JPH10507625A

JPH10507625A - 宿主細胞における蛋白産生の改良

Info

Publication number: JPH10507625A
Application number: JP8508356A
Authority: JP
Inventors: ミルランド，ジュリー; ラブランド，ブルース; クリスチャンセン，デール; エフ．シー．マッケンジー，イーアン
Original assignee: ジオースティンリサーチインスティテュート
Priority date: 1994-08-30
Filing date: 1995-08-30
Publication date: 1998-07-28
Also published as: CA2198345A1; ATE233321T1; AUPM772494A0; NZ291735A; EP0770137B1; US6130062A; DE69529750D1; EP0770137A4; WO1996006937A1; EP0770137A1

Abstract

(57)【要約】蛋白をコードする核酸がエクソンにＡおよび／またはＴ富裕領域を有する場合に宿主細胞で該蛋白産生を増加させる方法。該方法は、Ａおよび／またはＴ富裕領域の量を低下させ、さらに該改変核酸を宿主細胞にトランスフェクションさせて該核酸の発現を得ることを含む。本発明はまた、該リコンビナント核酸構築物、精製蛋白調製物および製造された医薬組成物の他、該精製蛋白調製物を利用する治療方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】宿主細胞における蛋白産生の改良発明の分野本発明は、一般に宿主細胞における蛋白の改良された産生に関する。特に、本発明は、治療または試薬に利用するために必要でありながら、十分な量を得ることが困難である蛋白の改良された産生に関する。本発明はまた、当該蛋白をコードする組換え体（リコンビナント）核酸分子を製造する方法、該リコンビナント核酸分子およびそれを含むリコンビナント構築物、並びにそれによって製造される蛋白に関する。特に重要なものは、ホルモン、サイトカイン、成長因子、レセプターおよびそのリガンド、並びに補体調節蛋白を含む細胞表面蛋白をコードする核酸分子である。発明の背景有用な蛋白をコードする多くの遺伝子およびｃＤＮＡが分離されたが、研究者が直面している主要な問題は、一層の研究のためおよび診断または治療的利用のために十分量のリコンビナント蛋白を製造することである。このことは、該蛋白の産業的生産が必要とされる場合に特に言えることである。特に、ホルモン、サイトカイン、成長因子、レセプターとそのリガンドおよび組み換え手段による他の蛋白の製造が試みの中心となっている。例を挙げれば、細胞表面分子、ＣＤ４６（膜補助因子またはＭＣＰとしても知られている）は、真核細胞宿主では種々の発現ベクターを用いる他のｃＤＮＡ構築物の場合と同様に発現されなかった。同様な懸念がＣＤ５５（ＤＡＦ）およびＣＤ３５（ＣＲ１）並びにＨ因子について生じたが、これらは、ＣＤ４６と同様に補体活性化調節物質(Regulators of Complement Activa tion(ＲＣＡ))と呼ばれる種類の蛋白に属する。補体活性化調節物質は補体カスケードの増幅を制御する。この種類に属するものは各々構造的な特徴、主に〜６０−６５アミノ酸の小コンセンサスリピート（ＳＣＲ）モジュールを共有するが、これは、補体結合と調節機能を担当する。この種類に属するものをコードする遺伝子は染色体１ｑ３．２と連動し、この染色体にマッピングされている。これら分子は炎症および恒常性について生物学的に重要である。しかしながら、これらの分子は、人間への移植のためにブタおよび他の器官の使用の可能性について現時点でまた別の利用性を有する。そのような外来性器官は抗体および補体仲介過敏性拒絶反応を受ける。ＣＤ４６および他のＲＣＡに関する研究の限界は、一時的または安定系のいずれかでリコンビナント蛋白をコードする構築物をトランスフェクション（transf ection）させた際、極めて僅かな細胞しかトランスフェクションされず、しかもそれらは僅かな蛋白しか発現しないということであった。実際、本発明者らおよび他の研究室では、巧妙な細胞の分類、クローニングおよび選別工程が適切な細胞を分離するために必要であった。このことは、特にリコンビナントＣＤ４６の分析、その生理学的役割および治療剤としての価値に関して問題をもたらした。本発明につながる研究で、驚くべきことに本発明者らは、ＣＤ４６をコードする核酸の改変はトランスフェクションさせた真核細胞宿主で高レベルのＣＤ４６の産生をもたらすことを見出した。ＣＤ４６の野性型遺伝子から得られる場合の８倍に及ぶ蛋白産生が認められた。これらの改変は、核酸のアデニン（Ａ）および／またはチミン（Ｔ）富裕領域におけるＡおよび／またはＴの量もしくは割合の減少を含む。本発明者らは、エクソンのＡＴ富裕領域における改変は蛋白産生の増加をもたらすことを発見した最初の者である。発明の要旨本発明は、宿主細胞での蛋白産生を増加または改良する方法を提供する。この場合、該蛋白をコードする核酸はエクソンに存在するＡおよび／またはＴ富裕領域を有し、当該方法は、当該領域のＡおよび／またはＴ量を減少もしくは低下させることによって核酸を変化させ、さらに当該核酸を宿主細胞にトランスフェクションさせ、適切な条件下で当該核酸を発現させることを含む。本発明の別の特徴は、宿主細胞のＲＣＡ蛋白の産生を増強させる方法を提供することであるが、この場合、ＲＣＡをコードする核酸はそのエクソンの１つまたは２つ以上に存在するＡおよび／またはＴ富裕領域をもち、本方法は、当該Ａおよび／またはＴ富裕領域のＡおよび／またはＴ量を低下させることによって核酸を変化させ、当該核酸を宿主細胞にトランスフェクションさせ、さらに適切な条件下で当該核酸を発現させることを含む。本発明のまた別の特徴は宿主細胞でのＲＣＡ蛋白の産生を増加させる方法に関し、これは、ＡＴ富裕領域を含むＳＣＲモジュールまたはその部分を欠失させることによってＲＣＡをコードする核酸を変化させ、当該改変核酸を宿主細胞にトランスフェクションさせ、さらに適切な条件下で当該核酸を発現させることを含む。本発明はまた宿主細胞で蛋白の産生を高めることができるリコンビナント核酸構築物に関する。この場合、該蛋白をコードする核酸内のエクソンの１つまたは２つ以上に存在する１つまたは２つ以上のＡおよび／またはＴ富裕領域のＡおよび／またはＴ量が減少させられる。本発明はまた、本発明の方法によって製造された蛋白、本発明の構築物によってコードされた蛋白、医薬組成物、該構築物をトランスフェクションさせた宿主細胞、および該蛋白を発現する遺伝子導入（transgenic）動物に関する。本発明はまた蛋白をコードする変異遺伝子の製造方法に関する。この場合、当該変異遺伝子は該蛋白の産生を高めることができ、当該方法は、Ａおよび／またはＴ富裕領域のＡおよび／またはＴ量を減少もしくは低下させることによって、１つまたは２つ以上のエクソンに存在する１つまたは２つ以上の当該領域について遺伝子を変異させることを含む。図面の簡単な説明図１：変異ＳＣＲ２およびＳＣＲ３領域のＣＤ４６構築物の配列。該配列の番号付与はｃＤＮＡクローンｐｍ５．１(Purcellら、1991)を基にし、ヌクレオチド３０３(nt303)の末端からＳＣＲ３(nt564)の開始点へと伸長する。ＳＣＲ結合部は示されている。構築物ｗｔＳＣＲ（ｐｍ５．１に匹敵）の完全な配列は、対応する一文字記号のアミノ酸配列によってその上に示されている。構築物のいずれかの置換されたヌクレオチドには下線を付してある。ｓｕｂＳＣＲ２、ｓｕｂＳＣＲ３およびｓｕｂＳＣＲ２＋３構築物については、ｗｔＳＣＲと一致する配列はドット（．）で示され、置換されたヌクレオチドは表示されている。欠失変異体構築物は、ＳＣＲ２欠失は空白で表示されているという点を除き他の構築物の場合と同様である。図２：野性型および変異体構築物による一時的トランスフェクション後のＣＯＳ細胞のフローサイトメトリー。フローサイトメトリーは材料と方法の項で述べるように実施した。全ての細胞はＣＤ４６ｍＡｂＥ４．３で染色した。パネルＡは擬似トランスフェクションさせたＣＯＳ細胞を示す。パネルＢはｓｕｂＳＣＲ２トランスフェクション細胞（―）を上に重ねたｗｔＳＣＲトランスフェクション細胞（----）についての像を示し、パネルＣはｓｕｂＳＣＲ３（―）を上に重ねたｗｔＳＣＲ（----）を示し、パネルＤはｓｕｂＳＣＲ２＋３（―）を上に重ねたｗｔＳＣＲ（----）を示し、パネルＥはｄｅｌＳＣＲ２／ｓｕｂＳＣＲ３（ ―）を上に重ねたｗｔＳＣＲ（----）を示す。変異構築物は各々の事例において右に移動した像を出現させた。図３：ＣＤ４６構築物（材料と方法の項参照）でトランスフェクションさせたＣＯＳ細胞溶解物のウェスタンブロット分析。レーンは５×１０⁶／ｍｌの希釈の細胞溶解物４０μｌを含む。レーンの左から右の順で、トランスフェクション体ＷＯＰ−５．１０Ｌ（ＣＤ４６ＢＣ２）（１／５希釈）；ＤＮＡの非存在下でトランスフェクションさせたＣＯＳ細胞の溶解物の１／１０希釈および１／５０希釈；ｗｔＳＣＲ２でトランスフェクションさせたＣＯＳ細胞溶解物の１／１０希釈および１／５０希釈；ｓｕｂＳＣＲ２でトランスフェクションさせたＣＯＳ細胞溶解物の１／１０希釈および１／５０希釈；ｓｕｂＳＣＲ３でトランスフェクションさせたＣＯＳ細胞溶解物の１／１０希釈および１／５０希釈；並びにｓｕｂＳＣＲ２＋３でトランスフェクションさせたＣＯＳ細胞溶解物の１／１０希釈および１／５０希釈。分子量マーカーは表示されている。図４：ＣＯＳ細胞溶解物の準定量放射性免疫アッセー（材料と方法を参照）。同等数のトランスフェクションされた細胞を各サンプルについて用いた。標準誤差とともに結合平均カウント数（二組）を希釈因子に対して示す。滴定曲線は、擬似（■）、ｗｔＳＣＲ（□）およびｓｕｂＳＣＲ２＋３（●）トランスフェクションされた細胞の溶解物についてである。図５：ＣＤ４６構築物でトランスフェクション後１６８時間のＣＯＳ細胞の無血清上清のウェスタンブロット分析（材料と方法を参照）。