JPH1112299A - 微小管形成促進物質およびその製造方法 - Google Patents
微小管形成促進物質およびその製造方法Info
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- JPH1112299A JPH1112299A JP18043897A JP18043897A JPH1112299A JP H1112299 A JPH1112299 A JP H1112299A JP 18043897 A JP18043897 A JP 18043897A JP 18043897 A JP18043897 A JP 18043897A JP H1112299 A JPH1112299 A JP H1112299A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 細胞機能の活性化をもたらす健康食品、ある
いはアルツハイマー型痴呆症等の予防、治療に用いられ
る、微小管形成促進物質を提供すること。 【解決手段】（１）大麦の分級粉を水で抽出し、水抽出
物を取得する工程； （２）該水抽出物をゲル濾過クロマトグラフィーに供
し、低分子画分を取得する工程； （３）該低分子画分をイオン交換クロマトグラフィーに
供する工程；および （４）該得られた画分をゲル濾過クロマトグラフィーに
供し、微小管形成促進物質画分を取得する工程；を含む
工程により、微小管形成促進物質を取得する。この物質
は酵母の生育、生菌数を増加させる。真核生物の細胞機
能（細胞分裂、細胞形態の維持）の促進に有効である。
いはアルツハイマー型痴呆症等の予防、治療に用いられ
る、微小管形成促進物質を提供すること。 【解決手段】（１）大麦の分級粉を水で抽出し、水抽出
物を取得する工程； （２）該水抽出物をゲル濾過クロマトグラフィーに供
し、低分子画分を取得する工程； （３）該低分子画分をイオン交換クロマトグラフィーに
供する工程；および （４）該得られた画分をゲル濾過クロマトグラフィーに
供し、微小管形成促進物質画分を取得する工程；を含む
工程により、微小管形成促進物質を取得する。この物質
は酵母の生育、生菌数を増加させる。真核生物の細胞機
能（細胞分裂、細胞形態の維持）の促進に有効である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本願発明は、細胞機能の維持
に関与する微小管形成促進物質に関する。
に関与する微小管形成促進物質に関する。
【０００２】
【従来の技術】チューブリンは細胞骨格の主要蛋白質で
あり、真核細胞に普遍的に存在する蛋白質である。チュ
ーブリンは、重合して、細胞分裂および細胞形態の維持
等に関与している微小管を形成する。そのチューブリン
から微小管を形成するメカニズムは、図１に模式的に示
される。チューブリンは、α- サブユニットとβ- サブ
ユニットとの２つのサブユニットから構成される２量体
の蛋白質であり、それぞれのサブユニットには、GTP が
結合している。このチューブリンは、重合して環状とな
り、さらに重合を重ねてパイプ状の構造体、すなわち微
小管、を形成する。この重合の過程において、GTP は加
水分解され、GDP となる。
あり、真核細胞に普遍的に存在する蛋白質である。チュ
ーブリンは、重合して、細胞分裂および細胞形態の維持
等に関与している微小管を形成する。そのチューブリン
から微小管を形成するメカニズムは、図１に模式的に示
される。チューブリンは、α- サブユニットとβ- サブ
ユニットとの２つのサブユニットから構成される２量体
の蛋白質であり、それぞれのサブユニットには、GTP が
結合している。このチューブリンは、重合して環状とな
り、さらに重合を重ねてパイプ状の構造体、すなわち微
小管、を形成する。この重合の過程において、GTP は加
水分解され、GDP となる。
【０００３】ところで、高齢化社会の特徴の一つとし
て、老人性痴呆症の増加がある。老人性痴呆症には脳血
管性痴呆、アルツハイマー型痴呆等が含まれる。アルツ
ハイマー型痴呆症は、形態学的には(1) 脳組織の萎縮、
脱落、(2) 大脳皮質あるいは海馬に存在する老人斑、
(3) 神経原繊維の変化等が特徴である。さらに、生物学
的には、神経伝達物質であるアセチルコリンの合成酵素
であるコリン・アセチルトランスフェラーゼ活性が低下
していることが報告されている。アルツハイマー型痴呆
症の発症機構の解明は、老人斑に存在するアミロイド、
または神経原繊維変化に関与するタウタンパク質を中心
に行われている。このタウタンパク質は、微小管形成を
促進すると報告されている（Weingarten, M.D.ら、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 72: 1858(1975) 等）。
て、老人性痴呆症の増加がある。老人性痴呆症には脳血
管性痴呆、アルツハイマー型痴呆等が含まれる。アルツ
ハイマー型痴呆症は、形態学的には(1) 脳組織の萎縮、
脱落、(2) 大脳皮質あるいは海馬に存在する老人斑、
(3) 神経原繊維の変化等が特徴である。さらに、生物学
