JPH11199599A - 補体活性阻害性ペプチドおよび抗補体剤 - Google Patents
補体活性阻害性ペプチドおよび抗補体剤Info
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- JPH11199599A JPH11199599A JP9338964A JP33896497A JPH11199599A JP H11199599 A JPH11199599 A JP H11199599A JP 9338964 A JP9338964 A JP 9338964A JP 33896497 A JP33896497 A JP 33896497A JP H11199599 A JPH11199599 A JP H11199599A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 補体の第１成分（Ｃ１）と確実に結合してそ
の活性化を充分に抑制できるものとし、生体に本来必要
な生体防御能力を低下させにくい医療製剤用のペプチド
を提供することである。 【解決手段】 下記のアミノ酸配列からなるペプチドを
１単位とし、２単位のＣ末端同士を遊離Lys を介して連
結した２倍体、２つの２倍体の前記連結に係るLys 同士
を遊離のLys を介して結合した４倍体、２つの４倍体の
前記連結に係るLys 同士を遊離のLys を介して結合した
８倍体、または２つの８倍体の前記連結に係るLys 同士
を遊離のLys を介して結合した１６倍体からなり、補体
成分Ｃ１に対して不活化性を有する補体活性阻害性ペプ
チド、またはこのペプチドを有効成分とする抗補体剤と
する。 Val Gln Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
の活性化を充分に抑制できるものとし、生体に本来必要
な生体防御能力を低下させにくい医療製剤用のペプチド
を提供することである。 【解決手段】 下記のアミノ酸配列からなるペプチドを
１単位とし、２単位のＣ末端同士を遊離Lys を介して連
結した２倍体、２つの２倍体の前記連結に係るLys 同士
を遊離のLys を介して結合した４倍体、２つの４倍体の
前記連結に係るLys 同士を遊離のLys を介して結合した
８倍体、または２つの８倍体の前記連結に係るLys 同士
を遊離のLys を介して結合した１６倍体からなり、補体
成分Ｃ１に対して不活化性を有する補体活性阻害性ペプ
チド、またはこのペプチドを有効成分とする抗補体剤と
する。 Val Gln Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、免疫反応抑制や
アレルギーの発症を防止する医療製剤用のペプチドに関
し、詳しくはヒト血清中の補体の活性化を抑制する補体
活性阻害性ペプチドおよび抗補体剤に関する。
アレルギーの発症を防止する医療製剤用のペプチドに関
し、詳しくはヒト血清中の補体の活性化を抑制する補体
活性阻害性ペプチドおよび抗補体剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】免疫反応による炎症やアレルギーなどを
抑制するために、ヒト血清中の補体反応を抑制する抗補
体剤を用いた治療法が知られている。
抑制するために、ヒト血清中の補体反応を抑制する抗補
体剤を用いた治療法が知られている。
【０００３】補体は、血清中に存在するタンパク質であ
って、Ｃ１、Ｃ４、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ
８、Ｃ９の９成分からなり、抗原抗体複合物または加熱
により凝集した抗体と反応して前記順序で活性化される
（古典的経路）。また活性化の経路において、特にＣ３
とＣ５の分解によって生じたＣ３ａとＣ５ａなどは生理
活性を有し、肥満細胞に作用してヒスタミンを遊離さ
せ、血管の透過性を亢進させたり、平滑筋を収縮させる
アナフィラトキシンとも呼ばれる。
って、Ｃ１、Ｃ４、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ
８、Ｃ９の９成分からなり、抗原抗体複合物または加熱
により凝集した抗体と反応して前記順序で活性化される
（古典的経路）。また活性化の経路において、特にＣ３
とＣ５の分解によって生じたＣ３ａとＣ５ａなどは生理
活性を有し、肥満細胞に作用してヒスタミンを遊離さ
せ、血管の透過性を亢進させたり、平滑筋を収縮させる
アナフィラトキシンとも呼ばれる。
【０００４】このような補体は、最終的には溶菌や溶血
反応を起こす作用があり、抗原が赤血球の場合には、活
性化されたＣ９が細胞膜に障害を与えて溶血反応が起こ
り、また抗原がグラム陰性菌等である場合には溶菌が起
こる。
反応を起こす作用があり、抗原が赤血球の場合には、活
性化されたＣ９が細胞膜に障害を与えて溶血反応が起こ
り、また抗原がグラム陰性菌等である場合には溶菌が起
こる。
【０００５】ところで、ＩｇＧ型抗体では、抗体分子の
Ｆｃ部分のＣＨ２と呼ばれる領域のペプチド（Val Gln
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg ）が、補体の第
１成分（Ｃ１）と結合することが知られている（J. Imm
unol., 27 2555 (1981)）。
Ｆｃ部分のＣＨ２と呼ばれる領域のペプチド（Val Gln
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg ）が、補体の第
