伝子はプラスミド中に導入することができる。
栄養要求性の方策においては、栄養要求性ミコバクテリ
ア変異体(例えばpyr-F)変異体を単離し、対応す
る野生型(非変異体)ミコバクテリア中に存在する遺伝
子をプラスミド中に導入する。pyr-F変異体のほか
に、グルコキナーゼ遺伝子に欠陥をもつデオキシグルコ
ース変異体、並びに他の生合成過程における変異(例え
ばアミノ酸生合成、ビタミン生合成及び炭水化物代謝例
えばアラビノース及びガラクトース代謝における変異)
をもつデオキシグルコース変異体を単離することが可能
である。
細胞を選別することを可能にする選別しうるマーカーが
必要とされる。選別しうるマーカーは例えば抗生物質耐
性をコードする遺伝子又は栄養要求性変異体において消
失しているものを補う遺伝子であつてよい。例えばカナ
マイシン耐性、ビオマイシン耐性、チオストレプトン耐
性、ニグロマイシン耐性又はブレオマイシン耐性をコー
ドする遺伝子はプラスミド中に導入することができる。
栄養要求性の方策においては、栄養要求性ミコバクテリ
ア変異体(例えばpyr-F)変異体を単離し、対応す
る野生型(非変異体)ミコバクテリア中に存在する遺伝
子をプラスミド中に導入する。pyr-F変異体のほか
に、グルコキナーゼ遺伝子に欠陥をもつデオキシグルコ
ース変異体、並びに他の生合成過程における変異(例え
ばアミノ酸生合成、ビタミン生合成及び炭水化物代謝例
えばアラビノース及びガラクトース代謝における変異)
をもつデオキシグルコース変異体を単離することが可能
である。
【0075】いずれの方法においても、ミコバクテリア
変異体が選別され、そして変異を相補する遺伝子を、問
題の抗原をコードするDNAも含むプラスミド・ベクタ
ー中に導入する。抗原をコードするDNAが成功裏に導
入されたミコバクテリア変異体は、適当に選択した媒体
(例えば耐性が付与される抗生物質を含む媒体、用いる
変異体に影響される生合成過程に含まれる栄養を含む又
は欠く媒体)上で培養することにより同定しうる(選別
できる)であろう。
変異体が選別され、そして変異を相補する遺伝子を、問
題の抗原をコードするDNAも含むプラスミド・ベクタ
ー中に導入する。抗原をコードするDNAが成功裏に導
入されたミコバクテリア変異体は、適当に選択した媒体
(例えば耐性が付与される抗生物質を含む媒体、用いる
変異体に影響される生合成過程に含まれる栄養を含む又
は欠く媒体)上で培養することにより同定しうる(選別
できる)であろう。
【0076】抗原をコードするDNAを、組換えミコバ
クテリアのワクチン・ビヒクル中に導入するのに有用な
プラスミドの他の成分は、その存在がプラスミドを自律
的に(染色体外的に)複製される場合の主要な決定因子
である自律的に複製するシーケンス(例えばレプリコ
ン)である。これらのシーケンスは例えばプラスミド・
レプリコン、ミコバクテリオフアージのグメント又は染
色体複製起源のセグメントを含むことができる。
クテリアのワクチン・ビヒクル中に導入するのに有用な
プラスミドの他の成分は、その存在がプラスミドを自律
的に(染色体外的に)複製される場合の主要な決定因子
である自律的に複製するシーケンス(例えばレプリコ
ン)である。これらのシーケンスは例えばプラスミド・
レプリコン、ミコバクテリオフアージのグメント又は染
色体複製起源のセグメントを含むことができる。
【0077】シヤトル・ファスミドphAE1のデザイ
ンはこれらの因子のいくつかを含む。例えば大腸菌コス
ミドpHC79の、ミコバクテリオフアージTM4中へ
の導入は、大腸菌プラスミドのレプリコン起源及び選択
しうるアンピシリン遺伝子、並びにバクテリオフアージ
のラムダ付着端(COS)シーケンス及び独特なEco
RI部位を提供することを可能にした。TM4フアージ
内にEcoRI部位は存在しない;phAE1内の独特
なEcoRI部位は外来の遺伝子をファスミドへ導入す
るために使用することができる。実施例4に記述するよ
うに、Tn903からのアミノグリコシドホスホトラン
スフエラーゼ(aph)遺伝子をコードする1.6kb
のEcoRIフラグメントはこのコスミドをクローン化
する方法によりphAE1中にクローン化した。
ンはこれらの因子のいくつかを含む。例えば大腸菌コス
ミドpHC79の、ミコバクテリオフアージTM4中へ
の導入は、大腸菌プラスミドのレプリコン起源及び選択
しうるアンピシリン遺伝子、並びにバクテリオフアージ
のラムダ付着端(COS)シーケンス及び独特なEco
RI部位を提供することを可能にした。TM4フアージ
内にEcoRI部位は存在しない;phAE1内の独特
なEcoRI部位は外来の遺伝子をファスミドへ導入す
るために使用することができる。実施例4に記述するよ
うに、Tn903からのアミノグリコシドホスホトラン
スフエラーゼ(aph)遺伝子をコードする1.6kb
のEcoRIフラグメントはこのコスミドをクローン化
する方法によりphAE1中にクローン化した。
【0078】抗原をコードするDNAを、ワクチン・ビ
ヒクルとして使用すべき培養しうるミコバクテリア例え
ばBCG又はM.スメグマチス中に効果的に導入するい
くつかの有用な方法がある。問題の抗原をコードするA
NA、選別しうるマーカー及び自律的に複製するシーケ
ンスを含むプラスミドの場合、ミコバクテリア中への効
果的な導入に対して、原形質体融合が使用できる。この
場合、大腸菌又はクローン化されたプラスミドを有する
ストレプトマイシスを、公知の技術を用いることによ
り、ミコバクテリアのスフエロプラストと融合させる。
この方法を用いることにより、外来の(抗原をコードす
る)DNAをミコバクテリアに転写することができる。
他にプラスミドDNAを含み且つ染色体DNAを本質的
に含まない大腸菌ミニ細胞はミニ細胞の原形質体融合を
行なうのに使用することができる。
ヒクルとして使用すべき培養しうるミコバクテリア例え
ばBCG又はM.スメグマチス中に効果的に導入するい
くつかの有用な方法がある。問題の抗原をコードするA
NA、選別しうるマーカー及び自律的に複製するシーケ
ンスを含むプラスミドの場合、ミコバクテリア中への効
果的な導入に対して、原形質体融合が使用できる。この