的には、神経伝達物質であるアセチルコリンの合成酵素
であるコリン・アセチルトランスフェラーゼ活性が低下
していることが報告されている。アルツハイマー型痴呆
症の発症機構の解明は、老人斑に存在するアミロイド、
または神経原繊維変化に関与するタウタンパク質を中心
に行われている。このタウタンパク質は、微小管形成を
促進すると報告されている（Weingarten, M.D.ら、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 72: 1858(1975) 等）。
【０００４】上記のように、微小管はチューブリンが重
合したものであり、細胞形態維持、細胞内輸送、細胞分
裂、細胞運動等の様々な細胞機能に関与していると考え
られている。他方で、アルツハイマー型痴呆症の特徴で
ある細胞の萎縮、細胞数の減少は微小管機能の劣化と考
えられる。
合したものであり、細胞形態維持、細胞内輸送、細胞分
裂、細胞運動等の様々な細胞機能に関与していると考え
られている。他方で、アルツハイマー型痴呆症の特徴で
ある細胞の萎縮、細胞数の減少は微小管機能の劣化と考
えられる。
【０００５】従って、微小管形成を促進することが、ア
ルツハイマー型痴呆症の治療、予防につながると考えら
れる。しかし、微小管の形成を促進する物質を用いて、
細胞形態の維持、細胞数の維持、増加を図り、ひいては
アルツハイマー型痴呆症の治療、予防が検討された例は
いまだ知られていない。
ルツハイマー型痴呆症の治療、予防につながると考えら
れる。しかし、微小管の形成を促進する物質を用いて、
細胞形態の維持、細胞数の維持、増加を図り、ひいては
アルツハイマー型痴呆症の治療、予防が検討された例は
いまだ知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本願発明は、微小管形
成促進物質を提供し、細胞機能の活性化をもたらす健康
食品、あるいはアルツハイマー型痴呆症の治療剤または
その予防剤を提供しようとするものである。
成促進物質を提供し、細胞機能の活性化をもたらす健康
食品、あるいはアルツハイマー型痴呆症の治療剤または
その予防剤を提供しようとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】従って、本願発明は、微
小管形成促進物質を提供しようとするものであり、以下
の工程： （１）大麦の分級粉を水で抽出し、水抽出物を取得する
工程； （２）該水抽出物をゲル濾過クロマトグラフィーに供
し、低分子画分を取得する工程； （３）該低分子画分をイオン交換クロマトグラフィーに
供する工程；および （４）該得られた画分をゲル濾過クロマトグラフィーに
供し、微小管形成促進物質画分を取得する工程；を含む
工程により得られる、微小管形成促進物質に関する。
小管形成促進物質を提供しようとするものであり、以下
の工程： （１）大麦の分級粉を水で抽出し、水抽出物を取得する
工程； （２）該水抽出物をゲル濾過クロマトグラフィーに供
し、低分子画分を取得する工程； （３）該低分子画分をイオン交換クロマトグラフィーに
供する工程；および （４）該得られた画分をゲル濾過クロマトグラフィーに
供し、微小管形成促進物質画分を取得する工程；を含む
工程により得られる、微小管形成促進物質に関する。
【０００８】好適な実施態様においては、前記イオン交
換クロマトグラフィーがDEAE- セファデックスA-50であ
り、0.5M NaCl の濃度で微小管形成促進物質が溶出され
る。
換クロマトグラフィーがDEAE- セファデックスA-50であ
り、0.5M NaCl の濃度で微小管形成促進物質が溶出され
る。
【０００９】また、本願発明は、前記微小管形成促進物
質を含有する細胞機能促進剤に関する。好適な実施態様
においては、前記細胞機能が細胞分裂の促進および／ま
たは細胞形態の維持である。
質を含有する細胞機能促進剤に関する。好適な実施態様
においては、前記細胞機能が細胞分裂の促進および／ま
たは細胞形態の維持である。
【００１０】好適な実施態様においては、前記細胞機能
が脳細胞の機能である。さらに、本願発明は、微小管形
成促進物質を含有する老人性痴呆症治療剤に関する。
が脳細胞の機能である。さらに、本願発明は、微小管形
成促進物質を含有する老人性痴呆症治療剤に関する。
【００１１】また、本願発明は微小管形成促進物質を含
有する食品組成物に関する。
有する食品組成物に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】微小管形成促進物質は、チューブ
リンからの微小管形成を促進する。微小管形成の測定に
は濁度法あるいは粘度法があるが、大量の試料を必要と
し、測定にも長時間を要する。他方で、チューブリンタ
ンパク質自身がGTPase活性を有し、その発現が微小管形
成に関与することが知られている（土井ら、Agric. Bio
l. Chem., 55: 245-246, (1991) ： Marie-France Car
lierら、Biochemistry.,28: 1791-1797 (1989)）。従っ