レーンは４０μｌの未希釈上清を含む。左から右へ順に、細胞表面構築物ｓｕｂＳＣＲ２＋３、可溶性構築物ｓｏｌ−ｗｔＳＣＲ、ブランク、可溶性構築物ｓｏｌ−ｓｕｂＳＣＲ３およびＤＮＡ無し（擬似トランスフェクション）でトランスフェクションさせた細胞の上清を含む。分子量マーカーは表示されている。図６：ＣＯＳ細胞上清の準定量放射性免疫アッセー（材料と方法を参照）。各サンプルについて同等量の組織培養上清を用いた。結合平均カウント数（二組）を希釈因子に対して示す。滴定曲線は、擬似（■）、ｓｏｌ−ｗｔＳＣＲ（□）およびｓｏｌ−ｓｕｂＳＣＲ３（●）トランスフェクション細胞の上清についてである。図７：トランスフェクションＣＯＳ細胞のＣＤ４６ｍＲＮＡのノザンブロット分析。トランスフェクション後４８時間のＣＯＳ細胞から調製した全ＲＮＡを電気泳動で分離した（１０μｇ／トラック）。ノザンブロットの方法は材料と方法の項で述べるとおりである。２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡバンドの位置は表示されている。レーン１−５は、ＤＮＡ無し、ｗｔＳＣＲ、ｓｕｂＳＣＲ２、ｓｕｂＳＣＲ３およびｓｕｂＳＣＲ２＋３でトランスフェクションさせたＣＯＳ細胞から調製したＲＮＡをそれぞれ含んでいる。図８：トランスフェクションさせたＣＯＳ細胞のＣＤ４６ｍＲＮＡのサザンブロット。トランスフェクションさせた後４８時間のＣＯＳ細胞から調製したＤＮＡを電気泳動（５μｇ／トラック）で分離した。サザンブロットの方法は材料と方法で述べるとおりでる。レーン１−５は、ＤＮＡ無し、ｗｔＳＣＲ、ｓｕｂＳＣＲ２、ｓｕｂＳＣＲ３およびｓｕｂＳＣＲ２＋３でトランスフェクションさせたＣＯＳ細胞から調製したＲＮＡをそれぞれ含んでいる。図９：野性型および変異体構築物で安定的にトランスフェクションさせた後のＣＨＯ細胞のフローサイトメトリー。フローサイトメトリーは、材料と方法の項で述べる通りである。全ての細胞をＣＤ４６ｍＡｂＥ４．３で染色した。パネルＡはｐｇｋ−ｎｅｏトランスフェクションＣＨＯ細胞を示す。パネルＢは、ｓｕｂＳＣＲ２トランスフェクション細胞（―）を上に重ねたｗｔＳＣＲトランスフェクション細胞（----）についての像を示し、パネルＣはｓｕｂＳＣＲ３（―）を上に重ねたｗｔＳＣＲ（----）を示し、パネルＤはｓｕｂＳＣＲ２＋３（―）を上に重ねたｗｔＳＣＲ（----）を示す。図１０：合成ＣＤ４６転写物のインビトロ翻訳。レーンは、表示したキャップ付加ｍＲＮＡの３５Ｓメチオニン標識インビトロ翻訳生成物を含む。矢印は予想される非グリコシル化蛋白サイズを示し、分子量マーカーは表示されている。図１１：ＣＨＯ−Ｋ１細胞溶解物の準定量放射性免疫アッセー（材料と方法を参照）。同等数のトランスフェクション細胞を各サンプルにつき用いた。標準誤差とともに結合平均カウント数（二組）を希釈因子に対して示す。滴定曲線は、擬似（■）、可溶性ｗｔＳｃＲ（□）および可溶性ｓｕｂＳＣＲ３（●）トランスフェクション細胞についてである。配列リストの要約配列番号１アミノ酸翻訳を示すｗｔＳＣＲのＣＤＮＡ配列配列番号２アミノ酸翻訳を示すｓｕｂＳＣＲ２のｃＤＮＡ配列配列番号３アミノ酸翻訳を示すｓｕｂＳＣＲ３のｃＤＮＡ配列配列番号４アミノ酸翻訳を示すｓｕｂＳＣＲ２＋３のｃＤＮＡ配列配列番号５アミノ酸翻訳を示すｄｅｌＳＣＲ２ｓｕｂＳＣＲ３のｃＤＮＡ配列好ましい実施例の詳細な説明本発明の第一の特徴は宿主細胞における蛋白産生の増加または改良の方法を提供することである。この場合、該蛋白をコードする核酸はエクソンに存在するＡおよびＴ富裕領域を有し、当該方法は、当該領域のＡおよび／またはＴの量を減少もしくは低下させることによって該核酸を変化させ、宿主細胞を当該核酸でトランスフェクションさせ、さらに適切な条件下で当該核酸を発現させることを含む。 “蛋白産生を増加または改善する”という語句は、宿主細胞で日常的に発現されるよりも多く所望蛋白の産生をもたらすことを指し、蛋白産生の強化を含む。本発明の方法は、蛋白産生レベルが至適なものより低い場合にはるかに高い蛋白産生レベルを提供することを特に目的とするが、このような状況に限定されるものではない。 “宿主細胞”とは、該蛋白をコードする核酸を発現することができるいずれの細胞も意味する。原核細胞および真核細胞の両方が含まれる。 “蛋白をコードする核酸”とはＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸を意味し、イントロンおよびエクソン並びにｃＤＮＡ分子を含む遺伝子を包含する。この用語はまた、合成プリンおよびピリミジン塩基を含むかまたはそれらで構成される核酸を含む。 “Ａおよび／またはＴ富裕領域”という語句は、平均量よりも多いＡおよび／またはＴを含む一続きのヌクレオチドを指し、また別には“ＡＴ富裕領域”とも呼ばれる。これは、その核酸が由来する特定の種の平均より多いＡＴ含有量をもつ一続きのヌクレオチドを意味する。例えば、ヒトの蛋白をコードする核酸のＡＴ富裕領域は、特定の区間のヌクレオチド配列で６０％より多いＡおよび／またはＴを含む領域であろう。ＡＴ富裕領域という用語は、核酸がＲＮＡの場合にはＡＵ富裕領域を含み、さらに“Ａおよび／またはＴ”はまたＲＮＡの場合には“ Ａおよび／またはＵ”を含むことは理解されよう。 “エクソン”という用語は実際に蛋白をコードする核酸部分を意味する。 “当該領域でＡおよび／またはＴの量を減少させまたは低下させることによって核酸を変化させる”という語句は、ＡＴ富裕領域のＡおよび／またはＴヌクレオチドを他の塩基（例えばＧもしくはＣまたは合成ヌクレオチド）によって置換すること、またはこれらのヌクレオチドを別の塩基で置換しないで欠失させることを意味する。通常そのような欠失は“枠内（インフレーム）”欠失であり、したがって読み枠移動（フレームシフト）を生じない。Ａおよび／またはＴ量の減少もしくは低下は、Ｇおよび／またはＣヌクレオチドに対してＡおよび／またはＴの比率を低下させることも含む。“変異”という用語はまた本明細書を通してそのような変化を指すために用いられる。ヌクレオチドが他の塩基によって置換される場合、該コドンが同じアミノ酸をコードすることができるように生じた変化は非表現型(silent)である。非表現型変異(silent mutation)は当業者には周知で、最も一般的にはコドンの第三のヌクレオチドの改変を伴う。また別にこの置換は保存的、すなわち、具体的な本来のアミノ酸と同様な特性を有するアミノ酸に特異的なコドンをもたらす。適切な保存的アミノ酸置換は下記の表Ａに示される。どの塩基が保存的アミノ酸置換を付与する置換かを当業者は知りえるであろう。典型的置換は表Ａにしたがって実施される置換である。また別に、完全に異なるコドンを、所望される蛋白に応じてＡもしくはＴ以外のヌクレオチドの挿入によって作出することができる。 “トランスフェクション”という用語は、核酸を細胞に取り込ませることを意味する。核酸は通常は発現ベクターなどの成分として存在する。結果として生じるトランスフェクションは、一時的なもの（この場合遺伝子はエピゾーム上に存在する）であっても安定的なものであってもよい。安定なトランスフェクションは、遺伝子が細胞ゲノムに組み込まれ安定的な遺伝が可能になる場合に達成される。核酸はまた、宿主細胞に、例えばリコンビナントワクシニアもしくはアデノウイルスの感染によってウイルスベクターを介して導入することができる。本発明の方法は、そのエクソン内にＡＴ富裕領域をもつ核酸によってコードされる全ての蛋白の産生を高めることを包含するが、この場合該蛋白は真核細胞系で産生されることが所望される。候補蛋白をコードする核酸は、例えばジェンバンク(GenBank)データベースのサーチのような標準的な手法によってそのエクソン内のＡＴ富裕領域についてスクリーニングすることができる。これらの核酸には、細胞表面蛋白、ペプチドホルモン、サイトカイン、成長因子、レセプターとそのリガンド、蛋白の産生を高めることが所望される治療的用途もしくは試薬としての新規なリコンビナント蛋白をコードする核酸が含まれる。補体調節蛋白、特に小コンセンサスリピートドメインを含む蛋白（例えばＣＤ４６）が特に重要である。本方法で用いられる原核細胞は、所望の遺伝子を発現するに適した何れの原核細胞でもよい。これには、大腸菌(例えば、Escherichia coli MC1061, E ．coli DH5α，E. coli NM522，EK12 およびE ．coli W3110)、桿菌（例えば、Bacillus subtilis または他の腸内細菌（例えば、Salmonella typhimuriumまたはSerratia marcesans および種々のPseudomonas種）が含まれる。好ましくは、これらの微生物の非病原性、弱毒株が用いられる。本方法で用いられる真核細胞は、所望の遺伝子の発現に適したいずれの真核細胞でも可能である。当業者に周知の適切な細胞は、COS-7，CHO-K1，WOP-3027，C 127，VERO， HeLa，W138，BHK，293，MDCKおよびL929のような動物細胞を含む。他のもの、例えばSaccharomyces ，Kluyveromyces，Pichia pastoris ，Schwanniomyces およびHansenula もまた適切である。宿主細胞に核酸を導入するために用いられる適切なベクターは当業者には周知である。適切な原核細胞ベクターには、ｐＧＥＸ、ｐＫＣ３０、ｐＫＫ１７３− ３、ｐＥＴ−３および他のものが含まれる。これらのベクターは好ましくは、上記のような選択宿主細胞に適合するレプリコンおよび制御配列を含む。例えば、哺乳類細胞では、真核細胞での発現に対する制御機能は、通常ウイルス源（例えばアデノウイルス２、ポリオーマ、ＨＩＶ−１、ヒトサイトメガロウイルスおよびＳＶ４０）によってもたらされる。 “適切な条件下で”という語句は、核酸の発現および蛋白の産生を得るために適切な条件を意味する。培養条件、例えば栄養物、温度などは当業者には周知であろう。エクソンに存在するＡＴ富裕領域のＡおよび／またはＴ含有量を低下させることにより提供される蛋白産生レベルの増加の機構について多くの説明が存在するようである。