場合、大腸菌又はクローン化されたプラスミドを有する
ストレプトマイシスを、公知の技術を用いることによ
り、ミコバクテリアのスフエロプラストと融合させる。
この方法を用いることにより、外来の(抗原をコードす
る)DNAをミコバクテリアに転写することができる。
他にプラスミドDNAを含み且つ染色体DNAを本質的
に含まない大腸菌ミニ細胞はミニ細胞の原形質体融合を
行なうのに使用することができる。
【0079】別に、外来のDNAがミコバクテリア中に
効果的に移行させうるならば、自律的に複製するシーケ
ンスは必ずしも必要でなく、その代りに外来の(例えば
抗原をコードする)DNAがミコバクテリアの染色体中
に組込める。これは例えばミニ細胞の原形質体融合を用
いて達成することができる。この場合、抗生物質耐性遺
伝子又は染色体変異であつてよいミコバクテリアに対す
る選別しうるマーカーは大腸菌コスミド中にクローン化
できる。また外来DNAの染色体中への効果的な取込み
を行なわせるDNAは大腸菌のコスミド中にも存在する
であろう。例えば、M.レプラエにおいて、組換えと関
連するように見える反復シーケンスが起こる;対応する
シーケンスはBCG及びM.スメグマチス中で同定され
且つそれから単離し、(選択しうるマーカーと一緒に)
大腸菌コスミド中に導入でき、高度の組換えがもたらさ
れる。
効果的に移行させうるならば、自律的に複製するシーケ
ンスは必ずしも必要でなく、その代りに外来の(例えば
抗原をコードする)DNAがミコバクテリアの染色体中
に組込める。これは例えばミニ細胞の原形質体融合を用
いて達成することができる。この場合、抗生物質耐性遺
伝子又は染色体変異であつてよいミコバクテリアに対す
る選別しうるマーカーは大腸菌コスミド中にクローン化
できる。また外来DNAの染色体中への効果的な取込み
を行なわせるDNAは大腸菌のコスミド中にも存在する
であろう。例えば、M.レプラエにおいて、組換えと関
連するように見える反復シーケンスが起こる;対応する
シーケンスはBCG及びM.スメグマチス中で同定され
且つそれから単離し、(選択しうるマーカーと一緒に)
大腸菌コスミド中に導入でき、高度の組換えがもたらさ
れる。
【0080】問題の(1つ又はそれ以上の抗原をコード
する)遺伝子(単数又は複数)[例えば大腸菌レプリコ
ン、組換えと関連したミコバクテリアの染色体DNAの
セグメント(リコンビノゲニツク(recombinogenic)シー
ケンス)及び2つの選別しうるマーカー、即ち大腸菌に
おいてマーカーとして役立つもの及びミコバクテリアに
おいてマーカーとして役立つものを含む]は、記述した
構築物中に導入することができる。次いで遺伝子をミク
ロバクテリアの染色体DNA例えばBCG又はM.スメ
グマチスの染色体DNA中に組込みうる。問題の遺伝子
がこの方法でM.スメグマチスに組込めるならば、それ
は一般的な形質導入フアージを用いることによつてBC
G中に移動させることもできる。この場合、他の構築物
成分のほかに、2つのリコミノゲニツク・シーケンス、
即ちM.スメグマチスからのもの及びBCGからのもの
を含むことが好適である。
する)遺伝子(単数又は複数)[例えば大腸菌レプリコ
ン、組換えと関連したミコバクテリアの染色体DNAの
セグメント(リコンビノゲニツク(recombinogenic)シー
ケンス)及び2つの選別しうるマーカー、即ち大腸菌に
おいてマーカーとして役立つもの及びミコバクテリアに
おいてマーカーとして役立つものを含む]は、記述した
構築物中に導入することができる。次いで遺伝子をミク
ロバクテリアの染色体DNA例えばBCG又はM.スメ
グマチスの染色体DNA中に組込みうる。問題の遺伝子
がこの方法でM.スメグマチスに組込めるならば、それ
は一般的な形質導入フアージを用いることによつてBC
G中に移動させることもできる。この場合、他の構築物
成分のほかに、2つのリコミノゲニツク・シーケンス、
即ちM.スメグマチスからのもの及びBCGからのもの
を含むことが好適である。
【0081】ワクチンの構築(construction) 本発明を用いることにより、ハンセン病に対する免疫化
に有用な組換えミコバクテリアのワクチン・ビヒクルを
構築することが可能である。ミコバクテリア例えばBC
Gの異常なアジユバント活性が故に、そのようなワクチ
ンは特に長期性又は持久性の細胞介在免疫性を形成させ
るのに有効であろう。ハンセン病寄生体M.レプラエの
蛋白質抗原をコードする遺伝子はヤング(Young)により
単離されており、本明細書に引用することによりその教
示が取り込まれる1986年7月31日付けの米国特許
願第892,095に詳細に記述されている。特に5つ
の免疫原蛋白質抗原(即ち分子量65kD、36kD、
28kD、18kD及び12kDの抗原)をコードする
遺伝子が単離されている。更に65kDの抗原に対して
遺伝子によりコードされた6つの異なるエピトープが定
義されている。これらのエピトープの少くとも1つは
M.レプラエに独特であることが示され、他のエピトー
プは他のミコバクテリアの65kD蛋白質を共有するこ
とが示された。
に有用な組換えミコバクテリアのワクチン・ビヒクルを
構築することが可能である。ミコバクテリア例えばBC
Gの異常なアジユバント活性が故に、そのようなワクチ
ンは特に長期性又は持久性の細胞介在免疫性を形成させ
るのに有効であろう。ハンセン病寄生体M.レプラエの
蛋白質抗原をコードする遺伝子はヤング(Young)により
単離されており、本明細書に引用することによりその教
示が取り込まれる1986年7月31日付けの米国特許
願第892,095に詳細に記述されている。特に5つ
の免疫原蛋白質抗原(即ち分子量65kD、36kD、
28kD、18kD及び12kDの抗原)をコードする
遺伝子が単離されている。更に65kDの抗原に対して
遺伝子によりコードされた6つの異なるエピトープが定
義されている。これらのエピトープの少くとも1つは
M.レプラエに独特であることが示され、他のエピトー
プは他のミコバクテリアの65kD蛋白質を共有するこ
とが示された。
【0082】本発明のシヤトル・ベクターを用いること
により、上述した及び次の実施例の方法に従つて、M.
