JPH11124394A - 低密度リボタンパク安定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 低密度リボタンパクを安定化させ、特に冷凍
及び凍結乾燥時に変性することを防止し、保存時の安定
化を効果的に達成できる低密度リボタンパクの安定化法
を提供する。 【解決手段】 トレハロースを低密度リボタンパク（Ｌ
ＤＬ等）を含む溶液に加え、冷凍ないしは凍結乾燥を行
うことからなる低密度リボタンパク安定化法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、低密度リボタンパ
クを安定化させる安定化法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、タンパクの安定化方法としては、
グリセロール、ショ糖、ポリオール等を高濃度に加える
方法が用いられている。これらグリセロール、ショ糖、
ポリオール等は、アルブミン、グロブリン、酵素等のタ
ンパクには有効であり、また、リボタンパクのうち高密
度リボタンパクには有効である。しかし、低密度リボタ
ンパク、特に密度画分１．００６〜１．０６３の低密度
リボタンパクに対しては効果はない。

【０００３】低密度リボタンパク中に含まれるコレステ
ロール量は、心疾患、動脈硬化のリスクファクターとし
て知られており、将来、その重要度は増大することが確
実と言われている。しかし、その測定における基準とな
る低密度リボタンパク校正液はきわめて不安定であるた
め、これを安定化する安定化方法が強く要望されてい
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述した従
来技術の問題点を解決して、低密度リボタンパクを安定
化させる有効な安定化法を提供することを目的とする。
特に、低密度リボタンパクが、冷凍及び凍結乾燥時に変
性することを防止し、かつ、保存時の安定化を効果的に
達成できる低密度リボタンパクの安定化法を提供するこ
とを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明に係る低密度リボ
タンパク安定化方法は、トレハロースを低密度リボタン
パクを含む溶液に加え、冷凍ないしは凍結乾燥を行うこ
とからなるものである。ここで、冷凍ないしは凍結乾燥
とは、冷凍の場合、凍結乾燥の場合、及びこれらの中間
的な状態と考えられる状態を含むものである。一般的に
は、通常概念における冷凍または、凍結乾燥を行う。

【０００６】本発明は、安定化剤にトレハロースを用
い、それをＬＤＬを含む溶液に加えた後、冷凍保存、も
しくは凍結乾燥保存を行う形態で実施できる。

【０００７】本発明者の知見によれば、トレハロース
は、リボタンパクのうち、低密度リボタンパク、特に密
度画分１．００６〜１．０６３の低密度リボタンパクの
有する特異的な変性を効果的に防止する。しかしその作
用機構は不明であり、同じ非還元性二糖類であるスクロ
ース、単糖のトレオース、キシロース等には、このよう
な作用はない。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明の好ましい実施の形
態例について、説明する。ただし当然のことではある
が、本発明は以下の述べる実施の形態例により、限定を
受けるものではない。

【０００９】以下の実施の形態例において、生理食塩
水、緩衝液、血清、血漿等、ＬＤＬを含む溶液に、トレ
ハロースを１０〜２５０ｍｇ／リットルの割合で加えて
溶かす。次に、フィルターろ過（たとえば０．２μｍフ
ィルターを用いる）し、必要に応じて、殺菌剤、防腐剤
を加えて、混ぜる。次に、所要量に分注し、冷凍保存
（−１０〜−８０℃）、もしくは凍結乾燥し、冷凍保存
する。

【００１０】実施の形態例１ ０．２μｍフィルターろ過血清１ｍｌに対し、トレハロ
ース５０ｍｇを加え、かき混ぜて溶解した。トレハロー
ス未添加血清と添加血清について、アガロース電気泳動
法により、リボタンパク分画パターンを比較したとこ
ろ、全く差は見られず、トレハロースが低密度、高密度
リボタンパクの電荷に何ら影響を与えていなかった。

【００１１】次に、トレハロース添加血清及びトレハロ
ース未添加血清を冷凍し、１日経過後、ＬＤＬコレステ
ロールをヘパリンクエン酸法で測定した。その結果、表
１に示すように、トレハロース未添加の場合、冷凍によ
り、１０ｍｇ／ｄｌ増加し、ＬＤＬの変性が明らかに生
じているが、トレハロース添加血清については差は見ら
れず、トレハロースが凍結時にＬＤＬ保護剤としての作
用を示したことがわかる。

【００１２】

【表１】

【００１３】なお、凍結前試料は、液体窒素保存し、−
４０℃凍結試料と同時測定し、測定による誤差を回避し
た。

【００１４】実施の形態例２ 血清の由来を変え、実施の形態例１と同様の実験を行っ
た。ここでは、安定化の再現性を見るために、血清のロ
ットを変えて実施した。その結果を表２に示す。本例に
おいても、トレハロースの効果が見られる。血清は生物
学的材料であるため、十分な再現性が見られないことが
あるが、本発明については、安定した再現性が得られる
ことが分かる。

