JPH10508299A - タンパク質ミクロスフェア、フィルムおよびコーティングの調製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 タンパク質または改変タンパク質から、ミクロスフェア、フィルム、およびコーティングを調製する方法を記載する。該方法において、該タンパク質産物は、少なくとも１種のα−ヒドロキシ酸水溶液の存在下で、調製することにより安定化される。好ましいα−ヒドロキシ酸は、グリコール酸、乳酸、α−ヒドロキシ酪酸、またはそれらの２種以上の混合物である。このように生成されたミクロスフェア、フィルム、またはコーティングは、水溶液中での安定性が改善されている。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質ミクロスフェア、フィルムおよびコーティングの調製 本発明は、タンパク質および改変タンパク質からつくられたミクロスフェア、 フィルムおよびコーティングに関し、そして特に、より安定した生産物が得られ るその調製方法における改善に関する。本発明に従い生産されたミクロスフェア 、フィルムおよびコーティングは種々の医用適用に適する。 用語「ミクロスフェア」は、一般に、実質的に球状であって、そして1Onm〜２ mmの範囲の直径を有するコロイド状粒子を記載するのに使用される。１μ未満の 直径を有する粒子はしばしば「ナノ粒子」と呼ばれる。非常に広範囲の天然およ び合成ポリマーからつくられたミクロスフェアは、種々の医用適用における用途 が見出されている。それらはマーカー（標識または検知デバイス）で標識され得 、そしてインビトロまたはインビボ両方において種々の媒体を介して輸送され得 る。標識は化学的蛍光、磁性または放射能であり得、そしてそれゆえ、それらは 適当な検知装置によって使用に際して観測され得る。ミクロスフェアが使用され てきた適用の種類は診断的スクリーニング、細胞分離、イムノアッセイ、食作用 および血流の研究、細胞運動性の研究、血液灌流および体外療法、薬物送達デバ イス、標的化薬物送達、細胞カプセル化および血管内塞栓形成法(endovasular e mbolisatlon)である。 ミクロスフェアが医用適用のために保有しなければならない重要な特性は生体 適合性である。それらは、インビボにおける免疫系からの攻撃に対して出来る限 り耐性であるべきである。さらに、多くの適用では、一旦その機能が果たされれ ば、ミクロスフェアは体内で生分解性および／または再吸収性であることが重要 である。また、他の場合には、それらは、体内への容易な導入に十分な位小さく あるべきである。 これらの理由で、天然に存在するタンパク質のようなポリマー物質が、ミクロ スフェアの調製のための多くの研究の実験材料であった。100nmほどの小さいナ ノ粒子は、例えば、ある調製技術を用いてアルブミンから調製され得、そしてこ れはとりわけ、注射製剤で非常に有用である。 それらの生体適合性のため、いくつかのタンパク質が、ヒト体内に導入され、 従って、体液と接触する人工補装具(artificial prostheses)用のコーティング の作成において使用されてきた。ミクロスフェアに関しては、このようないずれ のコーティングも、免疫系からの攻撃に対して出来る限り耐性であるべきで、さ らに、血栓溶解性であるべきではない。すなわち、単に最小の血小板活性化を引 き起こすに過ぎないものであるべきである。 動脈補装具の血液生体適合性は、Kottke-Marchantらによって、Biomaterials1 989 10 147-155に示されているように、アルブミンで表面をコーティングするこ とによって改良されることは公知である。事実、アルブミンは非抗原性、生分解 性であって容易に入手できるので、コーティングおよびミクロスフェア双方で選 択された特別の物質であった。 