JPH1077235A - 水不溶性核酸・キトサン複合体及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 高い核酸の含有率を持ち、結合性が強く安定
性も優れた核酸・キトサン複合体及びその製造法を提供
する。 【解決手段】 核酸の結合と共にｐＨ５前後に調製され
たキトサン水溶液から析出されてなり、水不溶性である
核酸・キトサン複合体。ｐＨ５前後に調製したキトサン
水溶液と、核酸水溶液とを混合して、析出物を得る製造
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生化学，分子生物
学等の研究用資材として利用することのできる水不溶性
の「核酸・キトサン複合体」及びその製造法に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術】ＤＮＡやその他のポリヌクレオチドなど
の核酸類は、本来水溶性の物質であるが、これらを不溶
化し、種々の研究に用いる試みがなされている。例え
ば、セルロースやその他の多糖類に共有結合で結合した
ものが、生化学，分子生物学等の研究用資材として利用
されている（Alberts,B.;Herrick,G. Methods in Enzym
ology 1971,XXI,PP.198-217.）。

【０００３】しかし、これらのものは担体（セルロー
ス）中の含量が０．５％以下と低く、また、担体として
用いられることの多いセファロースなどは有機溶媒中で
不安定であるという欠点があった。

【０００４】一方、キトサン(chitosan)は、かに甲羅か
ら得られるキチンをアルカリ処理して得られるポリグル
コサミンである。更に、キトサンは、医薬品のカプセル
材料や食品添加物として用いられるなど、近年特に注目
を浴びている物質である。核酸はポリアニオン性である
ため、ポリカチオン性のキトサンとはイオン結合（塩形
成）をすると期待されるが、実際にハドウィジャー(Had
wiger)らは、水に浮遊したキトサン粉末にＤＮＡが付着
することを観察して報告している（Plant physiology,6
6,205(1980))。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】、しかし、この水に浮
遊したキトサン粉末へのＤＮＡの付着では、キトサンに
対するＤＮＡの量は数％以下であり、また結合性も弱
く、付着したＤＮＡは容易に脱離するものであった。

【０００６】本発明は、高い核酸の含有率を持ち、結合
性が強く安定性も優れた核酸・キトサン複合体及びその
製造法を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の水不溶性核酸・
キトサン複合体は、核酸の結合と共にｐＨ５前後に調製
されたキトサン水溶液から析出されてなり、水不溶性で
あるものである。即ち、ｐＨ５前後に調製されたキトサ
ン水溶液と核酸との結合により析出物として得られるも
のである。

【０００８】本発明で用いるキトサンは天然より得られ
るキチンをアルカリ処理して得られた脱アセチル化物で
ある。このキトサンは、平均分子量のサイズにより、ま
た脱アセチル化の度合いにより、いくつかの規格がある
が、本発明については特に制限なく利用できる。

【０００９】また、本発明で付言された「ｐＨ５前後」
とは、具体的にはｐＨ４．０以上、ｐＨ５．５以下程
度、好ましくはｐＨ４．８以上、ｐＨ５．２以下であ
る。

【００１０】本発明で利用可能な核酸とは、ＤＮＡ，Ｒ
ＮＡまたはこの誘導体であり、天然より抽出したもの、
これをＰＣＲ法等により人工的に増殖したものまたｐｏ
ｌｙＩ，ｐｏｌｙＧ，ｐｏｌｙＡ等の様な全く人工的に
合成したもの等特に制限なく利用できる。

【００１１】本発明の水不溶性核酸・キトサン複合体の
製造法では、ｐＨ５前後に調製したキトサン水溶液と、
核酸水溶液とを混合して析出物を得るものである。例え
ば一旦ｐＨ３前後においてキトサンを水に溶解したキト
サン水溶液をｐＨ５前後に調製した後、核酸の水溶液と
混合する操作によって、溶液中に水不溶性の核酸・キト
サン複合体が沈殿として得られる。この沈殿した析出物
を分離して、核酸・キトサン複合体を得る。このとき、
核酸水溶液及びキトサン水容積の濃度は０．０１％〜２
％が適当である。