て、本願発明においては、チューブリンのGTPase活性を
測定し、そのGTPase活性を増強（賦活化）する物質を、
微小管形成促進物質とする。
リンからの微小管形成を促進する。微小管形成の測定に
は濁度法あるいは粘度法があるが、大量の試料を必要と
し、測定にも長時間を要する。他方で、チューブリンタ
ンパク質自身がGTPase活性を有し、その発現が微小管形
成に関与することが知られている（土井ら、Agric. Bio
l. Chem., 55: 245-246, (1991) ： Marie-France Car
lierら、Biochemistry.,28: 1791-1797 (1989)）。従っ
て、本願発明においては、チューブリンのGTPase活性を
測定し、そのGTPase活性を増強（賦活化）する物質を、
微小管形成促進物質とする。
【００１３】GTPaseの活性測定には、例えば、Seckler
ら、J. Biol. Chem., 265: 7655 (1990)、および川上、
長谷川、土井ら、武庫川女子大紀要（自然科学）42:17
(1994) に記載の方法（グリセロールを含むリン酸緩衝
液中で反応させ、生じるGDP を測定する方法）が用いら
れる。例えば、チューブリン1.0 mg/ml 、10mM リン酸
緩衝液（pH7.0)、3.4M グリセロール、0.1mM GTP 、お
よび10mM MgCl2、および試料1.0 mg/ml を含む反応液
を、適切な温度と時間、例えば、37℃、30分間反応させ
る。反応液の1/5 量の3N 過塩素酸を加え、反応を停止
する。0 ℃で10分以上冷却し、7000rpm 、5 分間遠心分
離する。遠心上清に、その1/6 量の3N水酸化カリウムと
1/6 量のリン酸カリウムー 酢酸緩衝液（1M K2HPO4-0.5M
CH3COOH）とを加えて、-20 ℃で保存後、7000rpm 、5
分間遠心分離して過塩素酸カリウムの沈澱を除き、さら
にシリンジフィルター（ポアサイズ 0.45 μm ）で濾過
してHPLCにかけ、生じたGDP 量を測定する。
ら、J. Biol. Chem., 265: 7655 (1990)、および川上、
長谷川、土井ら、武庫川女子大紀要（自然科学）42:17
(1994) に記載の方法（グリセロールを含むリン酸緩衝
液中で反応させ、生じるGDP を測定する方法）が用いら
れる。例えば、チューブリン1.0 mg/ml 、10mM リン酸
緩衝液（pH7.0)、3.4M グリセロール、0.1mM GTP 、お
よび10mM MgCl2、および試料1.0 mg/ml を含む反応液
を、適切な温度と時間、例えば、37℃、30分間反応させ
る。反応液の1/5 量の3N 過塩素酸を加え、反応を停止
する。0 ℃で10分以上冷却し、7000rpm 、5 分間遠心分
離する。遠心上清に、その1/6 量の3N水酸化カリウムと
1/6 量のリン酸カリウムー 酢酸緩衝液（1M K2HPO4-0.5M
CH3COOH）とを加えて、-20 ℃で保存後、7000rpm 、5
分間遠心分離して過塩素酸カリウムの沈澱を除き、さら
にシリンジフィルター（ポアサイズ 0.45 μm ）で濾過
してHPLCにかけ、生じたGDP 量を測定する。
【００１４】HPLCの条件は例えば、以下の通りである。 カラム：ODS カラム（4.6mm ×250mm ） 溶出液：0.2M K2HPO4-0.1M CH3COOH-4mM TBPA(tetra-n-
butylammonium phosphate) 流速：1.0 ml/min 検出：253nm の吸光
butylammonium phosphate) 流速：1.0 ml/min 検出：253nm の吸光
【００１５】なお、チューブリンの比活性は、255pmols
GDP/mg 蛋白質/minである。
GDP/mg 蛋白質/minである。
【００１６】チューブリンは、Lee らの硫安分別法及び
イオン交換法とを組み合わせ、最終段階でマグネシウム
沈澱法を取り入れた方法が用いられ得る（Lee ら、J. B
iol.Chem., 248: 7253 (1973)、Weisenbergら、Biochem
istry, 7: 4466 (1968)およびWeisenbergら、Biochemis
try, 9: 4410 (1970)を参照のこと）。
イオン交換法とを組み合わせ、最終段階でマグネシウム
沈澱法を取り入れた方法が用いられ得る（Lee ら、J. B
iol.Chem., 248: 7253 (1973)、Weisenbergら、Biochem
istry, 7: 4466 (1968)およびWeisenbergら、Biochemis
try, 9: 4410 (1970)を参照のこと）。
【００１７】本願発明の微小管形成促進物質は、大麦の
分級粉を分画して得られる。大麦の分級粉としては、95
ー80 ％の分級粉が用いられ、91-89 ％分級粉が最も好適
に用いられ得る。分級粉は、精米と同様の原理を用い
て、ドラフトバーレー分級法を用いて大麦穀粒を処理す
ることにより得られ得る。また、市販の分級粉も用いら
れ得、例えば、イトメン株式会社（兵庫県）から入手可
能である。
