JPH10509419A - ｈＰＴＨ（１−３７）配列由来のペプチド - Google Patents
ｈＰＴＨ（１−３７）配列由来のペプチドInfo
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-
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-
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、ヒト上皮小体ホルモン(hPTH)配列(1-37)由来のペプチドであって、α−ヘリックス形アミノ酸配列領域及び／又は不定構造のアミノ酸配列領域を含むペプチドに関する。該ペプチドは動物に注射した際に抗体を誘導することができる。本発明は、該ペプチドで動物を免疫することによって得ることができる診断薬及び抗体にも関する。
Description
【発明の詳細な説明】
hPTH(1-37)配列由来のペプチド
本発明はhPTH(1-37)配列からのペプチド、該ペプチドを使用して動物を免疫す
ることによって得ることのできる診断薬、該ペプチドを使用して動物を免疫する
ことによって得ることのできる抗体又はそのフラグメント、及び生物活性を持つ
hPTHを診断するための薬剤の製造における該ペプチドの使用に関する。
84アミノ酸を有する直鎖状ポリペプチドであるヒト上皮小体ホルモン(hPTH)は
カルシウム代謝の調節において重要な役割を演じている。このホルモンの代謝に
よって多数の C- 末端フラグメントが生じるが、その生物学的作用はまだ解明さ
れていない。hPTH(1-37)が体循環型の N- 末端フラグメントであることが立証さ
れている（EP-A 0 349 545）。このフラグメントは上記ホルモン全体の生物活性
を完全に有している。しかしながら、最初のアミノ酸であるセリンを失うと活性
は著しく低下し、最初の２アミノ酸、すなわちセリン及びバリンが無いと活性が
完全に失われる。
完全なホルモン hPTH(1-84)及び N- 末端フラグメントについては血清中レベ
ルが10-12mol/l の範囲にあることが測定されている。このような低濃度の測定
には免疫学的測定法が使用される。この場合、最も確実な結果は、二重抗体又は
サンドイッチ原理（例えば、二部位ラジオイムノメトリックアッセイ、IRMA、又
はサンドイッチ酵素結合免疫吸着剤アッセイ、サンドイッチELISA）による測定
法によって得られる。hPTH(1-84)については、そのようなアッセイ系が市販され
ている。hPTH(1-34)を測定するための二重抗体原理によるアッセイ系は知られて
いない。
この場合、２個の抗体が必要である。相互立体障害を避けるために、それらは
互いに十分離れた位置にある抗原エピトープを認識できる必要がある。抗原全体
を用いた免疫では、種々の抗体の不均質な混合物が得られ、サンドイッチアッセ
イを行うにはまず最初に費用のかかる精製にかけなければならない。ジェームソ
ン及びウォルフ（B.A．Jameson and H．Wolf）、「抗原指数：抗原決定因子を予
測するための新規計算法」、CABIOS 4，p.181-186，1988による理論的計算から
、N
-末端のアミノ酸 7-14 領域中に免疫原活性を持つ好ましい配列を検出すること
は従来でも可能であった。確立されている方法を用いた N- 末端フラグメントに
よる免疫化からは、hPTH(1-34)について記載されているような（タンペ、ブロジ
オ、マネック、ミシュビヒラー、ブリング、ミラーズ、シュミッツガイク、及び
アルムブルスター（J．Tampe，P．Brozio，H.E．Manneck，A．Missbichler，E．
Blind，K.B．MIllers，H．Schmidt-Gayk，and F.P．Armbruster），「エピトー
プマッピングによるヒト N- 末端上皮小体ホルモンに対する抗体の特性決定」；
J．Immunoassay 13，p．1-13，1992）これらのアミノ酸の領域に結合する抗体が
主に得られる。しかしながら、これらの抗体は生物活性を持つ PTH(1-84)と生物
活性を持たない PTH(1-84)又はその最初の２アミノ酸、セリン及びバリンを欠く
フラグメントとを識別することができない。
本発明の基礎となる技術的課題は、生物活性を有する hPTH の診断における上
記のような欠点を無くすことができるペプチドを提供することである。
驚くべきことに、上記の技術的課題はα−ヘリックス形アミノ酸配列領域及び
／又は不定構造のアミノ酸配列領域を含む hPTH(1-37)の配列由来のペプチドに
よって解決され、当該ペプチドは動物に注射した際に抗体を誘導することができ
る。上記ペプチドは好ましくは hPTH(1-37)のアミノ酸5-9 領域の N- 末端α−
ヘリックス、アミノ酸10-16 の不定構造（non-structured）部分、及び／又はア
ミノ酸配列 17-34領域の C- 末端α−ヘリックスを含む。本発明の以下のペプチ
ドが免疫化に使用されることが好ましい：
これらの NMRデータから具体的に示されるように、提示した配列はその一次構
造中に二次構造の必須の特徴を表している。このための前提条件の一つは生理的
溶液中における PTH(1-37)二次構造の決定である。
上記の特徴的な構造の領域は良好な免疫原性を持つ。抗体は N- 末端の最初の
アミノ酸に結合して形成される。わずか２個のアミノ酸が欠失すると親和性の実
質的な消失が生じる。これらのアミノ酸は生物活性の発現に不可欠であるために
、本発明のペプチドを使用することによって生物活性を有する hPTH 及びそのフ
ラグメントだけを認識する抗体を得ることが可能である。
さらに、アミノ酸 30-37の領域に C- 末端で結合する抗体と共に、中間領域 9
