JPH11242029A - 固相会合ファクターの検出および測定 - Google Patents
固相会合ファクターの検出および測定Info
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- JPH11242029A JPH11242029A JP10360661A JP36066198A JPH11242029A JP H11242029 A JPH11242029 A JP H11242029A JP 10360661 A JP10360661 A JP 10360661A JP 36066198 A JP36066198 A JP 36066198A JP H11242029 A JPH11242029 A JP H11242029A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 同一の固相に多数会合した固相会合ファクタ
ーの検出または測定のための方法の提供。 【解決手段】 試料を、固相会合ファクターへの結合ア
フィニティーを有するリガンド少なくとも１個およびト
ランスミッターが固定化されているトランスミッター粒
子、および、上記固相会合ファクターへの結合アフィニ
ティーを有するリガンド少なくとも１個およびレシーバ
ーが固定化されているレシーバー粒子に接触させ、次い
で、トランスミッターとレシーバーが相互に十分近接し
た場合に生じるシグナルを測定する。特に、本発明は細
胞型決定または細胞活性化状態測定に用いることのでき
る細胞表面レセプターの検出に関する。即ち、現在まで
広く一般的に用いられているフローサイトメトリーをよ
り簡単な方法に置き換えることができる。
ーの検出または測定のための方法の提供。 【解決手段】 試料を、固相会合ファクターへの結合ア
フィニティーを有するリガンド少なくとも１個およびト
ランスミッターが固定化されているトランスミッター粒
子、および、上記固相会合ファクターへの結合アフィニ
ティーを有するリガンド少なくとも１個およびレシーバ
ーが固定化されているレシーバー粒子に接触させ、次い
で、トランスミッターとレシーバーが相互に十分近接し
た場合に生じるシグナルを測定する。特に、本発明は細
胞型決定または細胞活性化状態測定に用いることのでき
る細胞表面レセプターの検出に関する。即ち、現在まで
広く一般的に用いられているフローサイトメトリーをよ
り簡単な方法に置き換えることができる。
Description
【０００1】本発明は同一の固相に多数会合した固相会
合ファクター（Solid phase-associated factors）の検
出または測定のための方法に関する。本発明によれば、
試料を、固相会合ファクターへの結合アフィニティーを
有するリガンド少なくとも１個とトランスミッターが固
定化されているトランスミッター粒子、および、上記固
相会合ファクターへの結合アフィニティーを有するリガ
ンド少なくとも１個とレシーバーが固定化されているレ
シーバー粒子に接触させ、次いで、トランスミッターと
レシーバーが相互に十分接近した場合に生じるシグナル
を測定する。特に、本発明は細胞型の決定または細胞活
性化状態の測定に用いることのできる細胞の表面受容体
の検出に関する。即ち、現在まで広く一般的に用いられ
ているフローサイトメトリー（flow cytometry）をより
簡単な方法に置き換えることが可能である。
合ファクター（Solid phase-associated factors）の検
出または測定のための方法に関する。本発明によれば、
試料を、固相会合ファクターへの結合アフィニティーを
有するリガンド少なくとも１個とトランスミッターが固
定化されているトランスミッター粒子、および、上記固
相会合ファクターへの結合アフィニティーを有するリガ
ンド少なくとも１個とレシーバーが固定化されているレ
シーバー粒子に接触させ、次いで、トランスミッターと
レシーバーが相互に十分接近した場合に生じるシグナル
を測定する。特に、本発明は細胞型の決定または細胞活
性化状態の測定に用いることのできる細胞の表面受容体
の検出に関する。即ち、現在まで広く一般的に用いられ
ているフローサイトメトリー（flow cytometry）をより
簡単な方法に置き換えることが可能である。
【０００２】血液細胞、特に白血球の分画（顆粒球、単
球およびリンパ球）は診断において日常的に用いられて
いる重要な手段である。これは特に種々の細胞型が異な
る表面抗原、例えばインテグリンファミリーの膜蛋白を
特徴とするとことにあるものである（Hynes RO. Integr
ins: a family of cell surface receptors. Cell 198
7; 48: 549-554）。これらの膜蛋白の大部分はCD（クラ
スターデシグネーション）番号により示されている。膜
蛋白または細胞刺激後の表面上に発現されるか、または
細胞内小胞との表面との融合により分泌されうる。例え
ばセレクチングループの蛋白の場合である（Bevilacqua
MP and Nelson RM, Endothelial-Leukocyte adhesion
molecules ininflammation and metastasis. Thromb. H
aemost. 1993; 70: 152-154）。
球およびリンパ球）は診断において日常的に用いられて
いる重要な手段である。これは特に種々の細胞型が異な
る表面抗原、例えばインテグリンファミリーの膜蛋白を
特徴とするとことにあるものである（Hynes RO. Integr
ins: a family of cell surface receptors. Cell 198
7; 48: 549-554）。これらの膜蛋白の大部分はCD（クラ
スターデシグネーション）番号により示されている。膜
蛋白または細胞刺激後の表面上に発現されるか、または
細胞内小胞との表面との融合により分泌されうる。例え
ばセレクチングループの蛋白の場合である（Bevilacqua
MP and Nelson RM, Endothelial-Leukocyte adhesion
molecules ininflammation and metastasis. Thromb. H
aemost. 1993; 70: 152-154）。
【０００３】血小板の場合は、例えばＧＭＰ−１４０
（Ｐセレクチン；ＤＣ６２Ｐ）が活性化マーカーであ
る。更に、活性化状態においては、例えば、フォンビル
ブラント因子またはフィブリノーゲンに結合する糖蛋白
ＧＰ Ｉｂ／ＩｘまたはＧＰ IIｂ／IIIａの活性化血小
板複合体の場合のように、細胞受容体とリガンドとの特
徴的な複合体が形成される（例えばClemetson KJ. Bioc
hemistry of Platelet membrane glycoproteins, Prog.
Clin. Biol. Res. 1988; 283: 33-75参照）。活性化の
後、凝固因子または他のリン脂質結合蛋白（例えばアネ
キシンファミリーのもの）が結合することのできるホス
ファチジルセリン含有脂質膜も血小板上に発現される。
（Ｐセレクチン；ＤＣ６２Ｐ）が活性化マーカーであ
る。更に、活性化状態においては、例えば、フォンビル
ブラント因子またはフィブリノーゲンに結合する糖蛋白
ＧＰ Ｉｂ／ＩｘまたはＧＰ IIｂ／IIIａの活性化血小
板複合体の場合のように、細胞受容体とリガンドとの特
徴的な複合体が形成される（例えばClemetson KJ. Bioc
hemistry of Platelet membrane glycoproteins, Prog.
