JPH1066570A - 新規プロリルオリゴペプチダーゼおよびそれをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 高濃度の食塩存在下でも機能する新規プロリ
ルオリゴペプチダーゼを見出だし、該酵素を利用した蛋
白質の加水分解プロセスを開発する。 【解決手段】 スフィンゴモナス カプスラタに属する
微生物由来のプロリルオリゴペプチダーゼは、２Ｍの食
塩存在下でも最大活性の５０％以上の活性を保持しう
る。また、市販の酵素を組み合わせて加水分解反応を行
うことにより、蛋白質が高度に分解される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規プロリルオリゴペプ
チダーゼ、該プロリルオリゴペプチダーゼをコードする
遺伝子、該プロリルオリゴペプチダーゼの製造方法、該
プロリルオリゴペプチダーゼを利用した蛋白質およびペ
プチドの加水分解方法に関する。蛋白質の加水分解物は
調味料および調味料原料として利用される。

【０００２】

【従来の技術】蛋白質の加水分解は、従来高濃度の塩酸
存在下に加熱することにより行われており、この方法に
より多くの蛋白質から調味料および調味料原料および食
品素材が製造されている。しかしながらこれらの食品を
取り扱う業界では、消費者の天然物嗜好の拡大に伴い、
化学薬品である塩酸を使用しない方法が望まれるように
なりつつある。塩酸加水分解法に代わる方法として、蛋
白質分解酵素を用いる加水分解方法が考えられるが、酵
素のコストが塩酸に比べて高価であること、また塩酸を
用いて加水分解した場合と同程度に加水分解率を高める
ことは困難であったことから実用化された例は少ない。

【０００３】酵素による加水分解で蛋白質の加水分解率
が低い原因の１つとして、蛋白質中のプロリン残基およ
びヒドロキシプロリン残基の存在があげられる。プロリ
ンおよびヒドロキシプロリンは環状α−イミノ酸であ
り、他のアミノ酸とは異なる立体構造をしている。蛋白
質またはペプチド中のプロリン残基およびヒドロキシプ
ロリン残基のイミノ基やカルボキシル基が関与するペプ
チド結合は通常の蛋白質分解酵素による加水分解を受け
にくい。一方、プロリン特異的ペプチダーゼはペプチド
中のプロリン残基部分を特異的に加水分解する酵素であ
り、プロリルオリゴペプチダーゼ（別名プロリルエンド
ペプチダーゼ）、プロリンジペプチダーゼ等多数の酵素
が知られている。本発明者らは、このようなプロリン特
異的ペプチダーゼを用いることにより、蛋白質が高度に
加水分解できることを既に見出し、特開平７ー１１５９
６９号公報、特開平８ー２６６２７６号公報、特開平９
ー０００１６４号公報にその詳細を開示した。

【０００４】食品加工のために酵素を用いる場合には、
反応中の微生物繁殖を抑制するために高い食塩濃度下で
反応を行うことが多い。しかしながら、これらの酵素は
高濃度の食塩が存在した場合にはその活性が大幅に低下
し、食品加工用途として工業的に使用する際の問題点と
なっていた。中でも、蛋白質の高度加水分解に特に重要
であると考えられるプロリルオリゴペプチダーゼについ
ては、何種類かの微生物由来酵素がこれまでに報告され
ているが、それら酵素が高い塩濃度の条件下でも活性を
示すか否かについては、これまで全く開示されていな
い。本発明者らは、これらの内の何種類かのプロリルオ
リゴペプチダーゼについて、高食塩濃度下での活性を調
べてみたが、満足できる食塩耐性度を示す酵素は存在し
なかった。さらに、既知のプロリルオリゴペプチダーゼ
生産菌であるフラボバクテリウムメニンゴセプティカム
（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅ
ｐｔｉｃｕｍ）は、新生児脳膜炎の病原菌として、キサ
ントモナス マルトフィリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）は日和見感染症の原因菌で
あるとの報告があり、エアロモナス ヒドロフィラ（Ａ
ｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）は魚毒生産菌
であると報告されている。このように人体や環境に対し
て有害な微生物を食品加工の用途に利用することは、産
業上望ましい姿ではなく、安全な微生物由来で、かつ食
塩に対する耐性度が高いプロリルオリゴペプチダーゼが
望まれていた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】高濃度の食塩存在下で
も高い活性を示し、かつ安全な微生物由来のプロリルオ
リゴペプチダーゼを見出し、該酵素を用いた蛋白質の加
水分解プロセスを確立することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意検討を行った結果、スフィンゴモナ
ス カプスラタ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｃａｐｓ
ｕｌａｔａ）ＩＦＯ１２５３３が高濃度の食塩に対する
耐性が強いプロリルオリゴペプチダーゼを生産すること
を見出し、該プロリルオリゴペプチダーゼを用いた蛋白
質の加水分解において高い加水分解率が達成できること
を見出し、さらに該プロリルオリゴペプチダーゼをコー
ドする遺伝子を単離し、その構造を調べることにより本
発明を完成させるに到った。すなわち、本発明は、食塩
に対する耐性度の強い新規プロリルオリゴペプチダー
ゼ、該プロリルオリゴペプチダーゼをコードする遺伝
子、および該プロリルオリゴペプチダーゼの製造方法、
並びにこれを用いた蛋白質の加水分解方法に係わる。

【０００７】本発明のプロリルオリゴペプチダーゼは以
下の特徴を有する。 （１）加水分解反応の最適食塩濃度が０．２±０．１Ｍ
であり、２Ｍの食塩濃度下での活性が最適食塩濃度下で
の活性の５０％以上である。 （２）反応の最適ｐＨが８．５±０．５であり、ｐＨ５
における活性が最適ｐＨにおける活性の２０％以上であ
る。 （３）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
分子量が７５０００±２０００である。 （４）等電点が７．５±０．２である。 （５）フェニルメタンスルホニルフルオリドおよびジイ
ソプロピルフルオロリン酸により阻害される。