そのような説明には、転写の安定性の改善、ｍＲＮＡの細胞質への移送の増加、リボソームによる翻訳効率の改善、ｍＲＮＡの上部構造による翻訳の増加または実際にはこれら要素の２つもしくはそれ以上の組合せが含まれる。一般的に、蛋白産生の増加は蛋白翻訳速度の増加によって説明できるというのが妥当なようである。蛋白産生の増加は無傷の細胞に限られ、無細胞翻訳系では明らかではないということを示唆するデータによって、この作用は、基質利用性や単純な構造的影響や蛋白翻訳成分の単純な相互作用ではなく、むしろｍＲＮＡ、転写物、リボソーム、ポリゾーム、ＲＮＡ結合蛋白および／または他の因子（例えば配列依存性三次元ｍＲＮＡ構造）間の相互作用に起因するものであることが示唆される。本発明に付随する蛋白産生の改良の要因となる正確な機構についてなおいくつかの推測が存在する一方、細胞表面分子の発現については２０倍またはそれを越える蛋白産生の増加を得ることができる。特にＣＤ４６の翻訳の場合、Ａおよび／またはＴ含有量における減少が開始コドンから約５４０塩基までの領域内で発生するときにこの蛋白産生の増加がもっとも著しいようである。好ましい具体例では、本方法で用いられる宿主細胞は真核細胞である。これは、リコンビナント蛋白の翻訳後修飾（例えばグリコシル化、これは原核細胞宿主または幾つかの昆虫細胞では必ずしも起こらないが。）を得ることがしばしば望ましいことによる。別の好ましい具体例では、核酸はそのエクソンの１つまたは２つ以上にＡおよび／またはＴ富裕領域を有するＲＣＡをコードする。ＲＣＡは、とりわけＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ３５またはＨ因子であろう。特に好ましい具体例では、本発明は、真核細胞でのＣＤ４６の産生の増加または改善方法に関するが、ここでは、ＣＤ４６をコードする遺伝子を、当該遺伝子の１つもしくは２つ以上のエクソン内のＡおよびＴ富裕領域のＡおよび／またはＴ量を減少または低下させることによって変化させ、当該改変遺伝子を真核細胞にトランスフェクションさせ、さらに適切な条件下で当該遺伝子を発現させる。本明細書で用いる“ＣＤ４６”という用語は全ての天然のアイソフォームおよびリコンビナント短縮（スプライス）変形体（ヒト細胞では通常発現されない天然形を含む）を指す。天然形であれリコンビナントであれ、いずれのＣＤ４６遺伝子も改変ＣＤ４６遺伝子の合成用出発点として用いることができる。これには天然のＣＤ４６遺伝子およびＰＣＴ／ＡＵ９１／００１９９（この文献は参照により本明細書に含まれる）に開示されたＣＤ４６構築物が含まれる。定義によりエクソンを含むｃＤＮＡＣＤ４６構築物が好ましい。本明細書の実施例ではＰＣＴ／ＡＵ９１／００１９９のクローンｐｍ５．１が出発点として用いられる。本発明の特に好ましい特徴として、当該改変は、小コンセンサスリピート（ＳＣＲ）ドメインまたは仮定的ポリアデニル化シグナルをコードするＡＴ富裕領域に対して行われる。このことは、仮定的ポリアデニル化シグナルが蛋白コードエクソン内に不適切に生じる場合に特に言えることである。より好ましいものは、ＣＤ４６ｃＤＮＡ構築物の第３および第４エクソン周辺の境界または結合部に対する改変である。この第３および第４エクソンはＳＣＲの１つをコードし、その７８％がＡまたはＴである一続きの４９ヌクレオチドを含み、これを改変することができる。さらに、隣接するエクソン５内のより小さなＡ富裕領域に対する改変もまた別個に、または上記の改変と合わせて実施することができる。これまで述べてきた当該改変の標的はエクソン３、４および５はではあったが、ＣＤ４６遺伝子の他の領域、例えばエクソン６および１４も意図している。改変は、ＡまたはＴヌクレオチドを他の塩基で置換するか、または上記のように他の塩基で置換しないでＡまたはＴヌクレオチドを欠失させることによって達成することができる。置換は必要とされる蛋白の構造によって左右され、非表現型または保存的であろう。さらにより好ましくは、図１のヌクレオチド４０６から４５４の間の領域のＡＴ含有量は７８％から約６０％、より好ましくは約５５％に減少する。また別により好ましくは、ＳＣＲ３のＡ富裕領域が減少させられるが、これは野性型ＣＤ４６遺伝子上の仮定的ポリＡシグナルを遮断させる。そして置換ヌクレオチドはＳＣＲ２をコードする領域の末端に５’を伸長させる。また別により好ましくは、ＳＣＲ２が欠失し、場合によってＳＣＲ３に置換が存在する。上記の改変に加え、ＣＤ４６蛋白を可溶性にする変異が行われる。好ましくは、終止コドンは、ＡをＧに変えることによって例えばｐｍ５．１（Purcellら(19 91)）の１０２２位に作出される。さらに好ましい形として、本発明は、図１に示すようにｓｕｂＳＣＲ２、ｓｕｂＳＣＲ３、ｓｕｂＳＣＲ２／３およびｄｅｌＳＣＲ２／ｓｕｂＳＣＲ３の構築物を用いる方法に関する。説明のために、エクソン３および４に置換を含む構築物はｓｕｂＳＣＲ２と表示され、エクソン５の置換はｓｕｂＳＣＲ３と表示され、エクソン３、４および５の置換はｓｕｂＳＣＲ２＋３と表示される。ＳＣＲ２の欠失を含み且つＳＣＲ３に置換を含む構築物はｄｅｌＳＣＲ２／ｓｕｂＳＣＲ３と称する。ＡまたはＴヌクレオチドの置換を所望する場合は、スプライスオーバラップ伸長（splice overlap extension）ＰＣＲ(SOE-PCR)を用いることができる。他の方法、例えばＰＣＲ利用突然変異誘発および適切に変異させた合成ヌクレオチドの連結(ligation)は当業者には周知である。ＡまたはＴヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの伸長は、標準的な位置特異的変異誘導技術によって実施できる。好ましくは、改変ＣＤ４６ｃＤＮＡを含む最初の構築物は細菌ベクターで作られる。一旦、所望の構築物が得られたことが確認されたら、続いてこの改変ＣＤ４６遺伝子を真核細胞ベクター（例えばｐｃＤＮＡ１、ｐＣＤＭ８、ＰＧＫ−ｎｅｏ、ｐＥＥ６．ｈＣＭＶ．ＧＳ、ｐＨＩＶ、ｐＨＭＧ、ｐＭＪ６０１、その他）に連結することができる。さらに、改変遺伝子を含む所望の構築物を用いて適切な宿主細胞にトランスフェクションさせる。好ましくはこれは真核宿主細胞である。標準的なトランスフェクション手法がリポフェクタミン(Gibco-BRL製、ガイザースバーグ、USA)または同様な試薬を用いて行われる。好ましくは、ＣＯＳ−７またはＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションさせることができるが、他の真核細胞（例えばＷＰＯ −３０２７、Ｌ９２９など）を用いてもよい。本発明の関連する特徴として、宿主細胞でのＲＣＡ蛋白の産生を強化する方法が提供される。ここで、ＲＣＡをコードする核酸はそのＳＣＲモジュールの１つまたは２つ以上に存在するＡおよび／またはＴ富裕領域を有し、当該方法は、当該Ａおよび／またはＴ富裕領域のＡまたはＴ量を低下させることによって該核酸を改変し、当該核酸を宿主細胞にトランスフェクションさせ、適切な条件下で当該核酸を発現させることを含む。 “Ａおよび／またはＴ富裕領域”および“Ａおよび／またはＴ量を低下させる ”という語句は上記と同じ意味を有する。好ましくは、上記に述べたような方法の場合は真核宿主細胞が用いられる。より好ましくはＳＣＲ２およびＳＣＲ３のＡＴ富裕領域が改変に付される。上記の方法は、ＣＤ４６のＳＣＲ２およびＳＣＲ３モジュールをコードするヌクレオチドにおける改変は、産生される蛋白量を強力に増加させる付加的効果をもたらすという観察に基づいている。好ましくはこの核酸はＣＤ４６をコードする。好ましくは該改変は非表現型ヌクレオチド置換によって得られる。より好ましくは、該核酸は本明細書で開示する構築物ｓｕｂＳＣＲ２＋３である。第二の特徴として、本発明は宿主細胞でのＲＣＡ蛋白の産生を高める方法に関し、当該方法は、ＡＴ富裕領域を含む１つまたは２つ以上のＳＣＲモジュール、またはその部分を欠失させることによってＲＣＡをコードする核酸を改変し、当該改変核酸を宿主細胞にトランスフェクションさせ、さらに適切な条件下で当該核酸の発現を得ることを含む。好ましくは、例えば上記で述べたような真核宿主細胞が当該方法で用いられる。場合によって、上記の方法で該核酸のＳＣＲモジュールの外のＡＴ富裕領域を含む他の部分もまた、ＡＴ富裕領域のＡおよび／またはＴ量を例えば減少させることによって改変させることができる。好ましくは、該改変核酸はＣＤ４６アイソフォームをコードする。より好ましくは、ＣＤ４６をコードする該核酸は本明細書に開示するｄｅｌＳＣＲ２／ｓｕｂＳＣＲ３である。第三の特徴として、本発明はまた、宿主細胞で蛋白の産生を高めることができるリコンビナント核酸構築物に関し、この場合、エクソンの１つまたは２つ以上に存在するＡおよび／またはＴ富裕領域におけるＡおよび／またはＴ量が減少させられる。 “リコンビナント核酸構築物”という用語は、異なる起源から一緒に結合させた核酸から作製され、宿主細胞にトランスフェクションさせることができる分子を指す。 “産生が高められ”という語句は以前の構築物（問題の蛋白をコードする天然の遺伝子を含む構築物を含む）で発現されるよりも高レベルの発現を意味する。 “Ａおよび／またはＴ富裕領域”、“エクソン”、“宿主細胞”および“Ａおよび／またはＴ富裕領域のＡおよび／またはＴ量の減少”という語句はこれまでに述べたものと同じ意味を有する。そのような構築物は先に述べた方法で作出される。好ましくは宿主細胞は真核宿主細胞である。好ましくは該構築物は蛋白をコードする核酸を含み、天然の状態の当該遺伝子はそのエクソンにＡおよび／またはＴ富裕領域を含む。該核酸は蛋白、例えば細胞表面蛋白、ペプチドホルモン、成長因子、レセプターとそのリガンド、治療的用途もしくは試薬のための新規なリコンビナント蛋白をコードするものでもよい。補体調節蛋白、特に小コンセンサスリピートドメインを含むものが含まれる。本発明の特に好ましい特徴として、該構築物は改変ＣＤ４６ｃＤＮＡ配列をコードする。