補装具用のタンパク質ミクロスフェアおよびフィルムならびにタンパク質コー ティングを調製する多数の方法が知られているが、ある種の欠点がそれら全てに 伴う。 例えば、タンパク質ミクロスフェアを調製する周知の方法は懸濁液架橋である 。このプロセスでは、タンパク質の水溶液を非混和性液体または油相に添加する 。タンパク質の液滴を高速で撹拌することによって分散させ、次いで、懸濁液を 例えば80℃を超える温度まで加熱することによって、あるいは別法としてグルタ ルアルデヒドのような架橋剤を使用した化学的架橋によって、ミクロスフェアを 形成するために液滴の硬化または安定化を行う。懸濁架橋技術によるアルブミン ミクロスフェアの種々の調製方法がArshadyによって、Journal of Controlled R elease，14（1990）111-131に記載されている。 懸濁架橋技術によるミクロスフェアの調製の不利は、高出力超音波処理を用い れば約100nmの直径のナノスフェアが調製されるが、サイズが約500nm未満のミク ロスフェアを生成するのが困難だという点である。さらに不利は、使用する架橋 剤がしばしば毒性だという点であり、これでは生体適合性に導かれない。 懸濁液架橋タンパク質ミクロスフェアとは別に、特にゼラチンミクロスフェア は、コアセルベーションまたは制御された脱溶媒によって調製されてきた。この 手法は、アルブミンの水溶液に添加されたコアセルベーション剤としてエタノー ルを用い、Knopら(1975)によって、0.1〜5μmのサイズ範囲のアルブミンミクロ スフェアを調製するのにも使用された。Ishizakら(1985)は、コアセルベーショ ン剤としてイソプロピルアルコールを用い、0.5〜1.5μmのサイズ範囲のアルブ ミンミクロスフェアを調製した。同様の技術が開発されて、アセトンをヒト血清 アルブミンの水溶液に添加し、コロイド系を加熱することによって、200-500nm のナノ粒子が調製されている(Chenら,1994，J．Microencapsulation，11，395-4 07)。別のアプローチにおいて、グルタルアルデヒドのような化学架橋剤を使用 してミクロスフェアを硬化している（Linら（1993）J．Drug Targeting １ 237- 243頁）。 タンパク質ミクロスフェアを調製するためのコアセルベーション方法は、懸濁 液架橋方法よりも行うのが簡単であり、粒子は毒性がより低い。しかしながら、 不利は、粒子が特には安定でなく、容易に凝集してより大きなミクロスフェアを 形成する点である。現在まで、コアセルベーション方法を使用して、注射製剤と しての潜在的用途を有し得る約200nmまたはそれ未満のタンパク質ナノスフェア を調製するのは困難であった。 アルブミン微粒子（2〜10μm）はまた、噴霧乾燥、それに続く100℃または150 ℃での6〜24時間の加熱安定化によっても調製される(Pavanettoら，J．Microenc apsulation，11，445-454)。噴霧乾燥の主要な利点は、アルブミン微粒子が油残 渣または有機溶媒を含まず、そして、このプロセスが連続操作に有用であるとい う点である。 人工補装具に適用すべきタンパク質コーティングの場合にはまた、架橋剤の毒 性の問題および安定性の問題が生じる。特に、生理学的環境においては、コーテ ィングは、望まれない免疫応答または血餅形成へと至りかねない、露出した補装 具の残存領域に施される。 こうして、前記にて概説した種々の不利を有しないタンパク質ミクロスフェア 、フィルムおよびコーティングの調製方法の改良に対する要望が継続して存在す る。本発明者らは、この目的を満たすタンパク質ミクロスフェア、フィルムおよ びコーティングの新しい調製方法を開発し、そしてすべての方法は、水性アルブ ミン 溶液のpHをα−ヒドロキシ酸、例えば乳酸で約4.4〜4.7まで低下させた場合に、 迅速で広範囲のアルブミン沈澱が形成され、この沈澱は異常に安定であるという 簡素な観察に基づいている。