【０００８】これらの特徴は、後述の実施例に記載の方
法により測定する。本発明のプロリルオリゴペプチダー
ゼの例としては、スフィンゴモナス カプスラタ ＩＦ
Ｏ １２５３３が生産するペプチダーゼがあげられる。
尚、スフィンゴモナス カプスラタ ＩＦＯ １２５３
３は財団法人発酵研究所が保有する微生物であり、同所
に依頼することにより誰でもこの菌株の分譲を受けるこ
とができる。本発明のプロリルオリゴペプチダーゼは、
このようなプロリルオリゴペプチダーゼを生産する能力
のある微生物を培地に接種し、一定時間培養を行った
後、培養液より該酵素を抽出することにより製造するこ
とができる。該プロリルオリゴペプチダーゼを生産する
能力のある微生物をスクロース、ゼラチン、酵母エキ
ス、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）等を含む培地に
接種し、２８〜３０℃で１〜３日好気培養することによ
り該ペプチダーゼが生産される。該ペプチダーゼは培養
上清中にも多少蓄積するため、これを濃縮してもよい
が、多量の酵素を取得する場合には菌体を遠心分離等に
より集め、超音波処理、浸透圧ショック処理、リゾチー
ム処理や界面活性剤処理を行い、菌体内に存在する該ペ
プチダーゼを抽出することが望ましい。該抽出液より公
知の常法、例えば硫安またはアセトンによる分画、疎水
クロマトグラフ、イオン交換クロマトグラフ、ゲル濾過
クロマトグラフ等を用いることにより、本発明の酵素を
精製することができる。

【０００９】本発明のプロリルオリゴペプチダーゼをコ
ードする遺伝子は、遺伝子工学の技術を用いて単離する
ことができる。大腸菌等の公知の宿主−ベクター系を用
い、公知の常法によりクローニングを行う。プロリルオ
リゴペプチダーゼをコードする遺伝子を含む組換え体
は、平板培地に生じたコロニーにカルボベンゾキシ−グ
リシル−プロリン−β−ナフチルアミド（今後Ｚ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｒｏ−βＮＡと略す）を含む軟寒天を重層し、さ
らにファスト・ガーネットＧＢＣ液を注ぎ、赤色に変化
するコロニーとして検出される。このような方法により
得られたプロリルオリゴペプチダーゼをコードする遺伝
子を含むＤＮＡを、ｐＵＣ１８等のベクターに接続し、
該組換え体を培養後、ＩＰＴＧ等の誘導化剤で処理する
ことによっても該プロリルオリゴペプチダーゼを生産す
ることができる。

【００１０】本発明のプロリルオリゴペプチダーゼを用
いて蛋白質およびペプチドを加水分解する際、必ずしも
酵素を精製することは必要ではない、加水分解反応もし
くは加水分解物に悪影響を与える因子が混在せず、かつ
食品衛生上の問題が無ければ該酵素の粗精製品または培
養液からの抽出物をそのまま反応に利用することも可能
である。尚、スフィンゴモナス カプスラタ ＩＦＯ
１２５３３の培養液より調製した粗酵素には、プロリル
オリゴペプチダーゼ（ＰＯＰ）の他にシペプチジルペプ
チダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、ロイシンアミノペプチダ
ーゼ（ＬＡＰ）、グリシンアミノペプチダーゼ（ＧＡ
Ｐ）の活性が含まれており、加水分解すべき蛋白質やペ
プチドの種類によっては、該粗酵素をそのまま加水分解
に用いた方が高い加水分解率が得られることもある。

【００１１】本発明のプロリルオリゴペプチダーゼを用
いた蛋白質およびペプチドを加水分解する方法も公知の
ペプチダーゼを用いる反応と何等変わりはない。蛋白質
を高度に加水分解する場合には、原料蛋白質を複数のプ
ロテアーゼおよびペプチダーゼで処理することが必要で
あるが、異なる複数のプロテアーゼ製剤を同時にまたは
連続して使用するよりも、複数のプロテアーゼおよびペ
プチダーゼを同時に含むプロテアーゼ製剤を用いる方が
有利である。複数のプロテアーゼおよび公知のペプチダ
ーゼを同時に含むプロテアーゼ製剤の例としてはノボ・
ノルディスク社（ＮＯＶＯ ＮＯＲＤＩＳＫ Ａ／Ｓ、
デンマーク）のフレ−バ−ザイム（Ｆｌａｖｏｕｒｚｙ
ｍｅ）があげられる。該プロテアーゼ製剤にはアスペル
ギルスオリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａ
ｅ）由来で、その中には、約２３ｋＤ、約３１ｋＤ、約
３５ｋＤ、約３８ｋＤ、約５３ｋＤの少なくとも５種の
プロテアーゼおよびペプチダーゼが含まれており、さら
にそれ以外にも、約２７ｋＤ、約３２ｋＤ、約４２ｋ
Ｄ、約４７ｋＤ、約１００ｋＤのプロテアーゼおよびペ
プチダーゼが含まれていることもある。このような酵素
製剤と、本発明のプロリルオリゴペプチダーゼとを同時
にまたは別々に蛋白質に作用させることにより蛋白質の
高度加水分解が達成される。

【００１２】本発明のプロリルオリゴペプチダーゼによ
る加水分解は反応液のｐＨが４〜１０、好ましくは７〜
９の範囲で、反応温度は３０〜５０℃、好ましくは４０
〜４５℃で行うことが必要である。以下に本発明の実施
例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。