いずれのＣＤ４６ｃＤＮＡも出発点として用いることができるが、一方、ＰＣＴ／ＡＵ９１／００１９９（この文献は参照により本明細書に含まれる）に開示されるもの、特にクローンｐｍ５．１が好ましい。より好ましい特徴として、該構築物は、ＣＤ４６構築物またはその同等物の図１の次のＡＴ富裕領域の１つまたは２つ以上に改変を含む。すなわちヌクレオチド４０６から４５４、５０４から５１６および５３０から５６１である。本発明の好ましい特徴として、本発明のＣＤ４６構築物は、ＳＣＲドメインのＡＴ富裕領域のＡおよび／またはＴの割合もしくは量が減少し、さらに場合によっては仮定的ポリＡシグナルが除去されるように改変される。本発明のさらに好ましい特徴として、該構築物は、第３および第４のエクソン周辺の境界もしくは結合部のＡＴ富裕領域のＡおよび／またはＴ量を減少させる改変を含む。さらに好ましいものは、その７８％が第３および第４エクソン内のＡおよび／またはＴを含む４９ヌクレオチド鎖におけるＡおよび／またはＴの減少、または隣接する第５エクソン内のＡ富裕領域の減少を含む。最も好ましい特徴として、本発明は構築物ｓｕｂＳＣＲ２、ｓｕｂＳＣＲ３、ｓｕｂＳＣＲ２＋３およびｄｅｌＳＣＲ２／ｓｕｂＳＣＲ３に関する。上記の構築物または、細胞表面のＣＤ４６の産生をもたらすそれらの誘導物を用いて、遺伝子導入動物、例えば細胞表面ＣＤ４６をその器官が産生する遺伝子導入ブタを作出することができる。そのような器官は移植治療に用いることができる。上記の“誘導物”という用語は、改変ＣＤ４６遺伝子または上記構築物に由来する遺伝子セグメントを含むリコンビナント構築物を指す。本発明はまた、本発明の第一および第二の特徴によって製造された蛋白の精製調製物、並びに本発明の第三の目的の構築物によってコードされた蛋白の精製調製物に関する。 “精製調製物”という用語は、宿主細胞の蛋白および他の構成物から少なくともある程度分離された蛋白調製物を指す。好ましくは、該蛋白は、重量、活性、アミノ酸類似性、抗体反応性または他の手段で他の蛋白または構成物と比較したとき、少なくとも純度５０％、好ましくは純度６０％、より好ましくは純度７０％、さらに好ましくは純度８０％、さらに好ましくは純度９０％またはそれ以上である。好ましくは該蛋白はＣＤ４６ＢＣ１である。最も好ましくは本発明は、開示したｓｏｌ−ｓｕｂＳＣＲ３（表１参照）または同等物によってコードされる可溶性ＣＤ４６（ｓＣＤ４６（ＢＣ））蛋白に関する。本発明はまた、本発明の第一および第二の特徴により作製された所望の蛋白を発現する宿主細胞、または本発明の第三の特徴の構築物で形質転換させた宿主細胞に関する。特に好ましい特徴として、本発明は安定的に形質転換された宿主細胞または所望の蛋白を発現する遺伝子導入動物に関する。本発明はまた、蛋白の産生を高めることができる、該蛋白をコードする改変遺伝子を作製する方法に関し、当該方法は、１つまたは２つ以上のエクソンに存在する１つまたは２つ以上のＡおよび／またはＴ富裕領域をもつ遺伝子を当該領域のＡまたはＴに対する量を減少もしくは低下させることによって改変することを含む。上記で用いられる改変遺伝子を作製するについての用語、語句および方法は上で説明した。好ましくは、該改変遺伝子は真核宿主細胞で蛋白の産生増加をもたらすことができる。好ましくは、該改変遺伝子はＣＤ４６コードセグメントを含む。改変ＣＤ４６遺伝子を作製するために、好ましくは表１に挙げたプライマーがスプライスオーバーラップ伸長ＰＣＲにおいて用いられる。また別の特徴として、本発明は、活性な成分として上記した精製蛋白調製物を医薬的に適切な担体または希釈剤とともに含む医薬組成物を包含する。該医薬組成物は、その活性成分がその治療に必要であることが示された疾患の治療に用いることができる。該活性成分がＣＤ４６である場合には、該組成物は、補体介在または炎症介在組織損傷の防止に、腫瘍およびウイルスに対する免疫強化に、受精過程の制御に、妊娠中の胎児の再発性自然流産の防止に、および移植組織の移植片定着の促進に、ＰＣＴ／ＡＵ９１／００１９９（この文献は参照により本明細書に含まれる）で先に開示されたように用いることができる。医薬組成物の形成は当分野で一般に周知で、手頃な「レミントンの薬剤学」(R emington's Pharmaceutical Sciences，17版、Mack Publishing Co．ペンシルバニア、USA)を参照することができる。好ましい特徴として、本発明は、上記の方法にしたがって作製され、または上記の構築物に由来するたＣＤ４６を医薬的に適切な担体または希釈剤とともに含む医薬組成物を含む。特に好ましい特徴として、本発明は、本明細書で開示するように可溶性ＣＤ４６蛋白を含む医薬組成物を含む。本発明は以下の非制限的具体例を参考にさらに詳述されるであろう。実施例１材料と方法ＣＤ４６アイソフォームの命名法ＣＤ４６遺伝子は選択的ＲＮＡスプライシングによって４つの通常発現されるｍＲＮＡ（全部で１４）を生じる(Russellら(1992))。ＣＤ４６蛋白のアイソフォームを簡潔に呈示するために、種々にスプライスされる領域、ＳＴＰ−Ａ、Ｂ、Ｃセグメント(エクソン７、８および９によってコードされる)および細胞質テール(テール１はエクソン１３によってコードされ、一方テール２はエクソン１３のスプライシングによる切り出しの後エクソン１４によってコードされる)のみを（本発明の目的のために変異させないかぎり）示す。本明細書で用いる“変異させる”という用語は先に述べた改変と同じことを意味する。本明細書で産生される野性型蛋白アイソフォームはＳＴＰ−ＢおよびＣ（エクソン８、９）および細胞質テール１を含み、ＣＤ４６（ＢＣ１）（同等な蛋白はｐｍ５．１ｃＤＮＡによってコードされる(Purcellら(1991)およびPCT/AU91/00199)と表示される。ＳＴＰ−ＢおよびＣ並びに細胞質テール２を含む蛋白アイソフォームはＣＤ４６（ＢＣ２）と表示される。本明細書で産生される可溶性蛋白はｓＣＤ４６（ＢＣ）と称されるが、その終止コドンが予想される膜内外境界部にあるからである。ヌクレオチド置換構築物および生成物は、標的エクソンによってコードされる蛋白ドメインによって名づけられる。したがってエクソン３および４に置換を含む構築物はｓｕｂＳＣＲ２であり、エクソン５の置換はｓｕｂＳＣＲ３であり、エクソン３、４および５に対する置換はｓｕｂＳＣＲ２＋３である。ＳＣＲ２欠失をコードしさらにＳＣＲ３置換を含む構築物はｄｅｌＳＣＲ２／ｓｕｂＳＣＲ３と称される。ＣＤ４６ｃＤＮＡの変異誘発非表現型ヌクレオチド置換は、スプライスオーバーラップ伸長ＰＣＲ(SOE-PCR )（Hortonら(1988)）を用いて実施した。第一に、２つのＰＣＲ反応で２つのオーバーラップＤＮＡフラグメントを増幅させた。このフラグメントは、一方の末端の相補的配列に必要とされる変異および他方の末端にＥｃｏＲＩ部位を含んでいた。第二に、ＥｃｏＲＩ部位を含むプライマーを用いてこの２つのフラグメントをＳＯＥ−ＰＣＲ反応でともにスプライスした。このＰＣＲプライマーおよびそれらがアニールするヌクレオチド部位は表１Ａに示す。変異を含むオーバーラップＤＮＡフラグメントは、表１Ｂに示す鋳型とオリゴヌクレオチド組合せを用いて２つのＰＣＲ反応で生成された。最初の各々の変異体のための２つのＰＣＲ反応生成物、５’および３’ＰＣＲフラグメントを低温溶融アガロース(Nusieve)で電気泳動した後分離し、希釈してＳＯＥ−ＰＣＲ反応の鋳型として直接用いた。非変異野性型ＣＤ４６を含む全てのＳＯＥ−ＰＣＲ反応でオリゴヌクレオチドとしてＯｎ２３２およびＯｎ２４１を用いた。ＰＣＲおよびＳＯＥ反応は、アンプリターク（Amplitaq）酵素と緩衝液（Perkin Elmer Cetus 製）を用いてＤＮＡサーマルサイクラー（DNA Thermal Cycler，Perkin Elmer C etus製）で実施した。最初の２通りのＰＣＲのサイクル条件は、９４℃で２分、５０℃で１分および７２℃で１分を３サイクル、続いて９４℃で３０秒、６０℃ で１分および７２℃で１分を２２サイクルであった。ＳＯＥ−ＰＣＲのサイクル条件は、９４℃で２分、４４℃で１分および７２℃で２分を３サイクル、続いて９４℃で３０秒、６０℃で１分および７２℃で２分を２２サイクルであった。一般的に上記の変異は、哺乳類の核酸で見出される通常のＡＴ／ＧＣバランス（ＡＴ：ＧＣ比）に復元するようであり、このバランス復元は蛋白産生の増強をもたらすようである変異体ＤＮＡ構築物および発現ベクターＰＣＲ生成物はＤＮＡポリメラーゼ(クレノーフラグメント)(Boehringer Mann heim製)で末端充填し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs製) で燐酸化した。このＤＮＡをＮＡ４５濾紙（ＤＥＡＥ）（Schleicher & Schuell 製）を用いてアガローズゲル電気泳動後、続いてマジックプレプＤＮＡクリーンアップシステム（Magic Prep DNA clean-up system，Promega Corp．製）で精製した。ＤＮＡ生成物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（Stratagene製）のＳｍａＩ部位に連結し（ＤＮＡリガーゼ、New England Biolabs 製）、ＸＬ１Ｂｌｕｅ大腸菌（Stratagene製）を形質転換した。プラスミドＤＮＡをマクシプレプ (Maxiprep，Promega Corp.製)を用いて変異を (Sequenase^TM)キット(United States Biochemical Corp.)を用いてジデオキシシークェンシングによって確認した。すべての生成物はＰＣＲエラーがなくヌクレオチド変異を含んでいた。ＤＮＡ挿入物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターからＥｃｏＲＩ消化で遊離させ、ＤＮＡポリメラーゼで（クレノーフラグメント）(B oehringer Mannheim製)末端充填し、ｐｃＤＮＡＩ（Invitrogen Corp.製）のＥｃｏＲＶ部位に連結し、ＭＣ１０６１／Ｐ３大腸菌を形質転換した。