JP3457004B6

JP3457004B6 - ｈＰＴＨ（１−３７）配列由来のペプチド

Info

Publication number: JP3457004B6
Application number: JP1996511352A
Authority: JP
Inventors: ウォルフ−ゲオルグフォルスマン; クヌットアデールマン; ディエターホック; マルクスメゲルライン
Original assignee: ファリスバイオテックゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1994-09-28
Filing date: 1995-09-22
Publication date: 2004-08-18

Description

本発明はhPTH（１−37）配列からのペプチド、該ペプチドを使用して動物を免疫することによって得ることのできる診断薬、該ペプチドを使用して動物を免疫することによって得ることのできる抗体又はそのフラグメント、及び生物活性を持つhPTHを診断するための薬剤の製造における該ペプチドの使用に関する。
84アミノ酸を有する直鎖状ポリペプチドであるヒト上皮小体ホルモン（hPTH）はカルシウム代謝の調節において重要な役割を演じている。このホルモンの代謝によって多数のＣ−末端フラグメントが生じるが、その生物学的作用はまだ解明されていない。hPTH（１−37）が体循環型のＮ−末端フラグメントであることが立証されている（EP−A 0 349 545）。このフラグメントは上記ホルモン全体の生物活性を完全に有している。しかしながら、最初のアミノ酸であるセリンを失うと活性は著しく低下し、最初の２アミノ酸、すなわちセリン及びバリンが無いと活性が完全に失われる。
完全なホルモンhPTH（１−84）及びＮ−末端フラグメントについては血清中レベルが10^-12mol/lの範囲にあることが測定されている。このような低濃度の測定には免疫学的測定法が使用される。この場合、最も確実な結果は、二重抗体又はサンドイッチ原理（例えば、二部位ラジオイムノメトリックアッセイ、IRMA、又はサンドイッチ酵素結合免疫吸着剤アッセイ、サンドイッチELISA）による測定法によって得られる。hPTH（１−84）については、そのようなアッセイ系が市販されている。hPTH（１−34）を測定するための二重抗体原理によるアッセイ系は知られていない。
この場合、２個の抗体が必要である。相互立体障害を避けるために、それらは互いに十分離れた位置にある抗原エピトープを認識できる必要がある。抗原全体を用いた免疫では、種々の抗体の不均質な混合物が得られ、サンドイッチアッセイを行うにはまず最初に費用のかかる精製にかけなければならない。ジェームソン及びウォルフ（B.A.Jameson and H.Wolf）、「抗原指数：抗原決定因子を予測するための新規計算法」、CABIOS 4,p.181−186,1988による理論的計算から、Ｎ−末端のアミノ酸７−14領域中に免疫原活性を持つ好ましい配列を検出することは従来でも可能であった。確立されている方法を用いたＮ−末端フラグメントによる免疫化からは、hPTH（１−34）について記載されているような（タンペ、ブロジオ、マネック、ミシュビヒラー、ブリング、ミラーズ、シュミッツガイク、及びアルムブルスター（J.Tampe,P.Brozio,H.E.Manneck,A.Missbichler,E.Blind,K.B.MIllers,H.Schmidt−Gayk,and F.P.Armbruster），「エピトープマッピングによるヒトＮ−末端上皮小体ホルモンに対する抗体の特性決定」;J.Immunoassay 13,p.1−13,1992）これらのアミノ酸の領域に結合する抗体が主に得られる。しかしながら、これらの抗体は生物活性を持つPTH（１−84）と生物活性を持たないPTH（１−84）又はその最初の２アミノ酸、セリン及びバリンを欠くフラグメントとを識別することができない。
本発明の基礎となる技術的課題は、生物活性を有するhPTHの診断における上記のような欠点を無くすことができるペプチドを提供することである。
驚くべきことに、上記の技術的課題はα−ヘリックス形アミノ酸配列領域及び／又は不定構造のアミノ酸配列領域を含むhPTH（１−37）の配列由来のペプチドによって解決され、当該ペプチドは動物に注射した際に抗体を誘導することができる。上記ペプチドは好ましくはhPTH（１−37）のアミノ酸５−９領域のＮ−末端α−ヘリックス、アミノ酸10−16の不定構造（non−structured）部分、及び／又はアミノ酸配列17−34領域のＣ−末端α−ヘリックスを含む。本発明の以下のペプチドが免疫化に使用されることが好ましい：