【００１３】

【実施例】以下の実施例で得られた酵素の性質は以下の
ようにして求めた。 （１）蛋白質量の測定 精製酵素を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
で適宜希釈後、同緩衝液をブランクとして２８０ｎｍの
吸光度を島津分光光度計ＵＶ−１６０Ａを用いて測定し
た。蛋白質量は、２８０ｎｍにおける吸光度１の蛋白質
溶液１ｍｌ中に含まれる蛋白質を１単位とする吸光度単
位で示した。尚、本精製酵素１．５吸光度単位が、約１
ｍｇの蛋白質量に相当した。 （２）プロリルオリゴペプチダーゼ活性 Ｚ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ５ｍＭ濃度のエタ
ノール溶液にその１．５倍容の５０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）を加えて基質溶液とした（終濃度２
ｍＭ）。酵素液は１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのジチ
オトレイトールおよび０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アル
ブミンを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で適宜希釈し、その５００μｌに基質溶液１００μ
ｌを加えて３７℃で５〜１５分間反応させた。反応液に
１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）３００μｌ
を添加して反応を停止させ、８０００×ｇで１分間遠心
分離を行うことにより不溶物を除去し、遊離パラニトロ
アニリンに由来する４１０ｎｍの吸光度を測定した。酵
素１単位はＺ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを基質
とした場合に３７℃、１分間の反応で１μモルのパラニ
トロアニリンを遊離させる酵素量と定義した。尚、パラ
ニトロアニリンの分子吸光係数は９４８０Ｍ^-1・ｃｍ^-1
とした。

【００１４】（３）阻害剤の影響 阻害剤の酵素に及ぼす効果を以下のように調べた。酵素
液に各種阻害剤を一定量添加して５００μｌとし、室温
で２０分放置した後、上述の基質溶液１００μｌを添加
して３７℃で５分間反応させた。 （４）最適温度 １０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）の緩衝液
中、各種温度で１０分間酵素反応を行い、Ｚ−Ａｌａ−
Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを加水分解する活性を比較し
た。 （５）分子量の測定 酵素の分子量はファルマシア社製ファストシステム（Ｐ
ｈａｓｔ ｓｙｓｔｅｍ）を用いたＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により測定した。ゲルは１０−１
５％のグラディエントゲルを使用した。分子量マーカー
として、ファルマシア社製ホスホリラーゼｂ（分子量９
４、０００）、アルブミン（分子量６７、０００）、オ
ボアルブミン（分子量４３、０００）、カーボニック・
アンヒドラーゼＢ（分子量３０、０００）、トリプシン
インヒビター（分子量２０、１００）、α−ラクトアル
ブミン（分子量１４、４００）を用い、これらの泳動位
置から求めた校正曲線より分子量を求めた。

【００１５】（６）等電点の測定 ファルマシア社製ファストシステム（Ｐｈａｓｔ ｓｙ
ｓｔｅｍ）を用いた等電点電気泳動により等電点を求め
た。ゲルはＩＥＦ５−８を使用し、内部標準として用い
た等電点マーカーであるファルマシア社製トリプシンイ
ンヒビタ−〔等電点４．５５）、β−ラクトグロブリン
Ａ（等電点５．２０）、ウシカーボニック・アンヒドラ
ーゼ（等電点５．８５）、人カーボニック・アンヒドラ
ーゼ（等電点６．５５）、ウマミオグロビン（酸性側バ
ンド［等電点６．８５］および塩基性側バンド［等電点
７．３５］）、レンチルレクチン酸性側バンド（等電点
８．１５）より校正曲線を求め本発明の酵素の等電点を
求めた。 （７）最適ｐＨおよびｐＨ安定性 ｐＨ安定性は、酵素を各種ｐＨの緩衝液中で、室温で１
時間放置し、その後ｐＨ８．０の緩衝液中での活性を測
定することにより求めた。その際、ｐＨ３．５〜５．５
は５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液をｐＨ５．５〜７．
０は５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を、ｐＨ７．０〜
９．０は５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液をｐＨ９．０〜１
０．５は５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液を用いた。酵素
の最適反応ｐＨは、Ｚ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮ
Ａを加水分解する反応を上記の緩衝液中で行わせること
により求めた。

【００１６】

【実施例１】スフィンゴモナス カプスラタ（Ｓｐｈｉ
ｎｇｏｍｏｎａｓ ｃａｐｓｕｌａｔａ） ＩＦＯ １
２５３３をスクロース０．５％、ゼラチン１％、酵母エ
キス０．５％、ＣＳＬ１％、塩化ナトリウム０．３％、
リン酸水素二カリウム０．２％、硫酸マグネシウム・７
水和物０．１％よりなる培地３リットルを含む５リット
ル容ジャ−ファ−メンタ−に接種し、３０℃で９時間通
気・撹拌培養した。培養液より集菌し、１０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄し、４３ｇの湿
菌体を得た。同緩衝液２００ｍｌに懸濁させた。これに
リゾチームとトリトンＸ−１００をそれぞれ終濃度１ｍ
ｇ／ｍｌおよび０．１％となるように添加し、３７℃で
１時間保温した。これを超音波処理し、１５、０００ｇ
で１０分間遠心分離して上清２００ｍｌを回収し、硫酸
プロタミンを終濃度０．１％となるように添加して核酸
を沈澱させ、沈澱を同様の遠心分離により除去した液を
粗酵素抽出液とした。粗酵素抽出液の各種合成ペプチド
に対する加水分解活性を測定した（表１）。その結果、
本粗酵素抽出液中にはプロリルオリゴペプチダーゼ（Ｐ
ＯＰ）活性の他に、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（Ｄ
ＰＰＩＶ）、ロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）、
グリシンアミノペプチダーゼ（ＧＡＰ）の各活性が認め
られた。