クローニング部位をジデオキシシークェンシングで確認した。トランスフェクション用プラスミドＤＮＡはウィザードマクシプレプ(Wizard^TMMaxiprep)ＤＮＡ精製システム (Promega Corp.製)を用いて調製した。トランスフェクションＣＯＳ−７ミドリザル線維芽細胞およびＣＨＯ−Ｋ１チャイニーズハムスター卵巣線維芽細胞を、２０μｇ／ｍｌのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１０％ｖ／ｖウシ胎児血清（ＣＨＯ−Ｋ１用培養液はまた２０μｇ／ｍｌプロリン、１４μｇ／ｍｌヒポキサンチンおよび３．９μｇ／ｍｌチミジンを含む）を補充したＤＭＥＭ培養液で１０％ＣＯ₂含有湿潤雰囲気中で培養した。製造元の指示にしたがって、プラスミドＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ１−ＣＤ４６構築物）を無血清、無抗生物質ＤＭＥＭ培養液中でリポフェクタミン(Gibco-BRL)を用いて培養細胞に導入した。６培養穴（ウェル）プレートのＣＯＳ−７細胞に各構築物をトランスフェクションさせた。細胞表面ＣＤ４６（ＢＣ１）をトランスフェクションさせた細胞を核酸導入後４８時間で採集し適量に分けて、サザンブロット、ノザンブロット、ウェスタンブロット、細胞溶解物の放射性免疫アッセー（ＲＩＡ）、蛍光顕微鏡観察およびフローサイトメトリーで分析した。可溶性ＣＤ４６構築物の発現については、ＣＯＳ−７細胞を無血清培養液中で培養し、トランスフェクション後１２０または１４８時間で採集した。安定的に構築物が組み込まれたトランスフェクションさせたＣＨＯ−Ｋ１細胞世代については、ＰＧＫ−ｎｅｏプラスミド（Richard Harvey博士（WEHI メルボルン、オーストラリア）提供）を１０倍過剰モル濃度のｐｃＤＮＡ１−ＣＤ４６構築物プラスミドＤＮＡとともに同時トランスフェクションさせた。１．２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて安定的発現についてトランスフェクションさせたＣＨＯ細胞を選別し、２週間以上経ってからＣＤ４６の細胞表面発現を調べた。免疫蛍光による細胞表面ＣＤ４６（ＢＣ１）産生の分析細胞質膜上で処理されたＣＤ４６蛋白（または浸透性付与細胞内の細胞内蛋白としてのＣＤ４６蛋白）を二段階免疫蛍光標識によって分析した。一次抗体の抗ＣＤ４６ｍＡｂ（Ｅ４．３ＩｇＧ２ａ(Sparrow & McKenzie(1983))またはＭ１７７ＩｇＧ１（Seyaら(1990)）またはアイソタイプコントロールｍＡｂ（ＭＥＭ− ４３ＩｇＧ２ａ抗−ＣＤ９５（Stefanovaら(1989)）を細胞とともに氷上で３０分以上維持した。細胞を洗浄し、ＦＩＴＣヒツジ（Ｆａｂ）−抗マウスＩｇ(Silenus製、メルボルン、オーストラリア)を氷上でさらに３０分添加した。細胞浮遊液のフローサイトメトリー（FACScan II，Becton Dickinson製）またはほぼ密集に近い細胞単層の顕微鏡観察によって蛍光を調べた。全細胞溶解物のＣＤ４６（ＢＣ１）の分析全細胞溶解物を５×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で記載にしたがって調製した。全てのサンプルについて同等数の細胞を用い、記載(Laemmli(1970))にしたがってウェスタンブロッティングを実施した。溶解物中に存在する蛋白を非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ブロットしｍＡｂＥ４．３をプローブとして調べた。ＣＤ４６蛋白の捕捉用にｍＡｂＥ４．３を、トレーサーとして¹²⁵Ｉ標識Ｍ１７７（Seya提供）を用いて捕捉／トレーサーＲＩＡを記載にしたがって実施したが、この場合トレーサーには１００００ｃｐｍをインプットカウントとして用いた（ Johnstoneら(1993)）。ＤＮＡおよびＲＮＡの分析ＲＮＡはシャーギンら（Chirgwinら(1979)）の方法を改変した方法を用いて調製した。ノザンブロッティングは下記の点を除き記載(Millandら、(1990))にしたがって実施した。すなわち、ブロット用膜はハイボンド−Ｎ（アマーシャム製）を用い、ブロットの移転は下方向に重力にしたがって実施した。細胞ＤＮＡの調製およびサザンブロッティングは記載（Southern）にしたがって、膜としてハイボンド−Ｎ⁺（アマーシャム製）を用いて実施した。ノザンおよびサザンブロットでは、ハイブリダイゼーション用プローブはｐｍ５．１ｃＤＮＡ(Purcellら(1991))で、メガプライム(Megaprime)ＤＮＡ標識システム(アマーシャム製)を用いて標識した。プラスミド構築物ＳＣＲ変異の配列は図１に示す。最終的構築物は全てｐｃＤＮＡ１ベクターに存在し、ＰＣＲのために使用したオリゴヌクレオチドに由来する同じクローニング部位を含んでいた。非変異（ｗｔＳＣＲ）配列を含む構築物は最初のｐｍ５．１ｃＤＮＡクローン(Purcellら、1991)に由来する。これと下記で考察する非表現型置換構築物の各々は野性型ＣＤ４６（ＢＣ１）蛋白をコードする。ｓｕｂＳＣＲ２構築物はエクソン３／４スプライス部位の周辺のＳＣＲ２の領域内に非表現型ヌクレオチド置換を含み、野性型ＣＤ４６（ＢＣ１）蛋白をコードする。この置換は、ヌクレオチド４０６と４５４との間の領域のＡ／Ｔ含有量を７８％から５５％へ減少させる。ｓｕｂＳＣＲ３構築物はＳＣＲ３のＡ富裕領域に対して非表現型ヌクレオチド置換（ＳＣＲ２の末端の１個の置換を含む）を含み、さらにまた仮定的ポリアデニル化シグナルを遮断して野性型ＣＤ４６（ＢＣ１）蛋白をコードする。ｓｕｂＳＣＲ２＋３構築物はＳＣＲ２とＳＣＲ３の改変の組合せを含み、野性型ＣＤ４６（ＢＣ１）蛋白をコードする。最終的な細胞表面構築物、ｄｅｌＳＣＲ２／ｓｕｂＳＣＲ３はＳＣＲ２の欠失およびＳＣＲ３に対する置換を有する。この構築物はＳＣＲ２を欠く変異蛋白をコードし、ＣＤ４６（ｄｅｌＳＣＲ２／ＢＣ１）と称される。２つのＤＮＡ構築物を変異させ、ｓＣＤ４６（ＢＣ）と呼ばれる可溶性蛋白をコードさせた。最初の構築物、ｓｏｌ−ｗｔＳＣＲは、トランスメンブレンドメインの前に終止コドンを作出するためにヌクレオチド１０２２でＧをＡで置換して作製された。ｓｏｌ−ｓｕｂＳＣＲ３構築物は終止コドン変異および上記のＳＣＲ３に非表現型ヌクレオチド置換を含む。非表現型ヌクレオチド置換は細胞表面ＣＤ４６（ＢＣ１）の産生を高める最初に本発明者等は、顕微鏡写真技術によって変異はＣＤ４６の蛋白産生を高めることを示した。これらの実験では、細胞をウェルでトランスフェクションさせ、Ｅ４．３で染色した。結果は呈示していない。蛋白産生増加の順位はｗｔＳＣＲ、ｓｕｂＳＣＲ２、ｓｕｂＳＣＲ３、ｓｕｂＳＣＲ２＋３およびｄｅｌＳＣＲ２／ｓｕｂＳＣＲ３であった。ＣＤ４６産生の改善はまたＷＯＰ−３０２７細胞のトランスフェクションさせた後にも認められた（データは呈示せず）。フローサイトメトリーによって、より多くのＣＯＳ−７細胞がその表面にＣＤ４６を産生し、変異構築物をトランスフェクションさせた後ではｗｔＳＣＲ構築物と較べて極めて高レベルで産生されることが示された（図２）。産生におけるこの改善は、顕微鏡写真技術による観察でも同じ順位であった。予想したように、一部分の細胞集団は擬似トランスフェクションさせた細胞に対して同様な蛍光を有し、細胞表面ＣＤ４６をもたない非トランスフェクション細胞とトランスフェクション細胞とを示したが、パネルＣ、ＤおよびＥでは変異構築物に曝された全ての細胞がトランスフェクションされＣＤ４６を発現しているようであった。すなわち各々の事例の全体像は野性型をトランスフェクションさせた細胞と比較して右に移動している。非表現型ヌクレオチド置換は細胞溶解物でＣＤ４６（ＢＣ１）の産生を高める細胞溶解物はトランスフェクションさせた細胞から調製した。これらの溶解物は、大量の細胞表面ＣＤ４６を産生しない細胞を高比率で含むトランスフェクションさせた細胞全てを含む。全ての事例で、ＣＤ４６（ＢＣ１）のトランスフェクションさせた後に産生される蛋白はウェスタンブロッティングによる予想サイズが６６ｋＤａであった（図３）。変異ＣＤ４６ＤＮＡをトランスフェクションさせた細胞の溶解物には非変異ＣＤ４６ＤＮＡの場合と較べてより多くのＣＤ４６が存在する。産生の改善の順位は細胞表面発現の場合と同じで、ｓｕｂＳＣＲ２＋３構築物でトランスフェクションさせた細胞がｗｔＳＣＲ構築物と比較して最も優れた結果をもたらした。ＣＤ４６蛋白レベルの違いについてもっと明瞭な比較を可能にするために、ＲＩＡを実施した（図４）。ｓｕｂＳＣＲ２またはｓｕｂＳＣＲ３をトランスフェクションさせた細胞集団は、ｗｔＳＣＲ感染細胞と比較して細胞溶解物中に約２倍のＣＤ４６を含んでいた。ｓｕｂＳＣＲ２＋３をトランスフェクションさせた細胞は、ｗｔＳＣＲ感染細胞と比較して細胞溶解物中に約８倍のＣＤ４６を含んでいた。これらの結果は、ＳＣＲ２およびＳＣＲ３のヌクレオチド配列は何らかの形で相互作用している可能性を示している。なぜならば、ＳＣＲ２およびＳＣＲ３に対する非表現型置換は付加的な方法で蛋白発現レベルを改善するように思えるからである。蛋白発現レベルに影響を与えるＳＣＲ２に他のヌクレオチド配列がまた存在する可能性がある。なぜならば、ＳＣＲ２の完全な欠失はＳＣＲ２＋３の非表現型ヌクレオチド置換よりも発現レベルを増加させるからである。非表現型ヌクレオチド置換は可溶性ＣＤ４６（ＢＣ）の産生を高めるＳＣＲ３の非表現型ヌクレオチド置換もまた一時的ＣＯＳ系で発現されるｓＣＤ４６（ＢＣ）量を顕著に高めることができた。ｓｏｌ−ｓｕｂＳＣＲ３構築物は、ＣＯＳ−７細胞のトランスフェクション後１４８時間で無血清細胞上清にウェスタンブロットで検出可能な蛋白を生じた（図５）。同様にトランスフェクションさせた細胞のトランスフェクション後１２０時間の上清をＲＩＡで調べた。ｓｏｌ−ｓｕｂＳＣＲ３をトランスフェクションさせた細胞から分泌された可溶性物質レベルは、ｓｏｌ−ｗｔＳＣＲをトランスフェクションさせた細胞のそれより約９倍であった（図６）。