レプラエ蛋白質抗原をコードする遺伝子の1つ又はそれ
以上をBCG中に導入することが可能である。例えば6
5kDのM.レプラエ抗原をコードする遺伝子は、BC
G中に導入され、そのゲノムDNA中に安定に組混まれ
且つそれを投与する宿主に免疫応答を刺激する又は誘導
するのに十分な量で発現することができる。この方法
で、1つ又はそれ以上のM.レプラエの保護抗原を含有
し、寛容原性決定基を有さず、そして細胞介在免疫を誘
導するための優秀なアジユバントを有するという点で理
想に近いワクチンを構築することが可能である。
により、上述した及び次の実施例の方法に従つて、M.
レプラエ蛋白質抗原をコードする遺伝子の1つ又はそれ
以上をBCG中に導入することが可能である。例えば6
5kDのM.レプラエ抗原をコードする遺伝子は、BC
G中に導入され、そのゲノムDNA中に安定に組混まれ
且つそれを投与する宿主に免疫応答を刺激する又は誘導
するのに十分な量で発現することができる。この方法
で、1つ又はそれ以上のM.レプラエの保護抗原を含有
し、寛容原性決定基を有さず、そして細胞介在免疫を誘
導するための優秀なアジユバントを有するという点で理
想に近いワクチンを構築することが可能である。
【0083】同様にして、シヤトル・ベクターと本発明
の方法を用いることにより、結核に対して特異的な保護
を提供するワクチンを構築することができる。そのよう
なワクチンは、現在使用されているワクチンが無効果で
あることが証明されつつあるという前述した最近の発見
が故に、特に魅力的である。結核杆菌の結核菌の免疫原
性蛋白質抗原を暗号化する遺伝子は、1987年2月2
日付けのロバート(Robert)N.ハツソン(Husson)及びリ
チヤード(Richard)A.ヤングによる「結核菌の蛋白質
抗原をコードする遺伝子及びそれに対する使用法」とい
う関連米国特許願第10,007号並びにメバートN.
ハツソン、リチヤードA.ヤング、及びトーマス(Thoma
s)M.シンニツク(Shinnick)による「結核菌の蛋白質抗
原をコードする遺伝子及びそれに対する使用法」という
一連の関連特許願(1988年2月10日付けの速達法
によつて申請された代理人処理番号第WHI86−06
A号)に記述されている。ここにこれらの教示は本明細
書に引用することにより取り込まれる。
の方法を用いることにより、結核に対して特異的な保護
を提供するワクチンを構築することができる。そのよう
なワクチンは、現在使用されているワクチンが無効果で
あることが証明されつつあるという前述した最近の発見
が故に、特に魅力的である。結核杆菌の結核菌の免疫原
性蛋白質抗原を暗号化する遺伝子は、1987年2月2
日付けのロバート(Robert)N.ハツソン(Husson)及びリ
チヤード(Richard)A.ヤングによる「結核菌の蛋白質
抗原をコードする遺伝子及びそれに対する使用法」とい
う関連米国特許願第10,007号並びにメバートN.
ハツソン、リチヤードA.ヤング、及びトーマス(Thoma
s)M.シンニツク(Shinnick)による「結核菌の蛋白質抗
原をコードする遺伝子及びそれに対する使用法」という
一連の関連特許願(1988年2月10日付けの速達法
によつて申請された代理人処理番号第WHI86−06
A号)に記述されている。ここにこれらの教示は本明細
書に引用することにより取り込まれる。
【0084】この場合、結核菌の免疫原性蛋白質抗原を
コードする遺伝子を上述した如くシヤトル・ベクターに
よりBCG中に導入する。それぞれ蛋白質抗原をコード
する1つよりも多い結核菌遺伝子をBCG中に導入する
ことも可能である。例えば、分子量12kD、14k
D、19kD、65kD及び71kDの免疫原性結核菌
をコードする遺伝子或いはこれらの遺伝子の2つ又はそ
れ以上の組合せをBCG中に挿入し、ゲノムDNA中に
安定に組込み、且つ発現することができる。この結果は
結核菌に対する免疫化に特異的であり且つ杆菌に対する
長期の免疫性を誘導するワクチンである。
コードする遺伝子を上述した如くシヤトル・ベクターに
よりBCG中に導入する。それぞれ蛋白質抗原をコード
する1つよりも多い結核菌遺伝子をBCG中に導入する
ことも可能である。例えば、分子量12kD、14k
D、19kD、65kD及び71kDの免疫原性結核菌
をコードする遺伝子或いはこれらの遺伝子の2つ又はそ
れ以上の組合せをBCG中に挿入し、ゲノムDNA中に
安定に組込み、且つ発現することができる。この結果は
結核菌に対する免疫化に特異的であり且つ杆菌に対する
長期の免疫性を誘導するワクチンである。
【0085】本発明の方法を用いることにより、多目的
又は多機能性ワクチン(即ちそれぞれ異なる蛋白質又は
毒素に対する蛋白質抗原をコードする1つよりも多い遺
伝子を含む外来のDNAを含有し且つこれを発現する単
一のワクチン・ビヒクル)を構築することも可能であ
る。例えば上述したシヤトル・ベクター・ファスミドを
用いることにより、M.レプラエに対する蛋白質抗原を
コードする遺伝子、リーシユマニアに対する蛋白質抗原
をコードする遺伝子、及びマラリアに対する蛋白質抗原
をコードする遺伝子をBCG中に導入することも可能で
ある。この多機能ワクチンの投与は、各抗原に対する免
疫応答を刺激し、ハンセン病、結核、リーシユマニア、
及びマラリアに対する長期の保護を提供する。
又は多機能性ワクチン(即ちそれぞれ異なる蛋白質又は
毒素に対する蛋白質抗原をコードする1つよりも多い遺
伝子を含む外来のDNAを含有し且つこれを発現する単
一のワクチン・ビヒクル)を構築することも可能であ
る。例えば上述したシヤトル・ベクター・ファスミドを