【００１２】また、得られた核酸・キトサン複合体は核
酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）含量は１０％（Ｗ／Ｗ）以上、具
体的には約３０〜５０％（Ｗ／Ｗ）である。更にこの複
合体は、有機溶媒中でも安定である。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明では、例えばｐＨ３前後に
おいてキトサンを水に完全に溶解したキトサン水溶液を
ｐＨ５前後に調製した後、核酸の水溶液と混合すること
により、溶液中に水不溶性の核酸・キトサン複合体が沈
殿として得られるという知見を得た。また、得られた核
酸・キトサン複合体は核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）含量が約
３０〜５０％であり、更に有機溶媒中でも安定であると
いう知見を得た。

【００１４】本発明の複合体は、別々に調製した核酸の
水溶液（または生理食塩水溶液、緩衝液溶液）と、ｐＨ
５前後に調製されたキトサンの水溶液とを、単に混合す
ることにより、析出物として得られる。その混合する際
の条件としては、温度，濃度共に特に制限はなく、キト
サン水溶液のｐＨのみが関係する。即ち、例えばｐＨ３
付近でキトサンを水に溶解した後、混合時にはｐＨ５付
近とすることにより、核酸・キトサンの収量やＤＮＡ含
量等において好ましい結果が得られる。ここでいうｐＨ
５付近とは、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．５程度のことであ
る。

【００１５】

【実施例】次に核酸・キトサン複合体の合成法及び性質
について詳述する。 実施例１ ＤＮＡ・キトサン複合体の合成 （ａ）用いた溶液 ・Phosphate-bufferd saline（0.9%ＮａＣｌを含むＰＢ
Ｓ緩衝液（以下ＰＢＳという））；10mM Ｎａ−リン酸
バッファー（ｐＨ７．２）に0.9%ＮａＣｌを含有。 ・ＤＮＡ溶液；子牛 胸腺 ＤＮＡ（Sigma 社製）を上
記ＰＢＳ緩衝液に入れ、２日問ゆっくり振り回して溶か
したもの。１ｍｇ／ｍｌ。 ・キトサン水溶夜；キトサン（chitosan 1000 和光社
製；0.5%水溶液における粘度 800〜1500ｃＰ） 0.6ｇを
0.05N ＨＣｌ 80ml に溶かし、0.025N ＮａＯＨを徐々
に加え（攪件下）、合計60ml加えてｐＨ５の溶液とし、
水を加えて 200ｍｌとしたもの（３ｍｇ／ｍｌ）。

【００１６】（ｂ）ＤＮＡ水溶液とキトサン水溶液とか
らの合成 ＤＮＡ溶液５０ｍｌを氷冷下スターラーで攪件しなが
ら、キトサン水溶液５０ｍｌを滴下した。加え終わって
から、生じた沈澱を遠心分離で集めた。この沈澱をＰＢ
Ｓ２０ｍｌで洗浄した。遠心して沈澱を集め、更にＰＢ
Ｓ各２０ｍｌでの洗浄を２回行った。その後、水２０ｍ
ｌ，エチルアルコール２０ｍｌ，ジエチルエーテル２０
ｍｌで洗って得られる白色繊維状粉末を風乾した。収量
６５ｍｇ。この物質は出発物質として用いたＤＮＡの量
の９１％を含んでいた（含量検定法は後述する）。ＤＮ
Ａ・キトサン複合体のＩＲスペクトルを図１に示す。

【００１７】また、反応液の上清、及びＰＢＳと水の洗
液についてはＡ₂₆₀ （２６０ｎｍの吸光度）を測定して
ＤＮＡ含量を調べた。その結果、反応上清に５．４％，
洗液に＜０．１％ＤＮＡが存在した。この合成法は多数
回繰り返し、再現性を確認した。またキトサンとしてch
itosan 500, chitosan 100, chitosan 10 （各和光社
製）を用いた場合もＤＮＡの収率としてそぞれ９８，９
６，９４％の値が得られており、更にchitosan(Aldrich
社製）を用いても同様の結果が得られた。

【００１８】また、上記作製法の中で、ＤＮＡ濃度を１
／１０，すなわちＰＢＳで１０倍希釈したものを用いた
場合、並びに、キトサン濃度を１／１０，すなわちＰＢ
Ｓで１０倍希釈したものを用いた場合で行ってもＤＮＡ
・キトサン複合体が沈澱した。但し、収率は１／２とな
った。しかし、そのＤＮＡ含量は前述の場合とほぼ同一
であった。

