JPS6399018A - 複合免疫原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一以上の明確な合成ペプチドを有する複合免疫
原に関し、さらに詳しくは、Ｂ型肝炎ウィルス膜蛋白質
の複数の合成ペプチド類縁体を有するサポニン誘導体含
育核構造に関する。

ワクチンとして威力を発揮するためには、保護抗体を惹
起することの知られたウィルス蛋白質の合成ペプチド類
縁体は、かかる抗体に対する結合部（ゲを有するばかり
でなく、Ｔ細胞レセプタおよびＩａ抗原との反応を掌る
必要がある（　Ｊ、Ｂｅｒｚｏｒｓｋｙ、”Ａｎｔｉｇ
ｅｎｉｃ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅ
ｎｔｓ　ｆｏｒ　ＭｌｌｃｍＲｅｓｔｒｉｃｔｅｄ　ｔ
ｌｅｌｐｅｒ　Ｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ
’、　Ｍ。

ｄｅｒｎ　Ａｐｐｒｏａｈｅｓ　ｔｏ　Ｖａｃｃｉｎｅ
ｓ、　２１−２３．　Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙＲ，Ｃｈａｎ
ｏｃｋ、　Ｒ，Ｌｅｒｒｎｅｒ　＆　Ｆ、　Ｂｒｏｗｎ
、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｅｒ、　ＮＹ
：　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ。

（１９８５）；　Ｊ、Ｂｅｒｚｏｒｓｋｙ、　”Ｉｎｔ
ｒｉｎｓｉｃ　ａｎｄ　Ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ　Ｆａｃｔ
ｏｒｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　
５ｔｒｕｃｔｕｒｅ”。

５ｃｉｅｎｃｅ、　２２９．９３２−９４０．（１９８
５）；　Ｔ　、Ｗａｔｔｓ、　Ｊ、Ｇａｒｉｅｐｙ、　
Ｇ、５ｃｈｏｏｌｎｉｋ、　Ｈ，ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ、
　’Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ：　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　
Ｐｅｐｔｉｄｅ　　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｍｅｔ
ｈｏｄ　ｏｒ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉ
ｏｎ”、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｒ　ｔｈｅ　Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅ
、　　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　　８２．　５４８０−５４８４
．（１９８５））。

積極的な予防のための免疫原としての合成ペプチドの有
用性は、ペプチドに対する免疫応答性が蛋白質に対する
応答に比べて遺伝学的に狭く制約を受けているために非
常に限られている（Ａ、Ｒ，Ｎｅｕｒａｔｈ、　Ｓ、Ｂ
、Ｉｌ、Ｋｅｎｔ、　Ｎ、５ｔｒｉｃｋ、　Ｄ、５ｔａ
ｒｋ　ａｎｄ　Ｐ、５ｐｒｏｕｌ、　’Ｇｅｎｅｔｉｃ
　Ｒｅ５ｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｏｆＩｍｍｕｎｅ　Ｒｅ５
ｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ　ｔｏ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｔｏ　
５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｌｈｅ　Ｐｒｅ−３Ｒｅ５
ｉｏｎ　ｏｒ　ｔｈｅ　１ｔｅｐａｔｉＬｉｓ　Ｂ　Ｖ
ｉｒｕｓ　（ＩＩＢＶ）　Ｅｎｖｅｌｏｐｅ　Ｇｅｎｅ
　”、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ、　１７．１１９−１２５．　（１９８５
））。

ヒトワクチンとして好適でない蛋白質支持体およびアジ
ュバント（完全および不完全フロインドアジュバント）
ら合成ペプチドの予防学的な有用性を確立するために敢
多くの実験において使用されてきた。

それ故、前述したような問題点を解消することは有用で
あろう。本発明の目的は、複数の明確な合成ペプチドの
多重コピーを有する高分子合成免疫原を調製することに
よりこれら問題点を解消することである。かかる高分子
はＴ細胞レセプタおよびＩａ抗原と反応する部位を保持
しやすい。複数の明確なペプチド類縁体を有する高分子
に対する免疫応答は個々のペプチドに対する応答よりも
遺伝学的に制約を受けにくいことも期待される。

さらに、多重免疫原は抗原補強性アジュバントに組み込
まれ、蛋白質支持体を必要としない（Ａ、Ｉ？。

ＮｅｕｒａＬｈ、　Ｓ、Ｂ、Ｉ！、ＫｅｎＬ　ａｎｄ　
Ｎ、５ｔｒｉｃｋ、　”Ｌｏｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｒａ　Ｐｒｅ
−８Ｇｅｎｅ　ＣｏｄｅｄＩｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｒ
＋ｔ　Ｅｐｉｔｏｐｅ　ｏｒ　ｌ１ｅｐａｔｉｔｉｓ　
Ｂ　Ｖｉｒｕｓ。

５ｃｉｅｎｃｅ、　２２４．３９２−３９５．　（１９
８４）；　Ａ、Ｒ，Ｎｅｕｒａｔｈ。

Ｓ、Ｂ、Ｉｌ、Ｋｅｎｔ　ａｎｄ　Ｎ、５ｔｒｉｃｋ、
　”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　１ｌｃｐａｔｉｔｉ
ｓ　Ｂ　５ｕｒｒａｃｅ　ＡｎＬｉｇｅｎ　（ＩＩＢｓ
Ａｇ）　Ｅｌｉｃｉｔｅｄ　ｂｙＩｍｍｕｎｉｚａＬｉ
ｏｎ　　ｗｉｔｈ　　ａ　　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　　Ｉ
’ｅｐｔｉｄｅ　　Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ　Ｌｉｎｋｅ
ｄ　Ｌｏ　Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ”、　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｒＧｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　６
５．１００９−１０１４．（１９８４）：　Ａ、Ｒ，Ｎ
ｃｕｒａｔｈ、　Ｓ、Ｂ、Ｉｌ、Ｋｅｎｔ　ａｎｄ　Ｎ
、５ｔｒｉｃｋ、　”Ｉｍｍｕｎｅ　Ｒａ５ｐｏｎｓａ
　　Ｌｏ　　１ｌｅｐａｔｉＬｉｓ−Ｂ　　Ｖｉｒｕｓ
　　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　　Ｃｏｄｅｄ　ｂｙ　
ｔｈｅ　Ｐｒｅ−Ｓ　Ｇｅｎｅ”、　Ｖａｃｃｉｎｅｓ
　’８５．１８５−１８９゜Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｒ，
Ａ、ｌ、ｅｒｎｃｒ、　Ｒ，Ｍ、Ｃｈａｎｏｃｋ　＆　
Ｆ、Ｂｒｏｗｎ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ、　　ＮＹ　
　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａＬｏｒｙ、　　（１９８５））。

従来の研究により、リボゾームに合成ペプチドを組み込
むと、合成ペプチドに対する免疫応答が増大することが
知られている（　Ａ、Ｒ，ＮｅｕｒａＬｈ、　Ｓ、Ｂ。

１１、ＫｅｎＬ　ａｎｄ　Ｎ、５Ｌｒｉｃｋ、　”Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　ｌ１ｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　
５ｕｒｒａｃｃ　　Ａｎｔｉｇｅｎ　（ＩＩＢｓＡｇ）
　Ｅｌｉｃｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｉ＋ｎｍｕｎｉｚａＬｉｏ
ｎ　ｗｉｔｈ　ａ　５ｙｎＬｈｃｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄ
ｅ　Ｃｏｖａｌｅｎ口ｙ　Ｌｉｎｋｅｄ　ｔｏ　Ｌｉｐ
ｏｓｏｍｅｓ”。Ｔｈ、ｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｇ
ｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　６５．１００９−
１０１４；　Ａ、Ｒ，ＮｃｕｒａＬｈ、　Ｓ、Ｂ。