用いることにより、M.レプラエに対する蛋白質抗原を
コードする遺伝子、リーシユマニアに対する蛋白質抗原
をコードする遺伝子、及びマラリアに対する蛋白質抗原
をコードする遺伝子をBCG中に導入することも可能で
ある。この多機能ワクチンの投与は、各抗原に対する免
疫応答を刺激し、ハンセン病、結核、リーシユマニア、
及びマラリアに対する長期の保護を提供する。
【0086】
【実施例】今や次の実施例によつて本発明を例示する
が、実施例はいずれの具合いにも本発明を制限するもの
と考えるべきでない。
が、実施例はいずれの具合いにも本発明を制限するもの
と考えるべきでない。
【0087】実施例1 M.スメグマチスのスフエロプラストの、ミコバクテリ
オフアージD29DNAとのトランスフエクシヨン M.スメグマチス種mc26のスフエロプラストを次の方
法に従って準備した。mc26はATCC607号のM.
スメグマチス原培養物から単離された主にコロニー型で
ある単一コロニー単離物である。これは再生媒体上で橙
色のの粗いコロニーを形成した。ホプウツドら、ストレ
プトマイシスの遺伝子的取り扱い−実験室マニユアル、
ジヨン・インネス基金(The John Innes Foundation, No
rwich, England)(1985)。
オフアージD29DNAとのトランスフエクシヨン M.スメグマチス種mc26のスフエロプラストを次の方
法に従って準備した。mc26はATCC607号のM.
スメグマチス原培養物から単離された主にコロニー型で
ある単一コロニー単離物である。これは再生媒体上で橙
色のの粗いコロニーを形成した。ホプウツドら、ストレ
プトマイシスの遺伝子的取り扱い−実験室マニユアル、
ジヨン・インネス基金(The John Innes Foundation, No
rwich, England)(1985)。
【0088】M.スメグマチスに対してウドウ(Udou)ら
の記述するスフエロプラスト調製物に対する媒体を用い
ることにより、ストレプトマイセスに関してM.スメグ
マチスのスフエロプラストを調製した。ウドウ、T.
ら、ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー、151、1
035〜1039(1982)。mc26細胞を、25
0mlのバツフルド(baffled)フラスコ中において37℃
において適度に振とうしながら、1%グルコース及び
0.2%ツウイーン80を含むトリプシン大豆汁40ml
中でA600=0.2まで生長させた。この時点で20%グ
リシン溶液を最終濃度1%まで添加した。次いで、細胞
を更に16時間培養し、5000×gで10分間遠心分
離することによって室温下に収穫した。ペレツトを1
0.3%スクローズ10mlで2回洗浄し、次いでリソザ
イム溶液2mg/mlを含む原形質体(p)緩衝液中に再懸
濁した。37℃で2時間の培養後、p緩衝液5mlを添加
し、スフエロプラストを3000×gで7分間遠心分離
することによってペレツトとした。このペレツトをp緩
衝液10ml中に再懸濁させ、3時間以内に使用した。
の記述するスフエロプラスト調製物に対する媒体を用い
ることにより、ストレプトマイセスに関してM.スメグ
マチスのスフエロプラストを調製した。ウドウ、T.
ら、ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー、151、1
035〜1039(1982)。mc26細胞を、25
0mlのバツフルド(baffled)フラスコ中において37℃
において適度に振とうしながら、1%グルコース及び
0.2%ツウイーン80を含むトリプシン大豆汁40ml
中でA600=0.2まで生長させた。この時点で20%グ
リシン溶液を最終濃度1%まで添加した。次いで、細胞
を更に16時間培養し、5000×gで10分間遠心分
離することによって室温下に収穫した。ペレツトを1
0.3%スクローズ10mlで2回洗浄し、次いでリソザ
イム溶液2mg/mlを含む原形質体(p)緩衝液中に再懸
濁した。37℃で2時間の培養後、p緩衝液5mlを添加
し、スフエロプラストを3000×gで7分間遠心分離
することによってペレツトとした。このペレツトをp緩
衝液10ml中に再懸濁させ、3時間以内に使用した。
【0089】mc2−11は、108個の細胞を3×10
8個のD29プラーク形成単位と混合し且つトリプシン
大豆寒天プレートで処理した時、ATCC607号の
M.スメグマチス原培養物の自然によるD29耐性単離
物として単離された。D29耐性コロニーは10-7の頻
度で起った。
8個のD29プラーク形成単位と混合し且つトリプシン
大豆寒天プレートで処理した時、ATCC607号の
M.スメグマチス原培養物の自然によるD29耐性単離
物として単離された。D29耐性コロニーは10-7の頻
度で起った。
【0090】mc26スフエロプラストをD29DNA
1ugと混合した;得られた混合物の1/10を、0.5M
スクローズの有無下にトリプシン大豆寒天プレートで処
理した。次いでこれに、108個のmc26細胞を含む適
当な軟質寒天を上塗りした。DNアーゼI(シグマ)を
50ug/mlの最終濃度でD29DNAに添加すること
によってDNアーゼ処理を行なった。
1ugと混合した;得られた混合物の1/10を、0.5M
スクローズの有無下にトリプシン大豆寒天プレートで処
理した。次いでこれに、108個のmc26細胞を含む適
当な軟質寒天を上塗りした。DNアーゼI(シグマ)を
50ug/mlの最終濃度でD29DNAに添加すること
によってDNアーゼ処理を行なった。
【0091】同一の方法でmc211スフエロプラスト