分級粉を分画して得られる。大麦の分級粉としては、95
ー80 ％の分級粉が用いられ、91-89 ％分級粉が最も好適
に用いられ得る。分級粉は、精米と同様の原理を用い
て、ドラフトバーレー分級法を用いて大麦穀粒を処理す
ることにより得られ得る。また、市販の分級粉も用いら
れ得、例えば、イトメン株式会社（兵庫県）から入手可
能である。
【００１８】大麦分級粉からの抽出は、水で行い得る。
抽出は、分級粉1 重量部に対して、約10から100 重量部
の水を加えて行う。好適には、約20〜40重量部、最も好
適には、約30重量部の水を用いて行われる。抽出は、約
0 ℃〜約60℃、好適には、約20℃〜約40℃で行われ得
る。抽出の時間は、温度、分級粉の濃度等に依存する
が、約15分〜約2 時間行い得る。
抽出は、分級粉1 重量部に対して、約10から100 重量部
の水を加えて行う。好適には、約20〜40重量部、最も好
適には、約30重量部の水を用いて行われる。抽出は、約
0 ℃〜約60℃、好適には、約20℃〜約40℃で行われ得
る。抽出の時間は、温度、分級粉の濃度等に依存する
が、約15分〜約2 時間行い得る。
【００１９】水による抽出を容易にするために、分級粉
を冷アセトン等の親水性溶媒で予め処理しておくことが
好ましい。アセトンは、分級粉１重量部に対して10〜10
0 倍量（W/V)、好ましくは、20〜50倍量が用いられ得
る。最も好ましくは、30倍量の冷アセトン（−20℃）を
加え、１分間、攪拌する。冷アセトン処理した分級粉
は、20〜50倍量の水で抽出され得る。好適には、約30倍
量の水で抽出する。
を冷アセトン等の親水性溶媒で予め処理しておくことが
好ましい。アセトンは、分級粉１重量部に対して10〜10
0 倍量（W/V)、好ましくは、20〜50倍量が用いられ得
る。最も好ましくは、30倍量の冷アセトン（−20℃）を
加え、１分間、攪拌する。冷アセトン処理した分級粉
は、20〜50倍量の水で抽出され得る。好適には、約30倍
量の水で抽出する。
【００２０】水による抽出終了後、遠心分離（例えば、
10,000rpm,2 ℃,20 分）して上清を得、これを抽出液と
し得る。後の操作等を考慮すると、この抽出液を濃縮あ
るいは粉末化することが好ましい。濃縮、粉末化は公知
の手段が用いられるが、凍結濃縮、凍結乾燥が、目的物
質の失活を防ぐ点で好ましい。
10,000rpm,2 ℃,20 分）して上清を得、これを抽出液と
し得る。後の操作等を考慮すると、この抽出液を濃縮あ
るいは粉末化することが好ましい。濃縮、粉末化は公知
の手段が用いられるが、凍結濃縮、凍結乾燥が、目的物
質の失活を防ぐ点で好ましい。
【００２１】得られた濃縮液あるいは凍結乾燥標品をゲ
ル濾過クロマトグラフィーにかける。凍結乾燥標品の場
合には、精製水に溶解後、遠心分離（例えば、10,000rp
m,2℃,20 分）した上清を用いる。ゲル濾過クロマトグ
ラフィーに用いるゲルはどの様なゲルでも、用いられ得
る。好適には、セファクリル（登録商標）S-100HR が用
いられ得る。ゲル濾過は、当業者に周知の方法で行われ
得る。
ル濾過クロマトグラフィーにかける。凍結乾燥標品の場
合には、精製水に溶解後、遠心分離（例えば、10,000rp
m,2℃,20 分）した上清を用いる。ゲル濾過クロマトグ
ラフィーに用いるゲルはどの様なゲルでも、用いられ得
る。好適には、セファクリル（登録商標）S-100HR が用
いられ得る。ゲル濾過は、当業者に周知の方法で行われ
得る。
【００２２】ゲル濾過により得られた画分について、上
記の方法で、微小管形成促進活性を測定し、物質を含む
画分をプールし、必要に応じて濃縮あるいは凍結乾燥し
て粉末とする。微小管形成促進物質は、セファクリル
（登録商標）S-100HR の分画可能範囲から推定すると分
子量約1000〜2000程度と考えられる。
記の方法で、微小管形成促進活性を測定し、物質を含む
画分をプールし、必要に応じて濃縮あるいは凍結乾燥し
て粉末とする。微小管形成促進物質は、セファクリル
（登録商標）S-100HR の分画可能範囲から推定すると分
子量約1000〜2000程度と考えられる。
【００２３】次いで、この得られた微小管形成促進活性
物質を含有する画分、その濃縮液またはその凍結乾燥物
をイオン交換クロマトグラフィーに供する。用いるイオ
ン交換樹脂としては、アニオン交換樹脂が好ましい。例
えば、商品名アンバーライトMB-1、商品名DEAE- セファ
デックスA-50等が用いられ得る。
物質を含有する画分、その濃縮液またはその凍結乾燥物
をイオン交換クロマトグラフィーに供する。用いるイオ
ン交換樹脂としては、アニオン交換樹脂が好ましい。例
えば、商品名アンバーライトMB-1、商品名DEAE- セファ
デックスA-50等が用いられ得る。
【００２４】溶出には、塩濃度勾配法あるいはステップ
ワイズ法等、当業者に周知の方法が用いられ得る。塩濃
度勾配法を用いる場合、例えば、20mMリン酸緩衝液(pH
7) に溶解した試料をDEAE- セファデックスA-50にか
け、同緩衝液で洗浄後、NaClの直線濃度勾配をかける。
