JPH10506791A - Microorganisms as therapeutic delivery systems - Google Patents

Microorganisms as therapeutic delivery systems

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JPH10506791A
JPH10506791A JP8512318A JP51231896A JPH10506791A JP H10506791 A JPH10506791 A JP H10506791A JP 8512318 A JP8512318 A JP 8512318A JP 51231896 A JP51231896 A JP 51231896A JP H10506791 A JPH10506791 A JP H10506791A
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lactobacillus
bacillus
bacillus subtilis
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JP8512318A
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アルド タグリアブエ，
デイアナ ボラシ，
パオラ ボツス，
ジヨバンニ マツキア，
ジヨバンニ マウリツツイ，
ステフアノ ポルツイオ，
パオロ ルツジーロ，
Original Assignee
ドンペ・ソチエタ・ペル・アチオニ
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 ある動物への治療用組成物の送達のための、その動物への組換え細菌（この細菌がその治療用蛋白質をコードする）の投与による方法および組成物。   (57) [Summary] Methods and compositions for the delivery of a therapeutic composition to an animal by administration of the recombinant bacterium to the animal, wherein the bacterium encodes the therapeutic protein.

Description

【発明の詳細な説明】 治療用送達系としての微生物 発明の分野 本発明は、動物への治療用化合物の送達のための媒介体としての微生物の使用 に関する。 発明の背景 組換えＤＮＡ技術を用いて作出される化合物の出現により、動物、特にヒトに おける多種多様の疾患状態を治療する能力を有する大多数の治療剤の開発が容易 となった。これらの薬物は事実上、主に蛋白質である。 抗生物質の発見以来、組換え蛋白質は最も有望な治療薬群の内の一つである一 方で、それらの使用には数々の問題が伴っている。具体的には、動物へのそのよ うな蛋白質の全身投与は、ほぼ必ずと言っていい程免疫応答を誘発し、この免疫 応答によりその蛋白質の破壊がもたらされることがある。従って、面倒でかつ費 用のかかる作業の後に得られる多くの組換え蛋白質は蛋白質分解メカニズムによ る動物内で迅速に破壊される運命にある。その薬物の作用のための標的部位が蛋 白質分解が亢進される既知の部位である動物粘膜となる状況下では、前述の障害 が激化することがある。このような粘膜表面には、その動物の口腔／腸管、気管 支／鼻咽頭管、および生殖器系が含まれる。 組換え蛋白質薬物の局所投与は、その蛋白質の増強された効能およびその蛋白 質の異化作用の低減を促進にさせることによりそれらの障害の幾つかは迂回され る。しかしながら、例えば、腸、気管支管、そして更 には生殖器系のような領域内への薬物の局所投与のための方法は、その数が限定 されている。 ＩＬ−１ｒａ遺伝子を用いて工学的に作製されたＢ．ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂ ｔｉｌｉｓ ）のインビボ投与により検出可能な血漿レベルの発現ＩＬ−１ｒａが もたらされ、従って薬理学的活性を有する蛋白質の経粘膜吸収の可能性が示され ることが、驚くべきことにここに見いだされた。 従ってこの知見により、組換え蛋白質バルクの発酵産生に今日まで記載および 使用されてきたそれ自体既知の形質転換微生物を、蛋白質構造を有する前記薬物 のインビボ放出のための担体として、用いることによる新規治療の可能性が開か れる。 組換え蛋白質の産生のために今日まで用いられてきた微生物の大半は実際にヒ トおよび動物へ安全に投与することができ、それらは生理学的微生物叢の通常の 構成成分であるか、もしくはいずれかの病原的危険性を欠失しているものである 。多数の真核生物蛋白質を産生するためのクローニングベクターとして広く用い られているバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１９９３、５７：１０９）については、認識されて いるその有利な特性を考慮すると特にこのことが当てはまる。 非病原性であり、かつヒトもしくは動物の粘膜に定着する能力という要件を満 たすとすれば、組換え蛋白質の産生のために既に用いられている他の種を用いる こともできる。従って本発明は、既に研究室または工業的環境下でタンパク質の 産生に使用されている微生物を、発現すべき蛋白質および発現ベクターを適切に 選択しかつ応用することにより、特定の治療上の問題に対処することを可能にす る。 従って本発明は、前記工学的に作製された微生物および同微生物を含む組成物 の治療上での使用に関し、この使用により動物への薬物の治療用送達の分野にお ける長年にわたる切実な要求性が満たされる。従来の技術 遺伝子工学的に操作された微生物のインビボ投与は既に、病原性微生物の抗原 に対する免疫を誘導するための手段として提唱されている。この事例では、保護 抗原をコードする遺伝子が細菌性ＤＮＡ内に適切な状態で挿入されてきた。 前記抗原の例には、ＨＩＶ蛋白質もしくはその断片（国際公開第９２／２１３ ７６号、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．３５１、ｐ．４７９−４８２、１９９１）、Ｂ ．