同じ効果が、沈澱が起こるpH範囲は変化するにも拘 わらず、他のタンパク質で観察される。 こうして、第１の局面において、本発明は、少なくとも１種のα−ヒドロキシ 酸またはその誘導体もしくはその類似体の水溶液の存在下で、前記タンパク質ミ クロスフェア、フィルムまたはコーティングを調製することを包含する少なくと も１種のタンパク質または改変タンパク質から作製されるミクロスフェア、フィ ルムまたはコーティングを安定化させるプロセスを提供する。 本明細書中において、用語タンパク質はペプチド、ポリペプチド、金属タンパ ク質、糖タンパク質、およびリポタンパク質を包含することを意図し、用語「改 変タンパク質」は、天然では当該タンパク質には結びつかない、それに結合した さらなる分子を有するように改変されたタンパク質をさすことが理解されるべき である。例えば、改変タンパク質は、ポリエチレングリコール、ポリラクチド、 または生体適合性の観点より、ミクロスフェア、フィルム、またはコーティング の表面特性に影響を及ぼし得るその他のポリマーのような別の有機ポリマーにコ ンジュゲートしたタンパク質からなり得る。 本発明のプロセスで使用し得る好ましいタンパク質は、アルブミン、ゼラチン 、ゼイン、カゼイン、コラーゲン、またはフィブリノーゲンである。特に好まし いのはアルブミン、ヒト血清アルブミン、またはオボアルブミンである。 本発明で使用される好ましいα−ヒドロキシ酸はグリコール酸、乳酸、ヒドロ キシ酪酸、またはその２種以上の混合物である。特に好ましいのは乳酸である。 α−ヒドロキシ酸誘導体とは、本発明のプロセスによって作製したミクロスフェ ア、フイルム、またはコーティングの表面特性に有利な影響を及ぼし得る、別の 分子、例えばポリエチレングリコールへのコンジュゲーションによって誘導体化 されたα−ヒドロキシ酸を意味する。 ミクロスフェアを作製するための上記の公知のプロセスは、本発明の安定化方 法と組み合わせて改変され得、新規で且つ改良された方法および生成物を提供す る。 例えば、本発明の１つの実施態様によるミクロスフェアの作製方法は、以下の 工程を包含する： （ａ）少なくとも１種のタンパク質または改変タンパク質の水溶液と、少なく とも１種のα−ヒドロキシ酸またはその類似体もしくは誘導体の水溶液とを混合 する工程、 （ｂ）工程（ａ）で調製された混合物にコアセルベーション剤を添加し、その 結果、該タンパク質または改変タンパク質を取り込むミクロスフェアを形成する 工程、 （ｃ）該コアセルベーション剤を蒸発させる工程、そして、 （ｄ）該水溶液からミクロスフェアを回収する工程。 コアセルベーション剤としては、アセトン、エタノールまたはイソプロパノー ルを使用するのが好ましく、最も好ましくはアセトンである。その添加の結果、 ミクロスフェアの脱溶媒が制御され、これは次いで遠心分離、音波処理、または 濾過によって水溶液から回収し得る。 上記のコアセルベーション方法においては、適切なタンパク質濃度は約0.1〜1 0重量％であり、そしてタンパク質溶液に対するコアセルベーション剤の容量比 は好ましくは約２〜３：１である。 上記のコアセルベーション方法の特別の利点は、所与のミクロスフェアがナノ 粒子、例えば約200nmであることである。それらは従って、注射製剤を作製する のに適する。その調製の間に、例えば薬学的に活性な薬剤、それらがインビボで 検出され得るように、またはバイオイメージング手順によって検出可能な物質を ナノ粒子に含めることが可能である。これは、コアセルベーション剤を添加する 前に、活性な薬剤またはバイオイメージング物質をタンパク質およびα−ヒドロ キシ酸の水性混合物に含めることによって達成される。次いで、このように生成 されたミクロスフェアを薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と混合して、 バイオイメージングに適した薬学的組成物または製剤を作製し得る。