JPH10512278A - 酸吸引誘発急性肺損傷の治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 酸吸引した患者に、抗ＩＬ−８抗体などの抗ＩＬ−８結合物質を投与することによって、酸吸引による肺損傷を治療する。

Description

【発明の詳細な説明】 酸吸引誘発急性肺損傷の治療方法 本発明は、米国国立衛生研究所により許可された、許可番号No．HL19155及びH L51854の下、米国政府の支持を受けてなされた。米国政府は、本発明について一 定の権利を有する。 本発明は、出願番号08/377,077号（1995年１月23日出願）の一部継続出願であ り、その開示はすべて、参考として本明細書に含まれる。 発明の背景１．発明の分野 本発明は、胃の内容物を吸引したか又は他の原因により生じる、酸に暴露され た患者の肺を治療及び保護する方法に関する。 胃酸の吸引は、例えば、意識のない患者が胃の内容物を吐き戻して肺へ入った ときなどに生じ得る。酸吸引は、成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）の第２の主要 な原因である。この症候群は、間質スペース及び肺胞内スペースへの血液及び血 漿の漏出を伴う肺内皮及び肺胞上皮への損傷に特徴がある。酸誘発ＡＲＤＳの死 亡率は40％〜50％の範囲である。現在利用できる適当な治療はない。 このため、酸を肺に吸引して、ＡＲＤＳが進行している危険に冒されている患 者を治療する方法が望まれている。特に、酸による損傷後１時間以内に治療がな されると、肺内皮及び肺胞上皮への損傷を減ずることができる方法がさらに望ま れる。２．背景技術の説明 ミリガンら(Mulligan et al)(1993年)J．Immunol．150巻：5585頁は、抗ＩＬ −８抗体を用いて、免疫学的に誘発される肺の炎症を治療することを記載してい る。セキドら(Sekldo et al)(1993年)Nature 365巻：654頁は、抗ＩＬ−８抗体 がウサギの虚血性肺組織の局所潅流(reperfusion)損傷を減ずることができるこ とを示している。抗ＩＬ−８抗体は、ウサギのエンドトキシン誘発胸膜炎モ デルの好中球流入を阻害することがわかった。ブロードゥスら(Broaddus et al) (1994年)J．Immunol．152巻：2960-2967頁。ＩＬ−８の上昇したレベルが存在し 、これにより成人呼吸困難症候群を患う患者の好中球流入が生じる。ミラーら(M iller et al)(1992年)Am．Rev．Respir．Dis．146巻：427-432頁。ＴＮＦ−αを 中和することにより（多くの細胞でＩＬ−８が製造される）、酸吸引により生じ る肺損傷を減ずることがわかった。ゴールドマンら(Goldman et al)（1990年）A nn．Surg．212巻：513-520頁。酸吸引誘発肺損傷の可能なメカニズムは、種々の 化学走化性及び炎症性分子の放出に依存する。次に、化学走化性及び炎症性分子 は、肺毛状内皮と結合する際又はそれを通って移動する際、好中球を補充する。 そのようなメカニズムは、多くの文献で議論されている。例えば、イシイら(Ish ii et al)(1989年)Prostaglandins Leukot．Essent．Fatty Acids 37巻：65-70 頁、ゴールドマンら（1990年）上掲、ゴールドマンら（1991年）J．Appl．Physi ol．70巻：1511-1517頁、ゴールドマンら（1992年）Surgery 111巻：55-61頁、 フォウラーら(Fowler et al)(1987年)Am．Rev．Respir．Dis．136巻：1225-1231 頁、キンドら（Kindt et al）（1987年）J．Appl.Physiol．70巻：1575-1585頁 、及びミラーら（1992年）上掲が挙げられる。ＩＬ−８は、炎症の血管外部位へ 好中球を補充する主な化学走化性因子として提案されている。コルディッツら（ Colditz et al）（1990年）J．Leukoc．Biol．48巻：129-137頁及びクンケルら （Kunkel et al）（1991年）Exp．Lung Res．17巻：17-23頁。 発明の概要 本発明にしたがって、インターロイキン−８（ＩＬ−８）結合物質を患者に全 身投与することにより、酸吸引後の急性肺損傷の程度を軽減するか又は除去する 。ＩＬ−８結合物質は、酸に暴露された細胞から放出されるフリーのＩＬ−８を 中和するのに選択される。ＩＬ−８を中和することにより、循環から肺の脈管外 スペースへの好中球の流入を阻害するか又は防止し、ＩＬ−８結合物質による好 中球の補充が減少すると、細胞の損傷が減少すると考えられる。ＩＬ−８結合物 質の例として、抗ＩＬ−８抗体がある。酸吸引後、できる限り迅速にＩＬ−８結 合 物質を患者に投与し、治療上の有効性を実質的に失わないように、そのような投 与を１時間よりも遅くならないようにするのがよい。 図面の簡単な説明 図１Ａ及び１Ｂ。