Clin. Biol. Res. 1988; 283: 33-75参照）。活性化の
後、凝固因子または他のリン脂質結合蛋白（例えばアネ
キシンファミリーのもの）が結合することのできるホス
ファチジルセリン含有脂質膜も血小板上に発現される。
【０００４】以前の方法では、これらの表面抗原に対す
る標識された抗体または他の標識された反応性のリガン
ド、例えばアネキシンを、血液に添加することによりホ
スファチジルセリン含有脂質膜を検出していた（Roemis
ch J等., Anticoagulant properties of placenta prot
ein 4 (annexin V); Thromb. Res. 1990; 60: 355-36
6）。次いでフローサイトメトリーにより細胞を大きさ
により分類し、その際平行して所定数と比率の１つ以上
の細胞型の上の標識の検出を介して同時に結論が引出さ
れる。使用される標識はそれ自体当業者には既知の物
質、特に化学ルミネセンス化合物（一般的検索のために
は例えばMichelson, A.D. and Barnard. M.R., US 5552
290参照）。
る標識された抗体または他の標識された反応性のリガン
ド、例えばアネキシンを、血液に添加することによりホ
スファチジルセリン含有脂質膜を検出していた（Roemis
ch J等., Anticoagulant properties of placenta prot
ein 4 (annexin V); Thromb. Res. 1990; 60: 355-36
6）。次いでフローサイトメトリーにより細胞を大きさ
により分類し、その際平行して所定数と比率の１つ以上
の細胞型の上の標識の検出を介して同時に結論が引出さ
れる。使用される標識はそれ自体当業者には既知の物
質、特に化学ルミネセンス化合物（一般的検索のために
は例えばMichelson, A.D. and Barnard. M.R., US 5552
290参照）。
【０００５】上記したフローサイトメトリーは確立され
た方法であるが、細胞の計数および／またはタイピング
という特定の目的のためにのみ使用可能であるという不
都合な点を有する。従って通常は特定の実験室において
確立されているのみである。しかしながら臨床的検討の
ためには細胞の分画およびその活性化状態をより広範に
利用することが望ましい。通常の使用のためには、一般
的な実験室の慣用の臨床化学分析装置または他の自動装
置への応用が必要である。従って本発明は均一な免疫化
学的方法において細胞表面抗原の測定を可能にする、こ
れまでの慣用のフローサイトメトリー法の代替法を得る
ことを目的とする。
た方法であるが、細胞の計数および／またはタイピング
という特定の目的のためにのみ使用可能であるという不
都合な点を有する。従って通常は特定の実験室において
確立されているのみである。しかしながら臨床的検討の
ためには細胞の分画およびその活性化状態をより広範に
利用することが望ましい。通常の使用のためには、一般
的な実験室の慣用の臨床化学分析装置または他の自動装
置への応用が必要である。従って本発明は均一な免疫化
学的方法において細胞表面抗原の測定を可能にする、こ
れまでの慣用のフローサイトメトリー法の代替法を得る
ことを目的とする。
【０００６】抗原および抗体の測定のための均一な免疫
化学的方法が既に多く知られており、例えば、FRATシス
テム（Syva)、EMITシステム、酵素チャンネル免疫検
定、蛍光エネルギー転移免疫検定（FETI、例えばTRASE'
Technology; CIS bio International社製）、酵素阻害
剤免疫検定（Hoffmann LaRoche, Abbott Laboratories
社製）または蛍光分極免疫検定（Dandlicker）が挙げら
れる。これらの均一な方法は分離および／または洗浄工
程を伴わずに実施できる方法を得るために開発された。
これらの方法の一部は感度が限られており、また複数の
エピトープを有する高分子量の分析対象には適していな
い。
化学的方法が既に多く知られており、例えば、FRATシス
テム（Syva)、EMITシステム、酵素チャンネル免疫検
定、蛍光エネルギー転移免疫検定（FETI、例えばTRASE'
Technology; CIS bio International社製）、酵素阻害
剤免疫検定（Hoffmann LaRoche, Abbott Laboratories
社製）または蛍光分極免疫検定（Dandlicker）が挙げら
れる。これらの均一な方法は分離および／または洗浄工
程を伴わずに実施できる方法を得るために開発された。
これらの方法の一部は感度が限られており、また複数の
エピトープを有する高分子量の分析対象には適していな
い。
【０００７】発現シンチレーション近接度検定（expres
sion scintillation proxymity assay (SPA))はHiram
E. Hart and Elaine B. Greenwald (Molecular Immunol
ogy 1979; 16: 265-267）により、特定の均一ラジオイ
ムノアッセイを説明するために導入された。この方法で
は、異なる２種の重合体ビーズを用い、これらに特定の
結合成分を担持させる。これらのビーズのうち第１のも
のには更に染料を担持させ、第２のビーズには更にトリ
チウムを担持させる。染料は3Ｈβ−放射（Augerelectr
ons社製）で刺激されると即座に光パルスを発する性質
を有する。しかしながら、この放射は水溶液中では数ミ
クロンの範囲しか有しないので、両方の種類のビーズを
含有する希薄懸濁液中では１種のビーズ数個のみが他の
種類のビーズに十分近接したものとして検知される。そ
の結果、全体で僅かな蛍光シグナルが生じるのみであ
る。しかしながら２種のビーズの特定の結合成分と反応
することのできる反応体の添加により、ビーズの凝集が
起こり、これにより多くの第１種ビーズ（トリチウムビ
ーズ）が第２種ビーズ（蛍光団ビーズ）の近接部に移送
され、これにより全体で高値のシグナルが生じるのであ
る。生じたシグナルはシンチレーションカウンターで検
知される。この方法を125ヨウ素標識特異的結合成分を
用いて更に開発した例が、Udenfriend, S. 等により報
告されている（Proc. Natl. Acad. Sci. 1985; 82: 867
2-8676）。
sion scintillation proxymity assay (SPA))はHiram
E. Hart and Elaine B. Greenwald (Molecular Immunol
ogy 1979; 16: 265-267）により、特定の均一ラジオイ
ムノアッセイを説明するために導入された。この方法で
は、異なる２種の重合体ビーズを用い、これらに特定の
結合成分を担持させる。これらのビーズのうち第１のも
のには更に染料を担持させ、第２のビーズには更にトリ
チウムを担持させる。染料は3Ｈβ−放射（Augerelectr
ons社製）で刺激されると即座に光パルスを発する性質
を有する。しかしながら、この放射は水溶液中では数ミ
クロンの範囲しか有しないので、両方の種類のビーズを
含有する希薄懸濁液中では１種のビーズ数個のみが他の
種類のビーズに十分近接したものとして検知される。そ
の結果、全体で僅かな蛍光シグナルが生じるのみであ
る。しかしながら２種のビーズの特定の結合成分と反応
することのできる反応体の添加により、ビーズの凝集が
起こり、これにより多くの第１種ビーズ（トリチウムビ
ーズ）が第２種ビーズ（蛍光団ビーズ）の近接部に移送
され、これにより全体で高値のシグナルが生じるのであ
る。生じたシグナルはシンチレーションカウンターで検
知される。この方法を125ヨウ素標識特異的結合成分を
用いて更に開発した例が、Udenfriend, S. 等により報
告されている（Proc. Natl. Acad. Sci. 1985; 82: 867
2-8676）。
【０００８】更に別の方法として発光酵素チャンネル免
疫検定（LOCI）が報告されている（EP-O-515194 A2; Ul
lman等., Proc. Natl. Acad. Sci. 1994; 91: 5426-543
0; Ullman等., Clinical Chemistry 1996; 42: 1518-15
26）。これにおいては、２種の粒子を使用し、うち１種
は光増感剤を含有し（増感剤ビーズ）、他方は化学ルミ
ネセンス成分を含有している（レセプタービーズ）。光
増感剤は１重項状態の酵素を発生させ、化学ルミネセン
ス成分が十分接近すればこれを活性化させる。活性化さ
れた化学ルミネセンス成分は光を発生し、これを測定シ
グナルとして検知することができる。Bystrak、 Ｓ等（A
nalytical Biochemistry 1995; 225: 127-134）は、単
層の小胞に結合する蛍光基質の一重項状態の酸素による
光酸化が起こる均一な方法を記載している。特異的結合
成分は小胞の表面に共有結合している。
疫検定（LOCI）が報告されている（EP-O-515194 A2; Ul
lman等., Proc. Natl. Acad. Sci. 1994; 91: 5426-543