前述のよう にアルブミン、特にヒト血清アルブミンが医用適用のミクロスフェアの調製には 、特に好ましく、そして安定化剤としては、乳酸が好ましい。 本発明の別の実施態様に従ったミクロスフェアの作製方法は、 （ａ）少なくとも１種のタンパク質または改変タンパク質の水溶液と、少なく とも１種のα−ヒドロキシ酸またはその類似体もしくは誘導体の水溶液とを混合 する工程、 （ｂ）工程（ａ）で調製された混合物を水に非混和性の油に添加する工程、 （ｃ）工程（ｂ）で調製された混合物を撹拌してミクロスフェアを形成する工 程、そして （ｄ）該ミクロスフェアを水に非混和性の油から回収する工程。 工程（ｃ）におけるミクロスフェアの形成は、もし撹拌が上昇させた温度、例 えば約37〜約50℃で実施されるならば、増強される。好ましくは、工程（ｄ）の 回収前に、工程（ｃ）で調製されたミクロスフェアに溶媒を添加して分散を助け る。 前記乳化方法によって生じたミクロスフェアは通常10〜50μmサイズ範囲であ る。この方法は、ミクロスフェアが、特別の利点である毒性の架橋剤の添加なし に、硬化するのを可能とする。そのタンパク質溶液は好ましくはコアセルベーシ ョン方法よりも高濃度であり、約10〜30重量％が特に適している。好ましくは、 水相に対する油相の容量比は約100．１．である。ミクロスフェア分散を助ける 溶媒としては、アセトンまたは酢酸エチルが使用可能である。特に好ましい水に 非混和性の油は大豆油である。アルブミンは安定化剤としての乳酸と共に好まし いタンパク質である。 コアセルベーション方法に関しては、油との混合の前に、薬学的に活性な薬剤 またはバイオイメージング物質を水相に添加することが可能であり、こうして、 薬学的組成物またはバイオイメージング製剤における使用上適したミクロスフェ アが生じる。 ミクロスフェアの他の公知の用途としては、一般的に、活性な薬剤または検出 可能な薬剤をそれぞれ体内の特定の部位に輸送するのが望まれる薬物標的化およ びインビボ診断が挙げられる。本発明のコアセルベーション方法および乳化方法 の両方によって作製されたミクロスフェアは、適当に負荷したミクロスフェアの 表面に、ヒトまたは動物体内の細胞受容体によって認識される、またはそれに対 して特定の親和性を有する分子を接着させることによって、この様式において使 用され得る。また、抗原性物質をミクロスフェア中に取り込ませて、それらを適 切な薬学的キャリアと混合させ、ワクチンとして使用し得るようにすることも可 能である。 さらに別の局面において、本発明は、タンパク質または改変タンパク質からフ ィルムを作製する方法を提供し、それは以下の特定の工程を包含する： （ａ）前記タンパク質または改変タンパク質の水溶液を約４℃まで冷却する工 程、 （ｂ）工程（ａ）で調製された冷却溶液と、前記α−ヒドロキシ酸またはその 類似体もしくは誘導体の水溶液とを混合する工程、 （ｃ）工程（ｂ）で調製された該溶液を固体表面上の薄層として広げる工程、 そして （ｄ）該薄層を乾燥してフィルムを形成する工程。 好ましくは、乾燥段階は50および70℃の間で実施する。 本発明の方法によって作製されたアルブミンフィルムは、α−ヒドロキシ酸の 非存在下で作製されたフィルムよりも、水への溶解に対して、より非常に耐性で あることが示された。 最後に、さらに別の局面において、本発明は、物品をタンパク質または改変タ ンパク質層でコーティングするプロセスを提供し、それは物品またはその一部を 該タンパク質または改変タンパク質およびα−ヒドロキシ酸を含む水溶液に浸漬 する工程を包含する。 その別法においては、予めタンパク質−コートした物品を単にα−ヒドロキシ 酸溶液に浸漬するのみで得る。 本明細書中に記載したすべての方法の特に好ましい実施態様において、タンパ ク質および／またはα−ヒドロキシ酸は、所与のミクロスフェア、フィルム、ま たはコーティングの表面特性に影響を与えることが知られている別のポリマーを 付着させることによって、改変または誘導体化される。