JPH10508754A - 酵母用発現プラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、酵母に対するシグナルペプチドおよびポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを有する酵母発現プラスミドに関する。また、本発明は、かかる酵母発現プラスミドを含む酵母細胞および酵母発現プラスミドを用いるポリペプチドの製造方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 酵母用発現プラスミド 本発明は、酵母発現プラスミドおよび酵母発現プラスミドを含む酵母細胞に関 する。また、本発明は、本発明の発現プラスミドを用いる酵母におけるポリペプ チドの調製方法に関する。 ポリペプチドを発現させるために、シゾサッカロミセス ポンベ株等の酵母細 胞を用いることは公知である。しかし、発現したポリペプチドは、通常、培地に 分泌されるのではなく、酵母細胞中に蓄積する。従って、ポリペプチドを単離す るために、酵母細胞を破壊しなければならず、生じた破片と酵母蛋白質を分離し なければならない。このことは、非常に時間がかかり、高コストである。 従って、本発明の目的は、前記欠点を起こすことなく、酵母細胞でポリペプチ ドを発現させることが可能な方法を提供することにある。 本発明によれば、酵母に対するシグナルペプチドおよびポリペプチドからなる 融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む酵母発現プラスミドにより、このこ とが達成される。 かかる酵母発現プラスミドを用いてそれを含む酵母細胞で、融合ポリペプチド の形で、ポリペプチドを発現させる。それは、酵母細胞外への融合蛋白質の輸送 に役立つ酵母シグナルペプチドを含む。この場合、ポリペプチドのみが培地中に 蓄積するように、酵母シグナルペプチドを切断除去する。 酵母での発現に好適なベクターであればいかなるベクターも、本発明の酵母発 現プラスミドの調製に用いることが可能である。当業者であれば、かかるベクタ ーに精通している。例えば、当業者であれば、ｐＲＥＰ３−Ｌ２０に帰するであ ろう。このベクターは、ｐＲＥＰ３由来である（マウンドレル(Maundrell，K.), Gene 123(1993)，pp.127-130を参照）が、下記「マルチクローニング部位」（ ＭＣＳ）を有する： 酵母シグナルペプチドおよびポリペプチドからなる融合ポリペプチドをコード するＤＮＡを、前記ベクターに挿入する。酵母細胞中で融合ポリペプチドを発現 できるように、挿入を行う。当業者であれば、この目的のために好適な手順およ び条件に精通している。特に、当業者であれば、酵母シグナルペプチドをコード するＤＮＡおよびポリペプチドをコードするＤＮＡの各５’末端にＡＴＧコドン が存在するという事実に注意を払う。酵母シグナルペプチドをコードするＤＮＡ の３’末端が、直接、即ち、付加的なコドンを経ることなしにポリペプチドをコ ードするＤＮＡのＡＴＧコドンに隣接しているということも有利である。また、 酵母シグナルペプチドをコードするＤＮＡを、ポリペプチドをコードするＤＮＡ と最初に連結し、次いで、連結産物をベクターに挿入することが好ましい。他方 、２つのＤＮＡの分離挿入、即ち、酵母シグナルペプチドをコードするＤＮＡの みを挿入した場合、酵母用の新規で有利な発現ベクターを供給する。かかるベク ターも本発明の要旨を表す。 前記用語「酵母シグナルペプチド」とは、酵母において、ポリペプチドの外部 への輸送を可能にするいかなる種類のペプチドにも関する。これは、例えば、サ ッカロミセス ポンベ起源のシグナルペプチドである。そのＤＮＡは、図１に示 すような配列を有してもよい。例えば、ヌクレオチドの付加、欠失および／また は置換の形式で、１以上のヌクレオチドによりこの配列を変更することが好まし い。例えば、かかる変更は、酵母シグナルペプチドをコードするＤＮＡの３’末 端が、ポリペプチドをコードするＤＮＡのＡＴＧコドンに直接隣接するように設 計してもよい。 また、前記用語「ポリペプチド」は、酵母で発現できるいかなる種類のポリペ プチドにも関する。酵母起源でないポリペプチドが好ましい。その具体例として は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の蛋白質またはその一部が挙げられる。 