【００１５】

【表２】

【００１６】実施の形態例３ 実施の形態例１，２とは異なる血清について、実施の形
態例１と同様に操作し、保存安定性を調べた。その結果
を表３に示す。上記したように、血清は生物学的材料で
あり、一般に数十人の血清をブレンドしたものが使用さ
れ、よって成分組成がどうしても多少は異なって、リボ
タンパクの強じん性も異なる。したがって本例でも、異
なる血清を用いて、いずれの血清に対しても安定化の効
果が見られるかどうかを調べたものである。

【００１７】

【表３】

【００１８】本例で調べた血清についても、その保存の
状況は、液体窒素−１９０℃保存と比較して、−４０℃
保存であっても、４週間、ほとんどＬＤＬコレステロー
ルの値に差は見られず、冷凍安定性が得られていること
がわかる。

【００１９】実施の形態例４ 図１及び図２を参照する。図２は、本例における凍結乾
燥前のトレハロース添加血清の電気泳動パターンを示す
図である。図１は、本例においてトレハロース添加血清
を凍結乾燥し、水を加えて復元した血清の電気泳動パタ
ーンを示す図であって、本実施の形態例の安定化の効果
を示すものである。

【００２０】本例では、血清１ｍｌに対し、トレハロー
ス４０ｍｇの割合で溶かし、防腐剤を加えた後、凍結乾
燥を行った。次にこれを３７℃で保存し、加速試験を行
った。

【００２１】まず、凍結乾燥に対する安定剤の効果を電
気泳動的に調べた。その結果、図２（凍結乾燥前）及び
図１（凍結乾燥後復元）に示すように、差は見られな
い。ＬＤＬのリボタンパク分画割合も、それぞれ４８
％、４６％で、有意な差はない。また、凍結乾燥前のＬ
ＤＬコレステロール値は、１４０ｍｇ／ｄｌであった
が、凍結乾燥後も１４０ｍｇ／ｄｌで差は見られず、凍
結乾燥に対して安定化作用が見られる。

【００２２】次に、３７℃で１０日間保存した結果、ス
タート時１４１ｍｇ／ｄｌ、１４０ｍｇ／ｄｌ、１４２
ｍｇ／ｄｌ、平均１４１ｍｇ／ｄｌであったのが、１０
日後、１４０ｍｇ／ｄｌ、１４０ｍｇ／ｄｌ、１４１ｍ
ｇ／ｄｌ、平均１４０ｍｇ／ｄｌと、ほとんど差は見ら
れず、保存性も優れていた。

【００２３】なお、本例について、高密度リボタンパク
についても測定を行ったが、低密度リボタンパクと同様
に安定であり、本例は、高密度リボタンパクについても
利用できる。すなわち、本発明は他の安定剤と同様、高
密度リボタンパクについて安定化の効果があり、かつ、
他の安定剤では果たせない、低密度リボタンパクに対し
ての安定化効果をも有する、優れた手法ということがで
きる。

【００２４】参考例 しょ糖を血清１ｍｌに対して１５０ｍｇの割合で溶か
し、防腐剤を加えて、凍結乾燥を行ったところ、凍結乾
燥を行わない場合のＬＤＬコレステロールの濃度は６８
ｍｇ／ｄｌであったが、これを凍結乾燥し、水で元の血
清に復元し、ＬＤＬコレステロール濃度を測定したとこ
ろ、４５ｍｇ／ｄｌであった。すなわち、しょ糖では、
ＬＤＬの変性を防止できない。

【００２５】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
トレハロースにより、ＬＤＬ等が凍結に際して変性する
ことを防ぐことができ、冷凍保存による長期保存が可能
になる。また、トレハロースは、凍結乾燥に際して、Ｌ
ＤＬ等が変性することを防ぐことができ、したがって、
凍結乾燥状態にして長期保存が可能になる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の実施の形態例４の安定化の効果を示
す図であり、トレハロース添加血清を凍結乾燥し、水を
加えて復元した血清の電気泳動パターンを示す図であ
る。

【図２】 本発明の実施の形態例４における上記凍結乾
燥する前のトレハロース添加血清の電気泳動パターンを
示す図である。

【符号の説明】

ＬＤＬ・・・電気泳動的に調べたＬＤＬコレステロール
値。 ＨＤＬ・・・電気泳動的に調べたＨＤＬコレステロール
値。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 トレハロースを低密度リボタンパクを含
   む溶液に加え、冷凍ないしは凍結乾燥を行うことからな
   る低密度リボタンパク安定化法。