１成分（Ｃ１）と結合することが知られている（J. Imm
unol., 27 2555 (1981)）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかし、上記したＩｇ
Ｇ由来のＣ１結合性ペプチドは、補体の第１成分の活性
型（Ｃ１ｑ）との結合力が弱く、このようなペプチド単
独では補体の活性を充分に抑制することが困難であると
考えられていた。
Ｇ由来のＣ１結合性ペプチドは、補体の第１成分の活性
型（Ｃ１ｑ）との結合力が弱く、このようなペプチド単
独では補体の活性を充分に抑制することが困難であると
考えられていた。
【０００７】また、上記したＩｇＧ由来のＣ１結合性ペ
プチド（単独）は、血清中のエンドプロテアーゼで速や
かに分解されてしまうので、医療製剤用のペプチドとし
て実際に使用することは困難であった。
プチド（単独）は、血清中のエンドプロテアーゼで速や
かに分解されてしまうので、医療製剤用のペプチドとし
て実際に使用することは困難であった。
【０００８】また、周知の抗補体剤として、ＣＶＦやｓ
ＣＲＩと呼ばれるものが知られているが、これらは補体
を枯渇させたり、活性化の前記両経路をいずれも抑制す
るものであるため、本来生体に必要な生体防御能力を阻
害したり、低下させたりするものであった。
ＣＲＩと呼ばれるものが知られているが、これらは補体
を枯渇させたり、活性化の前記両経路をいずれも抑制す
るものであるため、本来生体に必要な生体防御能力を阻
害したり、低下させたりするものであった。
【０００９】さらにまた、補体の第１成分の活性型（Ｃ
１ｑ）は、血小板凝集を起こしたり、好中球を活性化す
ることで妊娠中毒症や腎炎、関節リウマチ、膠原病、ア
ルツハイマー病、敗血症や再潅流障害における広汎性血
管内凝固（ＤＩＣ）や組織障害を起こす場合もある。
１ｑ）は、血小板凝集を起こしたり、好中球を活性化す
ることで妊娠中毒症や腎炎、関節リウマチ、膠原病、ア
ルツハイマー病、敗血症や再潅流障害における広汎性血
管内凝固（ＤＩＣ）や組織障害を起こす場合もある。
【００１０】そこで、この発明の課題は、上記した問題
点を解決して、補体の第１成分（Ｃ１）と確実に結合し
てその活性化を充分に抑制できるものとすることであ
る。
点を解決して、補体の第１成分（Ｃ１）と確実に結合し
てその活性化を充分に抑制できるものとすることであ
る。
【００１１】また、この発明の他の課題としては、生体
に本来必要な生体防御能力を低下させにくい医療製剤用
のペプチドまたは抗補体剤を提供することである。
に本来必要な生体防御能力を低下させにくい医療製剤用
のペプチドまたは抗補体剤を提供することである。
【００１２】さらにまた、この発明の他の課題として
は、血清中のエンドプロテアーゼで分解されにくい医療
製剤用のペプチドまたは抗補体剤を提供することであ
る。
は、血清中のエンドプロテアーゼで分解されにくい医療
製剤用のペプチドまたは抗補体剤を提供することであ
る。
【００１３】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
め、この発明においては、下記のアミノ酸配列からなる
ペプチドを１単位とし、２単位のＣ末端同士を遊離Lys
を介して連結した２倍体、２つの２倍体の前記連結に係
るLys 同士を遊離のLys を介して結合した４倍体、２つ
の４倍体の前記連結に係るLys 同士を遊離のLys を介し
て結合した８倍体、または２つの８倍体の前記連結に係
るLys 同士を遊離のLys を介して結合した１６倍体から
なり、補体成分Ｃ１に対して不活化性を有する補体活性
阻害性ペプチドとしたのである。または、このような補
体活性阻害性ペプチドを有効成分とする抗補体剤とした
のである。 Val Gln Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg この発明に係る補体活性阻害性ペプチドは、ヒトＩｇＧ
抗体のＦｃ部分のＣＨ２と呼ばれる領域のペプチドと同
じ配列部分を有しているので、抗原性に乏しく副作用が
少ない。また、ＣＩｑ（Ｃ１の活性型）に選択的に結合
することにより、補体活性化の古典経路のみ抑制し、生
体防御の中心である代価経路を温存することができる。
め、この発明においては、下記のアミノ酸配列からなる
ペプチドを１単位とし、２単位のＣ末端同士を遊離Lys
を介して連結した２倍体、２つの２倍体の前記連結に係
るLys 同士を遊離のLys を介して結合した４倍体、２つ
の４倍体の前記連結に係るLys 同士を遊離のLys を介し
て結合した８倍体、または２つの８倍体の前記連結に係
るLys 同士を遊離のLys を介して結合した１６倍体から
なり、補体成分Ｃ１に対して不活化性を有する補体活性
阻害性ペプチドとしたのである。または、このような補
体活性阻害性ペプチドを有効成分とする抗補体剤とした
のである。 Val Gln Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg この発明に係る補体活性阻害性ペプチドは、ヒトＩｇＧ
抗体のＦｃ部分のＣＨ２と呼ばれる領域のペプチドと同
じ配列部分を有しているので、抗原性に乏しく副作用が
少ない。また、ＣＩｑ（Ｃ１の活性型）に選択的に結合
することにより、補体活性化の古典経路のみ抑制し、生
体防御の中心である代価経路を温存することができる。
【００１４】この発明の抗補体剤は、補体の第１成分の
活性型（Ｃ１ｑ）に起因する症状、その他に補体系の関
与する炎症症状の鎮静化に有効であり、具体的にはII型