ポジティブコントロール、前処置、処置、並びに６時間後（ 図１Ａ）及び24時間後（図１Ｂ）のネガティブコントロールグループの肺胞−動 脈酸素圧差。６時間の実験で２時間の時点で、前処置及び処置グループの肺胞− 動脈酸素圧差は、ポジティブコントロールグループより著しく低く、かつネガテ ィブコントロールグループとは違いがなかった。24時間の実験で２時間の時点で 、処置（長期）グループの肺胞−動脈酸素圧差は、ポジティブコントロール（長 期）グループより著しく低く、24時間でも低いままであった。ポジティブコント ロール（長期）グループのウサギ（ｎ＝３）はすべて、12〜14時間で死亡した。 データは、平均±ＳＥＭである。^*ｐ＜0.05対ネガティブコントロールグループ （図１Ａ）又は処置（長期）グループ（図１Ｂ）。†ｐ＜0.05対前処置グループ （図１Ａ）、‡ｐ＜0.05対処置グループ（図１Ａ）。 図２Ａ及び２Ｂ。ポジティブコントロール、前処置、処置、及び６時間の（図 ２Ａ）ネガティブコントロールグループ並びに12〜14時間のポジティブコントロ ール（長期）グループ及び24時間後（図２Ｂ）の処置（長期）グループの脈管外 肺水（肺浮腫の定量指標）。短期の研究において、前処置及び処置グループの脈 管外肺水は、ポジティブコントロールグループより35％低く、ネガティブコント ロールグループと差異がない。正常な、点滴注入されてないウサギの肺の脈管外 肺水は、3.2ｇ／（乾燥肺ｇ）である。長期の研究において、処置（長期）グル ープの脈管外肺水は、ポジティブコントロール（長期）グループより100％低い 。データは、平均±ＳＤである。^*ｐ＜0.05対ポジティブコントロールグループ （図２Ａ）又はポジティブコントロール（長期）グループ（図２Ｂ）。 図３Ａ及び３Ｂ。ポジティブコントロール、前処置、処置、及び６時間のネガ ティブコントロールグループ（図３Ａ）並びに24時間の処置（長期）グループ（ 図３Ｂ）の、肺の脈管外スペースにおける、脈管タンパク質トレーサー、¹³¹Ｉ −アルブミンの集積量として測定し、かつ脈管外血漿等価物として表した肺の 内皮透過性。短期の研究において、脈管外血漿等価物は、６時間のポジティブコ ントロールグループと比較して、前処置及び処置で70％減少していた。同じよう な脈管外血漿等価物の減少が、12〜14時間のポジティブコントロール（長期）グ ループと比較した、24時間の処置（長期）グループに観察された。データは、平 均±ＳＤである。^*ｐ＜0.05対ポジティブコントロールグループ（図３Ａ）又は ポジティブコントロール（長期）グループ（図３Ｂ）、^#ｐ＜0.05対ネガティブ コントロールグループ（図３Ａ）。 図４Ａ及び４Ｂ。ポジティブコントロール、前処置、処置、及び６時間のネガ ティブコントロールグループ（図４Ａ）並びに12〜14時間のポジティブコントロ ール（長期）グループ及び24時間の処置（長期）グループ（図４Ｂ）の、ウサギ の気室から洗浄した好中球の数。短期の研究において、前処置及び処置グループ の好中球の数は、ポジティブコントロールグループのそれよりと50％低く、６時 間のネガティブコントロールグループとの差異はなかった。長期の研究において 、24時間の処置（長期）グループの好中球の数は、12〜14時間のポジティブコン トロール（長期）グループより低く、75％より多く低い。データは、平均±ＳＤ である。^*ｐ＜0.05対ポジティブコントロールグループ（図４Ａ）又はポジティ ブコントロール（長期）グループ（図４Ｂ）。 特定の実施の形態の詳細な説明 本発明は、酸誘発性肺損傷がインターロイキン−８（ＩＬ−９）−依存メカニ ズムにより肺に補充された好中球によって仲介されるということを見出したこと に少なくとも一部は基づく。吸引された胃酸による肺の直接的な損傷は、おそら く肺に入った後にすぐ酸が中和されるので、ある程度制限されると考えられる。 しかし、酸の吸引により、かなりの量のＩＬ−８が肺の中の様々な細胞（気道、 上皮細胞、肺胞上皮細胞、及び肺胞マクロファージを含む）から気室に放出され るのを剌激する。気室中に生成されると、ＩＬ−８は肺の内皮に拡散して好中球 のための化学走性勾配を確立し、おそらくＩＬ−８が循環している好中球と相互 作用する管腔内皮表面に結合する。ＩＬ−８と好中球の相互作用は、他のメカニ ズムによる内皮上への好中球接着分子のアップレギュレーション、活性内皮中の 好中球の移動、及び活性化のための好中球のプライミング（priming）を誘発す る。このように肺に補充された好中球は内皮損傷の多くの原因であると考えられ 、この内皮損傷によって酸吸入急性肺損傷の特徴である高タンパク肺水腫になる 。 本発明は、酸によって刺激された気道上皮細胞、肺胞上皮細胞、及び肺胞マク ロファージから放出されたフリーのＩＬ−８の結合に基づく。結合は、好ましく は好中球上のＩＬ−８受容体に結合するＩＬ−８分子の領域を介して起こるため 、放出されたＩＬ−８によって好中球の結合及び補充を直接ブロックする。結合 は少なくとも約１０⁷Ｍ^-1、好ましくは少なくとも１０⁸Ｍ^-1の親和力で起こるベ きである。 