アンスラキス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）毒素（国際公開第９２／１９７２０ 号）、ヒトパピローマウイルス タイプ１６からのＥ７蛋白質（Ｉｎｆｅｃｔｉ ｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６０、１９０２−１９０７、１９９７）、連 鎖球菌のプロテインＧの結合性領域ＢＢおよびヒトラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕ ｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ）からの蛋白質断片（Ｇｅｎｅ、１２８、８９ −９４、１９９３）が含まれる。 大半の事例では、これらの抗原は形質転換微生物の細胞表面に発現され、そし てそれらの抗原はその微生物からは放出されない。従ってこれらの微生物は、好 ましくは、免疫原およびワクチンの活性を働かせるように放出されるべきでない 、選択された抗原のための担体およびアジュバントとして作用する。 このアプローチはワクチン学的アプローチとして定義することができ、これは 現在に至るまでスタフィロコッカス キシロスス（Ｓｔａｐｈｙ ｌｏｃｏｃｃｕｓ ｘｙｌｏｓｕｓ）、バチルス アンスラキス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ストレプトコッカス ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔ ｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、もしくはミコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａ ｃｔｅｒｉａ ）（ＢＣＧ）株を用いて探索されてきた。 ワクチンとして遺伝子工学的に操作された微生物の使用に関するむしろ大多数 の報告とは対照的に、我々の知る限りでは、インビボで治療用蛋白質を送達する ためのサルモネラ チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒ ｉｕｍ ）のワクチン株を工学的に操作できることを示唆する報告はわずか一つ存 在するに過ぎない（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８、１１７６−１１８１、１１ ９２）。 しかしながら、組換え蛋白質としてのヒト１Ｌ−１βを用いて得られる結果は 落胆に値するものであり、それというのは、考慮された実験モデルでは形質転換 させた細菌の静脈内投与のみが十分な保護効果を示す一方で、経口もしくは腹膜 内経路の投与では高用量の範囲であったとしても一致しない保護効果を示すから である。ヒトに生きた細菌を静脈内経路で注入する実際的な可能性が除外される ため、この報告は工学的に操作された微生物の投与による粘膜生物送達の可能性 を示唆するよりはむしろ、実際には我々のアプローチとは掛け離れた教示を行っ ている。 発明の要約 本発明は、活性成分として、非ワクチン原性であって薬理学的活性を示す組換 え治療用蛋白質を発現する工学的に操作された微生物を含み、前記微生物がサル モネラ種ではない薬物学的組成物に関する。 図面の説明 図１は、ＩＬ−１ｒａ発現性プラスミド、ｐＳＥＴＡ−ＩＬ−１ｒａの概略図 である。 図２は、プラスミドｐＳＭ４４１の概略図である。 図３は、ＩＬ−１ｒａを発現するバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）から得られる同ＩＬ−１ｒａ含有試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥの 後の蛋白質のデンシトメトリー分析を示す。１：Ｂｉｏ−Ｒａｄ社から得られる 分子量（ｋＤａでの表示）マーカー（１５μｌ）；２：細胞溶解物上清（１５μ ｌ）；３：細胞溶解物上清から得られる部分精製されたＩＬ−１ｒａ（１５μｌ ）；４：胞子形成物上清（１５μｌ）；５：胞子形成物上清から得られる部分精 製されたＩＬ−ｌｒａ（１５μｌ）、を表す。矢印はＩＬ−１ｒａの電気泳動上 の移動を示す。 図４は、ヒトＩＬ−１ｒａの核酸および対応するアミノ酸の配列である。アミ ノ酸配列（一文字コード）の番号付けはシグナルペプチド（最初の２５アミノ酸 ）を含む完全な蛋白質に当てはまる。成熟蛋白質はアミノ酸番号２６（Ｒ２６） のアミノ酸アルギニンで開始する。 図５はパートＡ、Ｂ、およびＣを含み、（Ａ）では胞子形成を含むバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のライフサイクルの概略図 を示し；（Ｂ）ではバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ ｓ ）の胞子形成物上清内のＩＬ−１ｒａの存在を検出するウエスタン（Ｗｅｓｔ ｅｒｎ）ブロット実験の写真が示される。レーン１、野生型バチルス ズブチリ ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；レーン２、ｐＳＭ５３９を含みか つ組換えＩＬ−１ｒａを発現するバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ ｕｂｔｉ ｌｉｓ ）；（Ｃ）ではＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびレーザースキャニングデンシトメ トリーにより評定される胞子形成物上清内のＩＬ−１ｒａの検出を示すグラフが 示される。 図６は、ウサギ当たり２×１０9の生のバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ｐＳＭ５３９もしくはｐＳＭ２１４を含む）の単回 結腸内点滴注入物を投与したウサギにおけるＩＬ−１ｒａの血清濃度を示すグラ フである。ＩＬ−１ｒａはＥＬＩＳＡにより評定した。 図７は、２×１０9の生のバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ ｔｉｌｉｓ ）（ｐＳＭ５３９もしくはｐＳＭ２１４を含む）の二回分の結腸内点 滴注入物を投与したウサギにおけるＩＬ−１ｒａの血清濃度を示すグラフである 。各丸印は個々のウサギを表す。 図８は、ウサギ当たり２×１０9の生のバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ｐＳＭ５３９もしくはｐＳＭ２１４を含む）の単回 結腸内点滴注入後１時間目に７５ｎｇ／ｋｇの組換えヒトＩＬ−１βの静脈内投 与で治療したウサギの体温の上昇を示すグラフである。 