１１、Ｋｅｎｔ　ａｎｄ　Ｎ、５Ｌｒｉｃｋ、１ｍｍｕ
ｎｃ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　ｔｏ　１ｌｅｐａｔｉＬｉｓ
−ＢＶｉｒｕｓ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　Ｃｏｄｅ
ｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｐｒｅ−３Ｇｅｎｃ”、　Ｖａｃｃ
ｉｎｅｓ　’８５．１８５−１８９．　ｅｄｉｔｅｄ　
ｂｙ　Ｒ。

Ａ、Ｌｅｒｎｅｒ、　Ｉ？、Ｍ、Ｃｈａｎｏｃｋ　ａｎ
ｄ　Ｆ、Ｂｒｏｗｎ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｉ！
ａｒｂｏｒ、　ＮＹ：　Ｃ０Ｉ（ｌ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ
１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。またミセルに
合成ペプチドを組み込んでら合成ペプチドに対ずろ応答
が増大することら知られている（コ゛、Ｐ、１ｌｏｐｐ
、　”ｌｒｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｒａ　５ｙｎ
ｔｈｃＬｉｃ　ｌｌＢｓＡｇ　Ｉ’ｃｐＬｉｄｃ：　Ｅ
ｎｂａｎｃｃｍｃｎｔ　ｂｙ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ
ｔｏ　　ａ　　ＦａＬｔｙ　　Ａｃ１ｄ　　Ｃａｒｒｉ
ｅｒ”、　　＼ｔｏｌｃｃｕｌａｒ　　Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ、　２１．１３−１６．　（１９８４））。そし
て、これらいずれにおいても蛋白質支持体の必要性がな
い。しかしながら、いずれの場合においても、良好な抗
体応答を得るために、フロイントのアジュバントが使用
されてきた。

サポニン誘導体キルＡ（スピコサイド）のマトリックス
上に多重形でウィルス膜蛋白質が存在する免疫刺激性複
合体（ｉｓｃｏｍ）が最近報告されている（　Ｒ，Ｍｏ
ｒｅｉｎ、　Ｂ、５ｕｎｄｑｕｉｓｔ、　Ｓ、ｌＩｏｇ
ｌｕｎｄ。

Ｋ、　Ｄａｌｓｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ａ、０ｓｔｅｒｈ
ａｕｓ、“Ｉｓｃｏｍ、　Ａ　Ｎｏｖｅｌ　５Ｌｒｕｔ
ｕｒｅ　ｆ’ｏｒ　Ａｉｔｉｇｅｎｉｃ　Ｐｒｅｓｅｎ
ｔａｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｍｅｎｂｒａｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ　Ｆｒｏｍ　Ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ　Ｖｉｒｕｓ”、
　Ｎａｔｕｒｅ。

３０８、　４５７−４６０．　　（１９８４）；　　Ａ
、０ｓｔｅｒｈａｕｓ、　　、冒ｅｉｊｅｒ。

Ｆ、Ｕｙｔｄｅｈａａｇ、　０ｊａｒｒｅｔｔ、　Ｂ、
　５ｕｎｄｑｕｉｓＬ　ａｎｄ　Ｂ。

Ｍｏｒｅｉｎ、　　”Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　　Ｉｍｍｕｎｅ　　Ｒｅ５ｐｏ
ｎｓｅ　ｉｎ　Ｃａｔｓ　ｂｙ　Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏ
ｎ　ｗｉｔｈ　Ｐｅ１ｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉ
ｒｕｓ　Ｉｓｃｏｍ＠、　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ。

１３５、５９１−５９６（１９８５））。ｉｓｃｏｍ中
に組み込まれたウィルス蛋白質はアジュバントが存在し
なくとも極めて免疫抗原性となった。これら２つの文献
は、洗剤により破壊されたウィルスに関するもので、合
成ペプチドに関するものではない。破壊されたウィルス
は、次いで、サポニン誘導体キルＡを含有する容器に入
れられ、この容器は遠心分離に付される。しかる後、透
析を行う。

本発明は、サポニン誘導体と、有機化合物また、は炭素
原子数１２〜２４を有しかつ−ＣＯＯＨｌ−ＣＨ０１−
Ｎ　Ｈｔまたは−ＳＨのいずれかの活性部位を有する疎
水性ペプチドからなる積構造に共有結合した一以上の明
確な合成ペプチドの多重コピーからなる複合免疫原に係
る。

合成ペプチドはＢ型肝炎ウィルス膜蛋白質の合成ペプチ
ド類縁体であってもよい。Ｂ型肝炎ウィルス膜蛋白質の
合成ペプチド類縁体は以下のＢ型肝炎ウィルス（１−Ｉ
　Ｂ　Ｖ　”）膜蛋白質の明確な領域、すなわち、 （ａ）　　プリーＳｌ領域、 （ｂ）　　プリー８２領域、および （ｃ）　　Ｓ領域 から誘導することができる。

寅ｊ１ アミノ酸コード記号（第４図に示す） Ｄ　　Ａｓｐ　　アスパラギン酸 Ｎ　　Ａｓｎ　　アスパラギン Ｔ’ｌ’ｈｒ　　スレオニン Ｓ　　Ｓｅｒ　　セリン Ｅ　　Ｇｌｕ　　グルタミン酸 Ｑ　　Ｇｉｎ　　グルタミン Ｐ　　Ｐｒｏ　　プロリン Ｇ　　Ｇｌｙ　　グリシン Ａ　　Ａｌａ　　アラニン ＣＣｙｓ　　システィン Ｖ　　Ｖａｌ　　バリン ＭＭｅｔ　　メチオニン Ｉ　Ｎｅ　イソロイシン Ｌ　　Ｌｅｕ　　ロイシン Ｙ　　Ｔｙｒ　　チロシン Ｆ’Ｐ・ｈｅ　　フェニルアラニン ＷＴｒｐ）リプトファン ＫＬｙｓ　　リジン ＨＨｉｓ　　ヒスチジン ＲＡｒｇ　　アルギニン 合成ペプチド：　天然産でないペプチド本発明は、サポ
ニン誘導体と、有機化合物例えば脂肪族化合物または有
機化合物らしくはカルボキシル基、アルデヒド基、アル
キルアミン基および／またはチオール基の少なくとも一
以上の活性基を有する疎水性ペプチドとの複合体（積構
造）に係る。上記活性基を有しかつ水混和性有機溶媒例
えばジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、エ
タノール等に可溶性であれば、いかなる脂肪族化合物、
芳香族化合物または疎水性ペプチドも使用することがで
きる。この複合体は、次いで、ゲル濾過に付され、有機
溶媒および過剰のサポニン誘導体が除去される。その後
、−以上の明確な合成ペプチドがかかる複合体に共有結
合される。ペプチドは特に脂肪族化合物の活性基に共有
結合される。本発明において使用される好ましいサポニ
ン誘導体はキルＡである。

サボ−１−７（Ｃ３ｄ（５４０＋ｅ　：　　分子ｆＲ７
２６，５）９は１− は、ンヤボン位、キラヤおよび特にモラエクセル′す（
プリヂッシュギアナ）の心材から誘導される植物性グル
コシドである。谷サポニンは、分子のアルグコン部位を
構成するサボゲニンと糖とからなる。サボゲニンはステ
ロイドであってもよく、またはトリテルペンであっても
よい。糖部分はグルコース、ガラクトース、ペントース
またはメチルペントースであってもよい。

脂肪族化合物は７〜２４の炭素原子を有し、好ましくは
、１２〜１８の炭素原子を宵し、最も好ましくは、１４
〜！８の炭素原子を有し、しかも、−ＣＯＯＩ−Ｉ基、
−Ｃ１１０基、−Ｎ　Ｈ、基および−Ｓ　Ｈ基から選択
される活性部位の一以上を有する。

本発明において使用されろ脂肪酸（飽和および不飽和）
は特に限定されるものではなく、ステアリン酸、オレイ
ン酸、パルミチン酸およびミリスチン酸があり、これら
はカルボジイミド例えばＮ−エチル−Ｎ−（ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミドにより活性化することが
できる。好ましくは、脂肪族化合物はオクタデカンチオ
ールである。