ＩＬ−８と循環している好中球との結合を抑制するための適当な結合物質とし て、放出されたＩＬ−８と循環好中球との結合を破壊することができる、抗ＩＬ −８抗体及びそのフラグメント、即ちＩＬ−８受容体タンパク質、又はそのフラ グメント若しくは類似体、又は他のあらゆるタンパク質、糖タンパク、炭水化物 、小分子等が挙げられる。ＩＬ−８結合物質は、好ましくは好中球上のＩＬ−８ 受容体に結合する分子上の領域で、又はその近くで、ＩＬ−８分子に結合する。 この領域に直接結合することによって、ＩＬ−８分子と好中球との間の相互作用 はブロックされる。この領域の近くに結合することによって、放出されたＩＬ− ８による好中球の補充を効果的に抑制するのに充分なステアリン障害が提供され る。 現在好適なＩＬ−８結合物質はＩＬ−８分子に対する抗体を中和する。”中和 する”とは、その抗体がＩＬ−８分子と循環好中球との間の結合を中和する、即 ち抑制することができるという意味である。このような抗体は、ポリクローナル 又はモノクローナル抗体を調製するための従来技術における免疫抗原のように、 ＩＬ−８又はＩＬ−８フラグメントを用いて調製されてもよい。このような技術 は化学文献及び特許文献に詳しく記載されている。（例えば、"Antibodies：A L ABORATORY MANUAL，Harlow and Lane，Eds.，Cold Spring Harbor Laboratory P ress，Cold Spring Harbor，New York（1988）を参照）。モノクローナル抗体を 調製するための特定の技術はブロードダス(Broaddus)らのJ．IMMUNOL．152:2960 -2967(1994)に記載されている。 ＩＬ−８結合物質は、酸吸入が起こった後できるだけ早く全身系の、通常は静 脈内に患者に投与される。投与される特定の物質の性質によって、全投与量は体 重１ｋｇ当り１μｇ〜１０ｍｇで変化してもよい。モノクローナル抗体の例示的 なケースにおいて、投与量は典型的には体重１ｋｇ当り１ｍｇ〜１０ｍｇで変化 し、一回のボーラス又は何回かのボーラスで、全投与量が連続的に投与される。 静脈内投与が好ましいが、ＩＬ−８結合物質は他の全身系ルート、例えば気管内 等によって投与されることもできる。 意図された配送ルートに依って、ＩＬ−８結合物質は所望の投与量の結合物質 を含む好適な医薬組成物に組み込むことができる。このような組成物は、一般に 医薬上許容可能なキャリヤを含み、このキャリヤはＩＬ−８結合物質を患者に送 るのに適切なあらゆる適合性の非毒性物質であってもよい。無菌水、アルコール 、脂肪、ろう、及び不活性固体がキャリヤとして使用することができる。医薬上 許容可能なアジュバント、緩衝剤等もまた、この医薬組成物に組み込むことがで きる。このような組成物は、腸管外投与、即ち静脈内投与、又は肺（気管内）配 送に適している。このような医薬組成物の調製は当技術においてよく知られてお り、参考文献、例えばレミントンのPHARMACEUTICAL SCIENCIES，Gennaro，Ed.， Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania 18042，18th Ed.，1990に記載さ れている。 以下の実施例は例示のために提供したのであって、これらに限定するために提 供したのではない。 実験 方法 動物、外科手術の準備及び通気 最初の方で述べたように雄のニュージーランド産の白ウサギ（ｎ＝３２，体重 ２．５〜３．５ｋｇ，Nitabell，Hayward，CA.，USA）の外科手術の準備をした 。（フォルケッソン（Folkesson）らのAM．J．RESPIR．CRIT．CARE MED．150:14 82-1485）。簡単に述べると、Ｏ₂１００％中のハロタン４％を用いて始めにウサ ギを麻酔し、この麻酔をＯ₂１００％中ハロタン０．８％に維持した。神経筋遮 断のために臭化パンクロニウム（０．３ｍｇ／ｈ × ｋｇ体重； パブロン （Pavulon、登録商標）、オルガノン社（Organon Inc.）アメリカ合衆国 ニュ ージャージー州 ウェストオレンジ）を静脈内に投与した。 ２２ゲージのAngiocath（登録商標）を耳の縁の静脈に挿入し、流体及び薬を 投与した。ＰＥ−９０カテーテルを右の頚動脈に挿入し、体血圧を測定して血液 サンプルを得た。内部直径４．０ｍｍの気管を気管切開によって挿入した。実験 中ウサギをうつ伏せの状態にしたまま定量ピストンポンプ（ハーバード装置社（ Harvard Apparatus Co．）アメリカ合衆国 マサチューセッツ ドーバー）を用 いてベースライン周期の間は吸入酸素フラクション１．０及びピーク気道圧１５ 〜１８ｃｍＨ₂Ｏで通気し、及び陽性最終呼気圧４ｃｍＨ₂Ｏを補充した。ベース ライン周期の間、呼吸速度は動脈性ＰＣＯ₂が３５〜４０ｍｍＨｇに維持される ように調節した。その後、実験の間を通して呼吸装置の設定を一定に保った。 点滴の調製 １００mOsm/kgのＮａＣｌ（１／３の通常の食塩）溶液を、０．９％等張食塩 水及び蒸留水で調製した。１／３重量オスモル濃度を選んで胃の吸収液の重量オ スモル濃度に合わせた。次に、この溶液に塩酸（ＨＣｌ）を加えてｐＨ１．