図９は、ウサギ当たり２×１０9の生のバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ｐＳＭ２６１もしくはｐＳＭ２１４を含む）の単回 結腸内点滴注入物を投与したウサギの体温の上昇を示すグラフである。ＩＬ−１ β発現性細菌で処理した群では４０％の動物が低血圧性ショックで死亡した。 図１０は、１００ｎｇ／マウスの用量で腹膜内投与したＩＬ−１βにより誘導 される低血糖症を表すグラフである。これらの動物には更に、 食塩水（黒塗り棒）もしくは１００μｇのＩＬ−１ｒａ（斜交平行線）もしくは ｐＴ７ＭＩＬＲＡ−３を含む５×１０8の生の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（斜線）のいずれかを皮下投与し、各投与の２時間後にＩＬ−１β 処理を施した。 詳細な記述 本発明は、組換え工学的に操作された微生物を含み、そしてその微生物が動物 における様々な疾患状態の治療学的処置に有効である薬物学的組成物の調製法に 関する。本発明は更に、本発明の薬物学的組成物での治療を必要とする疾患状態 を有する動物へのそのような薬物学的組成物の投与方法も含む。 本発明は、様々な病理学的症状の治療学的処置に有用な、組換え工学的に操作 された微生物を含む薬物学的組成物を含む。本発明の方法は、動物の粘膜表面に 存続し、そして／または胞子形成もしくは溶解を受けて前記粘膜表面で発現され る組換え蛋白質を放出する所定の微生物の能力を利用する（その粘膜はその身体 の外部領域と内部領域との間の境界面を表す）。一旦動物に投与されると、所望 の治療用蛋白質をコードする本発明の組換え微生物は同蛋白質を発現および産生 する。そのようにして産生された蛋白質は、その後には産生部位で所望の治療効 果を有するか、もしくは所望の解剖学的部位に選択的に送達され、そしてその部 位でその後に所望の治療効果を発揮するかのいずれかとなる。 本発明では、所望の組換え蛋白質を発現させるように微生物を操作するが、こ れらの微生物はそれらを本発明の組成物を産生するため、およびそれらの使用法 において特に有用なものとする特性を有する。細菌および他の微生物の所定の特 性が、動物に対する治療学的組換え蛋白質の 投与のための媒介体としてそれらを有用なものとさせる目的で利用される。これ らの特性には、上皮細胞に付着する微生物の能力（Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａ ｌ．、１９８９、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：３０９）；不利な条 件に対して耐性を示し、かつ大量の蛋白質を産生することが可能な胞子を形成す る微生物（Ｋａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ １９９３、７３：２３７） が含まれるが、これらには限定されない。 微生物は腸管の粘膜、口腔および食道の粘膜、鼻、咽頭、気管の粘膜、膣粘膜 、皮膚、気管支肺系、眼、耳に対する選択的指向性を保持することが知られてい る。 本発明の方法に従うと具体的には、微生物、好ましくは細菌を、それが所望の 遺伝子を含み、その遺伝子が、ある動物における特定の疾患状態の治療に有用な 所望の蛋白質をコードするように操作される。その微生物をその動物に投与する が、その投与後にはその微生物から前記蛋白質が産生されて、その動物内に所望 の治療的処置が提供される。 所望の遺伝子を含むことに加え、その微生物は更に、その細菌による所望の蛋 白質の産生を容易にする他の配列因子をコードするように操作してもよい。その ような配列因子には、その蛋白質の構成性もしくは誘導性の発現を容易にさせる か、あるいはその細菌におけるその蛋白質の過剰発現を容易にさせるプロモータ ー／調節因子が含まれるが、これらには限定されない。追加的配列因子はその細 菌からの蛋白質の分泌、その細菌内でのその蛋白質の蓄積、および／またはその 細菌のプログラム化された溶菌（これは同細菌からのその蛋白質を放出させるこ とを目的とする）を容易にさせる配列因子も含んでもよい。先に引用される配列 因子の多くのものは当業者には知られている（Ｈｏｄｇｓｏｎ Ｊ．、１９９３ 、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：８８７）。 例えば、熱誘導、ガラクトース誘導、ウイルスプロモーター誘導、およびヒー トショック蛋白質誘導の系が当該技術分野では詳細に記載されており、かつ当業 者には容易に理解される。追加的誘導性発現系には、ストレス、金属イオン、他 の代謝産物および異化産物に応答する遺伝子発現系が含まれる。本発明で有用で あることがある他の因子は、用いられる予定の細菌の種類、発現される予定の蛋 白質の種類、およびその動物における標的部位の種類に依存するであろう。その ような因子は、本発明を一旦身につけた当業者には容易に明らかになるであろう 。 本発明は、薬理学的に活性な蛋白質を産生することが可能な微生物を含む。こ の薬理学的に活性な蛋白質は、その微生物内で産生され、かつ同微生物の溶解の 際に放出されることがあり；その蛋白質はその微生物によって用いられることが あるか、あるいは胞子形成の際か、もしくは栄養細胞を形成するための胞子の発 芽の際か、もしくは溶解の際にその微生物により放出されることがある。 本発明に有用である微生物の種類には、イーストおよび細菌が含まれるが、こ れらには限定されない。本発明に適するイースト微生物には、ハンセヌラ ポリ モルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス ラクティス（Ｋｌｕｉｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス マルキサヌス（Ｋｌｕｉｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）の亜種で あるラクティス（ｌａｃｔｉｓ）、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓ ｔｏｒｉｓ ）、サッカロミセス ケレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ ）、およびスキゾサッカロミセス ポムベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈ ａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）が含まれるが、これらには限定されない。 