【００１７】

【表１】

【００１８】ファルマシア社製オクチルセファロースＣ
Ｌ−４Ｂを充填したカラムを１．５Ｍの硫安を含む１０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した。
粗酵素抽出液に硫安を終濃度１．５Ｍとなるように添加
し、これを上記カラムにアプライし、１．５→０Ｍの硫
安の濃度勾配（総量２００ｍｌ）で酵素を溶出させた。
各画分につき２８０ｎｍの吸光度とＺ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ｐｒｏ−ｐＮＡを加水分解する活性について測定した
結果を図１に示した。活性画分（フラクション４７乃至
５１）を混合し、これを１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）に対して透析し、これを同緩衝液で平衡
化したファルマシア社製ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６
Ｂカラムにアプライして、０→１Ｍの塩化ナトリウムの
濃度勾配（総量２００ｍｌ）により酵素を溶出させた
（図２）。

【００１９】活性画分（フラクション１４乃至１５）を
集め、これを１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で平衡化した旭ペンタックス社製ヒドロキシルアパ
タイトカラムにアプライし、０→０．３Ｍのリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ８．０）の濃度勾配（総量２００ｍ
ｌ）により酵素を溶出させた（図３）活性画分であるフ
ラクション１２乃至１４をそれぞれアミコン社製セント
リフローＣＦ２５（分画分子量２５、０００）で濃縮し
た。フラクション１２の濃縮液をファルマシア社製スー
パーロース１２ ＨＲ１０／３０カラムを用い、０．５
Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）を流してゲル濾過を行った（図４Ａ）。
また前記フラクション１３および１４の濃縮液も同様に
ゲル濾過を行った（図４ＢおよびＣ）。図４Ａのフラク
ション４６乃至５０、図４Ｂのフラクション４５乃至５
０および図４Ｃのフラクション４６乃至５０を混合し、
セントリフローにて濃縮・脱塩を行って精製酵素液を得
た。本酵素精製のプロフィールを表２に示した。

【００２０】

【表２】

【００２１】精製酵素を１０〜１５％のポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ファルマシア社製ファストシステ
ム）にて解析した結果、純度は９５％以上であることを
確認した。精製酵素のＺ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｐ
ＮＡを加水分解する比活性は２８０ｎｍの吸光度単位当
たり１０．３単位であった。得られた酵素の分子量は７
５，０００±２，０００、（図５）と推定された。また
本酵素の等電点は７．５±０．２と推定された（図
６）。

【００２２】本精製酵素の活性に及ぼす食塩濃度の影響
を、生化学工業社製プロリルオリゴペプチダーゼ（商品
名：プロリン特異的エンドペプチダーゼ、フラボバクテ
リウム メニンゴセプティカム由来）と比較した。図７
に結果を示したとおり、本発明のプロリルオリゴペプチ
ダーゼは食塩濃度が０．２±０．１Ｍの場合に最大の活
性を示し、食塩濃度が２Ｍの場合でも、この最大活性の
５０％以上の活性を示した。一方、フラボバクテリウム
メニンゴセプティカム由来の酵素は、２Ｍの食塩存在
下ではその活性は最大活性の３０％以下であった（図
７）。

【００２３】本プロリルオリゴペプチダーゼに対する各
種阻害剤の影響を調べた結果を表３に示す。本発明のプ
ロリルオリゴペプチダーゼはキレート剤であるＥＤＴＡ
やｏ−フェナントロリン（ＯＰＴ）、チオール酵素の阻
害剤であるパラクロロメルクリ安息香酸（ＰＣＭＢ）や
ヨード酢酸（ＩＡＡ）では全く阻害を受けず、セリン酵
素の阻害剤であるフェニルメタンスルホニルフルオリド
（ＰＭＳＦ）やジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦ
Ｐ）により阻害されたことから、セリン残基を活性中心
に持つ酵素であると考えられた。

【００２４】

【表３】

【００２５】本酵素はｐＨ３乃至９の範囲で安定であっ
た（図８）。反応の最適ｐＨは８．５であり（図９）、
ｐＨ５でも最大活性の２０％以上の活性を示した。本酵
素の最適作用温度は４３℃であった（図１０）。精製酵
素のＮ−末端アミノ酸配列をエドマン分解法で調べた結
果、本酵素のＮ−末端は、Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｍ
ｅｔ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−であった。

【００２６】

【実施例２】実施例１と全く同様の操作により、約２０
０ｍｌの粗酵素抽出液を取得した。これに２倍容の冷ア
セトンを添加・混合し３、０００×ｇで１０分間遠心分
離を行って沈澱を回収した。沈澱を４０ｍｌの１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させ、不要物
を遠心分離（５、０００×ｇ、５分）により除去し、こ
れを凍結乾燥することにより約１００単位／ｇの粗酵素
標品約１ｇを得た。

【００２７】ゼラチンの１８％水溶液５０ｍｌに６ｇの
食塩を添加し、１０ｍｌずつ４本の試験管に分注した。
全ての試験管にそれぞれノボ・ノルディスク社製のアル
カラーゼ２．４Ｌを２０μｌ加え、試験管２および４に
はそれぞれノボ・ノルディスク社製のフレーバーザイム
ＭＧ１０ｍｇを、試験管３および４にはそれぞれ上記の
粗酵素標品１２５ｍｇを加えて、４５℃で２４時間反応
させた。８５℃で１５分間過熱することにより酵素を失
活させ、それぞれのサンプルにつき、ホルモール態窒素
含量と、ケルダール窒素含量を測定し、これらの比より
加水分解率を計算した。その結果、試験管４の反応液は
試験管２の反応液に比べて約１０％高い加水分解率を、
試験管３の反応液は試験管１の反応液に比べて約１６％
高い加水分解率を示し、プロリルオリゴペプチダーゼの
加水分解に及ぼす効果が確認された（表４）。