５に 滴定した。ネガティブコントロールのウサギの研究では、１／３通常食塩水を点 滴として使用した。エバンスブルー染料（Evans blue dye）（１ｍｇ、アルドリ ッヒケミカル社（Aldrich Chemical Company Inc.）アメリカ合衆国 ウィスコ ンシー州 ミルウォーキー）を全ての点滴に加え、注入された流体が両方の肺に 等分に分配されたことを死後の検査で確認した。 ウサギのｒＩＬ−８のモノクローナル抗体の生成 ウサギのｒＩＬ−８のモノクローナル抗体（ＡＲＩＬ８．２）の生成はブロー ドダス(Broaddus)らのJ．IMMUNOL．152:2960-2967(1994)に詳細に記載されてい る。ＡＲＩＬ８．２はウサギＩＬ−８を識別する能力があるので、ＡＲＩＬ８． ２を用いて、¹²⁵Ｉラベル化ウサギｒＩＬ−８がＩＬ−８受容体と結合するのを 抑制し、ＩＬ−８受容体を介したウサギｒＩＬ−８誘発性シグナル導入をブロッ クし、及びウサギ好中球のためのウサギｒＩＬ−８誘発性化学走性作用を抑制し た。ＡＲＩＬ８．２は、ウサギＩＬ−８（Ｋ_d＝０．４２ｎＭ）に対して高い親 和力を有していた。ＡＲＩＬ８．２は、ヒトＩＬ−８とはクロス反応したが、密 接に関連したサイトカイン（ｈＭＧＳＡ、血小板因子−４，β−トロンボグロブ リン）、他のヒトサイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α）、又は他の化学走性 因子（ＦＭＬＰ，Ｃ５ａ）にはクロス反応しなかった。抗体調製物を滅菌濾過し 、エンドトキシンはリムラス分析（Limulus assay）では検出不可能であった。 一般的な実験プロトコル 全ての実験において、手術準備後に、安定した心拍、全身血圧、及び動脈血液 ガスの１時間のベースラインが注入前に必要であった。ベースライン期間中の１ ５分間、３μＣｉ¹³¹Ｉ−ラベル化ヒト血清アルブミン（¹³¹Ｉ−アルブミン、フ ロスト（Frosst）実験室）を脈管トレーサタンパク質として静脈内に注入した。 ベースライン期間の残り４５分間に血液サンプルを１５分毎に採取した。脈管ト レーサを用いて、肺の脈管外スペースへの血漿タンパク質の流出を計算した。 注入に関しては、竜骨より約１cm上に位置するまで、チューブ［５ Fr．、ア キュマーク(Accumark、登録商標)、プレマークフィーディングカテーテル、コン コルド／ポルテックス（Concord/Portex）、キーン（keene）、ニューハンプシ ャー州、アメリカ合衆国］を静かに気管を通過させた。次いで、ＨＣｌ又は１／ ３正常食塩水（体重１kg当り４ml）を３分にわたり両方の肺に注入した。注入完 了後、チューブを取り出した。 注入の３０分後と、その後の６時間又は２４時間の実験期間中の１時間毎に、 血液をサンプリングした。 ６時間又は２４時間の実験終了時に、腹部を切開し、腹部の大動脈の切断によ り、ウサギの血を放血した。胸部切開法により両方の肺を取り出した。遠位気道 中のＶ形位置までカテーテルをゆっくりと気管内に通してサンプリングすること により、肺胞サンプルを吸い出した。次いで、脈管外肺水及びトレーサタンパク 質測定（以下を参照）において後ほど使用するために、主要な気管支において左 肺を締めつけた。次いで、１２mMリドカイン（シグマ・バイオケミカルズ(Sigma Biochemicals)、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ合衆国）を含む６ml等張 ０．９％ＮａＣｌを用いて、右肺を２回洗浄した。 サンプルの放射能を測定した。血液及び気管支肺胞の洗浄サンプルにおいて、 全セルカウント及び微分セルカウントを測定した。洗浄サンプル１ml当りのセル 数としてセルをカウントし、使用する洗浄カラム（１２ｍｌ）を乗算した。血漿 サンプル及び肺胞サンプルにおいて、他の物質と結合しないフリーのＩＬ−８の 濃度を測定した。 注入物及び各実験からの選択サンプルのトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）の沈殿によ り、脈管トレーサ¹³¹Ｉが９８％より高い割合でタンパク質に結合したままであ ることが確証された。 特定の実験プロトコル 実験グループは６つであった。これらグループの３グルーブにはＨＣｌを注入 し、１つには１／３正常食塩水を注入した。 ポジティブコントロールグループ（ｎ＝１０）では、ＨＣｌ注入の５分前に、 ０．９％ＮａＣｌ（体重１kg当り２ml）か又は無関係なモノクローナル抗体（体 重１kg当り２mg）をウサギに静脈内投与した。無関係なモノクローナル抗体は、 ＡＲＩＬ８．２（ＩｇＧ２ａ）と同じイソタイプからなり、ヒト免疫欠乏症ウイ ルスにおけるｇｐ１２０エンベロープタンパク質に対するものであった。調査す るパラメータに差はなかったので、無関係なモノクローナル抗体を静脈内投与し たウサギとＮａＣｌを静脈内投与したウサギを１つのグループに入れた。 前処置グループ（ｎ＝６）においては、ＨＣｌ注入の５分前に、ウサギにＩＬ −８に対するモノクローナル抗体（ＡＲＩＬ８．２、体重１kg当り２mg）を静脈 内投与した。 