0; Ullman等., Clinical Chemistry 1996; 42: 1518-15
26）。これにおいては、２種の粒子を使用し、うち１種
は光増感剤を含有し（増感剤ビーズ）、他方は化学ルミ
ネセンス成分を含有している（レセプタービーズ）。光
増感剤は１重項状態の酵素を発生させ、化学ルミネセン
ス成分が十分接近すればこれを活性化させる。活性化さ
れた化学ルミネセンス成分は光を発生し、これを測定シ
グナルとして検知することができる。Bystrak、 Ｓ等（A
nalytical Biochemistry 1995; 225: 127-134）は、単
層の小胞に結合する蛍光基質の一重項状態の酸素による
光酸化が起こる均一な方法を記載している。特異的結合
成分は小胞の表面に共有結合している。
【０００９】これらの方法は全て、結合成分への粒子の
特異的結合を包含している。原則として、これらの結合
成分の結合は例えば免疫化学的検出のための抗原または
抗体のような適切な特異的リガンドによる粒子のコーテ
ィングを介して行う。現在まで、これらの方法は可溶性
（体液性）因子の検出にのみ用いられていた。これらの
因子（例えば蛋白）への結合により、トランスミッター
粒子とレシーバー粒子は、トランスミッターにより発生
されたエネルギーのトランスファー粒子への転移を可能
にする空間的近接度をもたらす。不溶性の固相会合ファ
クター、例えば、細胞の表面抗原の検出のための使用は
これまで指摘されていない。
特異的結合を包含している。原則として、これらの結合
成分の結合は例えば免疫化学的検出のための抗原または
抗体のような適切な特異的リガンドによる粒子のコーテ
ィングを介して行う。現在まで、これらの方法は可溶性
（体液性）因子の検出にのみ用いられていた。これらの
因子（例えば蛋白）への結合により、トランスミッター
粒子とレシーバー粒子は、トランスミッターにより発生
されたエネルギーのトランスファー粒子への転移を可能
にする空間的近接度をもたらす。不溶性の固相会合ファ
クター、例えば、細胞の表面抗原の検出のための使用は
これまで指摘されていない。
【００１０】
【発明の要旨】意外にも、本発明において、トランスミ
ッター粒子とレシーバー粒子が、エネルギー転移に必要
な空間的近接度が固相の大きさとは無関係に達成される
ように、言い換えれば、エネルギー転移がなお起こり得
るトランスミッター粒子とレシーバー粒子との間の最大
距離を超えないように、多数会合した固相会合ファクタ
ーに結合できることが解った。固相は例えば、細胞であ
ってよく、そして、固相会合ファクターは例えば細胞の
表面抗原であってよい。即ち意外にも、現在までもっぱ
ら体液因子の検出に限定されていた均一免疫化学的検出
法の範囲を細胞の表面マーカーの検出にまで拡張するこ
とが可能になり、これによりフローサイトメトリーの原
理意外の原理に基づいた装置でその測定が行えるように
なった。
ッター粒子とレシーバー粒子が、エネルギー転移に必要
な空間的近接度が固相の大きさとは無関係に達成される
ように、言い換えれば、エネルギー転移がなお起こり得
るトランスミッター粒子とレシーバー粒子との間の最大
距離を超えないように、多数会合した固相会合ファクタ
ーに結合できることが解った。固相は例えば、細胞であ
ってよく、そして、固相会合ファクターは例えば細胞の
表面抗原であってよい。即ち意外にも、現在までもっぱ
ら体液因子の検出に限定されていた均一免疫化学的検出
法の範囲を細胞の表面マーカーの検出にまで拡張するこ
とが可能になり、これによりフローサイトメトリーの原
理意外の原理に基づいた装置でその測定が行えるように
なった。
【００１１】従って本発明は、ある試料において同じ固
相に多数会合している固相会合ファクターＦの検出また
は測定のための方法に関する。本発明によれば、試料
を、Ｆへの結合アフィニティーを有するリガンドＬ少な
くとも１個およびトランスミッターＴよりなる第１の安
定な複合体、ならびに、Ｆへの結合アフィニティーを有
するリガンドＬ少なくとも１個およびレシーバーＲより
なる第２の安定な複合体と、複合体Ｆ−Ｌ−ＴおよびＦ
−Ｌ−Ｒが形成されるように接触させる。ＴとＲが相互
に十分近接している場合に生じるシグナルを測定する。
相に多数会合している固相会合ファクターＦの検出また
は測定のための方法に関する。本発明によれば、試料
を、Ｆへの結合アフィニティーを有するリガンドＬ少な
くとも１個およびトランスミッターＴよりなる第１の安
定な複合体、ならびに、Ｆへの結合アフィニティーを有
するリガンドＬ少なくとも１個およびレシーバーＲより
なる第２の安定な複合体と、複合体Ｆ−Ｌ−ＴおよびＦ
−Ｌ−Ｒが形成されるように接触させる。ＴとＲが相互
に十分近接している場合に生じるシグナルを測定する。
【００１２】本発明は更に、ある試料中の同じ固相に第
１の固相会合ファクターＦｘと第２の固相会合ファクタ
ーＦｙが会合している場合の、Ｆｘ少なくとも１個およ
びＦｙの同時検出または同時測定のための方法に関す
る。本発明によれば、試料を、Ｆｘへの結合アフィニテ
ィーを有するリガンドＬｘ少なくとも１個およびトラン
スミッターＴよりなる第１の安定な複合体少なくとも１
個、そして更に、Ｆｙへの結合アフィニティーを有する
リガンドＬｙ少なくとも１個およびレシーバーＲよりな
る第２の安定な複合体に、複合体Ｆｘ−Ｌｘ−Ｔおよび
複合体Ｆｙ−Ｌｙ−Ｒが形成されるように接触させる。
ＴとＲが相互に十分近接している場合に生じるシグナル
を測定する。
１の固相会合ファクターＦｘと第２の固相会合ファクタ
ーＦｙが会合している場合の、Ｆｘ少なくとも１個およ
びＦｙの同時検出または同時測定のための方法に関す
る。本発明によれば、試料を、Ｆｘへの結合アフィニテ
ィーを有するリガンドＬｘ少なくとも１個およびトラン
スミッターＴよりなる第１の安定な複合体少なくとも１
個、そして更に、Ｆｙへの結合アフィニティーを有する
リガンドＬｙ少なくとも１個およびレシーバーＲよりな
る第２の安定な複合体に、複合体Ｆｘ−Ｌｘ−Ｔおよび
複合体Ｆｙ−Ｌｙ−Ｒが形成されるように接触させる。
ＴとＲが相互に十分近接している場合に生じるシグナル
を測定する。
【００１３】好ましい実施態様によれば、安定な複合体
Ｌ−Ｔ、Ｌ−Ｒ、Ｌｘ−ＴまたはＬｙ−Ｒは各々粒子を
有し、ＬまたはＬｘはＴと共に第１の粒子に固定され、
ＬまたはＬｙはＲと共に第２の粒子に固定される。より
好ましくは、固相は細胞、例えば、赤血球、白血球、顆
粒球、リンパ球、単球、血小板、または、他の組織また
は臓器由来の細胞である。しかしながら、本発明によれ
ば、細胞という用語は細菌や寄生虫のような原核生物ま
たは真核生物の外因性細胞、または、亜細胞寄生体、例
えばウイルスをも指すものとする。固相会合ファクター
とは、固相へ組み込まれたファクター、および、固相に
組み込まれていないが他の相互作用により固相と会合す
るファクターの両方を指すものとする。考えられる試料
としては、体液、組織抽出液、またはex-vivoの培養物
である。ここでは、体液とは好ましくは、血液、滑液、
脳脊髄液、腹水または尿、特に好ましくは全血または富
血小板血漿である。
Ｌ−Ｔ、Ｌ−Ｒ、Ｌｘ−ＴまたはＬｙ−Ｒは各々粒子を
有し、ＬまたはＬｘはＴと共に第１の粒子に固定され、
ＬまたはＬｙはＲと共に第２の粒子に固定される。より
好ましくは、固相は細胞、例えば、赤血球、白血球、顆
粒球、リンパ球、単球、血小板、または、他の組織また
は臓器由来の細胞である。しかしながら、本発明によれ
ば、細胞という用語は細菌や寄生虫のような原核生物ま
たは真核生物の外因性細胞、または、亜細胞寄生体、例
えばウイルスをも指すものとする。固相会合ファクター
とは、固相へ組み込まれたファクター、および、固相に
組み込まれていないが他の相互作用により固相と会合す
るファクターの両方を指すものとする。考えられる試料
としては、体液、組織抽出液、またはex-vivoの培養物
である。ここでは、体液とは好ましくは、血液、滑液、
脳脊髄液、腹水または尿、特に好ましくは全血または富
血小板血漿である。
【００１４】本発明は更に、Ｆ、Ｆｘおよび／またはＦ
ｙが膜内在性蛋白、膜会合蛋白、糖構造または脂質であ
る方法に関する。ここで膜内在性蛋白は例えばインテグ
リン、セレクチン、ＭＨＣ複合体由来の蛋白質またはク
ラスターデシグネーションによる別の知られた蛋白質で
ある。膜会合蛋白は膜に組み込まれてはいないが、特定
のリガンド／レセプター相互作用を介して表面上で検出
可能であり、例えば、フィブリノーゲンレセプター上の
フィブリノーゲン、膜蛋白に対する抗体、膜表面上の炭
水化物構造および／または膜蛋白に対する補体因子また
はレクチン、または抗原提示細胞上のＭＨＣ複合体中の
処理抗原である。膜会合蛋白は更に静電気的相互作用を
介して表面上で検出される蛋白、例えば、凝固系の活性
酵素、またはアネキシンファミリーの蛋白である。本発
明の脂質は当業者に知られた物質であり、アシルグリセ
ロール、ホスホグリセリド、スフィンゴリピド、ワック
ス、テルペン、ステロイドおよび／またはプロスタグラ
ンジングループから選択される。本発明によれば、表面
膜のリン脂質の組成、例えばホスファチジルセリンまた
はホスファチジルエタノールアミンの比率は、アネキシ