ペプチドは脂肪族化合物の活性部位に結合する。

例えば、ペプチドの一端のＮＨ，基（Ｎ末端）は複合体
の一〇　〇　〇　〇または一〇　〇　〇活性部位と結合
することができる。また、ペプチドの−ＣＯＯ１（端は
複合体の−Ｎ　Ｈ１活性部位と結合することができる。

さらに、ペプチドのＣ−末端ホモセリンラクトン端は複
合体のアミン部位と結合することができる（Ｔ、Ｋｅｍ
ｐｅ、　Ｓ、Ｂ、Ｈ，Ｋｅｎｔ、　Ｆ、Ｃｈｏｗ、　Ｓ
、Ｍ。

Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、　Ｗ、１．５ｕｎｄｑｕｉｓｔ　ａ
ｎｄ　Ｊ、Ｊ、Ｌ’１ｔａｌｉｅｎ、　Ｇｅｎｅ、　３
９．２３９．　（１９８５））　、ペプチド中のスルフ
ヒドリル基（システィン）は複合体（例えばオクタデカ
ンチオールを含む）中のスルフヒドリル基と結合するこ
とができる。

本発明は、特に、それぞれＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）
膜（ｅｎｖ）蛋白質のブリーＳｌ、プリーＳ２およびＳ
領域から誘導される３つの明確な合成ペプチドの多重コ
ピーを有する複合免疫原を意図するものである。本発明
者らは、本発明に従う刺激性複合体が、さらなるアジュ
バントを要することなく、固有のＨＢＶ　ｅ　ｎ　ｖ蛋
白質を認識する・抗体を兎中に惹起することを見いだし
た。

複数の明確なペプチド類縁体を有する本発明に従うン夏
合体は、 （１）　単一ペプチド免疫原に固有の重大な問題、すな
わち、免疫応答中の不十分なＴ−Ｉ３細胞協働および遺
伝的に狭く制約された免疫応答の解消、 （２）　ウィルス中和および感染に対する保護における
鍵となるエピトープを含むワクチンの云ザイン、および （３）　遺伝学的に定められた動物中の明確なエピトー
プに対する免疫応答を制御し位置特異的な抗体応答に対
する個々のエピトープの相関を評価する研究、 を行う機会を与える。

本発明において使用される特に好ましいペプチドはブリ
ーＳ（＋２Ｏ−１４５）である（Ａ、Ｒ，Ｎｅｕｒａｔ
ｈ、　Ｓ、Ｂ、Ｉｌ、ＫｅｎＬ、　Ｋ、Ｐａｒｋｅｒ、
　Ａ、Ｍ、Ｐｒ１ｎｃｅ、　Ｎ、５ｔｒｉｃｋ、　　Ｂ
、ＢｒｏＬｍａｎ　　ａｎｄ　　Ｐ、５ｐｒｏｕ！、　
　“八ｎＬｉｂｏｄｉｅｓ　　ｔｏ　ａ　　５ｙｎｔｈ
ｅｔｉｃ　　Ｐｅｐｔｉｄｅ　　ｆｒｏｍ　　ｔｈｅ　
　Ｐｒｅ−８（１２０−１４５）Ｒｅｇｉｏｎ　　ｏｆ
　　ｔｈｅ　　ｌ１ｅｐａｔｉＬｉｓ　　Ｂ　　Ｖｉｒ
ｕｓ　　Ｅｎｖｅｌｏｐｅ　　ａｒｅ　　Ｖｉｒｕｓ−
Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ″、Ｖａｃｃｉｎｅ、４．３
５−３７．（１９８６）　）。また好ましくは、ペプチ
ドはそれぞれＩ−ＩＢＶｅｎｖ蛋白質のブリーＳおよび
Ｓ連鎖から誘導されるプリーＳ（２１−４７）および５
（１３５−１５５）である。

複数のＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のゲノムのクローン
化および一連の単離により、ウィルスＤＮＡの遺伝学的
な構造が解明された（Ｐ、Ｔｉｏｌｌａｉｓ。

Ｐ、Ｃｈａｒｎａｙ、　Ｇ、Ｎ、Ｖｙａｓ、　５ｃｉｅ
ｎｃｅ、　２１３．４０６．　（１９８１））。

Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢ　Ｖ　）感・染の免疫学的標識
には、Ｓ蛋白質およびブリーＳ蛋白質を含む表面抗原、
核抗原（ＨＢ　ｃ　Ａ　ｇ　）、“ｅ゛抗原１−ＩＢｅ
Ａｇ）およびそれらの抗体が含まれる。Ｉ−Ｉ　ＢｓＡ
ｇのＳ蛋白質およびブリーＳ蛋白質に対する抗体はＨＢ
　Ｖ感染に対して保護的である。

ＨＢ　Ｖおよびそのサブウィルス（Ｂ型肝炎表面抗原；
ＨＢｓＡｇ）のいくつかの抗原のサブ夕、ｒブは約２２
ｎｍの径の粒子であることが認められて゛いろ（Ｇ、Ｌ
ｅ　Ｂｏｕｖｉｅｒ、　Ａ、Ｗｉｌｔｉａｍｓ、　Ａｍ
、Ｊ、　　Ｍｅｄ。

Ｓｃｉ、、　２７０．１６５．　（１９７５））。これ
らのサブタイプ（例えばａｙｗ、ａｄｗ、ａｄｗ２．ａ
ｄｗおよびａｄｒ）は総て共通の膜エピトープを共有し
ており（グループ特異的）、それに対する免疫応答は他
のなんらかのウイルスサ・ブタイブによる感染に対する
保護として十分であるようである（　Ｗ、Ｓｚａ＋ｕｎ
ｅｓｓ、　Ｃ，Ｅ、５ｔｅｖｅｎｓ、　Ｅ、Ｊ、１Ｉａ
ｒｌｅｙ、　Ｅ、Ａ、Ｚａｎｇ、　１１．Ｊ、Ａｌｔｅ
ｒ、　Ｐ、Ｅ、Ｔａｙｌｏｒ、　Ａ、ＤｅＶｅｒａ、　
Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｃｈｅｎ、＾、Ｋｅｌｉｎｅｒ、　ｅＬ　
ａｌ、、　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、、　３０
７．１４８１゜（１９８２））。

ＨＢ　Ｖゲノムは、２つのＤＮＡ鎖、すなわち、長鎖（
Ｌ）および短鎖（Ｓ）か・らなる。Ｌ鎖転写体は４つの
オーブン′リーヂングフレーム領域を有する。これらは
（Ｓ＋プリーＳ）、Ｃ，ＰおよびＸ領域と称される。

オープンリーヂングフレーム領域（Ｓ＋プリーＳ）はｔ
ｔ、　Ｂ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　Ａの膜遺伝子（ｅｎｖ）に相
当し、ＨＢＶ膜にみられる蛋白質の科に対するコードと
なる。ＨＢＶ　　ＤＮＡの膜遺伝子の重要な翻訳生成物
の概略的表現を下記に示す。

プリＳ領域　　　　　　Ｓ領域　　　４００）−−一−
−−−−−−−−１）−−一−−−−１１−−一−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−１プリ５（１）プリ
Ｓ　（１２）　　プリＳ　（１２０）　　プリＳ　（１
７４）トーーーーーーーーーーー−−−−−−ｑＳ　　
（１）　　　　　　　　　　　　　　５（２２６）１７
５　　　　　　　　　　　　　　　　４ＧＯ８領域のみ
：　　　　　　　）−−一−−−（Ｓ　（２２６） トーーーーーーー＠ プリＳ　（１２０）　　Ｓ　（２２６）ト−−−−−−
−−−−＋ プリＳ　（１２）　　　　　Ｓ　（２２６）トーーーー
ーーーーーーーーーー＋ ブリＳ　（１）　　　　　　　　　　Ｓ　（２２６）°
上記概略図における数字はアミノ酸（ＡＡ）を表す。Ｍ
ａｔｌにおける翻訳開始部位はａ　ｄ　ｗ　ｔとａｄｒ
サブタイプに対してのみ存在する。その他のサブタイプ
に対する第１のアミノ酸は位置プリＳ１２に相当する。