目的の物質は、約0.2MのNaCl濃度で溶出する。DEAE- セ
ファデックスA-50を用いて、ステップワイズ法で溶出す
る場合、ピリジン- 酢酸緩衝液(pH6.5) で平衡化したDE
AE- セファデックスA-50と試料とを懸濁した後、ピリジ
ンと酢酸の比率を変えてpHを段階的に変化させ、目的物
質を溶出する。溶出はpH約5.0 付近で行われる。
ワイズ法等、当業者に周知の方法が用いられ得る。塩濃
度勾配法を用いる場合、例えば、20mMリン酸緩衝液(pH
7) に溶解した試料をDEAE- セファデックスA-50にか
け、同緩衝液で洗浄後、NaClの直線濃度勾配をかける。
目的の物質は、約0.2MのNaCl濃度で溶出する。DEAE- セ
ファデックスA-50を用いて、ステップワイズ法で溶出す
る場合、ピリジン- 酢酸緩衝液(pH6.5) で平衡化したDE
AE- セファデックスA-50と試料とを懸濁した後、ピリジ
ンと酢酸の比率を変えてpHを段階的に変化させ、目的物
質を溶出する。溶出はpH約5.0 付近で行われる。
【００２５】イオン交換クロマトグラフィー処理で得ら
れた微小管形成促進物質は、さらにゲル濾過クロマトグ
ラフィーに供し、精製される。約1000から2000の分子量
を有する物質を分画できるゲルが好ましく、例えば、Bi
o-Gel P-4 が好適に用いられ得る。Bio-Gel P-4 による
分画で、本願発明の微小管形成促進物質の分子量は、約
2,000 程度と推定される。
れた微小管形成促進物質は、さらにゲル濾過クロマトグ
ラフィーに供し、精製される。約1000から2000の分子量
を有する物質を分画できるゲルが好ましく、例えば、Bi
o-Gel P-4 が好適に用いられ得る。Bio-Gel P-4 による
分画で、本願発明の微小管形成促進物質の分子量は、約
2,000 程度と推定される。
【００２６】このようにして精製された微小管形成促進
物質は、細胞内で細胞骨格あるいは細胞分裂の際の紡錘
体の建築素材であり細胞内輸送あるいは鞭毛運動などの
運動要素として機能する微小管の形成を促進するので、
細胞機能促進剤として機能し得る。具体的には、細胞形
態の維持および／または細胞分裂の促進が可能となる。
物質は、細胞内で細胞骨格あるいは細胞分裂の際の紡錘
体の建築素材であり細胞内輸送あるいは鞭毛運動などの
運動要素として機能する微小管の形成を促進するので、
細胞機能促進剤として機能し得る。具体的には、細胞形
態の維持および／または細胞分裂の促進が可能となる。
【００２７】例えば、本願発明の実施例として示すよう
に、酵母Rhodotorula rubra の培養に際して、本願発明
の微小管形成促進物質を添加した場合は、極めて生育が
良好になることおよび生菌数が増大することが示され、
細胞機能促進効果が認められる。
に、酵母Rhodotorula rubra の培養に際して、本願発明
の微小管形成促進物質を添加した場合は、極めて生育が
良好になることおよび生菌数が増大することが示され、
細胞機能促進効果が認められる。
【００２８】細胞骨格の維持、細胞分裂は、すべての細
胞において見られることから、細胞萎縮、細胞数の減少
の結果として生じる老人性痴呆症の症状の改善、治療に
も、その効果が期待される。
胞において見られることから、細胞萎縮、細胞数の減少
の結果として生じる老人性痴呆症の症状の改善、治療に
も、その効果が期待される。
【００２９】さらに、微小管形成促進物質を含有する食
品組成物を提供することにより、日常的に細胞の活性
化、アルツハイマー症の予防に寄与することができる。
品組成物を提供することにより、日常的に細胞の活性
化、アルツハイマー症の予防に寄与することができる。
【００３０】以下、実施例を挙げて本願発明を説明する
が、本願発明がこれらの実施例に限定されないことはい
うまでもない。
が、本願発明がこれらの実施例に限定されないことはい
うまでもない。
【００３１】（大麦分級粉からの微小管形成促進物質の
抽出）大麦の95-80 ％分級粉は、イトメン株式会社（兵
庫県龍野市）から入手した。分級粉60g に、30倍量(W/
V) の冷アセトン（ー20 ℃）を加え、１分間、攪拌後、
濾過によりアセトンを除去した。得られた脱脂分級粉10
g に300ml の精製水を加えて、室温で30分間、攪拌し、
抽出液を得た。遠心分離（10,000rpm, 2℃, 20分）して
上清を得、凍結乾燥して、水抽出物の凍結乾燥粉末を得
た。
抽出）大麦の95-80 ％分級粉は、イトメン株式会社（兵
庫県龍野市）から入手した。分級粉60g に、30倍量(W/
V) の冷アセトン（ー20 ℃）を加え、１分間、攪拌後、
濾過によりアセトンを除去した。得られた脱脂分級粉10
g に300ml の精製水を加えて、室温で30分間、攪拌し、
抽出液を得た。遠心分離（10,000rpm, 2℃, 20分）して
上清を得、凍結乾燥して、水抽出物の凍結乾燥粉末を得
た。
【００３２】（セファクリルS-100HR を用いるゲル濾
過）得られた凍結乾燥標品の0.4gを10mlの10mM 酢酸に
溶解し、遠心分離（10,000rpm, 2℃, 20分）した上清を