ンファミリーの蛋白のような親和性リガンドを結合する
ことにより、または凝固系の親和性蛋白、例えば活性化
ＣまたはＳ蛋白を結合することにより適宜検出される。
ｙが膜内在性蛋白、膜会合蛋白、糖構造または脂質であ
る方法に関する。ここで膜内在性蛋白は例えばインテグ
リン、セレクチン、ＭＨＣ複合体由来の蛋白質またはク
ラスターデシグネーションによる別の知られた蛋白質で
ある。膜会合蛋白は膜に組み込まれてはいないが、特定
のリガンド／レセプター相互作用を介して表面上で検出
可能であり、例えば、フィブリノーゲンレセプター上の
フィブリノーゲン、膜蛋白に対する抗体、膜表面上の炭
水化物構造および／または膜蛋白に対する補体因子また
はレクチン、または抗原提示細胞上のＭＨＣ複合体中の
処理抗原である。膜会合蛋白は更に静電気的相互作用を
介して表面上で検出される蛋白、例えば、凝固系の活性
酵素、またはアネキシンファミリーの蛋白である。本発
明の脂質は当業者に知られた物質であり、アシルグリセ
ロール、ホスホグリセリド、スフィンゴリピド、ワック
ス、テルペン、ステロイドおよび／またはプロスタグラ
ンジングループから選択される。本発明によれば、表面
膜のリン脂質の組成、例えばホスファチジルセリンまた
はホスファチジルエタノールアミンの比率は、アネキシ
ンファミリーの蛋白のような親和性リガンドを結合する
ことにより、または凝固系の親和性蛋白、例えば活性化
ＣまたはＳ蛋白を結合することにより適宜検出される。
【００１５】本発明は更にリガンドが媒介結合成分を介
してＦ、ＦｘまたはＦｙに結合する方法に関する。本発
明は更にまた、Ｌ、ＬｘまたはＬｙがビオチン−アビジ
ン架橋を介して粒子に結合する方法に関する。本発明は
更にまた、Ｌ、ＬｘまたはＬｙが抗体、抗原、レクチ
ン、補酵素、アポ蛋白、受容体のリガンド、基質類縁体
またはアネキシンである方法に関する。本発明の好まし
い実施態様によれば、エネルギーの転移はトランスミッ
ターＴとレセプターＲとの間で起こる。これは例えば、
放射活性工程により、または感光性染料の励起およびそ
れにより起こる直接または間接の電子転移により、例え
ば活性酵素を用いることにより行うことができる。本発
明の更に別の実施態様によれば、レシーバー粒子におけ
るエネルギー転移により例えば発光反応、好ましくは化
学ルミネセンス、または蛍光発光が起こり、これが検出
可能であり、そしてトランスミッター粒子とレシーバー
粒子の空間的近接度の尺度となる。
してＦ、ＦｘまたはＦｙに結合する方法に関する。本発
明は更にまた、Ｌ、ＬｘまたはＬｙがビオチン−アビジ
ン架橋を介して粒子に結合する方法に関する。本発明は
更にまた、Ｌ、ＬｘまたはＬｙが抗体、抗原、レクチ
ン、補酵素、アポ蛋白、受容体のリガンド、基質類縁体
またはアネキシンである方法に関する。本発明の好まし
い実施態様によれば、エネルギーの転移はトランスミッ
ターＴとレセプターＲとの間で起こる。これは例えば、
放射活性工程により、または感光性染料の励起およびそ
れにより起こる直接または間接の電子転移により、例え
ば活性酵素を用いることにより行うことができる。本発
明の更に別の実施態様によれば、レシーバー粒子におけ
るエネルギー転移により例えば発光反応、好ましくは化
学ルミネセンス、または蛍光発光が起こり、これが検出
可能であり、そしてトランスミッター粒子とレシーバー
粒子の空間的近接度の尺度となる。
【００１６】本発明によれば特定の系における当業者に
知られたエネルギー転移調節物質、例えばダンピング物
質、例えば染料または抗酸化剤を添加することにより、
トランスミッター粒子とレシーバー粒子との間で必要な
最小距離を低減し、これにより測定値／バックグウンド
値のシグナル比を改善することができる。本発明の方法
は、例えば、細胞型、サブグループまたは細胞の活性化
状態の特徴を調べるため、および、表面マーカーまたは
表面抗原、例えば、細胞上の腫瘍形成の過程におけるネ
オエピトープの検出のために用いることができる。さら
にまた、組織のタイピングまたは組織適合性の特定のた
めに用いることができる。特に本発明はまた外因性細
胞、一般的には細菌のような病原体の同定に関する。本
発明の方法は、クラミジアの同定に特に適している。
知られたエネルギー転移調節物質、例えばダンピング物
質、例えば染料または抗酸化剤を添加することにより、
トランスミッター粒子とレシーバー粒子との間で必要な
最小距離を低減し、これにより測定値／バックグウンド
値のシグナル比を改善することができる。本発明の方法
は、例えば、細胞型、サブグループまたは細胞の活性化
状態の特徴を調べるため、および、表面マーカーまたは
表面抗原、例えば、細胞上の腫瘍形成の過程におけるネ
オエピトープの検出のために用いることができる。さら
にまた、組織のタイピングまたは組織適合性の特定のた
めに用いることができる。特に本発明はまた外因性細
胞、一般的には細菌のような病原体の同定に関する。本
発明の方法は、クラミジアの同定に特に適している。
【００１７】「トランスミッター（transmitter)」およ
び「レシーバー（receiver)」の用語は本発明において
は、空間的近接域において相互に作用できる生物学的ま
たは化学的物質に分類されるものを指し、例えば、光増
感剤および化学ルミネセンス体（EP-0515194; Ullman等
（1996）Clinical Chemistry 42; 1518-1526）、光増感
剤および発蛍光団（WO 95／06877; Bystrak等, (1995),
Anal. Biochem. 225:127-134）または放射性ヨウ素125
および発蛍光団（S. Udenfriend等, (1985),Proc. Nat
l. Acad. Sci. 82: 8672-8676）、または発蛍光団およ
び発蛍光団（Mathis, G. (1993), Clin. Chem. 39: 195
3-1959）または発蛍光団および蛍光クエンチング剤（US
3996345）のようなエネルギー供与体およびエネルギー
受容体の形態である。この場合、エネルギーの転移は一
方の物質から他方の物質へ起こるが、エネルギー転移の
経路となる種々の物質のカスケードも可能である。
び「レシーバー（receiver)」の用語は本発明において
は、空間的近接域において相互に作用できる生物学的ま
たは化学的物質に分類されるものを指し、例えば、光増
感剤および化学ルミネセンス体（EP-0515194; Ullman等
（1996）Clinical Chemistry 42; 1518-1526）、光増感
剤および発蛍光団（WO 95／06877; Bystrak等, (1995),
Anal. Biochem. 225:127-134）または放射性ヨウ素125
および発蛍光団（S. Udenfriend等, (1985),Proc. Nat
l. Acad. Sci. 82: 8672-8676）、または発蛍光団およ
び発蛍光団（Mathis, G. (1993), Clin. Chem. 39: 195
3-1959）または発蛍光団および蛍光クエンチング剤（US
3996345）のようなエネルギー供与体およびエネルギー
受容体の形態である。この場合、エネルギーの転移は一
方の物質から他方の物質へ起こるが、エネルギー転移の
経路となる種々の物質のカスケードも可能である。
【００１８】トランスミッターとレシーバーとの間の相
互作用は、特にエネルギーの転移、即ち、例えば光また
は電子の放射を用いた、そしてまた反応性化学分子を用
いた、トランスミッターとレシーバーとの間のエネルギ
ーの直接の転移である。更に、トランスミッターとレシ
ーバーとの間の相互作用の考え方は酵素カスケードを指
すものとしても理解される。この場合、物質は酵素であ
り、うち少なくとも１つは別の酵素の基質を与えるもの
である。これにはまた、物質の活性が別の物質１種以上
により抑制または増強される過程、例えば酵素活性の抑
制または増強、または、反応物質により発生した光の抑
制、増強または変動（例えば波長シフト）が含まれる。
トランスミッターとレシーバーとの間の効果的な相互作
用はこれらが空間的に隣接している場合に、即ち例えば
数ミクロンの距離範囲内、特に６００nm未満、好ましく
は400nm未満、特に好ましくは２００nmの距離範囲内に
ある場合に起こる。
互作用は、特にエネルギーの転移、即ち、例えば光また
は電子の放射を用いた、そしてまた反応性化学分子を用
いた、トランスミッターとレシーバーとの間のエネルギ
ーの直接の転移である。更に、トランスミッターとレシ
ーバーとの間の相互作用の考え方は酵素カスケードを指
すものとしても理解される。この場合、物質は酵素であ
り、うち少なくとも１つは別の酵素の基質を与えるもの
である。これにはまた、物質の活性が別の物質１種以上
により抑制または増強される過程、例えば酵素活性の抑
制または増強、または、反応物質により発生した光の抑
制、増強または変動（例えば波長シフト）が含まれる。
トランスミッターとレシーバーとの間の効果的な相互作
用はこれらが空間的に隣接している場合に、即ち例えば
数ミクロンの距離範囲内、特に６００nm未満、好ましく
は400nm未満、特に好ましくは２００nmの距離範囲内に
ある場合に起こる。