の等量を用いたが、続いてmc66細胞を上塗りしてプ
ラーク形成単位(pfu)を評価した。
の等量を用いたが、続いてmc66細胞を上塗りしてプ
ラーク形成単位(pfu)を評価した。
【0092】フアージ・プレート原料:D29のプレー
ト溶解物を2mM CaCl2を含有するトリプシン大豆
寒天媒体上で準備した。バツフルド・フラスコ中37℃
において、ADC濃厚物を含むミドルブルーク(Middleb
rook)7H9汁中で中対数増殖期まで生長させたM.ス
メグマチスを、MP緩衝液(10mMトリス−HCl、p
H7.6−10mM MgCl2−100mMNaCl−2m
M CaCl2)で希釈したフアージと混合し、プレート
が集密的になるまで37℃下に36時間培養した。フア
ージをMP緩衝液で収穫し、次いで2回のCsCl 平衡
グラジエントで、続いてMP緩衝液に対する強力な透析
により精製した。EDTAを最終濃度50mMまで添加
し且つプロテイナーゼK100ug/mlで55℃下に2
4時間処理し、続いてフエノール−クロロホルム抽出及
びTE緩衝液に対する強力な透析を行なうことによりD
NAをフアージから抽出した。
ト溶解物を2mM CaCl2を含有するトリプシン大豆
寒天媒体上で準備した。バツフルド・フラスコ中37℃
において、ADC濃厚物を含むミドルブルーク(Middleb
rook)7H9汁中で中対数増殖期まで生長させたM.ス
メグマチスを、MP緩衝液(10mMトリス−HCl、p
H7.6−10mM MgCl2−100mMNaCl−2m
M CaCl2)で希釈したフアージと混合し、プレート
が集密的になるまで37℃下に36時間培養した。フア
ージをMP緩衝液で収穫し、次いで2回のCsCl 平衡
グラジエントで、続いてMP緩衝液に対する強力な透析
により精製した。EDTAを最終濃度50mMまで添加
し且つプロテイナーゼK100ug/mlで55℃下に2
4時間処理し、続いてフエノール−クロロホルム抽出及
びTE緩衝液に対する強力な透析を行なうことによりD
NAをフアージから抽出した。
【0093】トランスフエクシヨン:各トランスフエク
シヨンに対して、スフエロプラスト懸濁液2.5mlを1
5mlのコニカル・ポリスチレン管中でペレットにした。
上澄流体を注意深く傾斜し、スフエロプラストを緩衝液
の残留滴中に再懸濁させた。10ugよりも少い全容量
中DNA1ugを添加した後、p緩衝液中で準備した2
5%PEG−1000[J.T.ベーカー・ケミカル社
(J.T.Baker Chemical Co., Ohila, PA)]溶液0.5
mを混合した。3分以内にp緩衝液を混合物に添加し、
スフエロプラストを上述の如くペレットにした。上澄液
を注意深く除去した後、ペレットをp緩衝液1m中に再
懸濁させ、試料を0.5Mスクロースの有無下にトリプ
シン大豆寒天に移した。次いでプレートに軟いトリプシ
ン大豆寒天3.0mlを上塗りし、37℃で培養した。プ
ラークを培養24時間後に数えた。
シヨンに対して、スフエロプラスト懸濁液2.5mlを1
5mlのコニカル・ポリスチレン管中でペレットにした。
上澄流体を注意深く傾斜し、スフエロプラストを緩衝液
の残留滴中に再懸濁させた。10ugよりも少い全容量
中DNA1ugを添加した後、p緩衝液中で準備した2
5%PEG−1000[J.T.ベーカー・ケミカル社
(J.T.Baker Chemical Co., Ohila, PA)]溶液0.5
mを混合した。3分以内にp緩衝液を混合物に添加し、
スフエロプラストを上述の如くペレットにした。上澄液
を注意深く除去した後、ペレットをp緩衝液1m中に再
懸濁させ、試料を0.5Mスクロースの有無下にトリプ
シン大豆寒天に移した。次いでプレートに軟いトリプシ
ン大豆寒天3.0mlを上塗りし、37℃で培養した。プ
ラークを培養24時間後に数えた。
【0094】実施例2 シヤトル・ファスミドphAE1の構築 TM4フアージDNAを250ug/mlの濃度で連結し
た。一部を、連続的に希釈したSau 3Aで部分的に消
化した;この方法で(アガロース・ゲル電気泳動で分析
して)平均長さ30〜50kbのフラグメントを得た。
これらのフラグメントを、TM4フラグメントとBamH
Iで開裂したpHC79とのモル比1:2において連結
した。この連結の一部分を試験管内パツケージ混合物
[ギガパツク・プラス(Gigapack plus, Stratagene, Sa
n Diego, CA)]でパツケージし、続いてER1381[hs
dR mcrA+ marB+、E.ラリー(Raleigh)]中に形質導
入した。これは、アンピシリンを50ug/mlで含有す
るL寒天プレートで処理した時TM4DNA挿入物ug
当り106個のアンピシリン・コロニーを生成した。
た。一部を、連続的に希釈したSau 3Aで部分的に消
化した;この方法で(アガロース・ゲル電気泳動で分析
して)平均長さ30〜50kbのフラグメントを得た。
これらのフラグメントを、TM4フラグメントとBamH
Iで開裂したpHC79とのモル比1:2において連結
した。この連結の一部分を試験管内パツケージ混合物
[ギガパツク・プラス(Gigapack plus, Stratagene, Sa
n Diego, CA)]でパツケージし、続いてER1381[hs
dR mcrA+ marB+、E.ラリー(Raleigh)]中に形質導
入した。これは、アンピシリンを50ug/mlで含有す
るL寒天プレートで処理した時TM4DNA挿入物ug
当り106個のアンピシリン・コロニーを生成した。
【0095】Lブロス中コロニーをガラス・スプレツダ
ーでホモゲナイズ(homogenize)することにより40,0