以後、プリＳ領域（ｅ　ｎ　ｖ　ｌ　＝　１７５　）に
相当するアミノ酸鎖は接頭辞“プリＳ”で表し、Ｓ領域
（ｅｎｖ１７５〜４００）に相当するアミノ酸鎖は接頭
辞“Ｓ”で表す。ｅｎｖ遺伝子生成物の表現において、
Ｓ領域はアミノ酸１７５〜４００に及ぶ。一方、“Ｓ領
域のみ“におけろ表現はアミノ酸１〜２２６である。

上記概略図において、プリＳ領域はアミノ酸鎖部位ブリ
８１〜アミノ酸鎖部位ブリＳ＋７４により定義される。

Ｓ領域は鎖部位Ｓｌ（オーブンリーヂングフレームのア
ミノ酸１７５でプリ５１７４に隣・接）〜鎖部位５２６
６　（オーブンリーヂングフレームのアミノ酸４００）
により定義される。

Ｓ遺伝子生成物（Ｓ蛋白質）はかかる２２６アミノ酸鎖
からなる。

プリＳ２領域ＩこはプリＳ！〜プリ５１１９が含まれ、
プリＳ２領域にはプリ８１２０〜プリ５１７４が含まれ
る。

天然産のＢ型肝炎ウィルスには以下のものが含まれる。

（１）ＨＢＶのｅｎｖ遺伝子の全長翻訳生成物、すなわ
ち、ａ　ｄ　ｗ　＊およびａｄｒに対するプリ５（１−
１７４）＋Ｓ　（１７５−４００）＝４００のアミノ酸
、ａｙｗ、ａｄｙｗおよびａｄｗに対するプリＳ　（１
２−１７４）＋Ｓ　（１−２°２６）＝３８９のアミノ
酸（ｅｎｖ１２−４００）；（２）プリ５（１２０−鳳
７４）＋５（１７５−４００）＝２８１アミノ酸（ｅｎ
ｖｌ’２Ｏ−４００）＝プリＳ領域にお＋ｉる末端の５
５アミノ酸十全Ｓ領域の２２６のアミノ酸（相当する蛋
白質は寸法（Ｐ３３およびＰ３６）ｈ（３３および３６
ｋＤであり、グリコジル化の程度が各異なろ；さらには
、 （３）Ｓ　（１−２２６）＝２２６アミノ酸、すなわし
、全Ｓ領域（ｅｎｖ１７５−４００）；非グリコジル化
およびグリコジル化された形７３　（Ｓ蛋白質）におけ
るＩＩ　Ｂ　Ｖ膜（Ｐ２２およびＰ２６）の約２２およ
び２６ｋＤ主要成分を表す。

前述したプリ５（２１−４７）、プリ５（１２０−１４
５）およびＳ　（１３５−１５５）以外に本発明に従う
好ましいペプチドには以下のものが含まれろ。

（１）鎖がサブタイプａ　ｄ　ｗ　ｔに対してＭＧＴＮ
　Ｌ　Ｓ　Ｖ　Ｐ　Ｎ　Ｐ　Ｌ　Ｇ　Ｆ　Ｆ　Ｐ　Ｄ　
Ｉ−Ｉ　Ｑ　Ｌ　Ｄ　ＰであるプリＳ（＋２−３２）（
第４図参照） （２）鎖がサブタイプａｄｗ、に対してＭ　Ｑ　ＷＮ　
Ｓ　Ｔ　Ａ　Ｆ　ＨＱ　Ｔ　Ｌ　Ｑ　Ｄ　Ｐ　ＲＶ　Ｒ
（１；　Ｌ　Ｙ　Ｌ　Ｐ　Ａ　ＧＧであるプリＳ　（１
２０−１４５）（第４図参照）（３）鎖がサブタイプａ
ｄｗｌに対してＰＡＦＧＡＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＶＫ
ＤＤＷＰであるプリＳ　（３２−５３）（第４図参照）
（４）鎖がサブタイプａｄｗｔに対してＰＱＡＭＱＷＮ
、５ＴＡＦＨＱＴＬＱＤＰであるプリＳ　（１１７−１
３４）（第４図参照） （５）鎖がサブタイプａｄｗｔに対してＰＡＳＴＮＲＱ
ＳＧＲＱＰＴＰＩ　５ＰＰＬＲＤＳＨＰであるプリＳ　
（９４−１１７）（第４図参照）（６）！１がサブタイ
プａｄｗ２に対してＰＡＰＮＩＡＳＩ−１［５ｓＩｓＡ
ＲＴＧＤＰであるプリ５（１５３−１７１）（第４図参
照） （７）鎖がサブタイプａｄｗｌに対してＭＧＧＷＳＳＫ
ＰＲＫＧＭＧＴＮＬＳＶＰＮＰであるプリ５（１−２１
）（第４図参照） （８）鎖がサブタイプａ　ｄ　ｗ　ｔに対してＱＶＧＶ
ＧＡＦＧＰＩｔｌ、Ｔ　Ｐ　Ｐ　［−１Ｇ　Ｇ　テある
プ１．Ｉ　Ｓ　Ｃ５７−７３）（第４図参照） （９）ａｄｗｔに対して、鎖がＭＧＧＷＳＳＫＰＲＫＧ
であり（第４図参照）、ａｄｒに対して、鎖がＭＧＧＷ
ＳＳＫＰｒｔＱＧである（第４図参照）プリＳ　（１−
１１） 本発明に従うプリＳおよびＳ遺伝子コードされた鎖の類
縁体は、ＨＢＶまたはＢ型肝炎表面抗原のブリＳ蛋白質
を認識する抗体を惹起するものであれば、いかなるもの
であれ使用することができる。すなわち、アミノ酸欠如
、アミノ酸置換例えば他のアミノ酸による置換、等配電
子体（蛋白質アミノ酸と類似の構造および空間的な類似
性を有する修飾アミノ酸）による置換、アミノ酸付加ま
たは等配電体付加を使用することができる。

天然資源から誘導されるペプチドの形成には、必要なア
ミノ酸鎖を含む蛋白質が選択的な蛋白質加水分解例えば
化学試薬または酵素による蛋白質の壊裂に付される。ペ
プチドの合成には必要とさ　　。

れろアミノ酸鎖を化学的に合成する。

好ましくは、ペプチド残基はＢ型肝炎ウィルスのプリＳ
またはＳ遺伝子コードされた領域内の少なくとし６つの
連続したアミノ酸に相当し、Ｂ型肝炎ウィルスに対する
抗体によって認識されろ立体配置を有するのがよい。こ
のためには、所定のアミノ酸鎖をアミノ酸鎖の一部とし
てこれに結合させ、これらの一方または両方に一以上の
新たなアミノ酸を結合させる。これらの新たなアミノ酸
はアミノ酸鎖の安定性を増大させるための補助アミノ酸
として働き、Ｂ型肝炎ウィルスに対する抗体により容易
に認識される。これらの新たなアミノ酸は天然蛋白質に
おいて生ずるのと同じ連鎖の同じアミノ酸であってもよ
く、またそれ以外のアミノ酸を用いてもよい。

本発明の一態様においては、少なくとも６つのアミノ酸
の鎖長を有するペプチドがその端で新たなアミノ酸例え
ば残基の端の３つのアミノ酸に結合され、さらに長鎖の
アミノ酸が形成されろ。ア、ミノ酸の鎖はＢ型肝炎ウィ
ルスの表面抗原のプリＳ領域内に少なくとも６つの連続
したアミノ酸に相当する一以上のアミノ酸を有してもよ
い。