ｓｕｂＳＣＲ２＋３（図５）またはｄｅｌＳＣＲ２／ｓｕｂＳＣＲ３（データは提示せず）をトランスフェクションさせたＣＯＳ細胞は、細胞表面に発現されたＣＤ４６に加えてさらに、組織培養上清に顕著な量のＣＤ４６蛋白を放出または分泌した。他の細胞表面トランスフェクション体のいずれも検出可能量のＣＤ４６を上清に産生しなかった。非表現型ヌクレオチド置換によってもたらされるＣＤ４６（ＢＣ１）産生の増加はｍＲＮＡまたはトランスフェクションさせたＤＮＡの発現増加のためではないようである全ＲＮＡを種々の構築物をトランスフェクションさせた細胞集団から調製し、ｍＲＮＡ発現レベルをノザンブロットによって求めた（図７）。全ＲＮＡのｍＲＮＡレベルは、ｗｔＳＣＲ構築物の場合のレベルと比較して非表現型変異を含む構築物の場合に類似していた（図７）。この発現レベルは全細胞集団のそれを表し、細胞当たりの発現レベルを示していない。細胞集団に存在するプラスミド量はサザンブロティングによって決定した（図８）が、他の構築物のいずれとも顕著な違いはなかった。非表現型ヌクレオチド置換は安定なトランスフェクション系でのＣＤ４６（ＢＣ１）の産生を高めるトランスフェクションさせＧ４１８薬剤選別を実施した後、ＣＨＯ−Ｋ１トランスフェクション体をフローサイトメトリーで調べた。非表現型変異を含む構築物でトランスフェクションさせた選別細胞集団はＣＤ４６を発現するもっと多くの細胞を含み、さらにそれらははるかに高レベルのＣＤ４６を発現し（図９）、ｓｕｂＳＣＲ２＋３構築物では最高の増加が認められた（パネルＤ）。実施例２変異誘導ＣＤ５５構築物の調製本発明の適用のための具体例は、ＣＤ５５（ＤＡＦ：崩壊加速因子(Decay Acc elerating Factor)）（構造的に関連を有するＲＣＡ分子）をコードする核酸によって提供される。ＣＤ５５遺伝子は、ＣＤ５５のＳＣＲ２、ＳＣＲ３およびＳＣＲ４モジュールをコードするエクソン内にＡＴヌクレオチド富裕領域を有する。非表現型ヌクレオチド置換は、残基３８８から４１２（ＳＣＲ２をコード）；５９０から６０２、６３３から６４５および６５８から６７４（ＳＣＲ３をコード）；７１８から７２８および８４４から８５４（ＳＣＲ４をコード）内に含まれる配列に向けて個々に誘導される。変異誘発のための特定のＰＣＲプライマーは、予想されるアミノ酸配列を変更させることなくこれら領域のためのコドンのＡおよび／またはＴ含有量を減少させるためにデザインされる（これは当業者には明瞭であろう）が、これは、最初のＰＣＲのプライミングを可能にさせるために十分な長さのｃＤＮＡ鋳型に相補的な配列を有する。ＣＤ５５遺伝子の番号付与はルブリンとアトキンソン(Lublin & Atkinson，Curr．Top Micro．Immunol． 153，123，1989)の図３に対応している。これらのプライマーは、具体的に上記で詳述したようにスプライス−オーバーラップ伸長ＰＣＲにおける変異ＰＣＲ生成物のアニーリングを可能にするように、相補対（５’および３’方向において前進方向プライマーおよび逆進方向プライマー）としてデザインされる。制限酵素切断部位を含むまた別の前進方向および逆進方向プライマーがデザインされるが、これは、当業者には明白であろうが、３’−ＵＴＲ内の仮定的ポリアデニル化信号の３’および５’−ＵＴＲに隣接する位置で野性型ｃＤＮＡ鋳型とアニールする。上記で特定しリストに挙げた６つのＡＴ富裕配列は、トランスフェクションさせた細胞での蛋白産生の増強についての要請を様々な形で受け入れることができるかもしれない。各変異構築物は個々に作出し、一続きの多変異ヌクレオチド配列を含む組合せをさらに調製することができる。ＰＣＲ生成物を精製し、さらに、完全な配列決定のためにＳＫベクターにクローニングして、必要な変異配列の完全性を確認して後、適切な発現ベクター（例えばｐｃＤＮＡ１）へのクローニングや真核細胞へのトランスフェクションを行う。ＣＤ５５蛋白の産生は１Ｈ４抗ＣＤ５５単クローン性抗体を用いてフローサイトメトリーで調べ、さらに、トランスフェクションさせた細胞におけるＣＤ５５の相対的発現と変異誘発構築物との関係を調べる。したがって蛋白の翻訳に影響を与える変異に関する階層を構築することができる。至適構築物でトランスフェクションさせた細胞を、崩壊加速活性として発現ＣＤ５５によって仲介される補体介在溶解反応に対する防御についてさらに検査する。このアッセーによって、該蛋白が適切に発現され正常に機能していることが証明される。実施例３ＣＤ４６トランスフェクションデータの要約ヌクレオチド構築物（野性型または変異（置換）型のいずれか）を発現ベクター、ｐｃＤＮＡ１（上述）およびＡＰＥＸ−３にクローニングした。これらの発現構築物を哺乳類培養細胞株にトランスフェクションさせた。トランスフェクションを繰り返すことによって、表示されたいずれの発現の変化も定常的なものであり異常な人工産物でないことを確認した。ＣＯＳ−７細胞のｐｃＤＮＡ１ベクター構築物（一時的発現）は様々に発現され、具体的なＣＤ４６構築物中の非表現型ヌクレオチド変異に左右される。この作用は、細胞表面ＣＤ４６をコードする構築物についても、可溶性ＣＤ４６をコードする構築物についても一致していた。他の細胞株を野性型および変異構築物の発現について検査した。変異は、一時的トランスフェクションＷＯＰ−３０２７細胞でも安定的トランスフェクションＣＨＯ−Ｋ１細胞でも細胞表面ＣＤ４６蛋白の発現を改善した。可溶性蛋白はまた、ヒト２９３細胞および２９３−Ｅｂｎａ細胞で定常的で予想された発現で産生された。したがって、変異の効果はＣＯＳ−７アフリカミドリザル腎線維芽細胞様細胞に限定されず、ＷＯＰ−３０２７（ポリオーマウイルス癌化）マウス胎児線維芽細胞、ＣＨＯ−Ｋ１ハムスター卵巣細胞および２９３（ヒト胎児腎）細胞でも認められる。従ってこの作用は他の細胞でもまた認められるであろうと考えられる。変異構築物の発現に対するベクターの効果を調べるために、可溶性ＣＤ４６コード型をＡＰＥＸ−３ベクターにクローニングした。変異依存性発現強化はＣＯＳ−７および２９３（ヒト胎児腎）細胞で認められた。従って、これはこの作用は１種のベクターに限定されないようである。表ＩＩは、一連のベクター、細胞株および構築物を用いて得られるトランスフェクションによる細胞表面ＣＤ４６および可溶性ＣＤ４６の発現レベルを示している。記号“±”は基準となる野性型の発現レベルを示し、各検査で示す“＋” の数はＣＤ４６発現レベルに対して正比例する。実施例４無細胞翻訳系における翻訳速度に関する実験合成ＣＤ４６野性型および変異型の転写物をウサギ網状赤血球を含む無細胞翻訳系でインビトロ翻訳を実施した（図１０参照）。ｗｔＳＣＲ、ｓｕｂＳＣＲ２、ｓｕｂＳＣＲ３およびｓｕｂＳＣＲ２＋３ＤＮＡ配列から転写された等量のＲＮＡを含むレーンは全て同じような量の蛋白を生じ、転写物の配列に関係なく同じ効率で翻訳が進行することを示した。蛋白は非グリコシル化ＣＤ４６について予想されるサイズ（３８−４０ｋＤ）であった。実施例５ＣＨＯ−Ｋ１、ＷＯＰ−３０２７および２９３細胞における可溶性ＣＤ４６の発現強化可溶性ｗｔＳＣＲおよび可溶性ｓｕｂＳＣＲ構築物をＷＯＰ、ＣＨＯ−Ｋ１および２９３細胞にトランスフェクションさせた。トランスフェクションさせたＷＯＰ細胞から集めた上清を放射性免疫アッセーによる準定量を実施したときほぼ同じ傾向が観察された。可溶性ｓｕｂＳＣＲ３による一時的にトランスフェクションさせてから９６時間後に集めたＣＨＯ細胞の無血清上清は蛋白発現について４倍の増加を示した（図１１参照）。これは、可溶性ｓｕｂＳＣＲ２＋３とｐｇＫＮｅｏｐＡで同時トランスフェクションさせた後、表面ＣＤ４６を発現している安定的な親ＣＨＯ細胞株を樹立させたときに観察された増加と一致した。トランスフェクション後６日で２９３細胞の無血清上清を集め、ドットブロッティングで準定量すると、非表現型ヌクレオチド変更を含む構築物（可溶性ｓｕｂＳＣＲ３）を用いたときはより多くの蛋白（典型的には３倍）が認められた。これらのデータは、変異構築物をトランスフェクションさせた後に産生される可溶性ＣＤ４６蛋白の増加はＣＯＳ−７細胞に限定されないことを明瞭に示している。実施例６ＡＰＥＸ発現プラスミドを用いた可溶性ＣＤ４６発現強化ＣＤ４６をコードする挿入物をＡＰＥＸ発現プラスミドに連結し、２つの構築物（ＡＰＥＸ３−ｓｏｌ−ｗｔＳＣＲおよびＡＰＥＸ３−ｓｏｌ−ｓｕｂＳＣＲ３）をＣＯＳ−７細胞および２９３細胞にトランスフェクションさせた。トランスフェクション後６日して無血清上清を集め、ドットブロッティングで準定量した。非表現型ヌクレオチド変更を含む構築物（ＡＰＥＸ３−ｓｏｌ−ｓｕｂＳＣＲ３）を細胞にトランスフェクションさせたとき蛋白発現の増加（典型的には３倍）が認められた。この結果によって、観察された蛋白発現の増加はプラスミドに特異的ではないことが確認された。実施例７蛋白発現強化のメカニズム決定の研究（ａ）一時的にトランスフェクションさせたＣＯＳ細胞は、変異配列（非表現型ヌクレオチド置換）または野性型配列のいずれでトランスフェクションさせたかに関係なく、サザンブロット分析で測定した場合同じ量のプラスミドＤＮＡを含む。したがって、ＣＤ４６蛋白産生の顕著な増加は、おそらく転写または翻訳調節によるものであって、トランスフェクション、ＤＮＡ安定性またはプラスミドＤＮＡ複製の効率の変化によるものではない。（ｂ）変異または野性型ＣＤ４６プラスミド構築物をトランスフェクションさせたＣＯＳ細胞は同じ量のＣＤ４６ｍＲＮＡを含むがＣＤ４６蛋白の量は異なる。２つの構築物（ｓｕｂＳＣＲ３およびｓｕｂＳＣＲ２＋３）ではあいまいなポリアデニル化信号は除去されたが、これは短縮ｍＲＮＡ種を生じるかもしれなかった（野性型ではｄｅｌＳＣＲ２またはｓｕｂＳＣＲ２構築物）。しかしながら、短縮ｍＲＮＡ種はノザンブロットでは観察されず、ｍＲＮＡの安定性または半減期の変化をもたらすと予想されるｍＲＮＡ量の違いは認められない。したがって、ＣＤ４６蛋白の増加はおそらく翻訳の調節によって生じるのであろう。（ｃ）トランスフェクションさせたＣＯＳ細胞の各々から分離した同等量のｍＲＮＡを鋳型として用いたインビトロ翻訳によって、同等量のＣＤ４６蛋白が生成され、一方、細胞表面蛋白発現の２０倍もの増加がトランスフェクションさせたＣＯＳ細胞で再現性をもって観察される。