【００１９】実施例２ ＤＮＡ・キトサン複合体中のＤ
ＮＡ含量測定 （ａ）アルカリ法；実施例１で得られたＤＮＡ−キトサ
ン複合体１ｍｇを正確に秤りとり、0.1NＮａＯＨ １ｍ
ｌを加え、９０分間攪拌した。遠心して上清を分離し、
この上清を５０μｌ分取して0.1N ＮａＯＨ 0.95ｍｌ
で希釈して、分光光度計でＡ₂₆₀を測定する。この場
合、Ａ₂₆₀ ＝0.615 がオリジナルＤＮＡ１ｍｇに当た
る。

【００２０】実施例１で得られたＤＮＡ−キトサン複合
体には、0.74ｍｇ／ｍｇ オリジナルＤＮＡを含むこと
が確認された。但し、オリジナルＤＮＡサンプルは水，
Ｎａなどを含んでいて、実質約５０％（Ｗ／Ｗ）のＤＮ
Ａ量であった。

【００２１】（ｂ）ＨＣｌ法；実施例１で得られたＤＮ
Ａ‐キトサン複合体ｌｍｇを正確に秤りとり、0.1NＨＣ
ｌ １ｍｌを加え、沸騰水浴中ｌ０分問加熱する。この
間ときどき振りまぜる。得られる溶液の５０μｌを０．
９５ｍｌ 0.1N ＨＣｌで希釈して、分光光度計でＡ
₂₆₀ を測定する。この場合、Ａ₂₆₀ ＝0.464 がオリジナ
ルＤＮＡ１ｍｇに当たる。

【００２２】上記合成で得られたものをこのＨＣｌ法で
検定すると0.71ｍｇ／ｍｇのオリジナルＤＮＡ含量であ
った。この値はアルカリ法とよく一致する。結局このＤ
ＮＡ・キトサン複合体中のＤＮＡ量は、重量％で３１％
であったと結論された。

【００２３】実施例３ ＤＮＡ・キトサン複合体からの
ＤＮＡの回収及び比率決定 実施例２のアルカリ法を利用してＤＮＡをＤＮＡ・キト
サン複合体から分離回収できる。また、残るキトサンを
定量してＤＮＡ・キトサン複合体中のＤＮＡ：キトサン
の比率を決定できる。

【００２４】ＤＮＡ・キトサン複合体２２．５ｍｇに0.
1N ＮａＯＨ ５ｍｌを加え、９０分間ゆっくり振とう
する。遠心して上清を取り分けた後、再び0.1N ＮａＯ
Ｈ２ｍｌを加えて３７℃，２０分間振る。この上清を取
り、沈殿を水１ｍｌで洗う。上清と洗液とを混合して、
冷却（氷冷）し、１００％トリクロロ酢酸０．６４ｍｌ
を加えるとＤＮＡが沈澱する。氷冷３０分後遠心（４０
００ｒｐｍ，１０分間）し、沈澱をエタノール，ジエチ
ルエーテルで洗って風乾し、ＤＮＡ６．２ｍｇを得た。
（ＰＢＳ溶液でＡ₂₆₀ がｐｅａｋであり，ＤＮＡであ
る）。

【００２５】ＤＮＡを溶出した残りのキトサンを、エタ
ノール，ジエチルエールで洗って風乾し、１５．９ｍｇ
を得た。合計６．２＋１５．９＝２２．１（ｍｇ）とな
り、出発した量が９８％回収された。従って、ＤＮＡ・
キトサン複合体のＤＮＡ：キトサン＝２８：７２（Ｗ／
Ｗ）となった。（Ａ₂₆₀ の値から回収率９０％であると
分かる。）

【００２６】実施例４ ＤＮＡ・キトサン複合体の安定
性 ＤＮＡ・キトサン複合体をいろいろなｐＨ，温度で処理
し、ＤＮＡの「漏れ」をＡ₂₆₀ を用いて測定することに
より、安定性を調べた。詳細な方法は省略するが、結果
は次の表１に示す。表１に示すように、広い範囲のｐＨ
で安定であり、８０℃という高温でも殆どＤＮＡを放出
しない。