アレルギーやIII 型アレルギー（例えば、血清病、動物
由来モノクローナル抗体を用いた治療薬によるショック
症状の治療、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、進行
性全身性硬化症、結節性多発性動脈炎、リウマチ熱、関
節リュウマチ、皮膚筋炎など）の治療や予防に使用でき
るものである。また、敗血症、ＤＩＣなどＣ１ｑが増悪
因子となっている病態を改善するのに使用できるもので
ある。また、輸血製剤中のＣ１ｑの定量などの検査試薬
としても利用可能である。
活性型（Ｃ１ｑ）に起因する症状、その他に補体系の関
与する炎症症状の鎮静化に有効であり、具体的にはII型
アレルギーやIII 型アレルギー（例えば、血清病、動物
由来モノクローナル抗体を用いた治療薬によるショック
症状の治療、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、進行
性全身性硬化症、結節性多発性動脈炎、リウマチ熱、関
節リュウマチ、皮膚筋炎など）の治療や予防に使用でき
るものである。また、敗血症、ＤＩＣなどＣ１ｑが増悪
因子となっている病態を改善するのに使用できるもので
ある。また、輸血製剤中のＣ１ｑの定量などの検査試薬
としても利用可能である。
【００１５】
【発明の実施の形態】この発明における所定のアミノ酸
配列からなるペプチドは、上述のように化学合成法など
の周知のペプチド調製方法を用いて製造することができ
る。具体的には、化学合成、遺伝子組み替えなどの手法
で製造することができる。
配列からなるペプチドは、上述のように化学合成法など
の周知のペプチド調製方法を用いて製造することができ
る。具体的には、化学合成、遺伝子組み替えなどの手法
で製造することができる。
【００１６】固相合成法によりペプチドを合成する場合
には、架橋ポリスチレンなどの不溶性支持体上に合成す
べきペプチドのＣ末端のアミノ酸を固定し、それを起点
としてマイクロコンピュータで制御された市販の合成装
置でＮ−α−ｔ−ブトキシカルボニル化アミノ酸（Ｂｏ
ｃ−アミノ酸）またはＮ−α−９−フルオレニルメトキ
シカルボニル化アミノ酸（Ｆｍｏｃ−アミノ酸）に対し
て、適宜に保護基を除去して順に所要のペプチド鎖を伸
長させる。因みに、ペプチド合成機の製造会社または販
売会社としては、ファルマシア バイオテク社、パーキ
ンエルマージャパン社、アロカ社、島津製作所製などが
ある。
には、架橋ポリスチレンなどの不溶性支持体上に合成す
べきペプチドのＣ末端のアミノ酸を固定し、それを起点
としてマイクロコンピュータで制御された市販の合成装
置でＮ−α−ｔ−ブトキシカルボニル化アミノ酸（Ｂｏ
ｃ−アミノ酸）またはＮ−α−９−フルオレニルメトキ
シカルボニル化アミノ酸（Ｆｍｏｃ−アミノ酸）に対し
て、適宜に保護基を除去して順に所要のペプチド鎖を伸
長させる。因みに、ペプチド合成機の製造会社または販
売会社としては、ファルマシア バイオテク社、パーキ
ンエルマージャパン社、アロカ社、島津製作所製などが
ある。
【００１７】ショートペプチドの２〜１６倍体のＭＡＰ
（Multiple antigen peptide) を製造するには、架橋ポ
リスチレンなどの不溶性支持体にＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏ
ｃ）またはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）を用いて枝分
かれペプチドを合成し、そこに抗原のペプチドのＣ末端
のアミノ酸を固定し、それを起点としてペプチドを成長
させていく方法を採用できる。ペプチドを成長させるに
は、通常の固相合成法によりペプチドを合成する方法で
あるＢｏｃ法やＦｍｏｃ法を採用できる。
（Multiple antigen peptide) を製造するには、架橋ポ
リスチレンなどの不溶性支持体にＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏ
ｃ）またはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）を用いて枝分
かれペプチドを合成し、そこに抗原のペプチドのＣ末端
のアミノ酸を固定し、それを起点としてペプチドを成長
させていく方法を採用できる。ペプチドを成長させるに
は、通常の固相合成法によりペプチドを合成する方法で
あるＢｏｃ法やＦｍｏｃ法を採用できる。
【００１８】その際に注意すべきことは、反応点が増加
するので最初のＬｙｓの含有量を０．１ｍｍｏｌ／ｇ程
度に調節すること、およびぺプチド鎖を成長させるアミ
ノ酸縮合反応の後、未反応のアミノ基を必ずアセチル化
して、それ以後のペプチド鎖の伸長を阻止し、途中のア
ミノ酸が欠落したペプチドを生成しないようにすること
である。
するので最初のＬｙｓの含有量を０．１ｍｍｏｌ／ｇ程
度に調節すること、およびぺプチド鎖を成長させるアミ
ノ酸縮合反応の後、未反応のアミノ基を必ずアセチル化
して、それ以後のペプチド鎖の伸長を阻止し、途中のア
ミノ酸が欠落したペプチドを生成しないようにすること
である。
【００１９】この発明の所定のアミノ酸配列からなるペ
プチドを有効成分とする抗補体剤の有効成分の投与量
は、患者の年齢や体重その他の最適な条件で個別に設定
されるため、特に限定されるものではないが、例えば経
口投与の場合、成人に対して一日５〜１０ｍｇ程度を投
与することが好ましい。
プチドを有効成分とする抗補体剤の有効成分の投与量
は、患者の年齢や体重その他の最適な条件で個別に設定