00個のアンピシリン耐性コロニーの貯蔵物を準備し
た。クローンの貯蔵物から、アルカリ性SDS抽出、続
くフエノール−クロロホルム抽出及びエタノールでの濃
縮によりプラスミドを単離した。共有結合的に閉じたプ
ラスミドDNAを実施例1に記述したようにmc26の
スフエロプラスト中にトランスフエクシヨンした。ベン
トン(Benton)及びデービス(Davis)の手順並びにバイオ
トランス・ナイロン膜(ICN)を用いてプラーク・リ
フトを行なうことにより、プラークをpHc79の存在
に対して選別した。ベントン、W.D.及びR.W.デ
ービス、サイエンス(Science)、196、180〜18
2(1977)。この膜を32p−dcTPでニツク・ト
ランスレーシヨンしたpHc79DNAと交雑させ、オ
ートラジオグラフイーに供した。
ーでホモゲナイズ(homogenize)することにより40,0
00個のアンピシリン耐性コロニーの貯蔵物を準備し
た。クローンの貯蔵物から、アルカリ性SDS抽出、続
くフエノール−クロロホルム抽出及びエタノールでの濃
縮によりプラスミドを単離した。共有結合的に閉じたプ
ラスミドDNAを実施例1に記述したようにmc26の
スフエロプラスト中にトランスフエクシヨンした。ベン
トン(Benton)及びデービス(Davis)の手順並びにバイオ
トランス・ナイロン膜(ICN)を用いてプラーク・リ
フトを行なうことにより、プラークをpHc79の存在
に対して選別した。ベントン、W.D.及びR.W.デ
ービス、サイエンス(Science)、196、180〜18
2(1977)。この膜を32p−dcTPでニツク・ト
ランスレーシヨンしたpHc79DNAと交雑させ、オ
ートラジオグラフイーに供した。
【0096】実施例3 BCG及びM.スメグマチスへ
の、シヤトル・ファスミドphAE1の感染 ADC濃厚物[デイフコ(Difco)]及び0.5%ツウ
イーン80(シグマ)を含有するミドルブルーク7H9
汁(デイフコ)中において、BCG−グラクソ(W.ジ
ヨーンズ)を37℃下の放置培養で増殖した。108個
のBCG細胞を、補充したトツプ・ソフト(top soft)
の寒天と混合し且つOADS濃厚物(デイフコ)を補充
したツウイーン80(ギブコ)を含まないデユボス(D
ubos)寒天上に注ぐことによってBCG−グラクソ又は
mc26細胞のローン(lawn)を製造した。ジヨンズ
(Jones),W.D.Jr.,ツバークル(Tubercl
e),60,55〜58(1979)。4つのフアー
ジ、DS6A、TM4、phAE1、及び33Dを連続
的に希釈し、2つのローン上にスポツトをつけた。プレ
ートをBCG−グラクソ及びM.スメグマチスに対して
それぞれ14日及び2日で読みとった。
の、シヤトル・ファスミドphAE1の感染 ADC濃厚物[デイフコ(Difco)]及び0.5%ツウ
イーン80(シグマ)を含有するミドルブルーク7H9
汁(デイフコ)中において、BCG−グラクソ(W.ジ
ヨーンズ)を37℃下の放置培養で増殖した。108個
のBCG細胞を、補充したトツプ・ソフト(top soft)
の寒天と混合し且つOADS濃厚物(デイフコ)を補充
したツウイーン80(ギブコ)を含まないデユボス(D
ubos)寒天上に注ぐことによってBCG−グラクソ又は
mc26細胞のローン(lawn)を製造した。ジヨンズ
(Jones),W.D.Jr.,ツバークル(Tubercl
e),60,55〜58(1979)。4つのフアー
ジ、DS6A、TM4、phAE1、及び33Dを連続
的に希釈し、2つのローン上にスポツトをつけた。プレ
ートをBCG−グラクソ及びM.スメグマチスに対して
それぞれ14日及び2日で読みとった。
【0097】実施例4 アミノグリコシド・ホスホトラ
ンスフエラーゼ遺伝子のphAE1へのクローン化 Tn903からのアミノグリコシド・ホスホトランスフ
エラーゼ遺伝子(aph)をコードする1.6kbのE
coRIフラグメントを、コスミド・クローン化法を利
用してphAE1中にクローン化した。プラスミドph
AE1 DNAを大腸菌から単離し、EcoRIで切断
し、その1.6kbフラグメントをこれらの大きいDN
A分子に連結した。連結した生成物を試験管内でフアー
ジ・ラムダにパツケージし、大腸菌細胞にカナマイシン
耐性とアンピシリン耐性を形質導入した粒子を生成せし
めた。これらの大腸菌細胞からプラスミドDNAを単離
した。これはM.スメグマチスmc26の原形質体中に
トランスフエクシヨンした時プラーク形成単位を高頻度
で生ずることが示された。これは、更なるDNAの少く
とも1.6kbを、phAE1の独特なEcoRI部位
中にクローン化できることを示す。シヤトル・ファスミ
ドphAE2、即ちphAE1と同様の特性を有する
が、寸法でphAE1よりも2kb小さいシヤトル・ベ
クターを用いても同様の結果が得られた。この場合には
更なるDNAの少くとも3.6kbのクローン化が可能
なはずである。両方の場合、aph遺伝子の導入は、新
しいNruI部位の導入をもたらした。これは、更なる
フラグメントがクローン化でき且つシヤトル・ファスミ
ド中で安定に維持しうるという証明を提供する。斯くし
て、これらのベクターは更なる改変なしに、更なる遺伝
子をミコバクテリア中にクローン化するのに有用であ
る。
ンスフエラーゼ遺伝子のphAE1へのクローン化 Tn903からのアミノグリコシド・ホスホトランスフ
エラーゼ遺伝子(aph)をコードする1.6kbのE
coRIフラグメントを、コスミド・クローン化法を利
用してphAE1中にクローン化した。プラスミドph