例えば、ポリエチレング リコールは、それらの余分の親水性を引き下げ、そしてそれゆえ網状−内皮細胞 系の細胞によるゼクエストレーションに対して耐性とすることによって、ミクロ スフェアの表面に対して有利な影響を有することが知られている。こうして、本 発明の方法は、ポリエチレングリコールまたは他の適切なポリマー、例えばポリ ラクチドに結合したα−ヒドロキシ酸またはタンパク質を用いて実施され得る。 さて、以下の非限定的実施例を参照して本発明を説明する。実施例１ コアセルベーション方法によるアルブミンナノ粒子の調製 アルブミン水溶液（オボアルブミンまたはヒト血清アルブミン）を２重量％の 濃度で調製し、そして２mlのアルブミン溶液を20μlの乳酸（LA）（式量90.8; 8 5+％水溶液）と混合した。次いで、5.2mlのアセトンを添加し、そしてこの混合 物を磁気スターラーで一晩撹拌してアセトンを蒸発させた。遠心および音波処理 によってナノ粒子を水溶液から回収し、そして次に蒸留水に再懸濁した。 上記のように調製したミクロスフェアのサイズおよびゼータ電位を測定した。 それを以下の表１に示す。 グルタルアルデヒド安定化ナノ粒子に対する、乳酸安定化ナノ粒子のゼータ電 位の顕著な低下は、表面化学における差を示す証拠である。グルタルアルデヒド 安定化ナノ粒子は、先に引用したLinらにおいて記載されたように調製した。 上記のように乳酸で安定化したナノ粒子は、200nmの粒子サイズを有し、この ため、これらは薬学的用途、特に注射製剤に適するようにする。それらは、グル タルアルデヒド架橋を用いて生成されたアルブミンナノ粒子よりも毒性が低いこ とが予期される。 ナノ粒子懸濁液は、室温にて７日間にわたって安定のようである。37℃におけ るオボアルブミン溶液のpHを乳酸で4.4と4.7との間に調整すると、オボアルブミ ン沈澱物が形成される。これらの沈澱物は、室温に72時間暴露すると、２％SDS 溶液による分解(breakdown)に抵抗性になる。この沈澱物の多くの成分が、５％S DSにおける同様の処理に対して耐性のようである。実施例２ 乳化方法によるアルブミンミクロスフェアの調製 界面活性剤として２％のSpan85を含有する大豆油100mlをオーバーヘッド撹拌 機を用い、2000rpmにて氷浴中で撹拌した。20％（w/v）のオボアルブミン（OVA ）水溶液1.0mlを、100μlの乳酸と混合し、そして大豆油に滴下して加え、これ を連続して撹拌した。得られたエマルジョンを10分間撹拌し、そして次に45℃で さらに30分間撹拌した。50mlのアセトンまたは酢酸エチルを（分散助剤として） 添加し、そして硬化したOVAミクロスフェアの懸濁液を10分間音波処理した。OVA ミクロスフェアを遠心分離によって分離し、そしてアセトンまたは酢酸エチルで 洗浄して残存する油を除去した。 レーザー光散乱によるミクロスフェアサイズの測定により、直径は10〜50μm 範囲であり、平均サイズが約25μmであることが明らかとなった。 室温下で蒸留水中で実施した簡易な溶解試験により、乳酸を使用して調製した OVAミクロ粒子は、少なくとも３〜５日間物理的に安定のようであることが明ら かとなった。対照的に、乳酸なしで上記技術を用いて生産したOVAミクロ粒子は1 0分未満のうちに溶解した。実施例３ オボアルブミンフィルムの調製 50μlの乳酸を氷浴中で冷却したオボアルブミンの２％溶液12mlに添加した。 ４mlの混合物を３つの50mlビーカーの各々に添加し、そして60℃および32℃で一 晩、および室温で16時間各々保持して、乾燥したOVAフィルムを得た。 オボアルブミンのフィルムをまた、乳酸の添加なしであることを除いては、先 の方法によって製造した。 溶解実験を、20mlの蒸留水を各ビーカーに添加し、そして室温で経時的に溶液 中の遊離アルブミンの濃度を測定することによって実施した。