されるため、特に限定されるものではないが、例えば経
口投与の場合、成人に対して一日５〜１０ｍｇ程度を投
与することが好ましい。
【００２０】また、この発明の補体活性阻害性ペプチド
を有効成分とする抗補体剤は、プロテアーゼで分解され
難いので、経口、外用、筋肉注射、静脈注射のいずれの
処方も採用できるものである。
を有効成分とする抗補体剤は、プロテアーゼで分解され
難いので、経口、外用、筋肉注射、静脈注射のいずれの
処方も採用できるものである。
【００２１】投与に際しては、有効成分を薬理学的に許
容される担体や賦型剤などを混合することもでき、製剤
の形態としては、錠剤、顆粒剤などの固形剤、溶液剤、
懸濁剤などの液剤その他の周知の剤型が挙げられる。
容される担体や賦型剤などを混合することもでき、製剤
の形態としては、錠剤、顆粒剤などの固形剤、溶液剤、
懸濁剤などの液剤その他の周知の剤型が挙げられる。
【００２２】
【実施例】〔比較例１〕自動ペプチド合成機（バイオシ
ステム社製：ＡＢＩ ４３１Ａ）を用い、J.Am.Chem.,8
5,2149 (1963) に記載の化学合成法（ｔ−Ｂｏｃ法によ
る固相合成法で縮合剤としてＢＯＰを使用する。）によ
り、アミノ酸配列が、Thr Lys Pro Argからなるペプチ
ド（２８９−２９２）を作製し、逆相カラムを用いた高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製し
た。
ステム社製：ＡＢＩ ４３１Ａ）を用い、J.Am.Chem.,8
5,2149 (1963) に記載の化学合成法（ｔ−Ｂｏｃ法によ
る固相合成法で縮合剤としてＢＯＰを使用する。）によ
り、アミノ酸配列が、Thr Lys Pro Argからなるペプチ
ド（２８９−２９２）を作製し、逆相カラムを用いた高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製し
た。
【００２３】〔比較例２〕自動ペプチド合成機（バイオ
システム社製：４３１）を用い、J.Am.Chem.,85,2149
(1963) に記載の化学合成法（ｔ−Ｂｏｃ法による固相
合成法で縮合剤としてＢＯＰを使用する。）により、ア
ミノ酸配列が、Val Gln Val His Asn Ala Lys Thr Lys
Pro Arg からなるペプチドを作製し、逆相カラムを用い
た高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精
製した。
システム社製：４３１）を用い、J.Am.Chem.,85,2149
(1963) に記載の化学合成法（ｔ−Ｂｏｃ法による固相
合成法で縮合剤としてＢＯＰを使用する。）により、ア
ミノ酸配列が、Val Gln Val His Asn Ala Lys Thr Lys
Pro Arg からなるペプチドを作製し、逆相カラムを用い
た高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精
製した。
【００２４】ＨＰＬＣは、粒径５μｍのＣ18シリカゲル
を充填した和光純薬社製の内径φ４．６ｍｍ、長さ２５
０ｍｍのカラム（Wakosil-２、５Ｃ１８ ＡＲ）を用
い、ペプチド溶出の条件は初期溶媒を０．１％テトラフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液に５％アセトニトリル（Ｃ
Ｈ3 ＣＮ）を含ませた混合溶液とし、アセトニトリル濃
度を５〜６５％の範囲で経時的に濃度勾配を設けて毎分
９．５ｍｌの流量で３０分溶出とした。
を充填した和光純薬社製の内径φ４．６ｍｍ、長さ２５
０ｍｍのカラム（Wakosil-２、５Ｃ１８ ＡＲ）を用
い、ペプチド溶出の条件は初期溶媒を０．１％テトラフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液に５％アセトニトリル（Ｃ
Ｈ3 ＣＮ）を含ませた混合溶液とし、アセトニトリル濃
度を５〜６５％の範囲で経時的に濃度勾配を設けて毎分
９．５ｍｌの流量で３０分溶出とした。
【００２５】ＨＰＬＣは、波長２２０ｎｍの紫外線検出
器を用い、吸光度のピークを検出し、その結果を図１に
示した。なお、ピークリポートは以下の通りである。 ピーク番号 検出時間（分） エリア 高さ 濃度 １ ６．２ ２５９２２６ ２６９３２ ３．６ ２ ６．５ ６９４３３９６ ６４０６５１ ９６．４ 。
器を用い、吸光度のピークを検出し、その結果を図１に
示した。なお、ピークリポートは以下の通りである。 ピーク番号 検出時間（分） エリア 高さ 濃度 １ ６．２ ２５９２２６ ２６９３２ ３．６ ２ ６．５ ６９４３３９６ ６４０６５１ ９６．４ 。
【００２６】〔実施例１〕自動ペプチド合成機（バイオ
システム社製：ＡＢＩ ４３１Ａ）を用い、J.Am.Che
m.,85,2149 (1963) に記載の化学合成法（ｔ−Ｂｏｃ法
による固相合成法で縮合剤としてＢＯＰを使用する。）
を利用すると共に、バイオケミストリー第８５巻、pp.5
409-5413（１９８８年８月発行）に記載のジェームス
（ＪＡＭＥＳＰ．ＴＡＭ）の方法に従って、２倍体、４
倍体、８倍体または１６倍体のＭＡＰを製造した。
システム社製：ＡＢＩ ４３１Ａ）を用い、J.Am.Che
m.,85,2149 (1963) に記載の化学合成法（ｔ−Ｂｏｃ法
による固相合成法で縮合剤としてＢＯＰを使用する。）
を利用すると共に、バイオケミストリー第８５巻、pp.5
409-5413（１９８８年８月発行）に記載のジェームス