【００２８】

【表４】

【００２９】

【実施例３】スフィンゴモナス カプスラタ ＩＦＯ
１２５３３を５ｍｌの培地（バクトトリプトン１０ｇ／
ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、グルコース５ｇ／ｌ、ＮａＣ
ｌ３ｇ／ｌ、リン酸水素二カリウム２ｇ／ｌ、硫酸マグ
ネシウム０．１ｇ／ｌを含む培地で培養し、この培養液
よりＢＩＯ １０１社製ＧＥＮＯＭＥ ＤＮＡ ＩＳＯ
ＬＡＴＩＯＮ ＫＩＴを用いて染色体ＤＮＡを調製し
た。染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、
これをＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＵＣ１８と混合して、
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼで処理し、エシェリシア コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕ
ｅのコンピテントセル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に導
入した。２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ−寒天
培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／
ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ、グルコース２ｇ／ｌ、寒天１５
ｇ／ｌ）上に生じたコロニーを同じＬ−寒天培地２枚に
レプリカして３０℃で培養した。１ｍｇ／ｍｌのＺ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｒｏ−βＮＡを含む４０％ジオキサン溶液１ｍ
ｌを５０℃に保温した３％寒天を含む５０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２．５ｍｌに加え、これをレ
プリカしたＬ−寒天培地の内の１枚に重層して室温で３
０分間静置した後、１ｍｇ／ｍｌのファスト・ガーネッ
トＧＢＣ水溶液３ｍｌを流し込み、赤色に変化するコロ
ニーに対応するコロニーを、レプリカしたもう１枚のＬ
−寒天培地よりピックアップした。このコロニーを培養
後、フナコシ社製ＱＩＡＰＲＥＰ ＳＰＩＮ ＰＬＡＳ
ＭＩＤ ＫＩＴによりプラスミドｐＳＰＥＰ２を抽出し
た。ｐＳＰＥＰ２を各種制限酵素で処理し、切断点地図
を作成した。ｐＳＰＥＰ２はｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩ
Ｉ部位に約１６ｋｂの断片が挿入されていた（図１
１）。尚、ｐＳＰＥＰ２を保持するエシェリシア コリ
ＸＬ１−Ｂｌｕｅは工業技術院生命工学工業技術研究
所にＦＥＲＭ Ｐ−１６１２０として寄託されている。

【００３０】ｐＳＰＥＰ２よりプロリルオリゴペプチダ
ーゼ活性を指標に、サブクローニングを行った。ｐＳＰ
ＥＰ２を各種制限酵素を組み合わせて消化し、これを同
じ酵素で消化したｐＨＳＧ３９８と混合、Ｔ４−リガー
ゼ処理を行い、エシェリシアコリ ＸＬ１−Ｂｌｕｅの
形質転換を行った。その結果、プロリルオリゴペプチダ
ーゼ活性を示す形質転換株よりｐＳＰＥ１０３を得た。
ｐＳＰＥ１０３は約４．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ
断片を含む組換えプラスミドであった（図１１）。この
プラスミドより、種々の制限酵素を用いた欠失プラスミ
ドを作製した。ＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ断片を欠失したｐ
ＳＰｄＳｍａおよびＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ断片を欠失
したｐＳＰｄＲＶではプロリルオリゴペプチダーゼ活性
が発現したが、ＰｓｔＩ−ＳｐｈＩ断片を欠失したｐＳ
ＰｄＰｓｔではプロリルオリゴペプチダーゼは発現しな
かった。このことより、プロリルオリゴペプチダーゼを
コードする部分は約２．４ｋｂのＥｃｏＲＶ−ＳｐｈＩ
断片上に存在することが判明した。

【００３１】上記ＥｃｏＲＶ−ＳｐｈＩ断片を含む約
２．８５ｋｂのＳｍａＩ−ＳｐｈＩ断片につきジデオキ
シ法を用いて塩基配列を調べた（配列番号１）。その結
果、ＥｃｏＲＶ切断部位から数えて７塩基目より始ま
り、７２３アミノ酸残基をコードするオープンリーディ
ングフレーム（ＯＲＦ）が確認され、翻訳開始点である
ＡＴＧコドンの上流約８０塩基の間にプロモーターと考
えられる領域およびリボゾーム結合部位と考えられる領
域が存在した。実施例１で精製した酵素のＮ−末端アミ
ノ酸配列がＡｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−
Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−であったことから、成熟酵素は５３９
塩基目より始まるＧＡＣコドンより下流にコードされて
いることがわかる。塩基配列より推定される成熟酵素の
分子量は７５２５８であり、実施例１で行ったＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により得られた値、７
５０００と一致した。

【００３２】欠失プラスミドｐＳＰｄＲＶを保持するエ
シェリシア コリ ＸＬ１−Ｂｌｕｅを、２０μｇ／ｍ
ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地（バクトトリ
プトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ
／ｌ、グルコース２ｇ／ｌ）中で３７℃で４時間培養し
た。これにＩＰＴＧ（宝酒造社）を終濃度０．１ｍＭと
なるように添加してさらに２時間培養を続けた。遠心分
離により菌体を集め、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）で洗浄後同緩衝液に懸濁し、超音波処理を行
った。細胞残渣を遠心分離により除いて得られた粗酵素
抽出液についてプロリルオリゴペプチダーゼ活性を測定
した。この組換え体は培養液１ｍｌ当たり０．２単位の
プロリルオリゴペプチダーゼを生産した。一方、同様に
培養したスフィンゴモナス カプスラタ ＩＦＯ １２
５３３のプロリルオリゴペプチダーゼ活性は、培養液１
ｍｌ当たり０．０３単位であった。

【００３３】

【発明の効果】食塩に対する耐性度が高いプロリルオリ
ゴペプチダーゼが、これまでに病原性や毒性等の報告の
ない微生物より新たに見出され、これを用いることによ
り、高食塩濃度の条件下でも、蛋白質を高度に加水分解
できるようになった。また、該プロリルオリゴペプチダ
ーゼの遺伝子を単離したことにより、遺伝子工学の技術
を用いて該プロリルオリゴペプチダーゼを大量に生産で
きるようになった。