【００１９】本発明の好ましい実施態様におては、トラ
ンスミッターとレシーバーとの間の相互作用はエネルギ
ー転移として、例えば以下の手段により生じる。 ＊短命分子、例えば一重項酸素（EP 0515194; Ullman等
（1994）Proc. Natl.Acad. Sci. 91: 5426-5430; Ullma
n等（1996）Clinical Chemistry 42: 1518-1526, WO 95
／06877およびBystrak等（1995）Anal. Biochem. 225:
127-134参照） 、＊低範囲の放射線、例えば放射性β線（Hart & Green
wald（1979）MolecularImmunology 16: 265-267およびU
denfriend等（1985）Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 8672
-8676参照）、および／またはFoersterのエネルギー転
移（Mathis, G（1993）Clin. Chem. 39: 1953-1959; US
5527684）。
ンスミッターとレシーバーとの間の相互作用はエネルギ
ー転移として、例えば以下の手段により生じる。 ＊短命分子、例えば一重項酸素（EP 0515194; Ullman等
（1994）Proc. Natl.Acad. Sci. 91: 5426-5430; Ullma
n等（1996）Clinical Chemistry 42: 1518-1526, WO 95
／06877およびBystrak等（1995）Anal. Biochem. 225:
127-134参照） 、＊低範囲の放射線、例えば放射性β線（Hart & Green
wald（1979）MolecularImmunology 16: 265-267およびU
denfriend等（1985）Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 8672
-8676参照）、および／またはFoersterのエネルギー転
移（Mathis, G（1993）Clin. Chem. 39: 1953-1959; US
5527684）。
【００２０】本発明の方法には、粒子表面を調製後に更
に修飾したり、そして／あるいは粒子を、例えば蛋白、
炭水化物、新油性性物質、生体重合体、有機性重合体ま
たはこれらの混合物の１種以上の共有結合的にまたは吸
着により結合した層またはシェルにより被覆することに
より、例えば懸濁安定性、貯蔵安定性、形状安定性、ま
たはＵＶ光、微生物または他の破壊性物質への耐性に関
する改善を行う実施態様も含まれる。ここで修飾および
被覆は同様に反応容器表面および特に蛋白（例えばアル
ブミンまたは抗体）または細胞構成成分（例えばリン脂
質または核酸）のような蛋白成分表面への非特異的結合
を低減ないしは抑制するために使用できる。更に修飾お
よび被覆は粒子表面の疎水性または粒子表面の負荷を増
大または低減するために使用できる。
に修飾したり、そして／あるいは粒子を、例えば蛋白、
炭水化物、新油性性物質、生体重合体、有機性重合体ま
たはこれらの混合物の１種以上の共有結合的にまたは吸
着により結合した層またはシェルにより被覆することに
より、例えば懸濁安定性、貯蔵安定性、形状安定性、ま
たはＵＶ光、微生物または他の破壊性物質への耐性に関
する改善を行う実施態様も含まれる。ここで修飾および
被覆は同様に反応容器表面および特に蛋白（例えばアル
ブミンまたは抗体）または細胞構成成分（例えばリン脂
質または核酸）のような蛋白成分表面への非特異的結合
を低減ないしは抑制するために使用できる。更に修飾お
よび被覆は粒子表面の疎水性または粒子表面の負荷を増
大または低減するために使用できる。
【００２１】本発明の更に別の実施態様は、トランスミ
ッターまたはレシーバーとして、光増感剤、例えばアセ
トン、ベンゾフェノン、９−チオキサントン、エオシ
ン、９,１０−ジブロモアントラセン、クロロフィル、
バックミンスターフレレン（Buckminsterfullerene）、
メチレンブルー、ローズベンガル、ポルフィリン、フタ
ロシアニンおよび／またはその誘導体、そして、化学ル
ミネセンス化合物として例えばオレフィン、９−アルキ
リデンキサンタン、９−アルキリデン−Ｎ−アルキルア
クリダン、エノールエーテル、エナミン、アリールビニ
ルエーテル、ジオキサン、アリールイミダゾールおよび
／またはルシゲニンを用いることを包含し、光増感剤か
ら発生する一重項酸素は化学ルミネセンス化合物を活性
化して光を発することができる。さらにまた本発明で
は、一重項酸素と反応して光放射技術分野でよく知られ
た試薬と反応できる中間体が得られる物質、例えばルミ
ノールおよびオキサレートエステルを使用することも好
適である。
ッターまたはレシーバーとして、光増感剤、例えばアセ
トン、ベンゾフェノン、９−チオキサントン、エオシ
ン、９,１０−ジブロモアントラセン、クロロフィル、
バックミンスターフレレン（Buckminsterfullerene）、
メチレンブルー、ローズベンガル、ポルフィリン、フタ
ロシアニンおよび／またはその誘導体、そして、化学ル
ミネセンス化合物として例えばオレフィン、９−アルキ
リデンキサンタン、９−アルキリデン−Ｎ−アルキルア
クリダン、エノールエーテル、エナミン、アリールビニ
ルエーテル、ジオキサン、アリールイミダゾールおよび
／またはルシゲニンを用いることを包含し、光増感剤か
ら発生する一重項酸素は化学ルミネセンス化合物を活性
化して光を発することができる。さらにまた本発明で
は、一重項酸素と反応して光放射技術分野でよく知られ
た試薬と反応できる中間体が得られる物質、例えばルミ
ノールおよびオキサレートエステルを使用することも好
適である。
【００２２】原則として、化学ルミネセンス化合物は３
００nmを超える波長領域の光を発する。プラズマ蛍光は
５００nmからの領域に属し、５５０nmを超えると除外さ
れる。より長い波長が必要な場合は、本発明の化学ルミ
ネセンス化合物は、活性化化学ルミネセンス化合物によ
り励起され、より長い波長で発することのできる発蛍光
団と接触させることもできる。適当な発蛍光団は例え
ば、ローダミン、臭化エチジウム、５−ジメチルアミノ
ナフタレン−１−スルホニル、ユーロピウムと試薬３−
（２−チエノイル）−１,１,１−トリフルオロアセトン
とのキレート〔Eu(TTA)3(TTA＝３−（２−チエノイル）
−１,１,１−トリフルオロアセトン）〕またはルテニウ
ムと試薬２,２′−ジピリジルとのキレート〔Ru（bpy)3
++（bpy＝２,２′−ジピリジル）〕である。
００nmを超える波長領域の光を発する。プラズマ蛍光は
５００nmからの領域に属し、５５０nmを超えると除外さ
れる。より長い波長が必要な場合は、本発明の化学ルミ
ネセンス化合物は、活性化化学ルミネセンス化合物によ
り励起され、より長い波長で発することのできる発蛍光
団と接触させることもできる。適当な発蛍光団は例え
ば、ローダミン、臭化エチジウム、５−ジメチルアミノ
ナフタレン−１−スルホニル、ユーロピウムと試薬３−
（２−チエノイル）−１,１,１−トリフルオロアセトン
とのキレート〔Eu(TTA)3(TTA＝３−（２−チエノイル）
−１,１,１−トリフルオロアセトン）〕またはルテニウ
ムと試薬２,２′−ジピリジルとのキレート〔Ru（bpy)3
++（bpy＝２,２′−ジピリジル）〕である。
【００２３】本発明の更に別の実施態様は物質として光
増感剤および蛍光化合物を用いることを包含し、光発生
のための蛍光化合物は光増感剤により発生する一重項酸
素の光発生を活性化したり、あるいは、消光過程では抑
制することができる。特に本発明の方法は、例えば１,
３−ジフェニルイソベンゾフランのような一重項酸素と
の反応により光酸化−光漂白されるか、あるいは、光活
性前駆体として一重項酸素と反応することにより例えば
オキセンウンベリフェリルエーテルまたはウンベリフェ
リルセレニドのような発蛍光団を生じる蛍光化合物を使
用することを包含する。本発明の方法に適する粒子、光
増感剤、化学ルミネセンス物質または蛍光化合物の更に
別の例は、特に、EP 0515194, Ullman等 (Proc. Natl.
Acad. Sci. 91:5426-5430 1994）およびUllman等（Clin
ical Chemistry 42: 1518-1526, 1996,WO 95／06877）
を参照することができる。
増感剤および蛍光化合物を用いることを包含し、光発生
のための蛍光化合物は光増感剤により発生する一重項酸
素の光発生を活性化したり、あるいは、消光過程では抑
制することができる。特に本発明の方法は、例えば１,
３−ジフェニルイソベンゾフランのような一重項酸素と
の反応により光酸化−光漂白されるか、あるいは、光活
性前駆体として一重項酸素と反応することにより例えば
オキセンウンベリフェリルエーテルまたはウンベリフェ
リルセレニドのような発蛍光団を生じる蛍光化合物を使
用することを包含する。本発明の方法に適する粒子、光
増感剤、化学ルミネセンス物質または蛍光化合物の更に
別の例は、特に、EP 0515194, Ullman等 (Proc. Natl.