処置グループ（ｎ＝６）においては、ＨＣｌ注入後１時間経過時に、ウサギに ＡＲＩＬ８．２（体重１kg当り２mg）を静脈内投与した。 ネガティブコントロールグループ（ｎ＝４）においては、１／３正常食塩水注 入の５分前に、ウサギに０．９％ＮａＣｌ（体重１kg当り２ml）を静脈内投与し た。 ポジティブコントロール（長期）グループ（ｎ＝３）においては、ＨＣｌ注入 後１時間経過時に、ウサギに無関係なモノクローナル抗体ａｎｔｉ−ｇｐ１２０ を静脈内投与した。実験は２４時間行ったが、このグループ内の全てのウサギは ＨＣｌ注入の１２〜１４時間後に死亡した。 処置（長期）グループ（ｎ＝３）においては、ＨＣｌ注入後１時間経過時に、 ＡＲＩＬ８．２（体重１kg当り２mg）をウサギに静脈内投与した。次いでこれら ウサギを２４時間調査した。 血行力学、気道圧力、及び動脈血液ガス 較正された圧力トランスデューサ（Ｐｄ２３ ＩＤ）ゴウルドオクスナード（ Gould Oxnard）、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を用いて心拍、全身血圧 、及び気道圧力を測定し、グラスポリグラフ（グラスモデル７ポリグラフ、グラ スインスツルメント（Grass Instruments）、クインシー（Quincy）、マサチュ ーセッツ州、アメリカ合衆国）で連続的に記録した。動脈血液ガス及びｐＨ及び 全身動脈圧力を３０分毎に測定した。肺胞−動脈酸素差を計算した。 脈管外肺水 我々の脈管外肺水の決定方法については詳細に前述した。ベルチアウム（Bert hiaume）らの（1987年）J．CLIN．INVEST.79巻335〜343ページ、ウィーナー−ク ロニシュ（Wiener-Kronish）らの（1991年）J．CLIN．INVEST.88巻864〜875ペー ジ。手短にいえば、左肺を均質化し、脈管外の湿潤重量対乾燥重量比（湿潤肺１ ｇ／乾燥肺１ｇ）を測定することにより、脈管外肺水を決定した。右肺はセルカ ウントのために洗浄したので、左肺のみに対して脈管外肺水を得た。右肺からの 気管支肺胞洗浄物と両肺からのホモジェネートを用いて、放射能（以下参照）を 測定した。 肺脈管透過性 タンパク質に対する肺内皮透過性の測定に関しては、肺の内皮を通して肺の脈 管外部分への脈管トレーサタンパク質¹³¹Ｉ−アルブミンの浸透性を測定した。 肺全体の¹³¹Ｉ−アルブミン（量）をとり、気管支スペースの¹³¹Ｉ−アルブミ ンを引くことにより、肺中の脈管外¹³¹Ｉ−アルブミンの総集積量を計算した。 前に行った通り、計算した肺内の血漿量を最終の血漿サンプル中のカウント数に 乗算することにより、脈管スペースにおける¹³¹Ｉ−アルブミンを計算した。ベ ルチアウム（Berthiaume）らの（1987年）J．CLIN．INVEST.79巻335〜343ページ 、及びウィーナー−クロニシュ（Wiener-Kronish）らの（1991年）J．CLIN.INVE ST．88巻864〜875ページ。肺内の¹³¹Ｉ−アルブミンの脈管外集積量を、血漿評 価、又は肺内の放射能を評価する血漿（ml）として表した。 フリーのＩＬ−８濃度の測定 ブロードダス（Broaddus）らの（1994年）J．IMMUNL．152巻2960〜2967ページ で述べられるように、抗ＩＬ−８モノクローナル抗体が結合していないフリーな ＩＬ−８の濃度を、血漿中及び最終的な肺胞サンプル中でＥＬＩＳＡにより測定 した。このアッセイにおいては、ＡＲＩＬ８．２に既に結合したＩＬ−８が獲得 されないように、ＡＲＩＬ８．２を初期獲得ｍＡｂとして使用した。マイクロタ イタープレート［９６−ウェル；イムノプレートマキシソルプ．（ImmunoPlateM axiSorp．）ナンク．（Nunc．）アラメダケミカルサイエンス（Alameda Chemica l Sciences）、オークランド、カリフォルニア州、アメリカ合衆国］をＡＲＩＬ ８．２（１０μｇ／ml）でコーティングし、乾燥ブロットし、０．５％ウシ血清 アルブミン（シグマ）を含むホスフェート緩衝サリン（ＲＢＳ）で１時間ブロッ クした。ＡＲＩＬ８．２と混合されたｒｒＩＬ−８、いくつかの希釈度の血漿サ ンプル及び肺胞サンプルのスタンダードをウェルに加え、１時間培養した。洗浄 後、ロングアームビオチン［ビオチン−Ｓ−ＮＨＳ、リサーチアーバニクス（Re seach Organics）、クリーブランド、オハイオ州、アメリカ合衆国］に抱合され た二次抗体（８Ｃ１．１．６）を２時間加え、その後ホースラディシューペルオ キシダーゼ抱合ストレプタビジン（horseradish-peroxidase-conjugated strept avidin）［１：５，０００；ジムド(Zymed)研究室、サウスサンフランシスコ、 カリフォルニア州、アメリカ合衆国］を１時間加えた。次いでテトラメチルベン ジジン［ＴＭＢ；２コンポーネントシステム、カークガード＆ペリー（(Kirkega ard & Perry)研究室］を加え、室温にて１０分間発色させた。次いで、波長 ４０５nmのＥＬＩＳＡプレートリーダーにより、光学密度を測定した。