【００３４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の型：対応する蛋白質を有するヌクレオチド 配列の長さ：２７２０個の塩基対 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の起源：ゲノムＤＮＡ 起源 生物名：スフィンゴモナス カプスラタ ＩＦＯ １２
５３３ 特徴：プロリルオリゴペプチダーゼをコードするゲノム
ＤＮＡ １〜４４８ プロモーター領域 ４４９〜５３８ シグナル配列 ５３９〜２６１７ 成熟プロリルオリゴペプチダーゼ
コード領域 ２６１８〜２６２０ 停止コドン 配列 CCCGGGCACC 10 GCATCGTGCA TTTGCCAGCG AGGCCGGCCT CGCCGTGCTG GTACAGCAAC 60 GCTATCTGGC AGAGCCGGCA GAAACCTGCG AAACGCCGTT CGATCTGGGG 110 TGGACGGAGA TTGCCGCCGT GCTCGAACGT GTGCCCGATG GCCTTGATCG 160 CGCCGACACG ATTGCGTTTG TCGATGCCTG GGCGAACTCT GGGCGGGGGC 210 TCTTGCTTGC CGTGCGCTCG GCCGTGCTGC CAGAGGCCGA CGTCATCCTG 260 ATGAACGCCG ATCATCCCGC AGCAGGCACA GTGCCACCTC AGACAGTGCG 310 GCCGTTCCGC TTTGCCCAGT GCCTGCATCG CCCGCCGATG CTGGGCCGCT 360 ATTCCTGATC GTTGCAAAGT CTGTTGCACT GGGGCGATCC TGCGGTAGTT 410 TCTGGCGAAA CCACCCCCCG TCTTGTCAGG ATATCGCA ATG AAG AAC CGC 460 Met Lys Asn Arg -30 TTG TGG CTG GCC ATG GCC GCC CCG CTT GCG CTT GCC ACC CCG GTT 505 Leu Trp Leu Ala Met Ala Ala Pro Leu Ala Leu Ala Thr Pro Val -25 -20 -15 GCG TTT GCC CAG ACG CCG CCC ACC CTT GCC AAG GAC CAG GCC ATG 550 Ala Phe Ala Gln Thr Pro Pro Thr Leu Ala Lys Asp Gln Ala Met -10 -5 -1 +1 CCG TCA CTG CCG CCC TAT CCC GCC AGC CCG CAA GTG CCG CTG GTG 595 Pro Ser Leu Pro Pro Tyr Pro Ala Ser Pro Gln Val Pro Leu Val 5 10 15 GAG GAC CAT TTC GGT GAA AAG GTG TCC GAT CCC TGG CGC TGG CTG 640 Glu Asp His Phe Gly Glu Lys Val Ser Asp Pro Trp Arg Trp Leu 20 25 30 GAA GCC GAC GTG CGC ACC GAT GCC AAG GTG GCG GCC TGG GTC CAG 685 Glu Ala Asp Val Arg Thr Asp Ala Lys Val Ala Ala Trp Val Gln 35 40 45 GCG CAA AGC GCC TAT ACC GCA GCC TAT CTC AAG CAG TTG CCC GAG 730 Ala Gln Ser Ala Tyr Thr Ala Ala Tyr Leu Lys Gln Leu Pro Glu 50 55 60 CGT GCC GCG CTG GAA AAG CGG ATG AAG GCG CTG ATC GAT TAC GAA 775 Arg Ala Ala Leu Glu Lys Arg Met Lys Ala Leu Ile Asp Tyr Glu 65 70 75 CGG TTT GGC CTG CCG CAG CGC CGT GGC GCT TCG GTC TTC TAC AGC 820 Arg Phe Gly Leu Pro Gln Arg Arg Gly Ala Ser Val Phe Tyr Ser 80 85 90 TGG AAC AGC GGC TTG ATG AAC CAG TCG CAG CTG CTG GTG CGC CCT 865 Trp Asn Ser Gly Leu Met Asn Gln Ser Gln Leu Leu Val Arg Pro 95 100 105 GCC GAT GCG CCG GTG GGC ACC AAG GGA CGG GTA CTG CTC GAT CCC 910 Ala Asp Ala Pro Val Gly Thr Lys Gly Arg Val Leu Leu Asp Pro 110 115 120 AAT ACC TGG GCC AAG GAT GGC GCC ACT GCG CTC GAT GCC TGG GCG 955 Asn Thr Trp Ala Lys Asp Gly Ala Thr Ala Leu Asp Ala Trp Ala 125 130 135 GCA TCG GAT GAC GGG CGC CTG CTG GCC TAT TCG GTG CAG GAT GGC 1000 Ala Ser Asp Asp Gly Arg Leu Leu Ala Tyr Ser Val Gln Asp Gly 140 145 150 GGT TCG GAT TGG CGG ACG GTG AAG TTT GTC GGC GTG GCC GAC GGC 1045 Gly Ser Asp Trp Arg Thr Val Lys Phe Val Gly Val Ala Asp Gly 155 160 165 AAG CCG CTG GCC GAC GAA CTC AAG TGG GTG AAG TTT TCC GGC CTG 1090 Lys Pro Leu Ala Asp Glu Leu Lys Trp Val Lys Phe Ser Gly Leu 170 175 180 GCC TGG CTG GGC AAC GAT GCG CTG CTC TAT TCC CGC TTT GCC GAG 1135 Ala Trp Leu Gly Asn Asp Ala Leu Leu Tyr Ser Arg Phe Ala Glu 185 190 195 CCA AAG GAA GGC CAG GCC TTC CAG GCG CTG AAC TAT AAC CAG ACG 1180 Pro Lys Glu Gly Gln Ala Phe Gln Ala Leu Asn Tyr Asn Gln Thr 200 205 210 GTG TGG CTC CAC CGC CTG GGC ACG CCG CAA AGC GCC GAT CAG CCG 1225 Val Trp Leu His Arg Leu Gly Thr Pro Gln Ser Ala Asp Gln Pro 215 220 225 GTG TTC GCG ACG CCC GAG CTG CCC AAG CGC GGC CAC GGC GCC AGC 1270 Val Phe Ala Thr Pro Glu Leu Pro Lys Arg Gly His Gly Ala Ser 230 235 240 GTT TCG AGC GAT GGG CGC TGG GTG GTG ATC ACC AGC AGC GAG GGC 1315 Val Ser Ser Asp Gly Arg Trp Val Val Ile Thr Ser Ser Glu Gly 245 250 255 ACC GAT CCG GTC AAC ACC GTG CAC GTT GCG CGC GTC ACC AAC GGC 1360 Thr Asp Pro Val Asn Thr Val His Val Ala Arg Val Thr Asn Gly 260 265 270 AAG ATT GGG CCG GTT ACC GCA CTG ATC CCC GAT CTC AAG GCG CAA 1405 Lys Ile Gly Pro Val Thr Ala Leu Ile Pro Asp Leu Lys Ala Gln 275 280 285 TGG GAT TTC GTC GAT GGC GTG GGC GAT CAG CTG TGG TTC GTG TCG 1450 