これらのNMRデータから具体的に示されるように、提示した配列はその一次構造中に二次構造の必須の特徴を表している。このための前提条件の一つは生理的溶液中におけるPTH（１−37）二次構造の決定である。
上記の特徴的な構造の領域は良好な免疫原性を持つ。抗体はＮ−末端の最初のアミノ酸に結合して形成される。わずか２個のアミノ酸が欠失すると親和性の実質的な消失が生じる。これらのアミノ酸は生物活性の発現に不可欠であるために、本発明のペプチドを使用することによって生物活性を有するhPTH及びそのフラグメントだけを認識する抗体を得ることが可能である。
さらに、アミノ酸30−37の領域にＣ−末端で結合する抗体と共に、中間領域９−15を検出する抗体を製造することができる。従って、理論的計算では分子全体中の免疫原活性を示さないhPTH（１−37）領域に対する抗体を本発明によって製造することが可能である。さらに、これらの領域は２個の抗体が同時に結合するのを妨げる立体障壁が存在しないように互いに離れた距離に分離されている。
好ましい態様においては、上記ペプチドはＮ−末端、側鎖及び／又はＣ−末端が修飾されていてもよく、すなわちアシル化、アミド化、リン酸化及び／又はグリコシル化生成物の形態を取ってもよい。
その結果、本発明のペプチドはヘモシアニン、チログロブリン、ウシ血清アルブミン、オバルブミン、又はマウス血清アルブミン等のようなキャリアー蛋白に結合していてもよい。キャリアー蛋白への結合は好ましくはカルボジイミド又はホルムアルデヒドを用いて行われる。
本発明のペプチドは診断薬の製造に使用することもできる。本発明の診断薬は動物に少なくとも１個の本発明のペプチドによりそれ自体は公知の免疫法を用いて得ることができる。免疫の後、免疫グロブリン分画を免疫した動物から単離することができ、この免疫グロブリン分画は少なくとも１個の本発明のペプチドに対する抗体力価を有する抗体分画を含んでいる。本発明は、このようにして得られた抗体にも関する。F_ab及びF_cからなる完全な抗体の他に、F_abのようなそれのフラグメント又はペプチド・エピトープのイディオタイプである抗体フラグメントも他の態様として使用することができる。
本発明のペプチドは生物活性を有するhPTH（１−37）の診断に用いる薬剤の製造に適している。
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１
ペプチドの固相合成
ペプチドを合成するための本発明の方法は固体担体を用いたペプチド合成に基づくものである。Ｃ−末端アミノ酸のそれぞれをジシクロヘキシルカルボジイミド及びジメチルアミノピリジンの存在下で担体部材に結合させる。Wang樹脂又は同様の樹脂を合成用の担体部材として用いる。
以下のＬ−アミノ酸誘導体を、特定されているペプチド樹脂から開始する上記配列合成に使用した:a）hPTH（１−10）:Fmoc−Asn（Trt）−Wang樹脂、Fmoc−His（Trt）−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Gln（Trt）−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Glu（OtBu）−OH、Fmoc−Ser（tBu）−OH、Fmoc−Val−OH、Boc−Ser（tBu）−OH;b）hPTH（９−18）:Fmoc−Met−Wang樹脂、Fmoc−Ser（tBu）−OH、Fmoc−Asn（Trt）−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−His（Trt）−OH、Fmoc−Lys（Boc）−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Asn（Trt）−OH、Boc−His（Trt）−OH;c）hPTH（24−37）:Fmoc−Leu−Wang樹脂、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Asn（Trt）−OH、Fmoc−His（Trt）−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Asp（OtBu）−OH、Fmoc−Gln（Trt）−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Lys（Boc）−OH、Fmoc−Lys（Boc）−OH、Fmoc−Arg（Pmc）−OH、Fmoc−Leu−OH。
合成は、ジイソプロピルエチルアミン又はＮ−メチルモルホリン及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下で２−（1H−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム・テトラフルオロボレート（TBTU）若しくはその誘導体、又はベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート（BOP）若しくはその誘導体を用いるin situ活性化により、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド又はＮ−メチルピロリドン中におけるカップリング反応中に４ないし10倍過剰量のFmoc−Ｌ−アミノ酸を用いて行うことができる。Fmoc基の除去はN,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド又はＮ−メチルピロリドン中で20％ピペリジン又は２％ピペリジン及び２％1,8−ジアザシクロ［5.4.0］ウンデク−７−エン（DBU）を用いて行う。合成後、樹脂を２−プロパノール及びジクロロメタンで洗浄し、定常重量まで高減圧下で乾燥させる。
担体からの除去及び脱保護は上記ペプチド樹脂を室温で30−90分間、５％殺菌剤、水、エタンジオール、フェノール又はチオアニソールを含むトリフルオロ酢酸と反応させ、濾過してトリフルオロ酢酸で洗浄し、その後、tert−ブチルメチルエーテルで沈殿させることにより行われる。この沈殿を水溶液から凍結乾燥させる。
実施例２
精製及び分析
未処理の生成物をC18逆相カラムのクロマトグラフィーにより精製する（10μｍ、バッファーA:0.01 N HCl水；バッファーB:20％イソプロパノール、30％メタノール、50％水、0.01 N HCl;勾配:60分間で10−80％;230nmで検出）。
生成物の純度はマススペクトル及びC18逆相クロマトグラフィーを用いて測定する。
実施例３
キャリアー蛋白へのカップリング
ヘモシアニン、チログロブリン、ウシ血清アルブミン、オバルブミン、又はマウス血清アルブミンをキャリアー蛋白として使用する。カップリングはカルボジイミド法によりペプチドのカルボキシル基を用いて行う。ペプチドを水溶液中で塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドと５分間反応させることにより活性化する。カップリングは活性ペプチドをキャリアーの水溶液に加えることによって行う。モル比はキャリアー蛋白の50アミノ酸に対して１ペプチドである。反応には４時間を要する。
反応は酢酸ナトリウムを100mMの最終濃度になるように加えて停止する。インキュベーションは１時間継続する。
上記蛋白−ペプチド共役体を100mMリン酸バッファー、pH7.2に対して透析を繰り返すことによってペプチドから分離する。
実施例４
多重抗原性ペプチド（MAP）の合成
三重リジン分枝化（triple lysine branching）をWang樹脂に結合したＣ−末端アラニンにFmoc−Ｌ−lysine（Fmoc）−OHを３回のカップリングサイクルを用いて結合させることによって行う。ピペリジンを用いて開裂すると８個の遊離のアミノ基が得られ、ヒト上皮小体ホルモン配列が上記の記載に従って合成される。
実施例５
免疫
最初の免疫用に、免疫すべき動物の体重1kg当たり125μｇのキャリアー−ペプチド共役体又はMAPを水250mlに溶解して250μｌの完全フロインド・アジュバンドを加えて乳化する。このエマルジョンを背中の種々の位置に10箇所に分けて皮下注射する。
完全フロインド・アジュバンドを不完全フロインド・アジュバンドに置き換える以外は同様の方法でブースティングを２−４週間後に行う。