（ＪＡＭＥＳＰ．ＴＡＭ）の方法に従って、２倍体、４
倍体、８倍体または１６倍体のＭＡＰを製造した。
【００２７】すなわち、ジビニルベンゼンで架橋したポ
リスチレン樹脂に官能基を導入した樹脂（ヒドロキシメ
チルフェニルアセトアミド樹脂（ＰＡＭレジンとも呼ば
れる）、または４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂）
にＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）を使用する自動ペプチド合
成機を用いた。
リスチレン樹脂に官能基を導入した樹脂（ヒドロキシメ
チルフェニルアセトアミド樹脂（ＰＡＭレジンとも呼ば
れる）、または４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂）
にＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）を使用する自動ペプチド合
成機を用いた。
【００２８】自動ペプチド合成機では、Ｂｏｃ−Ａｌａ
−ＰＡＭレジン0.０３ｍｍｏｌ（0.５ｍｍｏｌの１６分
の１）とＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ0.０９ｍｍｏ
ｌをＢＯＰでカップリングさせて２倍体のＭＡＰのコア
を製造した。次に、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ0.
０９ｍｍｏｌをＢＯＰでカップリングさせた後、Ｂｏｃ
−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ0.１８ｍｍｏｌをＢＯＰでカ
ップリングさせて４倍体のＭＡＰのコアを製造した。さ
らに、同様にＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ0.３６ｍ
ｍｏｌをＢＯＰでカップリングさせて８倍体のＭＡＰの
コアを製造し、さらにＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ
0.７２ｍｍｏｌをＢＯＰでカップリングさせて１６倍体
のＭＡＰのコアを製造した。この合成工程を図２に示
し、参考のため樹脂から切り出した状態のＭＡＰ１６の
コアの構造を図３に示した。なお、図２中のＫおよびＡ
は、それぞれＬｙｓ、Ａｌａの略式表示である。
−ＰＡＭレジン0.０３ｍｍｏｌ（0.５ｍｍｏｌの１６分
の１）とＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ0.０９ｍｍｏ
ｌをＢＯＰでカップリングさせて２倍体のＭＡＰのコア
を製造した。次に、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ0.
０９ｍｍｏｌをＢＯＰでカップリングさせた後、Ｂｏｃ
−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ0.１８ｍｍｏｌをＢＯＰでカ
ップリングさせて４倍体のＭＡＰのコアを製造した。さ
らに、同様にＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ0.３６ｍ
ｍｏｌをＢＯＰでカップリングさせて８倍体のＭＡＰの
コアを製造し、さらにＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ
0.７２ｍｍｏｌをＢＯＰでカップリングさせて１６倍体
のＭＡＰのコアを製造した。この合成工程を図２に示
し、参考のため樹脂から切り出した状態のＭＡＰ１６の
コアの構造を図３に示した。なお、図２中のＫおよびＡ
は、それぞれＬｙｓ、Ａｌａの略式表示である。
【００２９】次に、前記自動ペプチド合成機でアルギニ
ン（Ａｒｇ）を固定し、分岐型ペプチドの２、４、８ま
たは１６個のＮ末端に、周知のＢｏｃ法によりアミノ酸
配列がVal Gln Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
からなるペプチドをそれぞれ作製し、ショートペプチド
を２、４、８または１６単位結合した２、４、８または
１６倍体のＭＡＰ（Multiple antigen peptide) を製造
し、それぞれ溶媒で保護基の除去およびペプチドの脱離
を行なった。
ン（Ａｒｇ）を固定し、分岐型ペプチドの２、４、８ま
たは１６個のＮ末端に、周知のＢｏｃ法によりアミノ酸
配列がVal Gln Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
からなるペプチドをそれぞれ作製し、ショートペプチド
を２、４、８または１６単位結合した２、４、８または
１６倍体のＭＡＰ（Multiple antigen peptide) を製造
し、それぞれ溶媒で保護基の除去およびペプチドの脱離
を行なった。
【００３０】因みに、自動ペプチド合成機による固相合
成（Ｂｏｃ法、0.５ｍｍｏｌスケール）では、下記の
〜の機械的な操作を繰り返すことで、所定のアミノ酸
を樹脂にＣ末端から連結させる。なお、操作中溶液の量
は約５〜１０ｍｌである。 脱Ｂｏｃ化 ５０％ＴＦＡ／ジクロロメタン ５
ｍｉｎ ボルテックス（攪拌）→溶液を排出→５０％Ｔ
ＦＡ／ジクロロメタン ３０ｍｉｎ ボルテックス→溶
液を排出 洗浄 （ジクロロメタン １ｍｉｎ ボルテックス
→溶液を排出）×３回→（ＤＭＦ １ｍｉｎ ボルテッ