Trp Asp Phe Val Asp Gly Val Gly Asp Gln Leu Trp Phe Val Ser 290 295 300 GGC GAT GGC GCC CCG CTC AAG AAG ATC GTG CGG GTC GAT CTG TCG 1495 Gly Asp Gly Ala Pro Leu Lys Lys Ile Val Arg Val Asp Leu Ser 305 310 315 GGC AGC ACG CCG CGC TTC GAT ACC GTG GTG CCC GAA AGC AAG GAC 1540 Gly Ser Thr Pro Arg Phe Asp Thr Val Val Pro Glu Ser Lys Asp 320 325 330 AAC CTC GAA TCC GTC GGC ATT GCC GGC AAC CGC CTG TTC GCC AGC 1585 Asn Leu Glu Ser Val Gly Ile Ala Gly Asn Arg Leu Phe Ala Ser 335 340 345 TAT ATC CAC GAT GCC AAG AGC CAG GTC CTG GCG TTC GAT CTT GAT 1630 Tyr Ile His Asp Ala Lys Ser Gln Val Leu Ala Phe Asp Leu Asp 350 355 360 GGC AAG CCG GCC GGT GCG GTC AGC CTG CCC GGC ATC GGC AGC GCC 1675 Gly Lys Pro Ala Gly Ala Val Ser Leu Pro Gly Ile Gly Ser Ala 365 370 375 TCG GGC CTG AGC GGC CGG CCC GGC GAT CGC CAT GCC TAT CTC TCG 1720 Ser Gly Leu Ser Gly Arg Pro Gly Asp Arg His Ala Tyr Leu Ser 380 385 390 TTC AGC AGC TTT ACC CAG CCT GCC ACG GTG CTG GCG CTC GAT CCC 1765 Phe Ser Ser Phe Thr Gln Pro Ala Thr Val Leu Ala Leu Asp Pro 395 400 405 GCC ACG GCG AAA ACC ACC CCG TGG GAG CCG GTG CAC CTG ACG TTC 1810 Ala Thr Ala Lys Thr Thr Pro Trp Glu Pro Val His Leu Thr Phe 410 415 420 GAT CCG GCC GAT TTC CGG GTG GAG CAG GTG TTC TAT CCC AGC AAG 1855 Asp Pro Ala Asp Phe Arg Val Glu Gln Val Phe Tyr Pro Ser Lys 425 430 435 GAC GGC ACC AAG GTG CCG ATG TTC ATC GTG CGC CGC AAG GAT GCC 1900 Asp Gly Thr Lys Val Pro Met Phe Ile Val Arg Arg Lys Asp Ala 440 445 450 AAG GGC CCG CTG CCC ACG CTG CTC TAT GGC TAT GGC GGC TTC AAT 1945 Lys Gly Pro Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Gly Tyr Gly Gly Phe Asn 455 460 465 GTG GCG CTT ACC CCA TGG TTT TCC GCC GGT TTC ATG ACC TGG ATC 1990 Val Ala Leu Thr Pro Trp Phe Ser Ala Gly Phe Met Thr Trp Ile 470 475 480 GAC AGC GGC GGC GCC TTT GCC CTG GCA AAC CTA CGC GGC GGC GGC 2035 Asp Ser Gly Gly Ala Phe Ala Leu Ala Asn Leu Arg Gly Gly Gly 485 490 495 GAA TAT GGC GAT GCG TGG CAC GAT GCC GGC CGG CGC GAC AAG AAG 2080 Glu Tyr Gly Asp Ala Trp His Asp Ala Gly Arg Arg Asp Lys Lys 500 505 510 CAG AAC GTC TTC GAC GAT TTC ATT GCC GCG GGC GAA TGG CTG ATC 2125 Gln Asn Val Phe Asp Asp Phe Ile Ala Ala Gly Glu Trp Leu Ile 515 520 525 GCC AAT GGC GTG ACG CCG CGC CAC GGC CTG GCG ATC GAG GGT GGC 2170 Ala Asn Gly Val Thr Pro Arg His Gly Leu Ala Ile Glu Gly Gly 530 535 540 TCC AAC GGT GGC CTG CTG ATC GGC GCG GTG ACC AAC CAG CGG CCC 2215 Ser Asn Gly Gly Leu Leu Ile Gly Ala Val Thr Asn Gln Arg Pro 545 550 555 GAT CTG TTT GCG GCG GCC AGC CCT GCC GTG GGC GTG ATG GAC ATG 2260 Asp Leu Phe Ala Ala Ala Ser Pro Ala Val Gly Val Met Asp Met 560 565 570 CTG CGC TTC GAC CAG TTC ACC GCC GGG CGC TAT TGG GTG GAT GAC 2305 Leu Arg Phe Asp Gln Phe Thr Ala Gly Arg Tyr Trp Val Asp Asp 575 580 585 TAT GGC TAT CCC GAA AAG GAA GCC GAT TGG CGC GTG CTG CGC CGC 2350 Tyr Gly Tyr Pro Glu Lys Glu Ala Asp Trp Arg Val Leu Arg Arg 590 595 600 TAT TCG CCC TAT CAC AAC GTG CGT TCG GGC GTG GAC TAT CCG GCC 2395 Tyr Ser Pro Tyr His Asn Val Arg Ser Gly Val Asp Tyr Pro Ala 605 610 615 ATC CTG GTG ACC ACG GCC GAC ACC GAC GAT CGC GTC GTG CCG GGG 2440 Ile Leu Val Thr Thr Ala Asp Thr Asp Asp Arg Val Val Pro Gly 620 625 630 CAC AGC CTC AAA TAT ACT GCG GCG CTG CAG ACC GCC GCG ATC GGG 2485 His Ser Leu Lys Tyr Thr Ala Ala Leu Gln Thr Ala Ala Ile Gly 635 640 645 CCC AAG CCG CAC CTG ATC CGC ATC GAG ACG CGC GCC GGC CAT GGT 2530 Pro Lys Pro His Leu Ile Arg Ile Glu Thr Arg Ala Gly His Gly 650 655 660 TCG GGC AAG CCG ATC GAC AAG CAG ATC GAG GAA ACC GCC GAT GTG 2575 Ser Gly Lys Pro Ile Asp Lys Gln Ile Glu Glu Thr Ala Asp Val 665 670 675 CAG GCG TTT CTG GCC CAT TTC ACC GGG CTG ACG CCG CGC CCC TGA 2620 Gln Ala Phe Leu Ala His Phe Thr Gly Leu Thr Pro Arg Pro 680 685 690 AGTCTATCTT TGACGGTGCA ATCTCTGGCG CCGGCGCTGT GCCGGTGCTA 2670 GAGATTTCCG AACAATGACA AGGTTTGGGA CAGGATGGCG CAAGGCGCTG 2720