２，００ ０〜３１pg／mlの範囲にわたって生成した標準曲線から４−パラメータプログラ ム（ジェネンテックインコーポレイテッド(Genentech Inc.)、サウスサンフラン シスコ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を用いて内挿することにより、サ ンプル値を決定した。中和されていないサンプルに対して、それらの線形範囲に わたって希釈の結果を平均した。しかし、捕獲抗体に等しい溶解性抗体の存在下 で抗原を検出すると、希釈の増大においてＥＬＩＳＡが非線形となるおそれがあ る。それはおそらく、溶解性の抗体から抗原が解離し、その後捕獲抗体により結 合されるためである。従って、中和されたサンプルに対して、フリーのＩＬ−８ の存在の過大評価となる可能性があることを知った上で、フリーのＩＬ−８の量 を計るために最低の希釈（１：１０）を選択した。ＡＲＩＬ８．２と混合された ｒｒＩＬ−８のスタンダードを用いてＥＬＩＳＡをテストしたところ、ＡＲＩＬ ８．２の濃度が増大するにつれてフリーのＩＬ−８の減少が検出され、５：１及 びそれ以上のモル比ではＩＬ−８がついに検出できなくなった。アッセイを個別 に実行することにより実験条件がわからないように全てのサンプルをコード化し た。 統計上の分析 繰り返しの測定分析による一方向ＡＮＯＶＡを用いて、いくつかの時点におけ る同一動物からのサンプルを比較した。他の単一グループを比較する際に一方向 ＡＮＯＶＡ（部分的）を用いた。スチューデント−ニューマン−キュール（Stud ent-Newman-Keuls）テストは統計後テストとして使用した。値は、表及び図の凡 例中に示されるように、平均±ＳＤ又は平均±ＳＥＭのいずれかとして表した。 無関係なモノクローナル抗体ａｎｔｉ−ｇｐ１２０か又は食塩水のいずれかによ り予め処理されたＨＣＬを注入されたウサギから得られたデータは、グループ間 に大差がなかったので組み合わせた。 結果 酸素添加反応、通気及びｐＨ 短期の実験では、ＡＲＩＬ８．２前処置グループ及び処置グループの肺胞−動 脈酸素圧の差は、酸点滴注入後２時間までにポジティブコントロールグループの 差よりも著しく小さく、６時間の実験でも小さいままであった（図１Ａ及び表１ ）。ＡＲＩＬ８．２前処置グループ及び処置グループの両方では、肺胞−動脈酸 素圧の差はネガティブコントロールグループの差とは著しく異なっていなかった （図１Ａ及び表１）。 長期の実験では、肺胞−動脈酸素圧の差は、ＨＣｌ点滴注入後２時間までにポ ジティブコントロール（長期）グループよりも処置（長期）グループで著しく小 さかった（図１Ｂ及び表２）。ポジティブコントロール（長期）グループでは、 ウサギは激しい低酸素血のために１２〜１４時間の間に死んだ。一方、処置（長 期）グループでは、ウサギは低酸素血を生じずに２４時間生きた。 ＰａＣＯ₂及びｐＨの酸誘発異常を、６時間及び２４時間の研究でのＡＲＩＬ ８．２による前処置又は処置、及び好中球の枯渇により、阻止した（表１及び表 ２）。 脈管外肺水 短期の実験では、前処置グループ及び処置グループの脈管外肺水（水対乾燥重 量の割合）は、ポジティブコントロールグループよりも３５％少なく、６時間の ネガティブコントロールグループとは著しく異なっていなかった（図２Ａ）。長 期の実験では、２４時間の処置（長期）グループの脈管外肺水は、１２〜１４時 間のポジティブコントロール（長期）グループよりも１００％少なかった（図２ Ｂ）。 肺脈管外透過性 短期の実験では、血漿の脈管外集積量はネガティブコントロールグループより も著しく多かったが、前処置グループ及び処置グループの肺中の血漿等価物の脈 管外集積量は、６時間のポジティブコントロールグループよりも７０％少なかっ た（図３Ａ）。長期の実験では、肺中の血漿等価物の脈管外集積量は、１２〜１ ４時間のポジティブコントロール（長期）グループよりも２４時間の処置（長期 ）グループで７５％少なかった（図３Ｂ）。 全身血圧、心拍数、及びピーク気道圧 実験グループの間では、いずれの時にも、血圧又は心拍数に差異は観察されな かった（表１）。全グループのピーク気道圧は、注入後５分以内に上昇した。ポ ジティブコントロールグループの気道圧は高いままであったが、ネガティブコン トロールグループの気道圧は、６時間のうちに減少した。前処置及び処置した両 グループで、気道圧は、減少する傾向があったが、これは、統計的有意性に達し なかった（表１）。長期研究においても同様の所見が成された（表２）。 気管支肺胞洗浄液及び末梢血中の細胞カウント 短期の実験では、前処置グループ及び処置グループの気室から洗浄した多形核 球（ＰＭＮ）の数は、ポジティブコントロールグループのものよりも５０％以上 少なく、またネガティブコントロールグループものとは差異が無かった（図４Ａ ）。長期の実験では、２４時間の処置（長期）グループ中の洗浄好中球の数は、 １２〜１４時間のポジティブコントロール（長期）グループよりも７５％以上少 なかった（図４Ｂ）。異なるグループ間の肺胞マクロファージの数に、有意な差 異は見られなかった（データは示さず）。