セファクリルS-100HR （4 ×40cm）にアプライした。70
ml/hr の流速で溶出し、10mlずつ分画した。分画画分を
凍結乾燥し、10mg/ml となるように精製水に溶解し、最
終濃度1.0mg/mlで微小管形成促進活性を測定した。即
ち、土井らの方法（前出）に従い、チューブリン1.0 mg
/ml 、10mM リン酸緩衝液（pH7.0)、3.4M グリセロー
ル、0.1mM GTP 、および10mM MgCl2、および試料1.0 mg
/ml を含む反応液1ml を、37℃、30分間反応させた。反
応液に200 μl の3N過塩素酸を加えて反応を停止し、0
℃で10分間以上冷却し、7000rpm、5 分間遠心分離し
た。遠心上清に、その1/6 量の3N水酸化カリウムと1/6
量のリン酸カリウムー 酢酸緩衝液（1M K2HPO4-0.5M CH3
COOH）とを加えて、-20 ℃で保存後、7000rpm 、5 分間
遠心分離して過塩素酸カリウムの沈澱を除き、さらにシ
リンジフィルター（ポアサイズ 0.45 μm ）で濾過して
HPLCにかけ、生じたGDP 量を測定した。HPLCの条件は上
記の通りであった。
過）得られた凍結乾燥標品の0.4gを10mlの10mM 酢酸に
溶解し、遠心分離（10,000rpm, 2℃, 20分）した上清を
セファクリルS-100HR （4 ×40cm）にアプライした。70
ml/hr の流速で溶出し、10mlずつ分画した。分画画分を
凍結乾燥し、10mg/ml となるように精製水に溶解し、最
終濃度1.0mg/mlで微小管形成促進活性を測定した。即
ち、土井らの方法（前出）に従い、チューブリン1.0 mg
/ml 、10mM リン酸緩衝液（pH7.0)、3.4M グリセロー
ル、0.1mM GTP 、および10mM MgCl2、および試料1.0 mg
/ml を含む反応液1ml を、37℃、30分間反応させた。反
応液に200 μl の3N過塩素酸を加えて反応を停止し、0
℃で10分間以上冷却し、7000rpm、5 分間遠心分離し
た。遠心上清に、その1/6 量の3N水酸化カリウムと1/6
量のリン酸カリウムー 酢酸緩衝液（1M K2HPO4-0.5M CH3
COOH）とを加えて、-20 ℃で保存後、7000rpm 、5 分間
遠心分離して過塩素酸カリウムの沈澱を除き、さらにシ
リンジフィルター（ポアサイズ 0.45 μm ）で濾過して
HPLCにかけ、生じたGDP 量を測定した。HPLCの条件は上
記の通りであった。
【００３３】ゲル濾過の結果を図２に示した。図２のフ
ラクションNo.55ー60付近のピーク(S-7) に、最も強い微
小管形成促進活性がみられた。このS-7 のGTPase活性の
賦活化の様子を、図３に示した。1.0mg/ml濃度のS-7
は、GTPase活性（微小管形成活性）を約1.8 倍に増加さ
せた。なお、図３において、（■）はS-7 を添加した場
合の活性、（◆）はコントロールを表す。
ラクションNo.55ー60付近のピーク(S-7) に、最も強い微
小管形成促進活性がみられた。このS-7 のGTPase活性の
賦活化の様子を、図３に示した。1.0mg/ml濃度のS-7
は、GTPase活性（微小管形成活性）を約1.8 倍に増加さ
せた。なお、図３において、（■）はS-7 を添加した場
合の活性、（◆）はコントロールを表す。
【００３４】（S-7 画分のイオン交換樹脂による分画）
S-7 画分をDEAE- セファデックスA-50イオン交換クロマ
トグラフィーにかけたときの結果を、図４に示した。31
mgのS-7 凍結乾燥粉末を、10mM 2- メルカプトエタノー
ルを含む20mM リン酸緩衝液(pH7.0) に溶解し、DEAE-
セファデックスA-50（1.5 ×30cm）にアプライした。同
緩衝液で洗浄後、0 から0.5MのNaClの直線濃度勾配をか
けた。17ml/hr の流速で溶出し、3.2ml ずつ分画した。
約0.1Mから約0.25M にかけてのNaCl濃度で、最初の230n
m の吸収ピークがみられたが、微小管形成促進活性は、
フラクションNo.18-20に検出された。このフラクション
から得られた凍結乾燥標品（IE-B）を、次に、ゲル濾過
クロマトグラフィーにかけた。
S-7 画分をDEAE- セファデックスA-50イオン交換クロマ
トグラフィーにかけたときの結果を、図４に示した。31
mgのS-7 凍結乾燥粉末を、10mM 2- メルカプトエタノー
ルを含む20mM リン酸緩衝液(pH7.0) に溶解し、DEAE-
セファデックスA-50（1.5 ×30cm）にアプライした。同
緩衝液で洗浄後、0 から0.5MのNaClの直線濃度勾配をか
けた。17ml/hr の流速で溶出し、3.2ml ずつ分画した。
約0.1Mから約0.25M にかけてのNaCl濃度で、最初の230n
m の吸収ピークがみられたが、微小管形成促進活性は、
フラクションNo.18-20に検出された。このフラクション
から得られた凍結乾燥標品（IE-B）を、次に、ゲル濾過
クロマトグラフィーにかけた。
【００３５】(IE-B 標品のゲル濾過クロマトグラフィー
による分画）Bio-Gel P-4 ゲル濾過クロマトグラフィー