クス→溶液を排出）×３回 縮合 Ｂｏｃ−アミノ酸1.５ｍｍｏｌ／ＤＭＦ、Ｂ
ＯＰ1.５ｍｍｏｌ／ＤＭＦ、ＤＩＥＡ２ｍｍｏｌ ４０
ｍｉｎ→排出 洗浄 （ＤＭＦ １ｍｉｎ ボルテックス→溶液を
排出）×３回→（ジクロロメタン １ｍｉｎ ボルテッ
クス→溶液を排出）×３回 。
成（Ｂｏｃ法、0.５ｍｍｏｌスケール）では、下記の
〜の機械的な操作を繰り返すことで、所定のアミノ酸
を樹脂にＣ末端から連結させる。なお、操作中溶液の量
は約５〜１０ｍｌである。 脱Ｂｏｃ化 ５０％ＴＦＡ／ジクロロメタン ５
ｍｉｎ ボルテックス（攪拌）→溶液を排出→５０％Ｔ
ＦＡ／ジクロロメタン ３０ｍｉｎ ボルテックス→溶
液を排出 洗浄 （ジクロロメタン １ｍｉｎ ボルテックス
→溶液を排出）×３回→（ＤＭＦ １ｍｉｎ ボルテッ
クス→溶液を排出）×３回 縮合 Ｂｏｃ−アミノ酸1.５ｍｍｏｌ／ＤＭＦ、Ｂ
ＯＰ1.５ｍｍｏｌ／ＤＭＦ、ＤＩＥＡ２ｍｍｏｌ ４０
ｍｉｎ→排出 洗浄 （ＤＭＦ １ｍｉｎ ボルテックス→溶液を
排出）×３回→（ジクロロメタン １ｍｉｎ ボルテッ
クス→溶液を排出）×３回 。
【００３１】次に、樹脂からの切り出しと同時にアミノ
酸側鎖の保護基の脱保護をフッ化水素（ＨＦ）で行なっ
た。すなわち、ＨＦ反応管に、樹脂５００ｍｇ、ｍ−ク
レゾール１ｍｌ、エタンジオール0.７ｍｌ、ジメチルス
ルフィド0.５ｍｌを入れ、ＨＦ装置に装着した。減圧
下、−７８℃に反応管を冷却し、ＨＦ１０ｍｌを反応管
に導いた。０℃で１時間攪拌した後、ＨＦを留去した。
無水エーテルを加え、残渣をガラスフィルターに移し、
エーテルジクロロメタンでよく洗浄した。１０％酢酸水
でペプチドを溶解させ、ろ液を凍結乾燥した。
酸側鎖の保護基の脱保護をフッ化水素（ＨＦ）で行なっ
た。すなわち、ＨＦ反応管に、樹脂５００ｍｇ、ｍ−ク
レゾール１ｍｌ、エタンジオール0.７ｍｌ、ジメチルス
ルフィド0.５ｍｌを入れ、ＨＦ装置に装着した。減圧
下、−７８℃に反応管を冷却し、ＨＦ１０ｍｌを反応管
に導いた。０℃で１時間攪拌した後、ＨＦを留去した。
無水エーテルを加え、残渣をガラスフィルターに移し、
エーテルジクロロメタンでよく洗浄した。１０％酢酸水
でペプチドを溶解させ、ろ液を凍結乾燥した。
【００３２】得られたペプチドのうち１６倍体のＭＡＰ
は、比較例２と全く同様にして逆相カラムを用いた高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行ない精製し
た。ＨＰＬＣは、波長２２０ｎｍの紫外線検出器を用
い、吸光度のピークを検出し、その結果を図５に示し
た。なお、ピークリポートは以下の通りである。 ピーク番号 検出時間（分） エリア 高さ 濃度 １ １０．０ ４４６００７０ ５９０２２ ９９．８ ２ １５．９ ７６２７ ５６３ ０．２ 。
は、比較例２と全く同様にして逆相カラムを用いた高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行ない精製し
た。ＨＰＬＣは、波長２２０ｎｍの紫外線検出器を用
い、吸光度のピークを検出し、その結果を図５に示し
た。なお、ピークリポートは以下の通りである。 ピーク番号 検出時間（分） エリア 高さ 濃度 １ １０．０ ４４６００７０ ５９０２２ ９９．８ ２ １５．９ ７６２７ ５６３ ０．２ 。
【００３３】〔比較例３〕比較例２と同様のペプチド合
成機を用いた化学合成法により、アミノ酸配列がHis Le
u Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser からなるペプチド
を作製した。そして、得られたペプチドを逆相カラムを
用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によっ
て精製した。
成機を用いた化学合成法により、アミノ酸配列がHis Le
u Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser からなるペプチド
を作製した。そして、得られたペプチドを逆相カラムを
用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によっ
て精製した。
【００３４】〔比較例４〕比較例２と同様のペプチド合
成機を用いた化学合成法により、アミノ酸配列が、His
Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser （配列番号３）
からなるペプチドを作製し、さらに実施例１と全く同じ
操作を行なって上記アミノ酸配列のＣ末端にLys を結合
した１６倍体のＭＡＰを作成した。そして、得られた１
６倍体のＭＡＰを逆相カラムを用いた高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。
成機を用いた化学合成法により、アミノ酸配列が、His
Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser （配列番号３）
からなるペプチドを作製し、さらに実施例１と全く同じ
操作を行なって上記アミノ酸配列のＣ末端にLys を結合
した１６倍体のＭＡＰを作成した。そして、得られた１
６倍体のＭＡＰを逆相カラムを用いた高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。
【００３５】以上のようにして得た実施例１、比較例１
〜４（表１にまとめてアミノ酸配列を示した。）および
参考としてのＩｇＧ、ＩｇＧのＦａｂ部分、ＩｇＧのＦ