Acad. Sci. 91:5426-5430 1994）およびUllman等（Clin
ical Chemistry 42: 1518-1526, 1996,WO 95／06877）
を参照することができる。
【００２４】
【発明の詳述】本発明における固相、例えば細胞は、固
相会合ファクター、例えば表面エピトープに対して多価
であると考えることができるため、必ずしも２種の結合
成分をトランスミッター粒子とレシーバー粒子に適用す
る必要はない。即ち、トランスミッターとレシーバーの
粒子上の結合成分が同じであっても、特定の固相結合フ
ァクター例えば抗原またはリガンドの検出には十分であ
る。従って、特定の細胞型の測定または細胞表面上に特
定のファクターの発現を伴う特定の活性化状態の測定が
可能である。
相会合ファクター、例えば表面エピトープに対して多価
であると考えることができるため、必ずしも２種の結合
成分をトランスミッター粒子とレシーバー粒子に適用す
る必要はない。即ち、トランスミッターとレシーバーの
粒子上の結合成分が同じであっても、特定の固相結合フ
ァクター例えば抗原またはリガンドの検出には十分であ
る。従って、特定の細胞型の測定または細胞表面上に特
定のファクターの発現を伴う特定の活性化状態の測定が
可能である。
【００２５】更に一方、２種以上の異なる結合成分をト
ランスミッターとレシーバーの粒子に適用することも可
能であり、これにより更に個々のファクター例えば個々
の抗原の検出のための識別を更に進めることができる。
ただしこれを行うには、有効エネルギー転移の半径は、
それが極めて近接したトランスミッターとレシーバーの
粒子の間で容易に起こるだけで、そして固相自体の多価
度が、例えば結合成分の過剰蓄積により望ましくないエ
ネルギー転移をもたらすことのないような、小さいもの
でなければならない。有効エネルギー転移の半径は使用
する検出系により異なり、この半径を減少させるには、
当業者に知られる添加剤を用いて、粒子の性質を変える
か、または、周囲の溶液の消光作用を変えればよい。
ランスミッターとレシーバーの粒子に適用することも可
能であり、これにより更に個々のファクター例えば個々
の抗原の検出のための識別を更に進めることができる。
ただしこれを行うには、有効エネルギー転移の半径は、
それが極めて近接したトランスミッターとレシーバーの
粒子の間で容易に起こるだけで、そして固相自体の多価
度が、例えば結合成分の過剰蓄積により望ましくないエ
ネルギー転移をもたらすことのないような、小さいもの
でなければならない。有効エネルギー転移の半径は使用
する検出系により異なり、この半径を減少させるには、
当業者に知られる添加剤を用いて、粒子の性質を変える
か、または、周囲の溶液の消光作用を変えればよい。
【００２６】図１を参照して、より詳細な説明を以下に
行う。図１Ａでは、トランスミッターとレシーバーの粒
子にＧＰIIｂに対する同じ抗体を担持させた。トランス
ミッターからレシーバーへのエネルギーの転移、即ちシ
グナルの発信は、分子相互間の平均距離がトランスミッ
ターとレシーバーの粒子間のエネルギー転移がなお可能
である最大半径より小さくなるようにＧＰIIｂ分子が細
胞表面上に密に配列している場合に起こるのみである。
そのため、シグナルの転移はＧＰIIｂによる本発明の例
における特定の表面エピトープの量（表面上の頻度）の
尺度となる。例えば白血球分画のためのＴ４およびＴ８
のような個々の表面抗原、アレルギー反応検出のための
ＩｇＥ受容体の測定、または、臓器または組織の移植の
前の細胞抽出液または溶解物における組織適合性抗原の
測定、または、表面活性蛋白またはネオペプチドの継続
性または新たに出現した膜内在性蛋白の変化の検知によ
る細胞の活性化状態の診断に好都合である。
行う。図１Ａでは、トランスミッターとレシーバーの粒
子にＧＰIIｂに対する同じ抗体を担持させた。トランス
ミッターからレシーバーへのエネルギーの転移、即ちシ
グナルの発信は、分子相互間の平均距離がトランスミッ
ターとレシーバーの粒子間のエネルギー転移がなお可能
である最大半径より小さくなるようにＧＰIIｂ分子が細
胞表面上に密に配列している場合に起こるのみである。
そのため、シグナルの転移はＧＰIIｂによる本発明の例
における特定の表面エピトープの量（表面上の頻度）の
尺度となる。例えば白血球分画のためのＴ４およびＴ８
のような個々の表面抗原、アレルギー反応検出のための
ＩｇＥ受容体の測定、または、臓器または組織の移植の
前の細胞抽出液または溶解物における組織適合性抗原の
測定、または、表面活性蛋白またはネオペプチドの継続
性または新たに出現した膜内在性蛋白の変化の検知によ
る細胞の活性化状態の診断に好都合である。
【００２７】図１Ｂに示すような、トランスミッターと
レシーバーの粒子に２種の異なるリガンドを担持させた
場合、例えば、トランスミッターはＧＰIIｂに対する抗
体、レシーバーにはＧＰIIIａに対する抗体を担持させ
た場合には、２種の異なるリガンドが相互に十分近接し
た場合に、即ち、この例では完全なフィブリノーゲン受
容体ＧＰIIｂ／IIIａが細胞上に存在する場合に、シグ
ナルが発せられるのみである。検出対象となりうる他の
複合体は例えば、凝固酵素およびそのコファクター、ま
たは凝固酵素および生理活性表面、またはＭＨＣ（主要
組織適合性複合体）の成分、または免疫細胞上のＴ３、
ＴｒおよびＴ４またはＴ８、または補体系、例えば、補
体因子Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９およびビトロネ
クチン（Ｔ蛋白）よりなるＭＡＣ（膜攻撃複合体）の成
分よりなるものである。最後の例では、例えば、補体系
の現在の溶解活性の測定を、それ自体の上のＣ９に対す
る抗体またはこれらの成分の２種以上に対する抗体の組
合わせを用いることにより行うことが考えられ、例え
ば、この方法により複合体形成（例えばＣ５ｂ−Ｃ６、
Ｃ５ｂ−Ｃ７、Ｃ５ｂ−Ｃ８、Ｃ５ｂ−Ｃ９）の完成度
を識別することが可能となる。
レシーバーの粒子に２種の異なるリガンドを担持させた
場合、例えば、トランスミッターはＧＰIIｂに対する抗
体、レシーバーにはＧＰIIIａに対する抗体を担持させ
た場合には、２種の異なるリガンドが相互に十分近接し
た場合に、即ち、この例では完全なフィブリノーゲン受
容体ＧＰIIｂ／IIIａが細胞上に存在する場合に、シグ
ナルが発せられるのみである。検出対象となりうる他の
複合体は例えば、凝固酵素およびそのコファクター、ま
たは凝固酵素および生理活性表面、またはＭＨＣ（主要
組織適合性複合体）の成分、または免疫細胞上のＴ３、
ＴｒおよびＴ４またはＴ８、または補体系、例えば、補
体因子Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９およびビトロネ
クチン（Ｔ蛋白）よりなるＭＡＣ（膜攻撃複合体）の成
分よりなるものである。最後の例では、例えば、補体系
の現在の溶解活性の測定を、それ自体の上のＣ９に対す
る抗体またはこれらの成分の２種以上に対する抗体の組
合わせを用いることにより行うことが考えられ、例え
ば、この方法により複合体形成（例えばＣ５ｂ−Ｃ６、
Ｃ５ｂ−Ｃ７、Ｃ５ｂ−Ｃ８、Ｃ５ｂ−Ｃ９）の完成度
を識別することが可能となる。
【００２８】本発明の方法は微生物の検出を簡易化する
のにも使用できる。以下に本発明の原理をクラミジア検
出を例に説明するが、本発明はこの微生物の検出に限定
されるわけではない。多くのクラミジア検出法が既に報
告されており、例えば細胞培養においてクラミジアを培
養する方法、免疫検定、核酸を用いる方法（ＤＮＡ検出
法）がある。免疫学的試験法は、例えば臨床診断を行う
なめのクラミジアの特異的検出を目的としている。ここ
では本質的に２通りの方法を用いるが、最初の方法で
は、酵素標識抗体を予め放出されたクラミジア抗原にお
いて測定し、第２の方法では、スライドに固定されたク
ラミジアを、クラミジアになお結合しつづけている非遊
離抗原を用いて蛍光標識抗体により顕微鏡的に検出し
た。
のにも使用できる。以下に本発明の原理をクラミジア検
出を例に説明するが、本発明はこの微生物の検出に限定
されるわけではない。多くのクラミジア検出法が既に報
告されており、例えば細胞培養においてクラミジアを培
養する方法、免疫検定、核酸を用いる方法（ＤＮＡ検出
法）がある。免疫学的試験法は、例えば臨床診断を行う
なめのクラミジアの特異的検出を目的としている。ここ
では本質的に２通りの方法を用いるが、最初の方法で
は、酵素標識抗体を予め放出されたクラミジア抗原にお
いて測定し、第２の方法では、スライドに固定されたク
ラミジアを、クラミジアになお結合しつづけている非遊
離抗原を用いて蛍光標識抗体により顕微鏡的に検出し
た。
【００２９】現在まで知られている全ての方法につい
て、試験のための試料調製中または試験中に数工程を行
うことが必要である。その一部を以下に記載するが、試
験の準備段階で検出すべきクラミジア抗原を抽出しなけ
ればならない。これは洗剤を用いるか（例えばEP-03928
65参照）または同時アルカリ条件下に洗剤を用いる（例
えばEP-0402396参照）ことにより行う。他の方法は抽出
工程の他に、試験中洗浄工程を設けて未結合のクラミジ
ア特異的抗体を除去することが必要である（例えば米国
特許No. 4497899号参照）。他の既知方法では、検出の
ためのクラミジア特異的抗原を放出するために１５分間
１００℃に加熱することが必要である（EP-0371049）。
他の種々の方法では抗原を抽出し、免疫複合体を形成
し、次にこれを濾過して特異的抗体を介した検出に付
し、その後、洗浄段階により未結合抗体を除去する（EP
-0451687）。更に別の既知法では、酵素的に放出された
抗原を多孔性膜を通して輸送し、その中でクラミジア特
異的抗体が放出された抗原に結合し、次段階の方法によ
り検出にされる（EP-0444303）。
て、試験のための試料調製中または試験中に数工程を行
うことが必要である。その一部を以下に記載するが、試
験の準備段階で検出すべきクラミジア抗原を抽出しなけ
ればならない。これは洗剤を用いるか（例えばEP-03928
65参照）または同時アルカリ条件下に洗剤を用いる（例
えばEP-0402396参照）ことにより行う。他の方法は抽出
工程の他に、試験中洗浄工程を設けて未結合のクラミジ
ア特異的抗体を除去することが必要である（例えば米国
特許No. 4497899号参照）。他の既知方法では、検出の
ためのクラミジア特異的抗原を放出するために１５分間
１００℃に加熱することが必要である（EP-0371049）。
他の種々の方法では抗原を抽出し、免疫複合体を形成
し、次にこれを濾過して特異的抗体を介した検出に付
し、その後、洗浄段階により未結合抗体を除去する（EP
-0451687）。更に別の既知法では、酵素的に放出された
抗原を多孔性膜を通して輸送し、その中でクラミジア特
異的抗体が放出された抗原に結合し、次段階の方法によ
り検出にされる（EP-0444303）。
【００３０】ＬＯＣＩ法を使用することにより、免疫化
学的に不溶性の抗原を予備放出しないでクラミジア細胞
上で直接検出できることも解った。緩衝液中にクラミジ
ア細胞を分散させ、この細胞懸濁液の一部の中で免疫化
学的にトランスミッターとレシーバーの粒子を結合さ
せ、別途洗浄工程を設けることなくシグナルを測定すれ
ばよい。２種の異なる抗体がクラミジア細胞中の異なる