による分画を、図５に示した。30mgの凍結乾燥標品IE-B
を回収し、その30mgをBio-Gel P-4 （1.5 ×80cm）にア
プライし、10mM 酢酸を用い、17.6ml/hr の流速で、2.
1ml ずつ分画した。低分子画分に４つのピークがみられ
たが、第３番目のピークには活性がなく、第２番目のピ
ーク（IE-B-2）に最も高いGTPase賦活化活性がみられ
た。
による分画）Bio-Gel P-4 ゲル濾過クロマトグラフィー
による分画を、図５に示した。30mgの凍結乾燥標品IE-B
を回収し、その30mgをBio-Gel P-4 （1.5 ×80cm）にア
プライし、10mM 酢酸を用い、17.6ml/hr の流速で、2.
1ml ずつ分画した。低分子画分に４つのピークがみられ
たが、第３番目のピークには活性がなく、第２番目のピ
ーク（IE-B-2）に最も高いGTPase賦活化活性がみられ
た。
【００３６】（IE-B-2の酵母の生育に対する影響）酵母
Rhodotorula rubra IFO 0709をハイダック氏培地（10％
庶糖、0.25％L-アシパラギン、0.1% K2HPO4 、0.3% MgS
O4・ 7H2O( いずれもW/V%) 、pH6.5 ）にIE-B-2を最終濃
度0.25mg/ml となるように加え、28℃で培養した。結果
を図６に示した。IE-B-2を添加した場合（●）、ペプト
ンを最終濃度0.25mg/ml 加えた場合（■）あるいは、無
添加の場合（◆）と比較して、明らかに生育が良好にな
っていることを示している。なお、図示していないが、
培養第12日目の生菌数の割合も増加していた。
Rhodotorula rubra IFO 0709をハイダック氏培地（10％
庶糖、0.25％L-アシパラギン、0.1% K2HPO4 、0.3% MgS
O4・ 7H2O( いずれもW/V%) 、pH6.5 ）にIE-B-2を最終濃
度0.25mg/ml となるように加え、28℃で培養した。結果
を図６に示した。IE-B-2を添加した場合（●）、ペプト
ンを最終濃度0.25mg/ml 加えた場合（■）あるいは、無
添加の場合（◆）と比較して、明らかに生育が良好にな
っていることを示している。なお、図示していないが、
培養第12日目の生菌数の割合も増加していた。
【００３７】さらに、図７は、培養第12日目の菌体のGT
Pase活性を示したものである。培養終了後、菌体を遠心
分離で集め、洗浄後、ビーズで破砕した。遠心分離（50
00rpm 、20分、4 ℃）により上清を得て、蛋白質含量お
よびGTPase活性を測定した。結果を図７に示した。図７
から明らかなように、IE-B-2を含む培地で生育した酵母
は、高いGTPase活性を有していた。
Pase活性を示したものである。培養終了後、菌体を遠心
分離で集め、洗浄後、ビーズで破砕した。遠心分離（50
00rpm 、20分、4 ℃）により上清を得て、蛋白質含量お
よびGTPase活性を測定した。結果を図７に示した。図７
から明らかなように、IE-B-2を含む培地で生育した酵母
は、高いGTPase活性を有していた。
【００３８】生育、生菌数、GTPaseに関する同様の結果
が、酵母Saccharomyces cerevisiaeおよび酵母Pichia p
olymorpha でも観察された。
が、酵母Saccharomyces cerevisiaeおよび酵母Pichia p
olymorpha でも観察された。
【００３９】
【発明の効果】本願発明の物質を添加することにより、
酵母の生育、生菌数が増大した。このことは、細胞内で
細胞分裂、細胞形態の維持に関する微小管形成が促進さ
れ、それによって、生育および生菌数が増大したことを
示すものである。微小管が、真核生物に普遍的に存在す
るものであるから、本願発明の微小管形成促進物資を用
いて、老人性痴呆症の予防、治療が可能となる。
酵母の生育、生菌数が増大した。このことは、細胞内で
細胞分裂、細胞形態の維持に関する微小管形成が促進さ
れ、それによって、生育および生菌数が増大したことを
示すものである。微小管が、真核生物に普遍的に存在す
るものであるから、本願発明の微小管形成促進物資を用
いて、老人性痴呆症の予防、治療が可能となる。
【図１】チューブリンからの微小管形成を示す模式図で
ある。
ある。
【図２】大麦分級粉の水抽出物のセファクリルS-100HR
による分画を示す図である。下線部は活性画分を表す。
による分画を示す図である。下線部は活性画分を表す。
【図３】S-7 のGTPase活性の賦活化を示す図である。
【図４】S-7 のDEAE- セファデックスA-50イオン交換ク
ロマトグラフィーの結果を示す図である。約0.2MのNaCl
濃度で、活性画分が溶出した。
ロマトグラフィーの結果を示す図である。約0.2MのNaCl
濃度で、活性画分が溶出した。
【図５】IE-B標品のBio-Gel P-4 ゲル濾過クロマトグラ
フィーによる分画を示す図である。
フィーによる分画を示す図である。
【図６】IE-B-2を添加したときの酵母の生育を示す図で
ある。
ある。