ｃ部分についての抗補体作用を調べるため、以下の条件
による新鮮ヒト血清によるブタ赤血球溶血反応阻害率を
測定した。
〜４（表１にまとめてアミノ酸配列を示した。）および
参考としてのＩｇＧ、ＩｇＧのＦａｂ部分、ＩｇＧのＦ
ｃ部分についての抗補体作用を調べるため、以下の条件
による新鮮ヒト血清によるブタ赤血球溶血反応阻害率を
測定した。
【００３６】《ブタ赤血球溶血反応阻害率の測定》１０
μｌの新鮮ヒト血清に３０μｌの段階希釈した各種阻害
剤（実施例、比較例等）を混合し、速やかに２０μｌの
３％ブタ赤血球と３７℃の下で３０分反応させ、３％ブ
タ赤血球の溶血阻害率（５０％阻害定数＝Ｉ50、単位：
ｍＭ）を調べ、結果を表２に示した。
μｌの新鮮ヒト血清に３０μｌの段階希釈した各種阻害
剤（実施例、比較例等）を混合し、速やかに２０μｌの
３％ブタ赤血球と３７℃の下で３０分反応させ、３％ブ
タ赤血球の溶血阻害率（５０％阻害定数＝Ｉ50、単位：
ｍＭ）を調べ、結果を表２に示した。
【００３７】
【表１】
【００３８】
【表２】
【００３９】表２の結果からも明らかなように、実施例
１の補体活性阻害性ペプチドは、ＩｇＧと比較して１６
７倍（０．１／０．０００６）、比較例２と比べて５５
００倍（３．３／０．０００６）の阻害効果が認められ
た。
１の補体活性阻害性ペプチドは、ＩｇＧと比較して１６
７倍（０．１／０．０００６）、比較例２と比べて５５
００倍（３．３／０．０００６）の阻害効果が認められ
た。
【００４０】なお、上記評価は、比較例２のペプチドが
活性型の補体成分Ｃｌｑと結合することが周知であるた
め、ペプチドによる溶血反応阻害は、Ｃｌｑとの結合に
よる結果であるとの考えに基づいている。
活性型の補体成分Ｃｌｑと結合することが周知であるた
め、ペプチドによる溶血反応阻害は、Ｃｌｑとの結合に
よる結果であるとの考えに基づいている。
【００４１】次に、新鮮ヒト血清と３％ブタ赤血球の組
合わせの代わりに、精製補体と感作ヒツジ赤血球を用い
て同様の抗補体作用、すなわち赤血球溶血反応阻害試験
を行なった。
合わせの代わりに、精製補体と感作ヒツジ赤血球を用い
て同様の抗補体作用、すなわち赤血球溶血反応阻害試験
を行なった。
【００４２】この結果、ＩｇＧのＩ50は、０．０５ｍ
Ｍ、比較例２（Val Gln Val His AsnAla Lys Thr Lys P
ro Arg のアミノ酸配列からなるペプチド）は、０．７
２ｍＭであった。
Ｍ、比較例２（Val Gln Val His AsnAla Lys Thr Lys P
ro Arg のアミノ酸配列からなるペプチド）は、０．７
２ｍＭであった。
【００４３】上記試験における溶血反応阻害率を新鮮ヒ
ト血清を用いた試験の結果と比較すると、ＩｇＧに関し
てはほぼ同じ結果であるが、比較例２に関しては４．５
倍の強い阻害効果が認められた。精製補体と感作ヒツジ
赤血球を用いた抗補剤の赤血球溶血反応阻害試験におけ
る系にはエンドプロテアーゼが存在しないので、上記結
果は、ショートペプチドの比較例２が血中で分解されな
いことに起因すると考えられる。そして、このことから
実施例１は、新鮮ヒト血清を用いた前記試験においても
強い溶血反応阻害率を示すことから、血清中のエンドプ
ロテアーゼで分解されにくい特性を示していた。
ト血清を用いた試験の結果と比較すると、ＩｇＧに関し
てはほぼ同じ結果であるが、比較例２に関しては４．５
倍の強い阻害効果が認められた。精製補体と感作ヒツジ
赤血球を用いた抗補剤の赤血球溶血反応阻害試験におけ
る系にはエンドプロテアーゼが存在しないので、上記結
果は、ショートペプチドの比較例２が血中で分解されな
いことに起因すると考えられる。そして、このことから
実施例１は、新鮮ヒト血清を用いた前記試験においても
強い溶血反応阻害率を示すことから、血清中のエンドプ
ロテアーゼで分解されにくい特性を示していた。
【００４４】
【発明の効果】以上説明したように、所定のアミノ酸配
列で補体成分Ｃ１の不活化性を有するこの発明の補体活
性阻害性ペプチドまたは抗補体剤は、補体の第１成分
（Ｃ１）と確実に結合してその活性化を充分に抑制でき
るという利点がある。
列で補体成分Ｃ１の不活化性を有するこの発明の補体活
性阻害性ペプチドまたは抗補体剤は、補体の第１成分
（Ｃ１）と確実に結合してその活性化を充分に抑制でき
るという利点がある。
【００４５】また、この発明の補体活性阻害性ペプチド
および抗補体剤は、生体に本来必要な生体防御能力を低
下させにくいものである。
および抗補体剤は、生体に本来必要な生体防御能力を低
下させにくいものである。
【００４６】さらにまた、この発明の補体活性阻害性ペ
プチドまたは抗補体剤は、血清中のエンドプロテアーゼ
で分解されにくいという利点もある。
プチドまたは抗補体剤は、血清中のエンドプロテアーゼ
で分解されにくいという利点もある。
【００４７】
配列番号：１ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：２ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：３ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【図１】比較例２のＨＰＬＣの測定チャートを示す図表
【図２】分岐型ペプチド（ＭＡＰ２、４、８、１６のコ
ア）の合成工程の説明図
ア）の合成工程の説明図
【図３】リジン（Lys)１５個が連結した分岐型ペプチド
の構造を示す説明図
の構造を示す説明図
【図４】分岐したペプチド（ＭＡＰ）からなる実施例１