このことは蛋白翻訳のメカニズムに注意を向けさせる。なぜならば、それは特に無傷の細胞内に限って生じるように思えるからである。（ｄ）ＣＤ４６産生の増加は蛋白によるものであるのか否かを決定するために、ＣＯＳ−７細胞を、３５Ｓ−Ｃｙｓおよび３５Ｓ−Ｍｅｔで生合成的に標識したｗｔＳＣＲ、ｓｕｂＳＣＲ２＋３またはｓｕｂＳＣＲ３で別々にトランスフェクションさせた。細胞溶解物と上清からＣＤ４６蛋白を免疫沈澱させ、さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べた。ｓｕｂＳＣＲ２＋３をトランスフェクションさせた細胞は、ｗｔＳＣＲをトランスフェクションさせた細胞よりもっと多くの標識ＣＤ４６を合成した。上清にはＣＤ４６蛋白は検出されなかった。生合成によって標識したＣＤ４６はｓｏｌＳＣＲ３でトランスフェクションさせた細胞によって産生され上清に分泌されたが、予想のとおり溶解物中では検出されなかった。アイソタイプコントロールｍＡｂ（ＭＥＭ−４３）で免疫沈澱させた溶解物および上清は予想サイズの標識物質を全く示さなかった。実施例８核酸導入動物の作出のための変異誘発ＣＤ４６およびＣＤ５５（野性型蛋白をコード）遺伝子の使用至適変異構築物（例えばＳＣＲ２＋３構築物をコードするＣＤ４６（上記参照））または適切なＣＤ５５構築物が真核細胞株の繰り返しインビトロトランスフェクションによって一旦証明されたら、このＤＮＡベクターを遺伝子導入に適するように十分に精製する。当業者に周知の方法にしたがって、このＤＮＡ（トランスジーン）を受精マウス単細胞卵母細胞に注入し、これを予め偽妊娠状態にしたマウスに再移植する。小ちさな組織サンプルから得たＤＮＡをサザンブロットで分析してトランスジーンの組み込みについて子孫をスクリーニングする。さらに、創始マウスを組織の細胞溶解物のウェスタンブロッティングによってトランスジーンの発現について検査する。該蛋白を発現している創始マウスを交配し、さらに適切に戻し交配を実施して適切なマウス株を得る。各世代の個々のマウスをまたトランスジーンの蛋白発現についてスクリーニングし、発現動物のみを用いる。そのような遺伝子導入マウスの組織サンプルを、補体介在溶解反応、補体介在移植片拒絶反応、および補体介在組織炎症アッセー（これらの各々は確立され日常的なアッセーである）でトランスジーン蛋白の機能について検査する。補体介在細胞損傷に対して抵抗性を増大させるために十分な量のＣＤ４６またはＣＤ５５遺伝子導入蛋白をその細胞上に発現している動物のみが、マウスの遺伝子導入系統を樹立するために維持される。遺伝子導入マウスの組織を用いて（それによって適切なトランスジーンＤＮＡ構築物が特定される）機能を一旦確認したら、同じ遺伝子導入操作をブタの卵母細胞を用いて繰り返し遺伝子導入ブタを作出する。適切な遺伝子導入ブタは、腎、心、肝、膵など移植を必要とする人間のための異種移植の仮のドナーと考えられる。本発明の重要な応用は、ＣＤ４６を発現している遺伝子導入動物とＣＤ５５を発現している遺伝子導入動物との遺伝的交配であるが、この場合、両分子の同時発現は補体介在損傷に対する抵抗性を増大させる。上記の例は器官移植のドナーを提供する遺伝子導入動物の作出に関するが、本発明の構築物を含む遺伝子導入動物または本発明の方法にしたがって蛋白を産生するその細胞は、他の目的のためにも作出することができる。例えば、そのミルク中にリコンビナント蛋白を産出する遺伝子導入乳牛を作出することが要望されるかもしれない。本発明は例示により開示してきたが、添付の請求の範囲に規定された本発明の範囲を外れることなく、それら例示に対して当業者にとって明白な修飾および／または変更を加えることができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年５月７日【補正内容】ＣＤ４６および他のＲＣＡに関する研究の限界は、一時的または安定系のいずれかでリコンビナント蛋白をコードする構築物をトランスフェクション（transf ection）させた際、極めて僅かな細胞しかトランスフェクションされず、しかもそれらは僅かな蛋白しか発現しないということであった。実際、本発明者らおよび他の研究室では、巧妙な細胞の分類、クローニングおよび選別工程が適切な細胞を分離するために必要であった。このことは、特にリコンビナントＣＤ４６の分析、その生理学的役割および治療剤としての価値に関して問題をもたらした。本発明につながる研究で、驚くべきことに本発明者らは、ＣＤ４６をコードする核酸の改変はトランスフェクションさせた真核細胞宿主で高レベルのＣＤ４６の産生をもたらすことを見出した。ＣＤ４６の野性型遺伝子から得られる場合の８倍に及ぶ蛋白産生が認められた。これらの改変は、核酸のアデニン（Ａ）および／またはチミン（Ｔ）富裕領域におけるＡおよび／またはＴの量もしくは割合の減少を含む。本発明者らは、エクソンのＡＴ富裕領域における改変は蛋白産生の増加をもたらすことを発見した最初の者である。発明の要旨本発明は、ＲＮＡの安定性を明白に変化させることなく宿主細胞での哺乳類の蛋白産生を増加または改良する方法を提供する。この場合、該哺乳類蛋白をコードする核酸はエクソンに存在するＡおよび／またはＴ富裕領域を有し、当該方法は、当該領域のＡおよび／またはＴ量を減少もしくは低下させることによって核酸を変化させ、さらに当該核酸を宿主細胞にトランスフェクションさせ、適切な条件下で当該核酸を発現させることを含む。本発明の別の特徴は、宿主細胞のＲＣＡ蛋白の産生を増強させる方法を提供することであるが、この場合、ＲＣＡをコードする核酸はそのエクソンの１つまたは２つ以上に存在するＡおよび／またはＴ富裕領域をもち、本方法は、当該Ａおよび／またはＴ富裕領域のＡおよび／またはＴ量を低下させることによって核酸を変化させ、当該核酸を宿主細胞にトランスフェクションさせ、さらに適切な条件下で当該核酸を発現させることを含む。本発明のまた別の特徴は宿主細胞でのＲＣＡ蛋白の産生を増加させる方法に関し、これは、ＡＴ富裕領域を含むＳＣＲモジュールまたはその部分を欠失させることによってＲＣＡをコードする核酸を変化させ、当該改変核酸を宿主細胞にトランスフェクションさせ、さらに適切な条件下で当該核酸を発現させることを含む。本発明はまた、明白にＲＮＡの安定性を変化させることなく宿主細胞での哺乳類の蛋白産生を高めることができるリコンビナント核酸構築物に関する。この場合、該核酸構築物の１つまたは２つ以上のエクソンに存在する１つまたは２つ以上のＡおよび／またはＴ富裕領域のＡおよび／またはＴ量が減少させられる。本発明はまた、本発明の方法によって製造された蛋白、本発明の構築物によってコードされた蛋白、医薬組成物、該構築物をトランスフェクションさせた宿主細胞、および該蛋白を発現する遺伝子導入（transgenic）動物に関する。本発明はまた蛋白をコードする変異遺伝子の製造方法に関する。この場合、当該変異遺伝子は該蛋白の産生を高めることができ、当該方法は、Ａおよび／またはＴ富裕領域のＡおよび／またはＴ量を減少もしくは低下させることによって、１つまたは２つ以上のエクソンに存在する１つまたは２つ以上の当該領域について遺伝子を変異させることを含む。図面の簡単な説明図１：変異ＳＣＲ２およびＳＣＲ３領域のＣＤ４６構築物の配列。該配列の番号付与はｃＤＮＡクローンｐｍ５．１(Purcellら、1991)を基にし、ヌクレオチド３０３(nt303)の末端からＳＣＲ３(nt564)の開始点へと伸長する。ＳＣＲ結合部は示されている。構築物ｗｔＳＣＲ（ｐｍ５．１に匹敵）の完全な配列は、対応する一文字記号のアミノ酸配列によってその上に示されている。構築物のいずれかの置換されたヌクレオチドには下線を付してある。ｓｕｂＳＣＲ２、ｓｕｂＳＣＲ３およびｓｕｂＳＣＲ２＋３構築物については、ｗｔＳＣＲと一致する配列はドット（．）で示され、置換されたヌクレオチドは表示されている。欠失変異体構築物は、ＳＣＲ２欠失は空白で表示されているという点を除き他の構築物の場合と同様である。そのような説明には、転写の安定性の改善、ｍＲＮＡの細胞質への移送の増加、リボソームによる翻訳効率の改善、ｍＲＮＡの上部構造による翻訳の増加または実際にはこれら要素の２つもしくはそれ以上の組合せが含まれる。一般的に、蛋白産生の増加は蛋白翻訳速度の増加によって説明できるというのが妥当なようである。蛋白産生の増加は無傷の細胞に限られ、無細胞翻訳系では明らかではないということを示唆するデータによって、この作用は、基質利用性（例えばＲＮＡ安定性の効果）や単純な構造的影響や蛋白翻訳成分の単純な相互作用ではなく、むしろｍＲＮＡ、転写物、リボソーム、ポリゾーム、ＲＮＡ結合蛋白および／または他の因子（例えば配列依存性三次元ｍＲＮＡ構造）間の相互作用に起因するものであることが示唆される。本発明に付随する蛋白産生の改良の要因となる正確な機構についてなおいくつかの推測が存在する一方、細胞表面分子の発現については２０倍またはそれを越える蛋白産生の増加を得ることができる。特にＣＤ４６の翻訳の場合、Ａおよび／またはＴ含有量における減少が開始コドンから約５４０塩基までの領域内で発生するときにこの蛋白産生の増加がもっとも著しいようである。好ましい具体例では、本方法で用いられる宿主細胞は真核細胞である。これは、リコンビナント蛋白の翻訳後修飾（例えばグリコシル化、これは原核細胞宿主または幾つかの昆虫細胞では必ずしも起こらないが。）を得ることがしばしば望ましいことによる。別の好ましい具体例では、核酸はそのエクソンの１つまたは２つ以上にＡおよび／またはＴ富裕領域を有するＲＣＡをコードする。ＲＣＡは、とりわけＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ３５またはＨ因子であろう。特に好ましい具体例では、本発明は、真核細胞でのＣＤ４６の産生の増加または改善方法に関するが、ここでは、ＣＤ４６をコードする遺伝子を、当該遺伝子の１つもしくは２つ以上のエクソン内のＡおよびＴ富裕領域のＡおよび／またはＴ量を減少または低下させることによって変化させ、当該改変遺伝子を真核細胞にトランスフェクションさせ、さらに適切な条件下で当該遺伝子を発現させる。