末梢血では、好中球が枯渇されたグル ープを除く全てのグループの好中球カウントに於いて、等しい小量の増加があっ た。この場合、実験中のどの時にも、循環好中球は観察されなかった。 フリーインターロイキン−８血漿、肺胞液、及び気管支肺胞洗浄液の濃度 短期の実験において、前処置及び処置グループの最終的な肺胞液サンプル中の フリーのＩＬ−８の濃度は、６時間のポジティブコントロールグループのものよ り１０倍以上低かった（表３）。また、ネガティブコントロールグループの希釈 していない肺胞液が吸引できなかったので、フリーのＩＬ−８を気管支肺胞液中 では測定しなかった。肺胞液中の場合と同様に、処置及び前処置グループの洗浄 液中のフリーのＩＬ−８濃度は、ポジティブコントロールグループのものより１ ０倍以上低かった（表３）。興味深いことには、処置グループの洗浄液中のフリ ーのＩＬ−８は、ネガティブコントロールグループのものと同じであった（表３ ）。長期の実験では、肺胞液を、処置（長期）グループから吸引することができ なかった。しかし、洗浄液中では処置（長期）グループのフリーのＩＬ−８濃度 は、ポジティブコントロール（長期）グループのものよりも著しく低かった（表 ３）。血漿中では、免疫フリーのＩＬ−８（抗ＩＬ−８モノクロナール抗体、Ａ ＲＩＬ８．２に結合していない）の濃度は、常に低く、全グループの場合と同様 であった（３３０±２８ｐｇ／ｍｌ）。 考察 この研究の結果、酸吸引誘発肺損傷は、ＩＬ−８によって肺に補充される好中 球が主に仲介することが確認された。最初に、酸を注入したウサギでは、多数の 好中球が、著しく増大した量のＩＬ−８と関係して気室から回収された。全グル ープの血漿中で殆ど検出できないＩＬ−８の濃度は、ＩＬ−８が酸吸引後に肺の 中で局所的に生成されるという前提を支持する。酸吸引後６時間の気室中のＩＬ −８の濃度（４１±１８ｎｇ／ｍｌ）は、生物学的に関連があり、走化性及び好 中球プライミングのインビトロアッセイ中のＩＬ−８は１０倍低い濃度で生物学 的に活性である。二番目に、肺を損傷する際の好中球の役割は、好中球枯渇後の 肺損傷の著しい整復(reduction)によって支持された。三番目に、好中球の補充 、及びその結果の酸吸引後の肺損傷を仲介する際のＩＬ−８の役割は、ＩＬ−８ を中和することにより確立された。抗ＩＬ−８抗体は、フリーのＩＬ−８の濃度 をポジティブコントロール（酸注入）ウサギ中で１０％未満の濃度で、インピト ロ及びインビボの双方の研究のＩＬ−８の生物学的活性の下限のレベルまで、効 果的に減少した。気管支肺胞洗浄液中の同様のＩＬ−８濃度から判断して、この ＩＬ−８濃度は、ネガティブコントロール（食塩水注入）ウサギ中の濃度と近似 した。抗ＩＬ−８モノクロナール抗体の使用により、好中球注入が５０％以上減 少し、更に重要なことには、酸吸引による厳しい急性肺損傷を著しく整復する。 ＩＬ−８の中和に従って、ガス交換、脈管外肺水及び肺脈管透過性における酸誘 発異常をほぼ完全に防止した。 肺損傷の三つの別個の指標は短期（６時間）及び長期（２４時間）の研究の首 尾一貫した信頼性のある結果を示した。第１に、肺胞−動脈酸素圧力差は、肺胞 水腫がなく、抗ＩＬ−８モノクローナル抗体を投与したウサギではほぼ標準であ った。第２に、ＩＬ−８を中和した場合、酸注入したウサギの脈管外肺水は食塩 水のみを注入したウサギと変わらなかった。前処置及び処置グループ及び食塩水 注入コントロールグループの水：乾燥の重量比４．２〜４．４ｇ水／ｇの乾燥肺 は、間質水腫に最も適合する。一方ポジティブコントロールグループでは、水： 乾燥の重量比が６時間で７．０ｇ水／ｇの乾燥肺及び１２〜１４時間で８．０水 ／ｇの乾燥肺は、かなりの肺胞水腫を示した。これらの差は、肺水が標準的なウ サギの肺（３．２ｇ水／乾燥肺ｇ）の肺水を越える、肺に蓄積する水のミリリッ トルとして表されるとより明らかになる。６時間のポジティブコントロールグル ープでは、両肺の余分な水は約９．２ｍｌか又はネガティブコントロール前処置 及び処置グループの量（１．６〜２．６ｍｌ）よりも３倍高い。最後に、内皮関 門は抗ＩＬ−８モノクローナル抗体を投与した酸注入ウサギでかなり保護される 。ＩＬ−８に対するモノクローナル抗体の前処置又は処置によって妨げられない 肺内皮透過性の僅かな増加があった。しかし、この増加は脈管外肺水の正味の蓄 積を起こすほど十分ではない。肺水の付随増加を伴わない肺内皮透過性の僅かの 増加は、エンドトキシンを注入したヒツジで既に述べた。全体として、ＩＬ−８ が一旦中和すると、肺に対する酸の効果は食塩水のみの効果と変わらない。 抗ＩＬ−８モノクローナル抗体が、酸注入後１時間して投与した場合と損傷の ５分前に投与した場合において同様に効果的であるという事実は、肺損傷の進行 が酸注入によって遅延することを確証している。このような時間経過はＩＬ−８ 発現に予測される速度論に一致する。ＩＬ−８濃縮物はインビボで連続的に測定 されるという研究によって、生物学的に適切なＩＬ−８濃縮物はエンドトキシン による刺激後２時間ではじめて見いだされることが証明された。