のアミノ酸配列を示す図表
のアミノ酸配列を示す図表
【図５】実施例１のＨＰＬＣの測定チャートを示す図表
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 596141952 東 成見 愛知県名古屋市昭和区汐見町137番地の１ (72)発明者 カルロス アドリエル デル カルピオ 愛知県豊橋市浜道町管石32−２−202 (72)発明者 小島 泰樹 愛知県渥美郡田原町大字田原字築出20番地 の１ ファミールハイツ202
Claims (2)
- 【請求項１】 下記のアミノ酸配列からなるペプチドを
１単位とし、２単位のＣ末端同士を遊離Lys を介して連
結した２倍体、２つの２倍体の前記連結に係るLys 同士
を遊離のLys を介して結合した４倍体、２つの４倍体の
前記連結に係るLys 同士を遊離のLys を介して結合した
８倍体、または２つの８倍体の前記連結に係るLys 同士
を遊離のLys を介して結合した１６倍体からなり、補体
成分Ｃ１に対して不活化性を有する補体活性阻害性ペプ
チド。 Val Gln Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg - 【請求項２】 請求項１記載の補体活性阻害性ペプチド
を有効成分とする抗補体剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9338964A JPH11199599A (ja) | 1997-12-09 | 1997-12-09 | 補体活性阻害性ペプチドおよび抗補体剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9338964A JPH11199599A (ja) | 1997-12-09 | 1997-12-09 | 補体活性阻害性ペプチドおよび抗補体剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11199599A true JPH11199599A (ja) | 1999-07-27 |
Family
ID=18322999
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9338964A Pending JPH11199599A (ja) | 1997-12-09 | 1997-12-09 | 補体活性阻害性ペプチドおよび抗補体剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11199599A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007106732A (ja) * | 2005-10-14 | 2007-04-26 | Ortec Inc | 細胞機能を変化させるための方法および組成物 |
| EP2415780A1 (en) * | 2009-03-30 | 2012-02-08 | Hebei Yuansen Pharmaceutical Co., Ltd. | Synthetic peptide and uses thereof |
| US8865763B2 (en) | 2005-10-14 | 2014-10-21 | Alltech, Inc. | Methods and compositions for altering cell function |
| US8871715B2 (en) | 2005-10-14 | 2014-10-28 | Alltech, Inc. | Use of selenium compounds, especially selenium yeasts for altering cognitive function |
-
1997
- 1997-12-09 JP JP9338964A patent/JPH11199599A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007106732A (ja) * | 2005-10-14 | 2007-04-26 | Ortec Inc | 細胞機能を変化させるための方法および組成物 |
| US8865763B2 (en) | 2005-10-14 | 2014-10-21 | Alltech, Inc. | Methods and compositions for altering cell function |
| US8871715B2 (en) | 2005-10-14 | 2014-10-28 | Alltech, Inc. | Use of selenium compounds, especially selenium yeasts for altering cognitive function |
| EP2415780A1 (en) * | 2009-03-30 | 2012-02-08 | Hebei Yuansen Pharmaceutical Co., Ltd. | Synthetic peptide and uses thereof |
| EP2415780A4 (en) * | 2009-03-30 | 2012-10-10 | Hebei Yuansen Pharmaceutical Co Ltd | SYNTHETIC PEPTIDE AND USES THEREOF |
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