AE1 DNAを大腸菌から単離し、EcoRIで切断
し、その1.6kbフラグメントをこれらの大きいDN
A分子に連結した。連結した生成物を試験管内でフアー
ジ・ラムダにパツケージし、大腸菌細胞にカナマイシン
耐性とアンピシリン耐性を形質導入した粒子を生成せし
めた。これらの大腸菌細胞からプラスミドDNAを単離
した。これはM.スメグマチスmc26の原形質体中に
トランスフエクシヨンした時プラーク形成単位を高頻度
で生ずることが示された。これは、更なるDNAの少く
とも1.6kbを、phAE1の独特なEcoRI部位
中にクローン化できることを示す。シヤトル・ファスミ
ドphAE2、即ちphAE1と同様の特性を有する
が、寸法でphAE1よりも2kb小さいシヤトル・ベ
クターを用いても同様の結果が得られた。この場合には
更なるDNAの少くとも3.6kbのクローン化が可能
なはずである。両方の場合、aph遺伝子の導入は、新
しいNruI部位の導入をもたらした。これは、更なる
フラグメントがクローン化でき且つシヤトル・ファスミ
ド中で安定に維持しうるという証明を提供する。斯くし
て、これらのベクターは更なる改変なしに、更なる遺伝
子をミコバクテリア中にクローン化するのに有用であ
る。
【0098】実施例5 シヤトル・ファスミドを用いる
ことによるミコバクテリア中の選別しうるマーカーの安
定な発現 TM4フアージに対して構築したものと同様の方法で、
フアージL1(ATCC27199号)からシヤトル・
ファスミドを構築した。S.ドケ、クマモト・メデイカ
ル・ジヤーナル(Kumamoto Medical Journal),3
4,1360〜1373(1960)。同定されたL1
−シヤトル・ファスミドのすべてはM.スメグマチスを
溶原化する能力を有する。L1はM.スメグマチスの染
色体物質中に組込まれ且つ安定な溶原(lysogen)を形
成することが示された。他のフアージ例えばL3(AT
CC27200号)、即ちプラスミドとして残るフアー
ジ(染色体外性)及びL5(ATCC27201号)も
シヤトル・ファスミドの構築に使用することができる。
結果は、これらのシヤトル・ファスミドがM.スメグマ
チスを溶原化するであろうということを示し、斯くして
外来のDNAを初めてミコバクテリアに安定に組込むこ
とを可能にした。大腸菌におけるTM4−シヤトル・フ
ァスミドに対して上述したように、phAE15と表示
されるL1−シヤトル・ファスミドの独特なEcoRI
部位にaph遺伝子をクローン化した。M.スメグマチ
ス細胞(mc26)を、カナマイシンを含むデユボス寒
天プレート上の寒天の表面に上塗りした。シヤトル・フ
ァスミドphAE15及びphAE19(クローンap
h遺伝子を有するphAE15)の希釈物を寒天ローン
上にスポツトした。プレートを37℃で5日間培養し
た。生長したコロニーはすべてが、aph遺伝子をクロ
ーン化したL1−シヤトル・プラスミドで溶原化した。
得られるシヤトル・ファスミドphAE19はM.スメ
グマチス細胞を溶原化することができた。得られる溶原
は、それらがカナマイシンに耐性であるからクローン化
されたaph遺伝子を発現した。更にこれらの溶原は、
カナマイシン耐性M.スメグマチス細胞の続く転写及び
溶原化時にカナマイシン耐性発現型も発現するミコバク
テリオフアージ粒子を生成した。これらのフアージの転
写は、溶原性状態[即ちスーパーインフエクシヨン(su
perinfection)に対する免疫]及びカナマイシン耐性を
一緒に形質導入する。M.スメグマチスを溶原化するた
めに使用されるフアージL1フアージはBCG上でプラ
ークを形成しない。しかしながらBCG上でプラークを
形成するL1及びシヤトル・ファスミドphAE19の
変種が単離された。これらは溶原性シヤトル・ファスミ
ドを用いることにより、BCG及び結核菌において異質
の遺伝子を導入し且つそれを安定に発現する能力に関し
て試験することができる。斯くしてこれらのフアージは
異質のDNAをM.スメグマチス中に安定に導入する能
力を有する。更にBCGを感染し且つ溶原化するであろ
う宿主範囲の変種(例えばphAE19)が単離され
た。これは問題のDNAを含有する組換えミコバクテリ
アを生成せしめることを可能にした。そのような組換え
ミコバクテリアはワクチンとして使用することができ
る。
ことによるミコバクテリア中の選別しうるマーカーの安
定な発現 TM4フアージに対して構築したものと同様の方法で、
フアージL1(ATCC27199号)からシヤトル・
ファスミドを構築した。S.ドケ、クマモト・メデイカ
ル・ジヤーナル(Kumamoto Medical Journal),3
4,1360〜1373(1960)。同定されたL1
−シヤトル・ファスミドのすべてはM.スメグマチスを
溶原化する能力を有する。L1はM.スメグマチスの染
色体物質中に組込まれ且つ安定な溶原(lysogen)を形
成することが示された。他のフアージ例えばL3(AT
CC27200号)、即ちプラスミドとして残るフアー
ジ(染色体外性)及びL5(ATCC27201号)も
シヤトル・ファスミドの構築に使用することができる。
結果は、これらのシヤトル・ファスミドがM.スメグマ
チスを溶原化するであろうということを示し、斯くして
外来のDNAを初めてミコバクテリアに安定に組込むこ
とを可能にした。大腸菌におけるTM4−シヤトル・フ
ァスミドに対して上述したように、phAE15と表示
されるL1−シヤトル・ファスミドの独特なEcoRI
部位にaph遺伝子をクローン化した。M.スメグマチ
ス細胞(mc26)を、カナマイシンを含むデユボス寒
天プレート上の寒天の表面に上塗りした。シヤトル・フ