請求の範囲１．哺乳類の蛋白をコードする核酸がエクソンに存在するＡおよび／またはＴ富裕領域を有する場合に、明白にＲＮＡ安定性を変化させることなく宿主細胞における該哺乳類蛋白の産生を増加または改善する方法であって、当該方法が、当該領域におけるＡおよび／またはＴの量を減少または低下させることによって該核酸を改変し、さらに当該改変核酸を宿主細胞にトランスフェクションさせ、適切な条件下で当該核酸の発現を得ることを含む前記蛋白産生の増加または改善方法。２．当該改変核酸が、リコンビナント核酸構築物の成分として当該宿主細胞にトランスフェクションされる請求の範囲第１項の方法。３．核酸の当該改変が、１つまたは２つ以上の非表現型変異を生み出すことによる請求の範囲第１項または第２項の方法。４．核酸の当該改変が１つまたは２つ以上の保存的変異を生み出すことによる請求の範囲第１項または第２項の方法。５．核酸の当該改変が、ＡまたはＴ以外のヌクレオチドの１つまたは２つ以上の挿入による請求の範囲第１項または第２項の方法。６．核酸の当該改変が、Ａおよび／またはＴの欠失または、Ａおよび／またはＴ富裕領域の欠失による請求の範囲第１項または第２項の方法。７．核酸の当該改変が、下記のいずれかの２つまたは３つ以上の組合せによる請求の範囲第１項または第２項の方法：ａ．１つまたは２つ以上の非表現型変異ｂ．１つまたは２つ以上の保存的変異ｃ．ＡまたはＴ以外のヌクレオチドの１つまたは２つ以上の挿入ｄ．Ａおよび／またはＴの欠失またはＡおよび／またはＴ富裕領域の欠失。８．当該核酸が、そのＳＣＲモジュールの１つまたは２つ以上に存在するＡおよび／またはＴ富裕領域を有するＲＣＡ蛋白をコードする、請求の範囲第１項から７項までのいずれかの方法。９．当該核酸がそのＳＣＲモジュールの１つまたは２つ以上で改変される請求の範囲第８項の方法。１０．請求の範囲第６項の方法において、核酸の当該改変が１つまたは２つ以上のＳＣＲモジュールまたはその部分の欠失による請求の範囲第９項の方法。１１．当該ＲＣＡ蛋白がＣＤ４６である請求の範囲第８項から第１０項のいずれかの方法。１２．構築物ｓｕｂＳＣＲ２、ｓｕｂＳＣＲ３、ｓｕｂＳＣＲ２＋３またはｄｅｌＳＣＲ／ｓｕｂＳＣＲ３の１つを利用する請求の範囲第１１項の方法。１３．請求の範囲第２項の方法において、当該リコンビナント核酸構築物が真核細胞ベクターを含む請求の範囲第３項から第１２項のいずれかの方法。１４．当該宿主細胞が真核宿主細胞である請求の範囲第１項から第１３項のいずれかの方法。１５．当該宿主細胞がＣＯＳ−７またはＣＨＯ−Ｋ１である請求の範囲第１４項の方法。１６．該核酸構築物の１つまたは２つ以上のエクソンに存在する１つまたは２つ以上のＡおよび／またはＴ富裕領域のＡおよび／またはＴの量が減少させられた、明白にＲＮＡ安定性を変化させることなく宿主細胞における哺乳類蛋白の産生を増加させることができるリコンビナント核酸構築物。１７．改変ＲＣＡｃＤＮＡ配列をコードする請求の範囲第１項に記載のリコンビナント核酸。１８．改変ＣＤ４６ｃＤＮＡ配列をコードする請求の範囲第１７項に記載のリコンビナント核酸。１９．リコンビナント核酸構築物ｓｕｂＳＣＲ２、ｓｕｂＳＣＲ３、ｓｕｂＳＣＲ＋３およびｄｅｌＳＣＲ２／ｓｕｂＳＣＲ３。２０．動物の遺伝情報中に請求の範囲第１６項から第１９項のいずれかに記載の構築物またはその誘導物を取り込むことによる遺伝子導入動物の作出方法。２１．動物の遺伝情報中に請求の範囲第１８項から第１９項のいずれかに記載の構築物またはその誘導物を取り込むことによりその器官が細胞表面ＣＤ４６を産生する遺伝子導入動物の作出方法。２２．当該動物がブタである請求の範囲第２１項の方法。２３．請求の範囲第２１項または第２２項のいずれかの方法にしたがって作出される遺伝子導入動物の器官を利用する、人間または動物への器官移植の方法。２４．請求の範囲第１項から第１５項のいずれかによって製造される精製蛋白調製物。２５．請求の範囲第１６項から第１９項のいずれかに記載の核酸構築物によって製造される精製蛋白調製物。２６．１つまたは２つ以上の医薬的に適切な担体または希釈剤と結合させた、請求の範囲第２４項または第２５項のいずれかに記載の精製蛋白調製物を含む医薬組成物。２７．１つまたは２つ以上の医薬的に適切な担体または希釈剤と場合によって結合させた、請求の範囲第２４項または第２５項のいずれかに記載の精製蛋白の有効量を投与することを含む、人間または動物において（ａ）補体介在性または炎症介在性組織損傷の治療；（ｂ）腫瘍またはウイルスに対する免疫の強化；（ｃ）受精の制御；または（ｄ）自然流産の防止のための方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＤＵＣ１２Ｐ 21/02 ＣＡＤＹＣ１２Ｎ 5/00 ＢＡＥＤＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＥ 48/00 ＡＤＴＡＤＵＣ０７Ｋ 14/705 ＡＤＹＣ１２Ｎ 5/10 ＡＣＶＣ１２Ｐ 21/02 ＡＥＤ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ラブランド，ブルースオーストラリアヴィクトリア 3147，アッシュバートン，テイラーストリート 13 (72)発明者クリスチャンセン，デールオーストラリアヴィクトリア 3095，エルサムビューヒルクレセント 50 (72)発明者マッケンジー，イーアンエフ．シー. オーストラリアヴィクトリア 3056，ブランスウィックブランウィックロード 359

Claims

【特許請求の範囲】１．蛋白をコードする核酸がエクソンに存在するＡおよび／またはＴ富裕領域を有する場合に、宿主細胞における該蛋白産生を増加または改善する方法であって、当該方法が、当該領域におけるＡおよび／またはＴの量を減少または低下させることによって該核酸を改変し、さらに当該改変核酸を宿主細胞にトランスフェクションさせ、適切な条件下で当該核酸を発現させることを含む前記蛋白産生の増加または改善方法。２．当該改変核酸が、リコンビナント核酸構築物の成分として当該宿主細胞にトランスフェクションされる請求の範囲第１項の方法。３．核酸の当該改変が、１つまたは２つ以上の非表現型変異を生じさせるとによる請求の範囲第１項または第２項の方法。４．核酸の当該改変が１つまたは２つ以上の保存的変異を生じさせるとによる請求の範囲第１項または第２項の方法。５．核酸の当該改変が、ＡまたはＴ以外のヌクレオチドの１つまたは２つ以上の挿入による請求の範囲第１項または第２項の方法。６．核酸の当該改変が、Ａおよび／またはＴの欠失または、Ａおよび／またはＴ富裕領域の欠失による請求の範囲第１項または第２項の方法。７．核酸の当該改変が、下記のいずれかの２つ以上の組合せによる請求の範囲第１項または第２項の方法：ａ．１つまたは２つ以上の非表現型変異ｂ．１つまたは２つ以上の保存的変異ｃ．ＡまたはＴ以外のヌクレオチドの１つまたは２つ以上の挿入ｄ．Ａおよび／またはＴの欠失またはＡおよび／またはＴ富裕領域の欠失。８．当該核酸が、そのＳＣＲモジュールの１つまたは２つ以上に存在するＡおよび／またはＴ富裕領域を有するＲＣＡ蛋白をコードする核酸である、請求の範囲第１項から７項までのいずれかの方法。９．当該核酸がそのＳＣＲモジュールの１つまたは２つ以上で改変される請求の範囲第８項の方法。１０．請求の範囲第６項の方法において、核酸の当該改変が１つまたは２つ以上のＳＣＲモジュールまたはその部分の欠失による請求の範囲第９項の方法。１１．当該ＲＣＡ蛋白がＣＤ４６である請求の範囲第８項から第１０項のいずれかの方法。１２．構築物ｓｕｂＳＣＲ２、ｓｕｂＳＣＲ３、ｓｕｂＳＣＲ２＋３またはｄｅｌＳＣＲ／ｓｕｂＳＣＲ３の１つを利用する請求の範囲第１１項の方法。１３．請求の範囲第２項の方法において、当該リコンビナント核酸構築物が真核細胞ベクターを含む請求の範囲第３項から第１２項のいずれかの方法。１４．当該宿主細胞が真核宿主細胞である請求の範囲第１項から第１３項のいずれかの方法。１５．当該宿主細胞がＣＯＳ−７またはＣＨＯ−Ｋ１である請求の範囲第１４項の方法。１６．該核酸構築物の１つまたは２つ以上のエクソンに存在する１つまたは２つ以上のＡおよび／またはＴ富裕領域のＡおよび／またはＴの量が減少させられた、宿主細胞における蛋白産生を増加させることができるリコンビナント核酸構築物。１７．改変ＲＣＡｃＤＮＡ配列をコードする請求の範囲第１６項に記載のリコンビナント核酸構築物。１８．改変ＣＤ４６ｃＤＮＡ配列をコードする請求の範囲第１７項に記載のリコンビナント核酸構築物。１９．リコンビナント核酸構築物ｓｕｂＳＣＲ２、ｓｕｂＳＣＲ３、ｓｕｂＳＣＲ＋３およびｄｅｌＳＣＲ２／ｓｕｂＳＣＲ３。２０．動物の遺伝情報中に請求の範囲第１６項から第１９項のいずれかに記載の構築物またはその誘導物を取り込むことによる遺伝子導入動物の作出方法。２１．動物の遺伝情報中に請求の範囲第１８項から第１９項のいずれかに記載の構築物またはその誘導物を取り込むことによりその器官が細胞表面ＣＤ４６を産生する遺伝子導入動物の作出方法。２２．当該動物がブタである請求の範囲第２１項の方法。２３．請求の範囲第２１項または第２２項のいずれかの方法にしたがって作出される遺伝子導入動物の器官を利用する、人間または動物への器官移植の方法。２４．請求の範囲第１項から第１５項のいずれかによって製造される精製蛋白調製物。２５．請求の範囲第１６項から第１９項のいずれかに記載の核酸構築物によって製造される精製蛋白調製物。２６．１つまたは２つ以上の医薬的に適切な担体または希釈剤と結合させた、請求の範囲第２４項または第２５項のいずれかに記載の精製蛋白調製物を含む医薬組成物。２７．１つまたは２つ以上の医薬的に適切な担体または希釈剤と場合によって結合させた、請求の範囲第２４項または第２５項のいずれかに記載の精製蛋白の有効量を投与することを含む、人間または動物において（ａ）補体介在または炎症介在組織損傷の治療；（ｂ）腫瘍またはウイルスに対する免疫の強化；（ｃ）受精の制御；または（ｄ）自然流産の防止のための方法。