【００２７】

【表１】

【００２８】実施例５ ＤＮＡ・キトサン複合体の酵素
分解 ＤＮＡ・キトサン複合体中のＤＮＡが、外からの酵素タ
ンパクの接近を許すか如何かを検証した。具体的には、
３つの酵素（ＤＮase Ｉ，phosphodiesferase，alkalin
ephosphatase ）をＤＮＡ・キトサン複合体に働かせ
て、ヌクレオシドまで分解し、溶液中に出てくるＡ₂₆₀
を測定することによって調べた。詳細は省略するが、結
果はほぼ全部のＤＮＡが分解することが分かった。３７
℃，１時間で５２％，７時間で７８％が溶出した。従っ
て、ＤＮＡ・キトサン複合体のＤＮＡに酵素は接近でき
ることが確認された。

【００２９】実施例６ ＤＮＡ・キトサン複合体の構造 ＤＮＡ・キトサン複合体の構造を検証した。即ち、ＤＮ
Ａ：キトサンの重量比３：７ならびに用いたキトサン中
の−ＮＨ₂ 基の数（７５〜９０％加水分解率）からＤＮ
Ａヌクレオシド／キトサングルコサミン＝１／３とな
る。

【００３０】従って、ＤＮＡ中のリン酸アニオン１個に
対し、キトサン中の「−ＮＨ₃ ⁺」，「−ＮＨ₂ 」が３個
ある。用いたキトサン溶液はｐＨ５であり（−ＮＨ₃ ⁺）
／（−ＮＨ₂ ）が２／１と仮定すると、リン酸アニオン
１個に対し、−ＮＨ₃ ⁺１個がイオン結合し、残り２個の
アミノ基は、−ＮＨ₃ ⁺Ｃｌ^- と−ＮＨ₂ とになっている
と考えられる。

【００３１】よって、恐らく２本鎖ｎａｔｉｖｅＤＮＡ
とキトサン鎖がランダムにからみ合った複合体であろう
と思われる。但し、ＤＮＡ・キトサン複合体は糸状物質
として得られるので、将来¹³Ｃ−ＮＭＲ，Ｘ−ｒａｙ
ａｎａｌｙｓｉｓなどで分折してその立体的構造を決定
できる可能性はある。

【００３２】実施例７ 他のアニオン性ポリマーとキト
サンとの結合 以上に示したように、ＤＮＡ水溶液とキトサン水溶液と
は、強固な複合体を形成することが示された。そこで、
他のアニオン性ポリマーとキトサン水溶液とは複合体を
形成するのかを検証した。

【００３３】用いたアニオン性ポリマーは、次の通りで
ある。 ・ＲＮＡ（酵母，Cal Biecham 社製）、 ・ｔｒａｎｓｆｅｒＲＮＡ（酵母，Pharmacia 社製）、 ・ｐｏｌｙＩ−ｐｏｌｙＣ（Pharmacia 社製）、 ・ｐｏｌｙＡ，ｐｏｌｙＩ，ｐｏｌｙＵ，ｐｏｌｙＣ
（以上ヤマサ社製）

【００３４】前記実施例１と同様に、各アニオン性ポリ
マー水溶液を調製した後、キトサン水溶液と混合するこ
とにより、全てＤＮＡと同様な不溶性複合体が生じた。
２本鎖，１本鎖いずれのポリヌクレオチドも不溶性キト
サン複合体を与える。また、ポリヌクレオチド含量はい
ずれも３０〜５０％（Ｗ／Ｗ）である。ｐｏｌｙＡ・キ
トサン複合体のＩＲスペクトルを図２に示す。

【００３５】実施例７ 核酸・キトサン複合体の応用例 本核酸・キトサン複合体を用いた具体的な核酸の抽出，
分離，精製や蛋白質の精製など分子生物学の研究補助へ
と適用される一例を示す。

【００３６】（ａ）背景 Ｔｒｐ−Ｐ−１，Ｔｒｐ−Ｐ−２についてＤＮＡとの親
和性があることが報告されている。これは蛍光消光度な
らびに平衡透折法によって調べられたものである（J.M.
Pezzuto et al, Proc Natl.Acad.Sci. USA,77,1427-143
1(1980) ）。