-15 を検出する抗体を製造することができる。従って、理論的計算では分子全体
中の免疫原活性を示さない hPTH(1-37)領域に対する抗体を本発明によって製造
することが可能である。さらに、これらの領域は２個の抗体が同時に結合するの
を妨げる立体障壁が存在しないように互いに離れた距離に分離されている。
好ましい態様においては、上記ペプチドは N- 末端、側鎖及び／又は C- 末端
が修飾されていてもよく、すなわちアシル化、アミド化、リン酸化及び／又はグ
リコシル化生成物の形態を取ってもよい。
その結果、本発明のペプチドはヘモシアニン、チログロブリン、ウシ血清アル
ブミン、オバルブミン、又はマウス血清アルブミン等のようなキャリアー蛋白に
結合していてもよい。キャリアー蛋白への結合は好ましくはカルボジイミド又は
ホルムアルデヒドを用いて行われる。
本発明のペプチドは診断薬の製造に使用することもできる。本発明の診断薬は
動物に少なくとも１個の本発明のペプチドによりそれ自体は公知の免疫法を用い
て得ることができる。免疫の後、免疫グロブリン分画を免疫した動物から単離す
ることができ、この免疫グロブリン分画は少なくとも１個の本発明のペプチドに
対する抗体力価を有する抗体分画を含んでいる。本発明は、このようにして得ら
れた抗体にも関する。Fab及び Fc からなる完全な抗体の他に、Fabのようなそれ
のフラグメント又はペプチド・エピトープのイディオタイプである抗体フラグメ
ントも他の態様として使用することができる。
本発明のペプチドは生物活性を有する hPTH(1-37)の診断に用いる薬剤の製造
に適している。
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１
ペプチドの固相合成
ペプチドを合成するための本発明の方法は固体担体を用いたペプチド合成に基
づくものである。C-末端アミノ酸のそれぞれをジシクロヘキシルカルボジイミド
及びジメチルアミノピリジンの存在下で担体部材に結合させる。Wang樹脂又は同
様の樹脂を合成用の担体部材として用いる。
以下のL-アミノ酸誘導体を、特定されているペプチド樹脂から開始する上記配
列合成に使用した：a）hPTH(1-10): Fmoc-Asn(Trt)-Wang 樹脂、Fmoc-His(Trt)-
OH、Fmoc-Met-OH 、Fmoc-Leu-OH 、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH 、Fmoc-Glu
(OtBu)-OH 、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH 、Boc-Ser(tBu)-OH; b）hPTH(9-1
8): Fmoc-Met-Wang 樹脂、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH
、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH 、Fmoc-Leu-OH 、Fmoc-A
sn(Trt)-OH、Boc-His(Trt)-OH; c）hPTH(24-37): Fmoc-Leu-Wang樹脂、Fmoc-Ala
-OH 、Fmoc-Val-OH 、Fmoc-Phe-OH 、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fm
oc-Val-OH 、Fmoc-Asp(OtBu)-OH 、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH 、Fmoc-Lys
(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Leu-OH 。
合成は、ジイソプロピルエチルアミン又は N- メチルモルホリン及び 1- ヒド
ロキシベンゾトリアゾールの存在下で 2-(1H- ベンゾトリアゾール -1-イル)-1,
1,3,3-テトラメチルウロニウム・テトラフルオロボレート(TBTU)若しくはその誘
導体、又はベンゾトリアゾール -1-イルオキシ -トリス（ジメチルアミノ）ホス
ホニウム・ヘキサフルオロホスフェート(BOP)若しくはその誘導体を用いる in s itu
活性化により、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド又は N-
メチルピロリドン中におけるカップリング反応中に４ないし10倍過剰量の Fmoc-
L-アミノ酸を用いて行うことができる。Fmoc基の除去は N,N- ジメチルホルムア
ミド、N,N-ジメチルアセトアミド又は N- メチルピロリドン中で 20%ピペリジン
又は 2% ピペリジン及び 2% 1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデク -7-エン(DBU)
を用いて行う。合成後、樹脂を 2- プロパノール及びジクロロメタンで洗浄し、
定常重量まで高減圧下で乾燥させる。
担体からの除去及び脱保護は上記ペプチド樹脂を室温で 30-90分間、5%殺菌剤
、水、エタンジオール、フェノール又はチオアニソールを含むトリフルオロ酢酸
と反応させ、濾過してトリフルオロ酢酸で洗浄し、その後、tert-ブチルメチル
エーテルで沈殿させることにより行われる。この沈殿を水溶液から凍結乾燥させ
る。
実施例２
精製及び分析
未処理の生成物を C18逆相カラムのクロマトグラフィーにより精製する（10μ
m、バッファーA: 0.01 N HCl 水；バッファーB: 20%イソプロパノール、30% メ
タノール、50% 水、0.01 N HCl；勾配：60分間で 10-80%；230 nmで検出）。