個々のアミノ酸鎖の長さは連鎖の製造方法に依存する。

連鎖が個々のアミノ酸を化学的手段により構成される場
合には、連鎖の長さは一般にアミノ酸５０以上であるこ
とはなく、好ましくは、アミノ酸４０以上ではない。合
成ペプチドがＤＮＡルートで得られる場合には、鎖の長
さはさらに長くすることができ、例えば１００以上とす
ることができる。しかし、通常はさらに麗く、天然のプ
リＳ蛋白質よりかなり短いのが最適である。それ故、ペ
プチドがＳ領域およびプリＳ領域のユニットを何する実
施態様においては、そのＳ領域に相当するペプチド部分
は天然の本蛋白質より短く、例えばアミノ酸１００以下
、好ましくは、アミノ酸４０以下であり、通常はアミノ
酸３０以下である。このような場合には、プリＳ領域に
相当するペプチド部分は全プリＳ領域に相当する長さで
あって、一般に全プリＳ領域より短い。

しかし、アミノ酸連鎖が長鎖の一部例えば−以上のアミ
ノ酸である場合には、鎖は種々の部位の残基例えばポリ
アミノ酸またはポリサッカライドのセグメントを有する
ことができる。

本発明の免疫原は、Ｂ型肝炎ウィルスのプリＳ領域内の
少なくとも６つの連続したアミノ酸に相当するアミノ酸
の一以上の異なるかまたは同一の連鎖例えばＢ型肝炎ウ
ィルスのプリＳ領域内の種々のエピトープ（抗原決定因
子）に相当する一以上のアミノ酸連鎖を含有するに加え
て、本発明の免疫原は、Ｂ型肝炎ウィルスおよび一以上
のさらなる病気例えばはしか、インフルエンザ、天然痘
、ポリオ、ジフテリア等に対するワクチンに使用するこ
とかできるように、種々の抗原またはアレルゲンのエピ
トープを含有するアミノ酸を含有させることができる。

本発明によれば、Ｂ型肝炎ウィルスの天然産の膜蛋白質
が存在しないことを特徴とする免疫原が得られる。すな
わち、本発明の免疫原はＢ型肝炎ウィルス膜蛋白質の限
られた部分に相当する一以上のペプチド鎖からなる。本
発明の免疫原はピリオンにおいてみられるようなその他
の蛋白質を含まない。

ペプチドの化学合成は下記の刊行物に記載されている。

すなわち、Ｓ、Ｂ、Ｈ，ＫｅｎＬ、　ＢｉｏＩＩｌｅｄ
ｉｃａｌ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、　ｅｄｓ、、　Ｅ、Ｐ、
Ｇｏｌｄｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ａ、Ｎａｋａｊｉｍａ、　
（＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ
）、　２１３−２４２（１９８０）；　Ａ、Ｒ。

ＭｉＬｃｈｅｌｌ、　Ｓ、Ｂ、Ｉｌ、Ｋｅｎｔ、　Ｍ、
Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、　ａｎｄ　Ｒ，Ｂ、Ｍｅｒｒｉｆ
ｉｅｌｄ、　Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｎ＋、、　４３．
２８４５−２８５２．　（１９７ｇ）；　Ｊ、Ｐ、Ｔａ
ｍ、　Ｔ、１１．Ｗｏｎｇ、　Ｍ、Ｒｊｅｍａｎ、　Ｆ
、Ｓ、Ｔｊｏｅｎｇ。

ａｎｄ　Ｒ，Ｂ、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｔｅｔ、　
Ｌｅｔｔｅｒｓ、　４０３３−４０３６゜（１９７９）
；　Ｓ、Ｍｏｊｓｏｖ、　Ａ、Ｒ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、
　ａｎｄ’Ｒ，Ｂ、Ｍｅｒｒｉｒｉｅｌｄ、Ｊ、Ｏｒｇ
、Ｃｈｅｗ、、４５，５５５−５６０．（１９８０）；
Ｊ、Ｐ、Ｔａｍ、Ｒ，Ｄ、ＤｉＭａｒｃｈｉ　　ａｎｄ
　　Ｒ，Ｂ、Ｍｅｒｒｉｒｉｅｌｄ、ＴｅＬ、Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ、２８５１−２８５４．（１９８１）；　　ａｎ
ｄ　Ｓ、Ｂ、Ｈ，Ｋｅｎｔ、Ｍ、Ｒｉｅｍｅｎ、Ｍ、Ｌ
ｅＤｏｕｘ　　ａｎｄ　　Ｒ，Ｂ、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌ
ｄ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｆ　Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｌ！ｌｐｏｓｉｕｍｏ
ｎ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｏｒ　　ｒ’ｒｏｔｅｉｎ　
　５ｅｑｕｅｎｃｅ　　Ａｎａｌｙｓｉｓ、（Ｂｒｏｏ
ｋｈａｖｅｎ　　Ｉ’ｒｅｓｓ、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ
、ＮＹ）、１９８１゜止１イ１【 いわゆる“メリフィールドの固層処理”において、適切
なし一アミノ酸連鎖はカルボキシ末端アミノ酸からアミ
ノ末端アミノ酸へと形成される。

クロロメチル基、ベンゾヒドリル基らしくは樹脂のその
他の反応性基に対する化学結合を介してポリスチレンま
たはその他の樹脂に結合した適当なカルボキシ末端アミ
ン酸を出発物質として、アミノ酸は以下の操作を用いて
ひとつずつ付加される。

ペプチド樹脂は、 （ａ）塩化メチレンで洗浄し、 （ｂ）、塩化メチレン中５％（ｖ／ｖ）ジイソプロピル
アミン（またはその他の嵩高い塩基と室温で１０分間混
合することにより中和し、（ｃ）塩化メチレンで洗浄し
、 （ｄ）成長ペプチドのモル数の６倍量に等しいアミノ酸
をその１／２１１のカルボジイミド例えばジシクロへキ
シルカルボジイミドまたはジイソプロピルカルボジイミ
ドと０℃で１０分間合わせることにより活性化し、アミ
ノ酸の対称無水物を形成する。使用されるアミノ酸は、
本来、側鎖をベンジルエステル（例えばアスパラギン酸
またはグルタミン酸）、ベンジルエーテル（例えばセリ
ン、スレオニン、システィンまたはチロシン）、ベンジ
ルオキシカルボニル基（例えばりシン）またはその他の
一般にペプチド合成に使用される保護基で保護されたＮ
−α−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル誘導体として
供されるべきである。

（ｅ）活性化されたアミノ酸はペプチド−樹脂と室温で
２時間反応させ、成長ペプチド鎖の末端に新たなアミノ
酸が付加される。

（ｆ）ベブヂドー樹晰は塩化メチレンで洗浄される。

（ｇ）Ｎ−α−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基は
、塩化メチレン中３０〜６５％、好ましくは、５０％（
Ｖ　／　Ｖ　）のトリフルオロ酢酸と室温で１０〜３０
分間反応させることにより最も新しく添加したアミノ酸
から除去される。

（’ｈ）ペプチド−樹脂は塩化メチレンで洗浄されろ。

（ｉ）必要とされるペプチド鎖が形成されるまで工程（
ａ）〜（ｈ）を繰り返す。

次いで、ペプチドは、！０％Ｖ　／　Ｖのアニソールま
たはその他の好適な（芳香族）スキャベンジャ−を含有
する無水フッ化水素酸と反応させろことにより樹脂から
除かれ、それと同時に側鎖の保護基も除かれる。しかる
後、ペプチドは、ゲル濾過、イオン交換、高圧液体クロ
マトグラフィにより精製される。

場合によっては、化学合成は固層樹脂なしでも実１ｉ！
することができる。この場合、合成反応は完全に溶液中
で実施される。反応は同様で当業者にはよく知られてお
り、最終生成物は本質的に同じである。

天然資源からの単離 蛋白質抗原をそっくり十分な量利用できる場合には、所
望のアミノ酸連鎖を有する分子の一定部分は以下のいず
れかの処理により切り取ることができる。

（ａ）蛋白質加水分解酵素、特にその基質特異性により
所望のアミノ酸連鎖にすぐ隣接する蛋白質を環装する酵
素による蛋白質の消化；（ｂ）化学的手段による蛋白質
の分解。