Claims

生物活性を有するhPTH（１−37）を診断するための抗体又は抗体フラグメントを製造するための、以下の配列からなるペプチドの使用。
ペプチドのＮ末端、側鎖、及び／若しくはＣ末端が修飾されて、ヘモシアニンに結合している、請求項１に記載の使用。
請求項１又は２に記載の少なくとも１個のペプチドによる動物の免疫によって得ることができる、抗体又は抗体フラグメント。
以下の配列から選ばれるペプチドを認識してそれに結合する、請求項３に記載の抗体又は抗体フラグメント。
以下の配列から選ばれるペプチドを特異的に認識してそれに結合する抗体又は抗体フラグメント。
それ自体公知の免疫法を用いて請求項１又は２の少なくとも１つに記載の少なくとも１個のペプチドにより免疫した動物から免疫グロブリンを含む分画を回収し、請求項１又は２の少なくとも１つに記載の少なくとも１個のペプチドに対する抗体力価を有する分画を単離することにより得ることができ、さらに別のアジュバンド及び／又は賦形剤を含むこともある、診断薬。
以下の配列から選ばれるペプチドを特異的に認識してそれに結合する抗体又は抗体フラグメントを含む、生物活性を有するヒト上皮小体ホルモン（hPTH（１−37））を検出するための診断薬。
ヒト上皮小体ホルモンのアミノ酸領域９−15又は30−37に結合する第２の抗体又は抗体フラグメントをさらに含み、両抗体が、相互立体障害を避けるために互いに十分離れた位置にある抗原エピトープを認識できる、請求項７に記載の診断薬。
請求項３から５の何れかに記載の抗体を用いて、インビトロで生物活性を有するヒト上皮小体ホルモン（hPTH（１−37））を検出する方法。
ヒト上皮小体ホルモンのアミノ酸領域９−15又は30−37に結合する第２の抗体又は抗体フラグメントをさらに使用し、両抗体が、相互立体障害を避けるために互いに十分離れた位置にある抗原エピトープを認識できる、請求項９に記載の方法。