生成物の純度はマススペクトル及び C18逆相クロマトグラフィーを用いて測定
する。
実施例３
キャリアー蛋白へのカップリング
ヘモシアニン、チログロブリン、ウシ血清アルブミン、オバルブミン、又はマ
ウス血清アルブミンをキャリアー蛋白として使用する。カップリングはカルボジ
イミド法によりペプチドのカルボキシル基を用いて行う。ペプチドを水溶液中で
塩酸 1- エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドと５分間反応さ
せることにより活性化する。カップリングは活性ペプチドをキャリアーの水溶液
に加えることによって行う。モル比はキャリアー蛋白の 50 アミノ酸に対して１
ペプチドである。反応には４時間を要する。
反応は酢酸ナトリウムを 100 mM の最終濃度になるように加えて停止する。イ
ンキュベーションは１時間継続する。
上記蛋白−ペプチド共役体を 100 mM リン酸バッファー、pH 7.2に対して透析
を繰り返すことによってペプチドから分離する。
実施例４
多重抗原性ペプチド(MAP)の合成
三重リジン分枝化（triple lysine branching)を Wang 樹脂に結合した C- 末
端アラニンに Fmoc-L-lysine(Fmoc)-OH を３回のカップリングサイクルを用いて
結合させることによって行う。ピペリジンを用いて開裂すると８個の遊離のアミ
ノ基が得られ、ヒト上皮小体ホルモン配列が上記の記載に従って合成される。
実施例５
免疫
最初の免疫用に、免疫すべき動物の体重１kg 当たり 125μg のキャリアー−
ペプチド共役体又は MAPを水 250 ml に溶解して 250μl の完全フロインド・ア
ジュバンドを加えて乳化する。このエマルジョンを背中の種々の位置に 10 箇所
に分けて皮下注射する。
完全フロインド・アジュバンドを不完全フロインド・アジュバンドに置き換え
る以外は同様の方法でブースティングを2-4 週間後に行う。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ａ６１Ｋ 39/00 ＡＢＤ Ａ６１Ｋ 37/24
(72)発明者 メゲルライン マルクス
ドイツ オベルンブルグ Ｄ−63785、ブ
ルメンストラッセ ５
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．α−ヘリックス形アミノ酸配列領域及び／又は不定構造のアミノ酸配列領域 を含むhPTH(1-37)の配列由来のペプチドであって、動物に注射した際に抗体を誘 導することができるペプチド。 ２．請求項１に記載の hPTH(1-37)由来のペプチドであって、以下の配列を有す るペプチド。 ３．請求項１及び／又は２に記載のペプチドであって、N- 末端、側鎖、及び／ 若しくは C- 末端が修飾されており、アシル化、アミド化、リン酸化、及び／若 しくはグリコシル化生成物の形態を取り、かつ／又はヘモシアニン、チログロブ リン、ウシ血清アルブミン、オバルブミン、若しくはマウス血清アルブミンのよ うなキャリアー蛋白に結合しているペプチド。 ４．それ自体公知の免疫法を用いて請求項１ないし３の少なくとも１つに記載の 少なくとも１個のペプチドにより免疫した動物から免疫グロブリンを含む分画を 回収し、請求項１ないし３の少なくとも１項に記載の少なくと１個のペプチドに 対する抗体力価を有する分画を単離することにより得ることができる診断薬であ って、さらに別のアジュバント及び／又は賦形剤を含むこともある診断薬。 ５．請求項１ないし３の少なくとも１項に記載の少なくとも１個のペプチドによ る動物の免疫によって得ることができる抗体又は抗体フラグメント。 ６．生物活性を有する hPTH(1-37)を診断するための薬剤を製造するための請求 項１ないし３の少なくとも１項に記載のペプチドの使用。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4434551.8 | 1994-09-28 | ||
| DE4434551A DE4434551A1 (de) | 1994-09-28 | 1994-09-28 | Peptide aus der Sequenz des hPTH (1-37) |
| DEP4434551.8 | 1994-09-28 | ||
| PCT/EP1995/003757 WO1996010041A1 (de) | 1994-09-28 | 1995-09-22 | PEPTIDE AUS DER SEQUENZ DES hPTH (1-37) |
Publications (3)
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|---|---|
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| JP3457004B6 JP3457004B6 (ja) | 2004-08-18 |
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ID=
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| EP0783522A1 (de) | 1997-07-16 |
| JP3457004B2 (ja) | 2003-10-14 |
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| DE59509914D1 (de) | 2002-01-17 |
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