これらの中で、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の核シグナルを有する 初期蛋白質Ｅ６およびＥ７を特に挙げなければならない。 好ましい態様において、本発明の発現プラスミドによりコードされる融合ポリ ペプチドは、シゾサッカロミセス ポンベ起源のシグナルペプチド、即ち、図１ のＤＮＡ配列を有するものおよびＨＰＶ １６のＥ７蛋白質からなる。かかる発 現プラスミドは、ｐＲＥＰ３ Ｌ２０ベクターを含有し、ｐＲＥＰ３−Ｌ２０ｓ ｐＩ−ＨＰＶ １６ Ｅ７と呼ぶ。それは、１９９４年１０月２８日に、ＤＳＭ ９５３２としてＤＳＭ[微生物のジャーマンータイプ カルチャー コレクシ ョン]に寄託された。ｐＲＥＰ３−Ｌ２０ ｓｐＩ−ＨＰＶ １６ Ｅ７の調製 を、図２に示す。 なお、用語「ポリペプチド」は、かかるポリペプチドが２以上のポリペプチド から生じた融合産物であってもよいという事実を示す。これらのポリペプチドの １以上は、抗体により容易に結合できる領域を含むことが好ましい。 好ましい態様において、本発明の発現プラスミドによりコードされる融合ポリ ペプチドは、サッカロミセス ポンベ起源のシグナルペプチド、即ち、図１のＤ ＮＡ配列を有するもの、ＨＰＶ １６のＥ７蛋白質およびｔａｇポリペプチドか らなる。後者のポリペプチドは、ＳＶ４０ｔ抗原のＣ末端の１１アミノ酸からな る。それは、通常利用できる抗体ＭＡＫ ｔａｇ（ＫＴ３）により結合する領域 を有する。前記融合ポリペプチドをコードする発現プラスミドは、ｐＲＥＰ３ Ｌ２０ベクターを含有し、ｐＲＥＰ３−Ｌ２０ ｓｐＩ−ＨＰＶ １６ Ｅ７ ｔａｇと呼ぶ。それは、１９９４年１０月２８日に、ＤＳＭ ９５３１としてＤ ＳＭに寄託された。ｐＲＥＰ３−Ｌ２０ ｓｐＩ−ＨＰＶ １６ Ｅ７ ｔａｇ の調製を、図３に示す。 本発明の発現プラスミドは、酵母細胞により発現されるポリペプチドが培地に 分泌されるという点がその特徴である。それから、ポリペプチドを遠心分離等の 通常の方法により酵母細胞から容易に分離し、次いで、精製することができる。 このことは、ポリペプチドが抗体により容易に結合可能な領域を含む場合、なお さら適用される。ポリペプチドは、カラム材料等に固定される対応する抗体によ り、この領域を介して捕捉することができる。その後の溶出により、ポリペプチ ドは精製形として得られる。 また、本発明の主題は、ｐＲＥＰ３ Ｌ２０ ｓｐＩ−ＨＰＶ １６Ｅ７また はｐＲＥＰ３ Ｌ２０ ｓｐＩ−ＨＰＶ １６Ｅ７ ｔａｇ等の本発明の発現プ ラスミドを含む酵母細胞、好ましくはシゾサッカロミセス ポンベ株の酵母細胞 を包含する。 本発明の他の主題は、下記手順工程からなるポリペプチドの調製方法に関する ： （ａ）前記発現プラスミドを用いて酵母細胞、特にシゾサッカロミセス ポンベ 株を形質転換する工程、 （ｂ）融合ポリペプチドを発現するように、工程（ａ）の形質転換酵母細胞を培 養する工程、および （ｃ）細胞上清中に存在するポリペプチドを分離し、任意にポリペプチドをさら に精製する工程。 当業者であれば、前記手順を行う好適な材料および条件に精通している。追加 により、マニアティスら、Molecular Cloning: A laboratory manual(1982)，Co ld Spring Harbor，New Yorkが参照される。 図面の簡単な説明： 図１は、シゾサッカロミセス ポンベのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ を示し、 図２は、発現プラスミドｐＲＥＰ３−Ｌ２０ ｓｐＩ−ＨＰＶ １６Ｅ７なら びにその調製を示し、 図３は、発現プラスミドｐＲＥＰ３−Ｌ２０ ｓｐＩ−ＨＰＶ １６Ｅ７ ｔ ａｇならびにその調製を示し、および 図４は、図式により、ポリペプチドｔａｇをコードするＤＮＡならびにＨＰＶ １６Ｅ７ ｔａｇをコードするＤＮＡを示す。 下記実施例により本発明を説明する。実施例１ 発現プラスミドｐＲＥＰ３−Ｌ２０ ｓｐＩ−ＨＰＶ １６Ｅ７の調製 この発現プラスミドの調製を、図式により図２に示す。 ｓｐＩをコードする一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡを合成する。このＤＮＡをＫｌｅｎ ｏｗ断片により二本鎖（ｄｓＤＮＡｓｐＩ）にし、次いで、制限酵素ＢａｍＨＩ およびＮｓｉＩで切断する。ＢａｍＨＩ−ＮｓｉＩ ＤＮＡ断片を得る。 