アミノ酸間の特定の結合は特異な試薬との反応により環
装することができる。例えば、メチオニンを含む結合は
シアノーゲンブロマイドにより環装され、アスパラギニ
ル−グリシン結合はヒドロキシルアミンにより環装され
る； （ｃ）蛋白質加水分解酵素および化学的手段の組み合わ
せによる環装。

天然物もしくは合成操作により調製されるか、またはそ
れらの組み合わせにより調製される所望のアミノ連鎖を
コードするＤＮＡの小部分をクロ、−ン化して、バクテ
リアまたはその他の細胞によりペプチドを生成ずろこと
もできる。

ＨＩ３ｓＡｇ（Ｓ領域）の抗原決定因子に類似するペプ
チドには以下のようなものがある。

Ｓ（１３５）（＾、Ｒ，Ｎｅｕｒａｔｈ、　Ｓ、Ｂ、Ｈ
，Ｋｅｎｔ　ａｎｄＮ、５Ｌｒｉｃｋ、　”５ｐｅｃｉ
ｆｉｃｉｔｙ　ｏｒ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｅｌｉｃ
ｉｔｅｄ　ｂｙ　ａ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ　Ｉｌａｖｉｎｇ　ａ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｎ　
Ｃｏｍｍｏｎ　Ｗｉｔｈ　ａ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｒ
　ａ　Ｖｉｒｕｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ。

ｔｈｅ　１ｌｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　５ｕｒｆａｃｅ　
Ａｎｔｉｇｅｎ”、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ！、＾ｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７９．７８７１−７８７５．
　Ｄｅｃ、　１９ｇ２）ペプチドｌ ｔ、ｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ−Ｃｙｓ＝Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ＋　　　　１
３７’１２．ｉ　　　　　　　　ＩＰｒｏ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　ＴｈｒＴｙｒ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　ＡｌａＭｅｔ−８ｅｒ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｎペプチド２はさらに５つのアミノ酸残
基５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｘをａす
る。（Ｇ、Ｒ，Ｄｒｅｅｓｍａｎ、　Ｙ、Ｓ’ａｎｃｈ
ｅｚ、　１．Ｉｏｎｅｓｃｕ−ＭａＬｉｕ、Ｊ、Ｔ、Ｓ
ｐａｒｒｏｗ、１１．Ｒ，ｓｉｘ、Ｄ、Ｌ、Ｐｅｔｅｒ
ｓｏｎ。

Ｆ、Ｂ、ＩＩｏｌｌｉｎｇｅｒ　ａｎ（ｉ　　Ｊ、Ｌ、
Ｍｅｌｎｉｃｋ、　　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　　ｔ。

！１ｅｐａｔｉＬｉｓ　　Ｂ　５ｕｒｆａｃｅ　Ａｎｔ
ｉｇｅｎ　Ａｒｔｅｒ　Ａ　ＳｉｎｇｌｅＩｎｏｃｕｌ
ａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｕｎｃｏｕｐｌｅｄ　　５ｙｎ
ｔｈｅｔｉｃ　　ｌｌＢｓＡｇ　　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”
、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９５．１５８−１６０．１９ｇ
２；および（２）以下のペプチド： 旦　　　　アミノ酸連鎖 ４８−８１　　Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓ
ｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−３ｅｒ
−Ａｓｎ−１１ｉｓ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ
−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｌ
ｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−１１ｅ２−１６　　Ｇ
ｌｕ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈ
ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ
−Ｌｅｕ−ＧＩｎ−Ｃｙｓ２２−３５　　Ｌｅｕ−Ｔｈ
ｒ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｎ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−＾ｓｐ−８ｅｒ−Ｔｒｐ−
Ｃｙｓ３ｇ−５２５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｃｙ
ｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ４７−５２　　Ｍ
ａｌ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ９５−
１０９　　Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−
Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖ
ａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ１０４−１０９Ｌｅｕ−
Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ本発明の複合
体は、Ｂ型肝炎表面抗原の合成ペプチド類縁体以外に種
々のウィルス、バクテリア、アレルゲン、およびヒトお
よび動物の畜生蛋白質の保護抗体を惹起する合成ペプチ
ド類縁体を結合するために用いられる。そして、Ｂ型肝
炎表面抗原の新規な合成ペプチド類縁体はＨＢＶのブリ
Ｓ遺伝子でコードされた領域のアミノ酸連鎖に相当す、
るアミノ酸連鎖を含有する。

したがって、本発明の複合体は以下のウィルスの合成ペ
プチド類縁体と結合させるために使用することができる
。すなわち、ＨＴＬＶ［［ｌ／ＬＡＶ。

インフルエンザ赤血球凝集素（Ａ／メンフィス／１０２
／７２鎖、　Ａ／Ｅｎｇ１８７８／６９鎖、　Ａ／ＮＴ
／６０／６８／２９ｃ鎖、およびＡ／Ｑｕ／７／７０鎖
、　Ａｏ／ＰＲ８／３４．　Ａｔ／ＣＡＭ／４６．およ
びＡ２／シンガポール／１１５７　；タイプロインフル
エンザウィルス、例えばＢ／Ｌｅｅ）、鳥のペストウィ
ルス、赤血球凝集素、牛痘腫、ポリオ、風疹、サイトメ
ガロウィルス、天然痘、単純ヘルペスタイプ■および■
、黄熱病、感染性エフトロメリアウィルス、牛痘、感染
性牛鼻気管炎ウィルス、エキネリノ肺炎（エキネアボル
チオン）ウィルス、牛の悪性カタル、ネコの鼻気管炎ウ
ィルス、イヌのヘルペスウィルス、ニブシュタイン−バ
ーウィルス（感染性単球増加症およびプルキットリンパ
腫をともなう）、マーレフ病つィルス、羊の肺腺腫症（
ヤーグテーカイト）ウィルス、サイトメガロウィルス、
アデノウィルス群、ヒトパピローマウィルス、ネコ汎白
血球減少症、ミンクの腸炎ウィルス、アフリカ鳥居ウィ
ルス（９血清型）、ブルータングウィルス（１２血清型
）、ますの感染性膵臓壊死ウィルス、鳥の肉腫ウィルス
（種々の鎖）、鳥類の白血病ウィルス（内臓、赤芽゛球
面病およびミニロブラスト）、大理石骨店ウィルス、ニ
ューキャッスル病ウィルス、パラインフルエンザウィル
ス１１パラインフルエンザウイルス２、パラインフルエ
ンザウィルス３、パラインフルエンザ４、ムンプスウィ
ルス、トルコウイルス、カナダ１５８、イヌジステンパ
ーウィルス、はしかのウィルス、呼吸性シンシチウムウ
イルス例えばＢ型インフルエンザウィルス、例えば、Ｂ
／Ｌｅｅ／４０：狂犬病ウィルス、イースタンエキニー
ネエンセファリチスウイルス；ベネズエラエキニーネエ
ンセファリチスウイルス；ウエスターンエキニーネエン
セファリチスウイルス：黄熱病ウィルス、デング熱タイ
プ！ウィルス（タイプ６）、デンジタイプ２ウイルス（
タイプ５）；デンジタイプ３ウイルス；デングタイブ４
ウイルス、日本胸奥ウィルス、キャサヌーアフォーリス
トウイルス：ルーピングイルウィルス、マレーバレーエ
ンセファリチスウイルス、オムスクへモラジック熱ウィ
ルス（タイプ１および■）；セントルイスエンセファリ
チスウイルス、ヒトリノウイルス、フットアンドマウス
病ウィルス；ポリオウィルスタイプｌウィルス、エンテ
ロウィルスポリ第２、エンテロウィルスポリ第３、鳥類
感染性気管支炎ウィルス；豚の伝染性胃腸炎ウィルス；
リンパ球脈絡髄膜炎ウィルス、ラサウイルス；マクボウ
イルス、ピシンデウイルス；タカリベウイルス、パピロ
ーマウィルス；シンドビスウイルス等である。