構造成分を認識するため、本発明による検出を行うため
には、シグナルの形成は双方、即ちトランスミッターと
レシーバーの粒子の両方が、クラミジア細胞上で相互に
隣合わせるように結合することができる。同時にこのこ
とは、クラミジア細胞の構造をもはや時間のかかる方法
により破壊する必要がないことを意味しており、他の試
験法と同様、クラミジア細胞構造の個々の構成要素が検
出できるように所望の抗原を検出できる（実施例１参
照）。このことは、必要な労力と誤差原因の低減に加
え、前処理のためにこれまでは不可能であった通常の装
置への適用を可能にする。
学的に不溶性の抗原を予備放出しないでクラミジア細胞
上で直接検出できることも解った。緩衝液中にクラミジ
ア細胞を分散させ、この細胞懸濁液の一部の中で免疫化
学的にトランスミッターとレシーバーの粒子を結合さ
せ、別途洗浄工程を設けることなくシグナルを測定すれ
ばよい。２種の異なる抗体がクラミジア細胞中の異なる
構造成分を認識するため、本発明による検出を行うため
には、シグナルの形成は双方、即ちトランスミッターと
レシーバーの粒子の両方が、クラミジア細胞上で相互に
隣合わせるように結合することができる。同時にこのこ
とは、クラミジア細胞の構造をもはや時間のかかる方法
により破壊する必要がないことを意味しており、他の試
験法と同様、クラミジア細胞構造の個々の構成要素が検
出できるように所望の抗原を検出できる（実施例１参
照）。このことは、必要な労力と誤差原因の低減に加
え、前処理のためにこれまでは不可能であった通常の装
置への適用を可能にする。
【００３１】従って本発明はまた試料中に含まれるクラ
ミジア細胞をトランスミッターとレシーバーの粒子に接
触させる方法に関し、各々の場合、両方の粒子はクラミ
ジア細胞に対する結合アフィニティーを有するリガンド
少なくとも１個を有し、トランスミッター粒子は更にト
ランスミッターを有し、そしてレシーバー粒子は更にレ
シーバーを有する。そして、トランスミッターとレシー
バーが相互に十分近接した場合に生じるシグナルが測定
される。以下の実施例は本発明を更に説明するためのも
のであり、本発明をこれに限定しようとするものでは決
してない。均一な免疫化学的方法の例としてＬＯＣＩ法
を選択した。
ミジア細胞をトランスミッターとレシーバーの粒子に接
触させる方法に関し、各々の場合、両方の粒子はクラミ
ジア細胞に対する結合アフィニティーを有するリガンド
少なくとも１個を有し、トランスミッター粒子は更にト
ランスミッターを有し、そしてレシーバー粒子は更にレ
シーバーを有する。そして、トランスミッターとレシー
バーが相互に十分近接した場合に生じるシグナルが測定
される。以下の実施例は本発明を更に説明するためのも
のであり、本発明をこれに限定しようとするものでは決
してない。均一な免疫化学的方法の例としてＬＯＣＩ法
を選択した。
【００３２】
【実施例】懸濁中のクラミジアの表面抗原の検出 ＬＯＣＩ法に従って、トランスミッターとレシーバーの
粒子として、増感剤と化学ルミネセンス粒子をそれぞれ
用いた。粒子はSyva Business Unit（BehringDiagnosti
cs Inc., San Lose）より入手した。調製は欧州特許 05
15194号に記載の方法に従い、Ullman等の方法（Clin Ch
em. (1996) 42：9, 1518-1526およびNatl. Acad. Sci.
(1994) 91, 5426-5430）を参考にして行った。アクセプ
ター粒子はリポ多糖類（LPS）特異的抗体でコーティン
グした。コーティング方法はUllman等（（1996) 42：9,
1518-1526）に記載の通りにした。これと平行して、主
要な外部膜蛋白（MOMP）に対する特異的抗体をビオチン
で標識した。増感剤粒子はアビジンでコーティングし
た。これらの方法は同様にUllman等（(1996) 42：9, 15
18-1526）に記載の通りにした。試験開始前に、クラミ
ジア、アクセプタービーズ、ビオチニル化抗体および増
感剤を０.１ＭトリスＨｃｌ；０.５Ｍ ＮａＣｌ；０.０
２５Ｍ ＥＤＴＡ；１.６％ ＢＴＡを組成とする緩衝液
（pH７.６）で希釈した。
粒子として、増感剤と化学ルミネセンス粒子をそれぞれ
用いた。粒子はSyva Business Unit（BehringDiagnosti
cs Inc., San Lose）より入手した。調製は欧州特許 05
15194号に記載の方法に従い、Ullman等の方法（Clin Ch
em. (1996) 42：9, 1518-1526およびNatl. Acad. Sci.
(1994) 91, 5426-5430）を参考にして行った。アクセプ
ター粒子はリポ多糖類（LPS）特異的抗体でコーティン
グした。コーティング方法はUllman等（（1996) 42：9,
1518-1526）に記載の通りにした。これと平行して、主
要な外部膜蛋白（MOMP）に対する特異的抗体をビオチン
で標識した。増感剤粒子はアビジンでコーティングし
た。これらの方法は同様にUllman等（(1996) 42：9, 15
18-1526）に記載の通りにした。試験開始前に、クラミ
ジア、アクセプタービーズ、ビオチニル化抗体および増
感剤を０.１ＭトリスＨｃｌ；０.５Ｍ ＮａＣｌ；０.０
２５Ｍ ＥＤＴＡ；１.６％ ＢＴＡを組成とする緩衝液
（pH７.６）で希釈した。
【００３３】試験を実施するために、成分を混合し、以
下の通りインキュベートした。これに必要な装置はUllm
an等（（1996) 42：9, 1518-1526）に記載の通りであ
る。 クラミジア懸濁液２５μlをアクセプタービーズ（１０
０μｇ／ml）２５μlと混合し、６分間３７℃でインキ
ュベートした。次にビオチニル化抗体（１０μｇ／ml）
３５μlを添加し、混合物を再度６分間３７℃でインキ
ュベートした。次に増感剤粒子（４００μｇ／ml）５０
μlを添加し、生じた化学ルミネセンスをルミノメータ
ーで測定した。比較のために、クラミジアのないテスド
バッチを用いた。２つのバッチのシグナルは以下の通り
であった。 試料緩衝液（対照）のシグナル ： ８６９８ クラミジア細胞のシグナル ： １３２２１
下の通りインキュベートした。これに必要な装置はUllm
an等（（1996) 42：9, 1518-1526）に記載の通りであ
る。 クラミジア懸濁液２５μlをアクセプタービーズ（１０
０μｇ／ml）２５μlと混合し、６分間３７℃でインキ
ュベートした。次にビオチニル化抗体（１０μｇ／ml）
３５μlを添加し、混合物を再度６分間３７℃でインキ
ュベートした。次に増感剤粒子（４００μｇ／ml）５０
μlを添加し、生じた化学ルミネセンスをルミノメータ
ーで測定した。比較のために、クラミジアのないテスド
バッチを用いた。２つのバッチのシグナルは以下の通り
であった。 試料緩衝液（対照）のシグナル ： ８６９８ クラミジア細胞のシグナル ： １３２２１
【図１】細胞表面上の特定のファクターの発現に伴う特
定の活性化状態の測定を行なう場合の模式図であり、１
Ａはトランスミッターおよびレシーバーの粒子上の同一
の抗体を示し、１Ｂはトランスミッターおよびレシーバ
ーの粒子上の異なる抗体を示す。
定の活性化状態の測定を行なう場合の模式図であり、１
Ａはトランスミッターおよびレシーバーの粒子上の同一
の抗体を示し、１Ｂはトランスミッターおよびレシーバ
ーの粒子上の異なる抗体を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヴイルヘルム・スフーイ ドイツ連邦共和国56414オーベラーバハ. シユリーフエルダーヴエーク６
Claims (26)
- 【請求項１】 ある試料中の同じ固相に多数会合した固
相会合ファクターの検出または測定方法であって、試料
を、Ｆへの結合アフィニティーを有するリガンドＬ少な
くとも１個とトランスミッターＴによりなる第１の安定
な複合体およびＦへの結合アフィニティーを有するリガ
ンドＬ少なくとも１個とレシーバーＲよりなる第２の安
定な複合体に、複合体Ｆ−Ｌ−Ｔおよび複合体Ｆ−Ｌ−
Ｒが形成されるように、そして、ＴとＲが相互に十分近
接した場合に生じるシグナルが測定されるように接触さ
せることからなる、前記方法。 - 【請求項２】 ある試料中の同じ固相に第１の固相会合
ファクターＦｘ少なくとも１個および第２の固相会合フ
ァクターＦｙがともに会合する上記ＦｘおよびＦｙの同
時検出または同時測定方法であって、試料を、Ｆｘへの
結合アフィニティーを有するリガンドＬｘ少なくとも１
個とトランスミッターＴよりなる第１の安定な複合体少
なくとも１種、そして更に、Ｆｙへの結合アフィニティ
ーを有するリガンドＬｙ少なくとも１個とレシーバーＲ
よりなる第２の安定な複合体に、複合体Ｆｘ−Ｌｘ−Ｔ
および複合体Ｆｙ−Ｌｙ−Ｒが形成されるように、そし
て、ＴとＲが相互に十分近接した場合に生じるシグナル
が測定されるように、接触させることからなる前記方
法。 - 【請求項３】 安定な複合体Ｌ−Ｔ、Ｌ−Ｒ、Ｌｘ−Ｔ
またはＬｙ−Ｒが各々粒子を有し、ＬまたはＬｘがＴと
共に第１の粒子に固定され、ＬまたはＬｙがＲと共に第
２の粒子に固定される請求項１または２記載の方法。 - 【請求項４】 固相が細胞である、請求項１または２記
載の方法。 - 【請求項５】 細胞が赤血球、白血球、顆粒球、リンバ
球、単球、血小板のような血液細胞または他の組織また
は臓器由来の細胞である、請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 細胞が外因性細胞である、請求項４記載
の方法。 - 【請求項７】 細胞が細菌、寄生虫またはウイルスであ
る請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 Ｆ、Ｆｘおよび／またはＦｙが組み込み
膜蛋白、膜会合蛋白または脂質である請求項４記載の方
法。 - 【請求項９】 組み込み膜蛋白がインテグリンまたはセ
レクチンであるか、または、ＭＨＣ複合体由来である
か、またはクラスター表示による他の蛋白である請求項
８記載の方法。 - 【請求項１０】 膜会合蛋白がフィブリノーゲン、抗
体、補体因子、レクチン、ＭＨＣ複合体の処理抗原、凝
固系酵素またはアネキシンファミリーの蛋白である請求
項８記載の方法。 - 【請求項１１】 脂質がアシルグリセロール、ホスホグ
リセリド、スフィンゴリピド、ワックス、テルペン、ス
テロイドおよび／またはプロスタグランジングループか
ら誘導される請求項８記載の方法。 - 【請求項１２】 脂質がリン脂質でありＬがアネキシン
ファミリーの蛋白であるか、または凝固系の反応性蛋白
である請求項８記載の方法。 - 【請求項１３】 リン脂質がホスファチジルセリンまた
はホスファチジルエタノールアミンであり、Ｌが蛋白Ｃ
または蛋白Ｔである請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 リガンドが媒介結合成分を介してＦ、
ＦｘまたはＦｙに結合する請求項１または２記載の方
法。 - 【請求項１５】 Ｌ、ＬｘまたはＬｙがビオチン−アビ
ジン架橋を介して粒子に結合する請求項３記載の方法。 - 【請求項１６】 Ｌ、ＬｘまたはＬｙが抗体、抗原、レ
クチン、補酵素、アポ蛋白、受容体のリガンド、基質類
縁体またはアネキシンである請求項１または２記載の方
法。 - 【請求項１７】 エネルギー転移がＴとＲとの間で起こ