【図７】IE-B-2を添加して培養した酵母の菌体内GTPase
活性の増大を示す図である。
活性の増大を示す図である。
Claims (7)
- 【請求項１】 以下の工程： （１）大麦の分級粉を水で抽出し、水抽出物を取得する
工程； （２）該水抽出物をゲル濾過クロマトグラフィーに供
し、低分子画分を取得する工程； （３）該低分子画分をイオン交換クロマトグラフィーに
供する工程；および （４）該得られた画分をゲル濾過クロマトグラフィーに
供し、微小管形成促進物質画分を取得する工程；を含む
工程により得られる、微小管形成促進物質。 - 【請求項２】 前記イオン交換クロマトグラフィーがDE
AE- セファデックスA-50であり、0.5M NaCl の濃度で溶
出される、請求項１に記載の微小管形成促進物質。 - 【請求項３】 請求項１または２に記載の微小管形成促
進物質を含有する、細胞機能促進剤。 - 【請求項４】 前記細胞機能が、細胞分裂の促進および
／または細胞形態の維持である、請求項３に記載の細胞
機能促進剤。 - 【請求項５】 前記細胞機能が脳細胞の機能である、請
求項４に記載の細胞機能促進剤。 - 【請求項６】 請求項１または２に記載の微小管形成促
進物質を含有する、老人性痴呆症治療剤。 - 【請求項７】 請求項１または２に記載の微小管形成促
進物質を含有する、食品組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18043897A JP3834128B2 (ja) | 1997-06-19 | 1997-06-19 | 微小管形成促進物質およびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18043897A JP3834128B2 (ja) | 1997-06-19 | 1997-06-19 | 微小管形成促進物質およびその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1112299A true JPH1112299A (ja) | 1999-01-19 |
| JP3834128B2 JP3834128B2 (ja) | 2006-10-18 |
Family
ID=16083248
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18043897A Expired - Fee Related JP3834128B2 (ja) | 1997-06-19 | 1997-06-19 | 微小管形成促進物質およびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3834128B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6667853B2 (en) | 2000-09-13 | 2003-12-23 | Funai Electric Co., Ltd. | Holding structure of indicating display device for recording medium drive, and recording medium drive |
| WO2024033946A1 (en) * | 2022-08-10 | 2024-02-15 | Dr Dozo Laboratories | Compositions and use in methods for treating a cognitive deficit |
-
1997
- 1997-06-19 JP JP18043897A patent/JP3834128B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6667853B2 (en) | 2000-09-13 | 2003-12-23 | Funai Electric Co., Ltd. | Holding structure of indicating display device for recording medium drive, and recording medium drive |
| WO2024033946A1 (en) * | 2022-08-10 | 2024-02-15 | Dr Dozo Laboratories | Compositions and use in methods for treating a cognitive deficit |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3834128B2 (ja) | 2006-10-18 |
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Effective date: 20051122 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060117 |
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