【００３７】しかし、蛍光消光法はＴｒｐ−Ｐ−１，Ｔ
ｒｐ−Ｐ−２以外のへテロサイクリックアミンのうち、
Ｇｌｕ−Ｐ−１，Ｇｌｕ−Ｐ−２を除いて蛍光発光を持
たないか、弱いものなので適用できない。Ｇｌｕ−Ｐ−
１，−２についてもその蛍光がＤＮＡによって消光され
るかどうかは分からない。また、平衡透折法は追試した
ところ、透折に用いるセロファンチューブにＴｒｐ−Ｐ
−２が付着してしまうため、分析不可能であることが分
かった。

【００３８】ＤＮＡ・キトサン複合体を用いれば、簡単
に水溶液中の化合物のＤＮＡへの親和性を評価できると
考えられる。この場合対照実験として、キトサンへの吸
着度を測定しておく必要がある。

【００３９】（ｂ）方法 「Ｔｒｐ−Ｐ−２」「ＩＱ」「ＭｅＩＱｘ」「ＰｈＩ
Ｐ」の４種のへテロサイクリックアミンの0.01〜0.02mM
ＰＢＳ溶液に対し、ＤＮＡ・キトサン複合体（１．５
ｍｇ及び３ｍｇ／ｍｌ），またはキトサン（１．５ｍｇ
／ｍｌ）を加え、２２℃で９０分間振りまぜた。この処
理前後の吸光度の差（滅少）から化合物のＤＮＡ・キト
サン複合体への吸着度を測定した。また、ＲＮＡ・キト
サン複合体の場合も同様に行った。

【００４０】（ｃ）結果 へテロサイクリックアミンのＤＮＡ・キトサン複合体，
ＲＮＡ・キトサン複合体，キトサンへの吸着度の結果を
次の表２に示す。その結果、テストした４種のへテロサ
イクリックアミンはいずれもＤＮＡ，ＲＮＡへの吸着が
起こることが分かった。

【００４１】

【表２】

【００４２】以上のように、本核酸・キトサン複合体
は、発ガン物質のヘテロサイクリックアミンのＤＮＡ，
ＲＮＡへの親和度を簡単に調べることができる。その結
果、へテロサイクリックアミンのいくつかがＲＮＡに強
い親和度を持つという意外な発見ができた。

【００４３】以上説明したように、本発明の核酸・キト
サン複合体は、核酸の抽出，分離，精製や蛋白質の精製
など分子生物学の研究補助へと適用され、さらにドラッ
グデリバリーなど多岐にわたる応用が期待できるものと
思われる。

【００４４】

【発明の効果】以上のように、高い核酸の含有率を持
ち、結合性が強く安定性も優れた核酸・キトサン複合体
及びその製造法を提供することができるという効果を有
する。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＤＮＡ・キトサン複合体のＩＲスペクトルであ
り、図において、縦軸は透過率（％）、横軸は波数（ｃ
ｍ^-1）を示す。

【図２】ｐｏｌｙＡ・キトサン複合体のＩＲスペクトル
であり、図において、縦軸は透過率（％）、横軸は波数
（ｃｍ^-1）を示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 核酸の結合と共にｐＨ５前後に調製され
   たキトサン水溶液から析出されてなり、水不溶性である
   ことを特徴とする水不溶性核酸・キトサン複合体。
2. 【請求項２】 キトサンに対する核酸の含量が１０％
   （Ｗ／Ｗ）以上である請求項１記載の水不溶性核酸・キ
   トサン複合体。
3. 【請求項３】 核酸がＤＮＡであることを特徴とする請
   求項１又は２の水不溶性核酸・キトサン複合体。
4. 【請求項４】 核酸がＲＮＡであることを特徴とする請
   求項１又は２の水不溶性核酸・キトサン複合体。
5. 【請求項５】 ｐＨ５前後に調製したキトサン水溶液
   と、核酸水溶液とを混合して、析出物を得ることを特徴
   とする水不溶性核酸・キトサン複合体の製造法。