【図面の簡単な説明】

【図１】オクチル−セファロースＣＬ−４Ｂクロマトグ
ラフィーによるプロリルオリゴペプチダーゼの分画パタ
ーンである。

【図２】ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂクロマトグ
ラフィーによるプロリルオリゴペプチダーゼの分画パタ
ーンである。

【図３】ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーに
よるプロリルオリゴペプチダーゼの分画パターンであ
る。

【図４】スーパーロース１２ＨＲ１０／３０カラムによ
るゲル濾過クロマトグラフィーによるプロリルオリゴペ
プチダーゼの分画パターンである。

【図５】ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により
求めたプロリルオリゴペプチダーゼの分子量を示す。

【図６】等電点電気泳動により求めたプロリルオリゴペ
プチダーゼの等電点を示す。

【図７】プロリルオリゴペプチダーゼ活性に及ぼす食塩
濃度の影響の比較である。

【図８】プロリルオリゴペプチダーゼのｐＨ安定性を示
す。

【図９】プロリルオリゴペプチダーゼのｐＨ特性を示
す。

【図１０】プロリルオリゴペプチダーゼの温度特性を示
す。

【図１１】プロリルオリゴペプチダーゼをコードする遺
伝子を含む組換えプラスミドの制限酵素切断点地図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/48 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｐ 21/06 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/06 Ｃ１２Ｒ 1:69）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （１）加水分解反応の最適食塩濃度が
   ０．２±０．１Ｍ、２Ｍの食塩濃度下での活性が最大活
   性の５０％以上であり、（２）反応の最適ｐＨが８．５
   ±０．５、ｐＨ５における活性が最適ｐＨにおける活性
   の２０％以上であることを特徴とするプロリルオリゴペ
   プチダーゼ。
2. 【請求項２】 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
   動による分子量が７５０００±２０００であり、等電点
   が７．５±０．２であり、フニルメタンスルホニルフル
   オリドおよびジイソプロピルフルオロリン酸により阻害
   されることを特徴とする請求項１記載のプロリルオリゴ
   ペプチダーゼ。
3. 【請求項３】 スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏ
   ｎａｓ）属細菌由来である請求項２記載のプロリルオリ
   ゴペプチダーゼ
4. 【請求項４】 配列表の配列番号１に記載された配列を
   有するプロリルオリゴペプチダーゼ。
5. 【請求項５】 スフィンゴモナス カプスラタ培養液よ
   り抽出される蛋白質加水分解酵素製剤。
6. 【請求項６】 請求項１乃至５記載のプロリルオリゴペ
   プチダーゼを加水分解反応に使用することを特徴とす
   る、蛋白質およびペプチドの加水分解方法。
7. 【請求項７】 アスペルギルス オリゼに由来し、かつ
   分子量がそれぞれ約２３ｋＤ、約２７ｋＤ、約３１ｋ
   Ｄ、約３２ｋＤ、約３５ｋＤ、約３８ｋＤ、約４２ｋ
   Ｄ、約４７ｋＤ、約５３ｋＤ、および約１００ｋＤの中
   から選ばれる少なくとも５種のプロテアーゼおよびペプ
   チダーゼを含む酵素製剤を加水分解反応に使用すること
   を特徴とする請求項６記載の加水分解方法。
8. 【請求項８】 ５種のプロテアーゼおよびペプチダーゼ
   の分子量が約２３ｋＤ、約３１ｋＤ、約３５ｋＤ、約３
   ８ｋＤ、約５３ｋＤである請求項７に記載の加水分解方
   法。