さらに時間が経 過すると、ＩＬ−８濃縮物は上皮細胞のような近隣傍観細胞に対するＴＮＦ−α 又はＩＬ−１のような近位マクロファージ誘導サイトカインの作用によってさら に増幅される。酸誘発肺損傷の近位サイトカインの重要な役割は、ＴＮＦ−αの 中和によって酸吸引による損傷を著しく減少するという前の研究によって、示唆 されている。ＴＮＦ−αは、多くの細胞によるＩＬ−８の生成を導く主な近位サ イトカインであり、ＴＮＦ−αの中和は炎症性カスケードのＩＬ−８よりも早く 現れるため、抗ＴＮＦ−αは酸注入を伴う抗ＩＬ−８ほど遅くては効果がない。 抗ＩＬ−８の比較的広い治療の窓口（少なくとも１時間）に起因する別の因子は 、生成後にＩＬ−８は内皮に拡散し好中球と相互作用するに違いないことである 。ＩＬ−８の生成及び拡散に必要な時間が与えられると、酸吸引後１時間より遅 く投与する抗ＩＬ−８治療も効果的であることが想像できる。 この研究のデータは、酸吸引後の急性損傷の進行に対してＩＬ−８が必須であ ることを示すが、ＩＬ−８は他の前炎症性(proinflammatory)分子に関連する損 傷を仲介するようである。単独で使用した場合、ＩＬ−８は比較的弱い好中球活 性化因子であるが、インピトロ研究では他のメカニズムによる活性化の有効的な プライマーであることが示された。ＩＬ−８のみを標準的なヒトの皮膚に注射し たインビボ研究では、好中球はじんましん又は発赤を表さずに補充された。同様 に、ＩＬ−８のみをイヌの通常の気管部に注入した場合、好中球はエラスターゼ 又はリゾチームを放出せずに補充された。ＩＬ−８を単独で使用したこれらの研 究とは対照的に、酸吸引肺損傷において、ＩＬ−８は他のサイトカイン、例えば ＴＮＦ−α及びＩＬ−１ならびに他の炎症性媒介物、例えばリューコトリエンス 、補足フラグメント(complement fragment)及び血小板活性化因子に関連して生 成する。しかし、肺への酸吸引後生成された様々なサイトカイン及び炎症性媒介 物にも関わらず、ＩＬ−８のみが存在することによって酸吸引によって起こるウ サギの実験的な肺損傷を防ぐことができる。 胃の内容物を吸引することは、罹病率及び死亡率の主な臨床原因であり、この 状態に対する有効な療法は現在得られない。現在の管理は正の圧力通気及び流体 療法の注意深い管理に制限される。この研究のデータは、この状態に対する抗Ｉ Ｌ−８療法の治療の可能性を示す。この方法には幾つかの可能な利点がある。Ｉ Ｌ−８は遠位サイトカインであるため、その中和はＴＮＦ−αのようなより近位 の多能性サイトカインの中和よりもより限定された効果を有する。また、中和療 法はＩＬ−８が生成される時間という短時間でのみ要求され得る。エンドトキシ ン剌激を伴うインビボ研究では、ＩＬ−８濃度は１２時間より短い時間で標準に 戻る。酸吸引を伴う１２〜１４時間の長期の研究では、未処置のウサギの肺胞流 体ＩＬ−８濃度は６時間の場合よりも低く、単一の酸吸引後の長期抗ＩＬ−８療 法の必要性がなくなることを示す。胃吸引は敗血症のような他の臨床状態でも頻 繁に見られ、発病の時間が特定しにくいため、吸引の発病の時間は多くの場合の 確率によって知られている。さらに重要なことは、酸吸引損傷の発病の遅延によ って医学的に実行可能な治療の窓口が少なくとも１時間は広がったことである。 抗ＩＬ−８療法の潜在的な限界は、抗炎症性療法と同様に、多くの免疫を抑制し 、感染の危険性を高めることである。実際、二次細菌肺炎は吸引後２〜１０日で 起こる酸吸引の合併症として知られている。 上述は本発明の好適な実施形態の完全な記述であるが、さまざまな変更、修飾 及び均等物を使用することができる。したがって、上述は請求の範囲によって定 められる本発明の範囲を制限するものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ， ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ ，ＶＮ (72)発明者 マッセイ、マイケル エー. アメリカ合衆国 94116 カリフォルニア 州 サンフランシスコ スィックスティー ンス アベニュ 1998 (72)発明者 フォルケッソン、ハンス ジー. アメリカ合衆国 94122 カリフォルニア 州 サンフランシスコ ナンバー 14 パ ーナスサス アベニュ 700

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．酸媒体に暴露した肺を有するホストの治療方法であって、暴露による肺への 損傷を阻害するのに有効な量の抗ＩＬ−８結合物質をホストに投与することを含 む、上記治療方法。 ２．抗ＩＬ−８結合物質が、ＩＬ−８のＩＬ−８受容体結合領域と結合する請求 項１記載の方法。 ３．抗ＩＬ−８結合物質か、ＩＬ−８のＩＬ−８受容体結合領域と結合する抗Ｉ Ｌ−８抗体である請求項１記載の方法。 ４．抗ＩＬ−８結合物質を、脈管内又は肺配送により投与する請求項１記載の方 法。 ５．抗ＩＬ−８結合物質が、酸媒体の暴露から１時間以内に投与される請求項１ 記載の方法。 ６．抗ＩＬ−８結合物質の量が、ＩＬ−８の好中球への結合を中和するのに十分 な量である請求項１記載の方法。