これは、UV分光光 度計を用い、280nmの溶解媒体の吸光度を測定し、そしてこれを水中のオボアル ブミンの一連の希釈から作成した較正曲線と比較することによって実施した。フ ィルム溶解の割合を時間の関数として表２に示す。 表２に掲げたデータは、乾燥前にOVA溶液に乳酸を添加した場合により大きな フィルム安定性が明白であることを示している。乳酸を含有するOVAフィルムを6 0℃で乾燥した場合には、顕著な改善が得られる。 上記のフィルム形成技術は、透過性を低下させそして、生体適合性を改良する ために、動脈移植片および軟部組織修復のために使用するもののような、医療用 織物をコーティングするのに特に有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 オーハジェン， デレック トーマス アメリカ合衆国 カリフォルニア 94704, バークレー，リージェント ストリート 2621ビー (72)発明者 デイビス， スタンレイ ステュワート イギリス国 エヌジー７ １ビーエイ ノ ッティンガム，ザ パーク， カベンディ ッシュ クレセント ノース 19

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも１種のタンパク質または改変タンパク質から作製されるミクロス フェア、フィルム、またはコーティングを安定化させる方法であり、少なくとも １種のα−ヒドロキシ酸またはその誘導体もしくは類似体の水溶液の存在下で、 該タンパク質ミクロスフェア、フィルム、またはコーティングを調製する工程を 包含する、方法。 ２．前記α−ヒドロキシ酸が、グリコール酸、乳酸、α−ヒドロキシ酪酸、また はそれらの２種以上の混合物である、請求項１に記載の方法。 ３．α−ヒドロキシ酸の前記誘導体が、ポリエチレングリコールに結合したα− ヒドロキシ酸である、請求項１に記載の方法。 ４．前記α−ヒドロキシ酸が乳酸である、請求項２または３に記載の方法。 ５．前記タンパク質がアルブミン、ゼラチン、コラーゲン、ゼイン、カゼイン、 またはフィブノーゲンである、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。 ６．前記タンパク質がヒト血清アルブミンである、請求項５に記載の方法。 ７．前記タンパク質がオボアルブミンである、請求項５に記載の方法。 ８．前記タンパク質がそれに付着した別の有機ポリマーを有することによって改 変される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。 ９．前記請求項のいずれか１項に記載の方法であり、以下の具体的な工程： （ａ）少なくとも１種のタンパク質または改変タンパク質の水溶液と、少なく とも１種のα−ヒドロキシ酸またはその類似体もしくは誘導体の水溶液とを混合 する工程、 （ｂ）工程（ａ）で調製された混合物に、コアセルベーション剤を添加して、 その結果、該タンパク質または改変タンパク質を取り込むミクロスフェアを形成 させる工程、 （ｃ）該コアセルベーション剤を蒸発させる工程、および （ｄ）該水溶液から該ミクロスフェアを回収する工程、 を包含する、方法。 １０．前記コアセルベーション剤がアセトン、エタノール、およびイソプロパノ ールから選択される、請求項９に記載の方法。 １１．前記コアセルベーション剤の添加前に、薬学的に活性な薬剤を工程（ａ） で調製された前記混合物に添加する、請求項９または請求項１０に記載の方法。 １２．前記コアセルベーション剤の添加前に、バイオイメージング手順により検 出可能な物質を、工程（ａ）で調製された混合物に添加する、請求項９または10 に記載の方法。 １３．請求項１から８のいずれか１項に記載の方法であり、以下の具体的な工程 ： （ａ）少なくとも１種のタンパク質または改変タンパク質の水溶液と、少なく とも１種のα−ヒドロキシ酸またはその類似体もしくは誘導体の水溶液とを混合 する工程、 （ｂ）工程（ａ）で調製された混合物を水に非混和性の油に添加する工程、 （ｃ）工程（ｂ）で調製された混合物を撹拌して、ミクロスフェアを形成する 工程、 （ｄ）該ミクロスフェアを該水に非混和性の油から回収する工程、 を包含する、方法。 １４．前記水に非混和性の油からの回収前に、工程（ｃ）で調製されたミクロス フェアに、溶媒を添加して分散を助ける、請求項１３に記載の方法。 １５．分散を助けるために添加する溶媒が、アセトンまたは酢酸エチルである、 請求項１４に記載の方法。 １６．前記水に非混和性の油からの回収前に、ミクロスフェアを音波処理する、 請求項１３から１５のいずれか１項に記載の方法。 １７．薬学的に活性な薬剤を、前記水に非混和性の油との混合前に、工程（ａ） で調製された混合物に添加する、請求項１３から１６のいずれか１項に記載の方 法。 １８．バイオイメージング手順によって検出可能な物質を、前記水に非混和性の 油との混合前に、工程（ａ）で調製された混合物に添加する、請求項１３から１ ６のいずれか１項に記載の方法。 １９．請求項９から１８のいずれか１項に記載の方法であって、形成されたミク ロスフェアの表面に、ヒトまたは動物体内の細胞性の受容体によって認識され、 および該受容体に対して親和性を有する分子を付着させるさらなる工程を包含す る、方法。 ２０．請求項９から１８いずれか１項に記載の方法であり、形成されたミクロス フェアの表面に、抗原性物質を付着させるさらなる工程を包含する、方法。 ２１．請求項９から２０のいずれか１項に記載の方法によって調製された、ミク ロスフェア。 ２２．請求項１１または請求項１７の方法によって調製される複数のミクロスフ ェア、および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含有する、薬学的組成 物。 ２３．請求項１９の方法によって調製される複数のミクロスフェア、および薬学 的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含有する、ワクチン。 ２４．請求項１２または請求項１８の方法によって調製された複数のミクロスフ ェア、および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含有する、バイオイメ ージング製剤。 ２５．請求項１から８のいずれか１項に記載の方法であり、以下の具体的な工程 ： （ａ）前記タンパク質または改変タンパク質の水溶液を約４℃まで冷却する工 程、 （ｂ）工程（ａ）で調製された該冷却溶液と、前記α−ヒドロキシ酸またはそ の類似体もしくは誘導体の水溶液とを混合する工程、 （ｃ）工程（ｂ）で調製された該溶液を、固体表面上に薄層として広げる工程 、および （ｄ）該薄層を乾燥してフィルムを形成する工程、 を包含する、方法。 ２６．前記溶液層を50℃と70℃との間で乾燥する、請求項２５に記載の方法。 ２７．請求項２５または２６の方法によって形成されるフィルム。 ２８．タンパク質または改変タンパク質層で物品をコーティングする方法であり 、該物品またはその一部を該タンパク質または改変タンパク質およびα−ヒドロ キシ酸またはその類似体もしくは誘導体を含む水溶液に浸漬する工程を包含する 、方法。 ２９．コートされた物品を、タンパク質または改変タンパク質を処理する方法で あり、該物品またはその一部をα−ヒドロキシ酸またはその類似体もしくは誘導 体を含む水溶液に浸漬する工程を包含する、方法。 ３０．請求項２から８いずれか１項の特徴を有する、請求項２７に記載の方法。 ３１．請求項１に記載の方法であり、そして実質的に添付の実施例を参照して、 本明細書中に記載されている方法。 ３２．請求項２０に記載の方法であり、そして実質的に実施例１および２を参照 して、本明細書中に記載されているミクロスフェア。 ３３．請求項２７に記載のフィルムであり、そして実質的に実施例３を参照して 、本明細書中に記載されているフィルム。