本発明の複合体は、バクテリア例えばレプラ、結核、梅
毒および淋病の合成ペプチド類縁体を結合させろために
も使用される。

本発明の複合体は以下の寄生体の合成ペプチド類縁体を
結合させるためにも使用されろ。マラリア性微生物（（
Ｐ、Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、　Ｐ、０ｖａｃｅ等）、住
血吸虫症、オンコセルカボルプラスおよびその池の交雑
寄生体、トリパノソーマ、リーシュマニア、チャガス病
、アメーバ、鉤虫等。

本発明の免疫原はワクチンの活性成分として使用するこ
とができ、生理学的に許容される希釈剤（溶媒）例えば
リン酸緩衝生理食塩水とともに使用することができる。

一般的にいえば、生理学的に許容される溶媒中の合成ペ
プチドの濃度は投与量当たり約１ミリグラム以下ＩＯマ
イクログラム以上である。しかし、アジュバントの使用
は必ずしら必要としない。

ワクチンは、皮下、皮膚内または筋肉的注射により投与
、することができろ。好ましい投与方法は、ワクチンに
よって異なるが、一般的には、筋肉的注射が好適である
。投与の回数はワクチンによって異なる。しかし、一般
的にいえば、ワクチンは、約１ケ月おいて２回投与し、
初期免疫化から６ケ月〜１年後に効能促進剤を投与する
。その後のワクチンの投与または効能促進剤の投与は初
期免疫化による血液中の抗体の濃度に依存し、場合によ
っては、必要としない。

本発明に従うワクチンは免疫応答を改善し、ある種の公
知のＢ型肝炎ウィルスに対する応答性の欠如を解消する
（例えば、プリＳ領域内のアミノ酸連鎖に相当するペプ
チドを含有しない）。

以下、実施例に基づき、本発明をさらに詳細に説明する
が、かかる実施例はなんら本発明を限定するものではな
い。

実施例 オクタデカンチオール（ｇｍｇ）にューヨーク州ホウパ
ーグ所在フルカ社製）および２−メルカプドール（ＭＥ
；２０ｍｇ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）　２
　ｍｌに２０℃で溶解させた。３０分後、スピコサイド
（スエーデン国、ルレア所在イソテックエーヒー社製）
を加え、この混合物を”セファデックスＧ−１０”カラ
ムにュージャージ州ピス力タウエイ所在のファルマシア
社製）４０ｍｌの項部に載せた。このカラムは０．８％
酢酸ナトリウムで洗浄しｐｔｒｓ、７とし、次いで、ス
ピコサイド２　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌを含む前記バッファ
ー２　ｍ　ｌを載什た。試料を載せた後、カラムはスピ
コザイド２μｇ　／　ｍ　Ｉを含む前記バッファーで溶
離させた。

カラムの排除体積に相当する蛋白光−分を集め、これを
ＨＢ　Ｖ　ｅ　ｎ　ｖ蛋白質サブタイプａｄｗ２のプリ
Ｓ２連鎖から誘導され（Ａ、Ｒ，ＮｅｕｒａＬｈ　ｅｔ
　ａｌ。

５ｃｉｅｎｃｅ、　２２４．３９２−３９５（１９８４
）、　５ｕｐｒａ；　Ａ、Ｒ，Ｎｅｕｒａｔｈ　ａｎｄ
　Ｓ、Ｂ、Ｉｌ、Ｋｃｎｔ、“＾ｎｔｉｇｅｎｉｃ　５
ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｒｌｌｕｍａｎ　ｌ１ｅｐａｔｉ
ｔｉｓ　Ｖｉｒｕｓｅｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙｏ［Ｖｉｒｕｓｅｓ；　Ｔｈｅ　Ｂａ５ｉｓ
　ｆｏｒ　５ｅｒｏｄｉａｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｖａｃ
ｃｉｎａｓ”、　３２５−３６６、　Ｅｃｌｉｔｅｄ　
ｂｙ　Ｍ、Ｉｌ、Ｖ、Ｖａｎ　Ｒｅｇｅｒ＋＋＋＋ｏｒ
ｔｅｌ　＆＾、Ｒ，ＮａｕｒａＬｈ、　Ａｍｓｔｅｒｄ
ａｍ：　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ。

Ｃｌ９８５））、Ｃ末端にＧｌｙ　−Ｇｌｙ　−Ｃｙｓ
スペーサを何する合成ペプチドプリＳ　（１２０−１４
５）と混合した。

ペプチドはＭＥ（１００μｇ／ｍｌ）で還元され凍結乾
燥されていた。次いで、ｐＨを６．７に保持しながら、
３０℃で１時間以内に５×４０μ！アリクオツドにナト
リウムフェリシアナイド（６ｍＭ）を加えた。その後、
混合物をｐ＋−１７，２の０．　１４ｍＮａＣｌ　０．
０１Ｍリン酸塩（ＰＢＳ）に対して透析した。２，００
０ｒ　ｐ　ｍで遠心分離することによ　。

り過剰のＰＢＳからｉ　ｓ　ｃ　ｏ　ｍ　ｓを分離した
。これらを４℃でペレットし２０℃でフロートした。

β−ガラクトシダーゼに結合したプリ５（１２０−１４
５）を用いる酵素結合免疫分析法（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）に
おける合成ペプチドｉｓｃｏｍの一連の希釈液を用いる
競合試験（Ａ、Ｒ，Ｎｅｕｒａｔｈ、　Ｓ、Ｂ、Ｉｌ、
Ｋｅｎｔ　＆Ｎ、５ｔｒｉｃｋ、“５ｐｅｃｉｆｉｃｉ
ｔｙ　ｏｒ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｅ！１ｃｉｔｅｄ
　ｂｙ　ａ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｉ
ｌａｖｉｎｇ　ａ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｎ　Ｃｏｍｍ
ｏｎ　ｗｉｔｈ　ａ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　Ｖ
ｉｒｕｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ。

ｔｂｅ　１ｌｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　５ｕｒｆａｃｅ　
Ａｎｔｉｇｅｎ”、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｒｔ
ｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃ
ｉｅｎｃｅ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。

、　７９．７８７１−７８７５．　（１９３２乃によれ
ばｉｓｃｏｍｓに対するペプチドの結合は完全であるこ
とが判明した。

ＩＩ　Ｂ　Ｖ　ｅ　ｎ　ｖ蛋白質のブリＳｔおよびＳ連
鎖から誘導されろ類縁体ブリＳ　（２１−４７）および
５（１３５−１５５）を含有する複合体（Ｎｅｕｒａｔ
ｈ　ｅｔ　ａｌ、　１９８２．５ｕｐｒａ；　Ａ、Ｒ，
Ｎｅｕｒａｔｈ、　Ｓ、Ｂ、Ｈ，Ｋｅｎｔ、　Ｎ、５Ｌ
ｒｉｃｋ、　Ｐ、Ｔａｙｌｏｒ、　　＆　　Ｃ，Ｅ、５
ｔｅｖｅｎｓ、　　“ｔｌｅｐａｔｉｔｉｓ　　Ｂ　　
Ｖｉｒｕｓ　　　Ｃ。

ｎＬａ１ｎｓ　Ｐｒｅ−３Ｇｅｎｅ−Ｅｎｃｏｄｅｄ　
Ｄｏｍａｉｎｓ”、　Ｎａｔｕｒｅ。

３１５、１５４−１５６．　（１９８５）；　Ｎｅｕｒ
ａｔｈ　ａｎｄ　Ｋｅｎｔ、　（１９８５）、　５ｕｐ
ｒａ）は、それぞれ、後者のペプチドの場合に、ｐ　Ｈ
８の０．１Ｍリン酸塩をモルキュラーエクスクルージョ
ンクロマトグラフィに対して使用し、ナトリウムフェリ
シアナイドを使用せず、ｉｓ　ｃ　ｏ　ｍ　ｓに対する
ペプチドの結合を１６時間に延長する以外は同様にして
調製した。Ｅ’ＬＩＳＡ競合試験によれば、２つのペプ
チドの個々に対する結合は完全であることが判明した。