また、ＨＰＶ１６のＥ７蛋白質（ＨＰＶ １６Ｅ７）をコードするＤＮＡを、 通常のＰＣＲ法により増幅する。次いで、生じたＤＮＡを制限酵素ＮｓｉＩおよ びＳａｌＩで切断する。ＮｓｉＩ−ＳａｌＩ ＤＮＡ断片を得る。 前記ＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ切断ベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ にリガーゼ反応で挿入する：プラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｓｐＩ ＨＰＶ １６Ｅ７を得る。このプラスミドを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切 断し、ｓｐＩおよびＨＰＶ １６Ｅ７を含むＤＮＡ断片を単離する。この断片を 、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ切断ベクターｐＲＥＰ３−Ｌ２０と共にリガーゼ反 応で挿入する（前記参照）。発現プラスミドｐＲＥＰ３−Ｌ２０ ｓｐＩ−ＨＰ Ｖ １６Ｅ７を得る。実施例２ 発現プラスミドｐＲＥＰ３−Ｌ２０ ｓｐＩ−ＨＰＶ １６Ｅ７ ｔａｇの調製 この発現プラスミドの調製を、図式により図３に示す。 実施例１に記載の手順と同様に、プラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＨＰＶ １６Ｅ７ ｔａｇを調製する。制限酵素ＮｓｉＩおよびＳａｌＩで切断後、そこ からＨＰＶ １６Ｅ７ ｔａｇをコードするＤＮＡ断片（図４参照）を単離する 。このＤＮＡ断片を、ＮｓｉＩおよびＳａｌＩで切断してＨＰＶ １６Ｅ７をコ ードするＤＮＡを除去した後のプラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｓｐＩ ＨＰ Ｖ １６Ｅ７（実施例１参照）に挿入する。プラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｓｐＩ−ＨＰＶ １６Ｅ７ ｔａｇを得る。このプラスミドを、制限酵素Ｓｐｅ ＩおよびＸｈｏＩで切断し、ｓｐＩ−ＨＰＶ １６Ｅ７ ｔａｇ断片を、対応す る切断ベクターｐＲＥＰ３−Ｌ２０（前記参照）に挿入する。発現プラスミドｐ ＲＥＰ３−Ｌ２０ ｓｐＩ−ＨＰＶ １６Ｅ７ ｔａｇを得る。実施例３ ＨＰＶ １６のＥ７蛋白質（ＨＰＶ １６Ｅ７）の発現 （ａ）発現プラスミドｐＲＥＰ３−Ｌ２０ ｓｐＩ ＨＰＶ−１６Ｅ７を用いて 、シゾサッカロミセス ポンベＬＥＵ １．３２株の酵母細胞を形質転換する。 これらの酵母細胞は、ロイシンを産生することができない。しかし、この欠失は 、前記発現プラスミドがロイシンもコードするので、前記発現プラスミドにより 克服される。ロイシン欠損培地で選別を行う。 発現プラスミドによりコードされる融合ポリペプチドの発現が行われるように 、形質転換した酵母細胞を培養する。酵母細胞を遠心分離し、細胞上清中のポリ ペプチドＨＰＶ １６ Ｅ７を検出する。 ＨＰＶ １６Ｅ７に対するモノクローナル抗体Ｍａｂ ＨＰＶ １６Ｅ７ Ｉ Ｖを用いて、細胞上清のドット−ブロット分析により、検出を行う。 また、ウエスタンブロットで、細胞内および細胞外ＨＰＶ １６Ｅ７の検出を 行う。前記抗体を抗体として用いる。 ポリペプチドＨＰＶ １６Ｅ７が細胞上清中に分泌されることが示される。 （ｂ）前記手順（ａ）と同様に、発現プラスミドｐＲＥＰ３−Ｌ２０ ｓｐＩ− ＨＰＶ １６Ｅ７ ｔａｇを用いて、シゾサッカロミセス ポンベＬＥＵ １． ３２株の酵母細胞を形質転換し、ポリペプチドＨＰＶ １６Ｅ７ ｔａｇの発現 を、ｔａｇに対するモノクローナル抗体Ｍａｂ ｔａｇ（ＫＴ３）により検出す る。 ポリペプチドＨＰＶ １６Ｅ７ ｔａｇが細胞上清中に分泌されることが示さ れる。 当業者であれば、実施例に記載の手順および材料に精通している。追加により 、マニアティスらの前記引用文が参照される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９６年１１月２５日 【補正内容】 請求の範囲 １．シゾサッカロミセス ポンベ起源のシグナルペプチドおよび酵母起源でない ポリペプチドからなる融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを有する酵母発現プ ラスミド。 ２．シグナルペプチドが、図１のシグナルペプチドであることを特徴とする請求 項１記載の酵母発現プラスミド。 ３．ポリペプチドが、ヒト病原性パピローマウイルス（ＨＰＶ）起源であること を特徴とする請求項１または２記載の酵母発現プラスミド。 ４．ポリペプチドが、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７蛋白質であることを特徴 とする請求項３記載の酵母発現プラスミド。 ５．Ｅ６およびＥ７蛋白質が、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８起源で あることを特徴とする請求項４記載の酵母発現プラスミド。 ６．ＤＳＭ ９５３２として、ＤＳＭ（微生物のジャーマン タイプ コレクシ ョン）に寄託されている請求項５記載の酵母発現プラスミド。 ７．ポリペプチドが、他のポリペプチドと融合していることを特徴とする請求項 １〜５いずれか記載の酵母発現プラスミド。 ８．ポリペプチドが、抗体結合領域をさらに含んでなることを特徴とする請求項 ７記載の酵母発現プラスミド。 ９．ＤＳＭ ９５３１としてＤＳＭに寄託されている請求項８記載の発現プラス ミド。 １０．請求項１〜９いずれか記載のベクターを含む酵母細胞。 １１．シゾサッカロミセス ポンベ株の酵母細胞であることを特徴とする請求項 １０記載の酵母細胞。 １２．下記手順工程からなるポリペプチドの調製方法： （ａ）請求項１〜９いずれか記載の発現プラスミドを用いて酵母細胞を形質転換 する工程、 （ｂ）融合ポリペプチドを発現するように、工程（ａ）の形質転換酵母細胞を培 養する工程、および （ｃ）細胞上清中に存在するポリペプチドを分離し、任意にポリペプチドをさら に精製する工程。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 メシェデ，ヴォルフガング ツェー ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク デー −69121 ドッセンハイマー ラントシュ トラッセ 72

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．酵母に対するシグナルペプチドおよびポリペプチドからなる融合ポリペプチ ドをコードするＤＮＡを有する酵母発現プラスミド。 ２．シグナルペプチドが、シゾサッカロミセス ポンベ起源であることを特徴と する請求項１記載の酵母発現プラスミド。 ３．シグナルペプチドが、図１のシグナルペプチドであることを特徴とする請求 項２記載の酵母発現プラスミド。 ４．ポリペプチドが、酵母起源でないことを特徴とする請求項１〜３いずれか記 載の酵母発現プラスミド。 ５．ポリペプチドが、ヒト病原性パピローマウイルス（ＨＰＶ）起源であること を特徴とする請求項１〜３いずれか記載の酵母発現プラスミド。 ６．ポリペプチドが、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７蛋白質であることを特徴 とする請求項５記載の酵母発現プラスミド。 ７．Ｅ６およびＥ７蛋白質が、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８起源で あることを特徴とする請求項６記載の酵母発現プラスミド。 ８．ＤＳＭ ９５３２として、ＤＳＭ（微生物のジャーマン タイプ コレクシ ョン）に寄託されている請求項７記載の酵母発現プラスミド。 ９．ポリペプチドが、他のポリペプチドと融合していることを特徴とする請求項 １〜７いずれか記載の酵母発現プラスミド。 １０．ポリペプチドが、抗体結合領域をさらに含んでなることを特徴とする請求 項９記載の酵母発現プラスミド。 １１．ＤＳＭ ９５３１としてＤＳＭに寄託されている請求項１０記載の発現プ ラスミド。 １２．請求項１〜１１いずれか記載のベクターを含む酵母細胞。 １３．シゾサッカロミセス ポンベ株の酵母細胞であることを特徴とする請求項 １２記載の酵母細胞。 １４．下記手順工程からなるポリペプチドの調製方法： （ａ）請求項１〜１１いずれか記載の発現プラスミドを用いて酵母細胞を形質転 換する工程、 （ｂ）融合ポリペプチドを発現するように、工程（ａ）の形質転換酵母細胞を培 養する工程、および （ｃ）細胞上清中に存在するポリペプチドを分離し、任意にポリペプチドをさら に精製する工程。