ァスミドphAE15及びphAE19(クローンap
h遺伝子を有するphAE15)の希釈物を寒天ローン
上にスポツトした。プレートを37℃で5日間培養し
た。生長したコロニーはすべてが、aph遺伝子をクロ
ーン化したL1−シヤトル・プラスミドで溶原化した。
得られるシヤトル・ファスミドphAE19はM.スメ
グマチス細胞を溶原化することができた。得られる溶原
は、それらがカナマイシンに耐性であるからクローン化
されたaph遺伝子を発現した。更にこれらの溶原は、
カナマイシン耐性M.スメグマチス細胞の続く転写及び
溶原化時にカナマイシン耐性発現型も発現するミコバク
テリオフアージ粒子を生成した。これらのフアージの転
写は、溶原性状態[即ちスーパーインフエクシヨン(su
perinfection)に対する免疫]及びカナマイシン耐性を
一緒に形質導入する。M.スメグマチスを溶原化するた
めに使用されるフアージL1フアージはBCG上でプラ
ークを形成しない。しかしながらBCG上でプラークを
形成するL1及びシヤトル・ファスミドphAE19の
変種が単離された。これらは溶原性シヤトル・ファスミ
ドを用いることにより、BCG及び結核菌において異質
の遺伝子を導入し且つそれを安定に発現する能力に関し
て試験することができる。斯くしてこれらのフアージは
異質のDNAをM.スメグマチス中に安定に導入する能
力を有する。更にBCGを感染し且つ溶原化するであろ
う宿主範囲の変種(例えばphAE19)が単離され
た。これは問題のDNAを含有する組換えミコバクテリ
アを生成せしめることを可能にした。そのような組換え
ミコバクテリアはワクチンとして使用することができ
る。
【図1】ミコバクテリウム・スメグマチスのスフエロプ
ラストの、ミコバクテリオフアージD29DNAでのト
ランスフエクシヨンの結果生じる細胞集団の状態を示す
図面に代わる写真である。
ラストの、ミコバクテリオフアージD29DNAでのト
ランスフエクシヨンの結果生じる細胞集団の状態を示す
図面に代わる写真である。
【図2】シヤトル・ファスミドphAE1の製造の概略図
である。
である。
【図3】KpnIで消化されたミコバクテリオフアージT
M4DNA及びシヤトル・ファスミドphAE1DNA
の、エチジウム・ブロマイドで染色した0.7%アガロ
ースゲル(パネルA)及びpHC79をプローブとして
用いることによるファスミドphAE1のサザーン・ブロ
ット(Southern blot)分析(パネルB)結果を示す
図面に代わる写真である。
M4DNA及びシヤトル・ファスミドphAE1DNA
の、エチジウム・ブロマイドで染色した0.7%アガロ
ースゲル(パネルA)及びpHC79をプローブとして
用いることによるファスミドphAE1のサザーン・ブロ
ット(Southern blot)分析(パネルB)結果を示す
図面に代わる写真である。
【図4】phAE1のBCG上での複製を示す。これは、
他のミコバクテリア上でなくて結核菌及びBCG上での
プラーク(plaque)に対して公知のミコバクテリオフア
ージであるDS6A;M.スメグマチス上であってBC
Gでないプラークに対して公知のフアージ33D;及び
両種のプラークに対して公知のフアージTM4によるB
CGのグラクソ(Glaxo)ワクチン種の細胞溶解状態、
およびそれらの溶解物のコスミドDNAの存在を示すオ
ートラジオグティーの結果を示す図面に代わる写真、な
らびにファージ粒子の形態を示す図面に代わる電子顕微
鏡写真である。
他のミコバクテリア上でなくて結核菌及びBCG上での
プラーク(plaque)に対して公知のミコバクテリオフア
ージであるDS6A;M.スメグマチス上であってBC
Gでないプラークに対して公知のフアージ33D;及び
両種のプラークに対して公知のフアージTM4によるB
CGのグラクソ(Glaxo)ワクチン種の細胞溶解状態、
およびそれらの溶解物のコスミドDNAの存在を示すオ
ートラジオグティーの結果を示す図面に代わる写真、な
らびにファージ粒子の形態を示す図面に代わる電子顕微
鏡写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI //(C12N 15/09 C12R 1:32) (72)発明者 ウイリアム・アール・ジエイコブズ・ジユ ニア アメリカ合衆国ニユーヨーク州10462ブロ ンクス・ポールデイングアベニユー2031 (72)発明者 リチヤード・エイ・ヤング アメリカ合衆国マサチユセツツ州01890ウ インチエスター・サセツクスロード11
Claims (5)
- 【請求項1】 少くとも1つの蛋白質抗原をコードする
外来DNAを発現する培養しうる組換えミコバクテリア
を含んでなるワクチン。 - 【請求項2】 培養しうる組換えミコバクテリウムがミ
コバクテリウム・ボビス‐BCG、M.スメグマチス又
はその遺伝学的変種である請求項1記載のワクチン。 - 【請求項3】 適当な担体を更に含んでなる請求項1記
載のワクチン。 - 【請求項4】 哺乳動物宿主に、1つ又はそれ以上の病
原体のそれぞれに対する少くとも1つの蛋白質抗原をコ
ードする外来DNAが導入されている組換えバクテリウ
ムを投与することを含んでなる該宿主を該病原体に対し
て免疫化する方法。 - 【請求項5】 1つ又はそれ以上の病原体のそれぞれに
対する少くとも1つの蛋白質抗原をコードする外来DN
Aを、ミコバクテリウム・ボビス‐BCG中に導入する
ことを含んでなる哺乳動物宿主の該病原体に対する免疫
化のためのワクチンの作製法。
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