。 ３つの明確な複合体調製物をＤＭＳＯに再び溶解し集め
た（全体積＝　４ｍ１）。スピコサイド（４ｍ１）を加
え、この混合物を、２μｇ　／　ｍ　１のスピコサイド
を含有するＰＢＳで予備洗浄した“セファデックスＧ−
１０”カラム４０ｍ１に載せた。カラムの排除体積に相
当しかつ結合した３つの明確なペプチド全てを有するｉ
　ｓ　ｃ　ｏ　ｍ　ｓを含有する両分（第１図）を集め
、４匹の兎を免疫化するために使用した。各免疫化のた
めのｉｓｃｏｍ投与は各３つのペプチド！２５μｇに相
当し各週毎に行った。

第１図は、ＨＢＶ　ｅ　ｎ　ｖ蛋白質のプリＳ＋、ブリ
Ｓ２およびＳ領域に相当する合成ペプチドを含有するｉ
ｓｃｏｍｓ（抗−ブリＳ　（２１−４７）で凝集された
）の顕微鏡写真である（　２５０ｘ位相コントラスト対
物レンズ：　バーの長す＝５０μ）。１ｓｃｏ　ｍ　ｓ
の径は約１〜３μであった。

兎はｉｓｃｏｍｓに組み込まれた合成類縁体の全てに応
答し、したがって、完全なり型肝炎ウィルス表面抗原（
ｌＩＢｓＡｇ；プリーＳｌ、プリー８２およびＳ蛋白質
連鎖を含有（Ｎｅｕｒａｔｈ　ｅＬ　ａｌ、　Ｎａｔｕ
ｒｅ、　３１５．１５４−１５６．　（１９８５）、　
５ｕｐｒａ）内およびペプシン処理ＨＢｓＡＧ（専らＳ
蛋白質含有、　　Ｎｅｕｒａｔｈ　ｅｔａｌ、　Ｎａｔ
ｕｒｅ、　３１５．１５４−１５６．　Ｃ１９８５）、
　５ｕｐｒａ）内に存在するＨＢＶｅｎｖと反応する。

抗血清は、電子顕微鏡によって観察されろようにＩ（Ｂ
　Ｖ粒子を凝集した（データ図示せず）。２つの最も良
好な応答因子によって得られた結果を第２図に図示する
。

第２図は、Ｉ（ＢＶｅｎｖ蛋白質のサブタイプａｄ　ｗ
　２　（Ｎｃｕｒａｔｈ　ａｎｄ　Ｋｅｎｔ、（１９８
５）、　５ｕｐｒａ）のブリＳ１、ブリＳ２、およびＳ
蛋白ｌＰｔ鎖から誘導された合成ペプチドを含有するｉ
ｓｃｏｍで初期免疫化してからｌＯ週間後の２匹の兎（
トップ、ボットム）における抗体応答の結果を示す。抗
体は、第２の抗体として目５！標識抗兎１ｇＧを使用し
てｌ　Ｉ　Ａにより分析した（　Ｎｅｕｒａｔｈ　ｅｔ
　ａｌ、　（１９８２）ｓｕｐｒａ）。固層を被覆する
ために使用される抗原は挿入において示されている。予
備免疫血清に対応する放射活性のカウントは抗−複合体
血清に対応するカウントから差し引かれろ。ペプチドＳ
　（１３５−１５５）に対する抗体応答は、それらのＳ
蛋白質に対する応答との相関か小さいために第２図に図
示しなかった（ＮｅｕｒａＬｈ　ｅｔ　ａｌ、　（１９
ｇ２）、　５ｕｐｒａ；　Ｎｅｕｒａｔｈ　ｅｔ　ａｌ
、　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏＣＧｅｎｅｒａｌ　Ｖ
旨ｏｌｏｇｙ。

６５．１００９−１０１４．（１９８４））。

ＨＢｓＡｇを認識する抗体の濃度は免疫化の数とともに
増大し、このことは記憶細胞の発育を示唆する（第３図
）。

第３図は、第２ａ図に対して記載したように、免疫化さ
れた兎の１匹におけるＩ−Ｉ　Ｂ　Ｖ　ｅ　ｎ　ｖ蛋白
質に対する抗体応答の動力学を示す。ウェスターンプロ
ットおよび血清分析により測定されるように全ての膜蛋
白質を含有するＨ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇで被覆したビーズ（
Ｎｅｕｒａｔｈ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１
５．１５４−１５６、　（１９８５）、５ｕｐｒａ）を
抗体検出のために使用した。

最終希釈度は、抗血清に相当するカウントを等希釈され
た予備免疫血清に相当するカウントで割った比が上２゜
１である最も高い希釈度を表す。Ｓ蛋白質に対する抗体
は非希釈の血清を使用しＡＵＳＡＢ試験（イリノイ州ノ
ースジカゴ所在のアボットラボラトリーズ社製）により
測定した。したがって、第３図の左および右座標の目盛
りは同じではない。

以上、実施例に基づき、本発明を具体的に詳述したが、
本発明はかかる実施例に限定されるしのではなく、種々
の変形変法が可能であることは容易に理解されよう。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に従う複合体の顕微鏡写真、第２ａ図お
よび第２ｂ図は本発明に従う複合体で免疫化された兎に
おける抗体応答のグラフ、第３図は本発明に従う複合体
で免疫化された兎における抗体応答の経時変化を示すグ
ラフ、第４図はＩ−Ｉ　ＢＶＤＮＡ連鎖から推論したブ
リＳ遺伝子領域の翻訳生成物のアミノ酸連鎖を示す図で
ある。 なお第４図において、連鎖は不明細吉中において定義し
た！文字のアミノ酸コード記号で表す。 すなわち、５つの明確なＨＢ　Ｖサブタイプに対する連
鎖を示す。第６番目のボトムラインは５つの全てのサブ
タイプに共通なアミノ酸残基を示す。 出願人　　ニューヨーク　ブラッド　センターＦＡＧ、
１ 戦亘滴弗釈棗

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）核構造と、前記核構造に共有結合した一以上の明
   確な合成ペプチドの複数のコピーとからなり、前記核構
   造が、サポニン誘導体と、炭素原子数７〜２４の有機化
   合物または−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＮＨ＿２および−
   ＳＨからなる群から選ばれる一以上の活性部位を有する
   疎水性ペプチドとからなる複合免疫原。
2. （２）前記有機化合物が脂肪族化合物である特許請求の
   範囲第１項記載の複合免疫原。
3. （３）前記脂肪族化合物がオクタデカンチオールである
   特許請求の範囲第２項記載の複合免疫原。
4. （４）前記サポニン誘導体がキルＡである特許請求の範
   囲第１項記載の複合免疫原。
5. （５）前記合成ペプチドがＢ型肝炎ウィルス膜蛋白質の
   合成ペプチド類縁体である特許請求の範囲第１項記載の
   複合免疫原。
6. （６）前記合成ペプチドが、 （ａ）Ｂ型肝炎ウィルス膜蛋白質のプリーＳ１領域から
   の少なくとも一の類縁体と、 （ｂ）Ｂ型肝炎ウィルス膜蛋白質のプリーＳ２領域から
   の少なくとも一のペプチド類縁体と、（ｃ）Ｂ型肝炎ウ
   ィルス膜蛋白質のＳ領域からの少なくとも一のペプチド
   類縁体と、 からなる特許請求の範囲第１項記載の複合免疫原。
7. （７）合成ペプチド類縁体（ｂ）がプリーＳ（１２０−
   １４５）である特許請求の範囲第６項記載の複合免疫原
   。
8. （８）合成ペプチド類縁体（ａ）がプリーＳ（２１−４
   ７）である特許請求の範囲第６項記載の複合免疫原。
9. （９）合成ペプチド類縁体（ｃ）がＳ（１３５−１５５
   ）である特許請求の範囲第６項記載の複合免疫原。