る請求項１または２記載の方法。 - 【請求項１８】 エネルギー転移を、放射活性過程によ
り、または感光性染料の励起およびそれにより起こる直
接または間接の電子移転により行うことができる、請求
項１７記載の方法。 - 【請求項１９】 電子転移を活性酸素を用いて行う請求
項１８記載の方法。 - 【請求項２０】 エネルギー転移によりレシーバーに発
光、化学ルミネセンスまたは蛍光が生じる請求項１７記
載の方法。 - 【請求項２１】 シグナル生成を調節する物質を添加す
る請求項１または２記載の方法。 - 【請求項２２】 細胞型、サブグループまたは細胞の活
性化状態の特徴を調べるのに用いる請求項１または２記
載の方法。 - 【請求項２３】 細菌の表面抗原の検出を病原体の同定
に用いる請求項１または２記載の方法。 - 【請求項２４】 細胞の表面マーカーの検出に用いる請
求項１または２記載の方法。 - 【請求項２５】 クラミジアの検出に用いる請求項２３
記載の方法。 - 【請求項２６】 組織のタイピングまたは組織適合性の
特定に用いる請求項４記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19756782A DE19756782A1 (de) | 1997-12-19 | 1997-12-19 | Nachweis und Bestimmung festphasenassoziierter Faktoren |
| DE19756782:7 | 1997-12-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11242029A true JPH11242029A (ja) | 1999-09-07 |
| JP4276320B2 JP4276320B2 (ja) | 2009-06-10 |
Family
ID=7852690
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP36066198A Expired - Fee Related JP4276320B2 (ja) | 1997-12-19 | 1998-12-18 | 固相会合ファクターの検出および測定 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6632599B1 (ja) |
| EP (1) | EP0924522B1 (ja) |
| JP (1) | JP4276320B2 (ja) |
| AT (1) | ATE336722T1 (ja) |
| CA (1) | CA2256087C (ja) |
| DE (2) | DE19756782A1 (ja) |
| ES (1) | ES2268747T3 (ja) |
Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| JP2007537432A (ja) * | 2004-05-13 | 2007-12-20 | サーントル ナスィヨナル ドゥ ラ ルシェルシュ スイヤンティフィック | ターゲット存在物をおとり存在物へ結合させるための装置、および該装置を使用する検出方法 |
| WO2010064734A1 (en) * | 2008-12-04 | 2010-06-10 | Fujifilm Corporation | Immobilization substrate and method for producing the same |
| US11156604B2 (en) | 2018-05-04 | 2021-10-26 | Korea University Research And Business Foundation | Multilayer nanowire complex and method of preparing the same |
Families Citing this family (3)
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| WO2002033396A1 (en) | 2000-10-14 | 2002-04-25 | Saunders Alex M | Ligand based solution assay for low concentration analytes |
| WO2009066131A1 (en) * | 2007-11-19 | 2009-05-28 | Mahmoud Rafea | Methods for preparation of vaccines, laboratory kits, and treatment components |
| US8153442B2 (en) * | 2009-10-21 | 2012-04-10 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Stabilization of signal generation in particles used in assays |
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| US3996345A (en) | 1974-08-12 | 1976-12-07 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
| US4497899A (en) | 1982-04-12 | 1985-02-05 | Abbott Laboratories | Immunoassay for Chlamydia trachomatis antigens |
| DE3871799D1 (de) | 1987-07-14 | 1992-07-09 | Univ Manchester | Verfahren zur diagnose von infektionen, bei welchem lipopolyscaccharidantigene bestimmt werden. |
| US4916057A (en) | 1988-02-29 | 1990-04-10 | Kallestad Diagnostics, Inc. | Chlamydia assay employing base treatment |
| US5047321A (en) * | 1988-06-15 | 1991-09-10 | Becton Dickinson & Co. | Method for analysis of cellular components of a fluid |
| ES2056378T3 (es) | 1989-04-14 | 1994-10-01 | Unilever Nv | Procedimiento de extraccion. |
| IE904258A1 (en) | 1990-03-01 | 1991-09-11 | Becton Dickinson Co | Detection of chlamydia by flow-through assay |
| CA2035646A1 (en) | 1990-04-12 | 1991-10-13 | Kollen K. Messenger | Chlamydia half-sandwich immunoassay |
| FR2672128B1 (fr) | 1991-01-28 | 1995-08-18 | Cis Bio Int | Procede de mesure de la luminescence emise dans un dosage par luminescence. |
| DE69233146T2 (de) * | 1991-05-22 | 2004-04-29 | Dade Behring Marburg Gmbh | Partikel, die eine Zusammensetzung beinhalten, die eine chemilumineszierende Verbindung umfassen |
| US5340716A (en) * | 1991-06-20 | 1994-08-23 | Snytex (U.S.A.) Inc. | Assay method utilizing photoactivated chemiluminescent label |
| ATE162892T1 (de) * | 1992-07-31 | 1998-02-15 | Behringwerke Ag | Photoaktivierbare chemiluminizierende matrices |
| ES2135597T3 (es) | 1993-09-03 | 1999-11-01 | Dade Behring Marburg Gmbh | Inmunoensayos fluorescentes de canalizacion del oxigeno. |
| US5536642A (en) * | 1993-09-09 | 1996-07-16 | Barbera-Guillem; Emilio | Diagnostic and prognostic methods for solid non-lymphoid tumors and their metastases |
| US5552290A (en) | 1994-11-14 | 1996-09-03 | University Of Massachusetts Medical Center | Detection of procoagulant platelet-derived microparticles in whole blood |
-
1997
- 1997-12-19 DE DE19756782A patent/DE19756782A1/de not_active Ceased
-
1998
- 1998-11-20 DE DE59813689T patent/DE59813689D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-20 ES ES98122039T patent/ES2268747T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-20 EP EP98122039A patent/EP0924522B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-20 AT AT98122039T patent/ATE336722T1/de active
- 1998-12-15 CA CA002256087A patent/CA2256087C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-18 US US09/215,209 patent/US6632599B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-18 JP JP36066198A patent/JP4276320B2/ja not_active Expired - Fee Related
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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