本発明の使用に適する細菌性微生物には、バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌ ｌｕｓ ｓｕｔｉｌｉｓ）および他の適切な胞子形成性細菌（ただしこれらには 限定されない）；ビフィドバクテリウム アドルスケンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム アン グラトゥム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｇｕｌａｔｕｍ）、ビフィ ドバクテリウム ビフィドゥム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄ ｕｍ ）、ビフィドバクテリウム ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ）、ビフィドバクテリウム カテヌラトゥム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍ ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム インファンテ ィス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテ リウム ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、および ビフィドバクテリウム プセウドカテヌラトゥム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）を初めとするビフィドバクテリウ ム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属のメンバー（ただしこれらには限定さ れない）；ブレビバクテリウム エピデルミス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）およびブレビバクテリウム ラクトフェルメントゥム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）を初めとする ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属のメンバー（ただしこ れらには限定されない）；エンテロバクテル アエロゲネス（Ｅｎｔ ｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクテル クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）を初めとするエンテロバクテル（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ）属のメンバー（ただしこれらには限定されない）； エンテロコックス ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉ ｓ ）を初めとするエンテロコックス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属のメンバー （ただしこれらには限定されない）；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ ｉ ）を初めとするエスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属のメンバー（ただ しこれらには限定されない）；ラクトバチルス アキドフィルス（Ｌａｃｔｏｂ ａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、ラクトバチルス ブル ガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチ ルス ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチル ス カセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス ク リスパトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバ チルス クルバトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラ クトバチルス デルブルエキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅ ｃｋｉｉ ）、ラクトバチルス デルブルエキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ）の亜種ブルガリクス（ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラク トバチルス デルブルエキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃ ｋｉｉ ）の亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス フェルメントゥ ム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス ガ ッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ ｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂ ａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルスヒルガルディイ（Ｌ ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ）、ラクトバチルス ジェンセ ニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、ラクトバチルス パ ラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチル ス ペントスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバ チルス プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、 ラクトバチルス レウテリイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉｉ ）、ラクトバチルス サケ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅ）、および ラクトバチルス バギナリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉ ｓ ）を初めとするラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバー （ただしこれらには限定されない）；ラクトコックス ラクティス（Ｌａｃｔｏ ｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコックス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏ ｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）の亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、およびラク トコックス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）の亜種ラク ティス（ｌａｃｔｉｓ）を初めとするラクトコックス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ）属のメンバー（ただしこれらには限定されない）；プロピオニバクテリウム ジェセニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｓｅｎｉｉ）を初めと するプロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属のメン バー（ただしこれらには限定されない）；スタフィロコックス エピデルミディ ス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を初めとするス タフィロコックス（Ｓｔａｐｈｙ ｌｏｃｏｃｃｕｓ ）属のメンバー（ただしこれらには限定されない）；ストレプ トコックス ラクティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、スト レプトコックス フォエカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｏｅｃａｌｉ ｓ ）、ストレプトコックス ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒ ｄｏｎｉｉ ）、ストレプトコックス ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコックス ムタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ ｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコックス セルモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔ ｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、およびストレプトコックス サ リバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）の亜種セル モフィルス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を初めとするストレプトコックス（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ）属のメンバー（ただしこれらには限定されない）、 が含まれる。 本発明の微生物は細菌であることが好ましい。この微生物が腸内微生物、もし くはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバー、特にＢ．ズブチリス（Ｂ．ｓ ｕｂｔｉｌｉｓ ）であることが更に好ましく、そして本発明の微生物がラクトバ チルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーであるか、もしくはその生 物体が組換えインターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）をコー ドするバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であるこ とが更に一層好ましい。 本発明に有用な他の微生物の例には、ストレプトコックス ピオゲネス（Ｓｔ ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコックス ムタンス （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、もし くはストレプトコックス ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄ ｏｎｉｉ ）が含まれ、それら各々は口腔内粘膜に定着し、そして歯肉および歯の 炎症性疾患を改善することが可能な抗−炎症性蛋白質を発現および放出すること が可能である。 同様に、例えば他のものの中でも、潰瘍性結腸炎およびクローン（Ｃｒｏｈｎ ’ｓ）病を初めとする腸の疾患の治療のために身体のその領域内に治療用蛋白質 を導入する目的で、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が腸粘 膜に定着する能力を利用することが可能である。このような細菌は経口的もしく は経腸的のいずれかでその動物に投与してもよい。腸粘膜の高吸収能を考慮に入 れると、本発明に従い、腸粘膜内の組換え細菌による組換え蛋白質の発現により 、産生された組換え蛋白質の、粘膜表面を横切る血流内への送達がもたらされ得 る。従って、組換え蛋白質の全身的送達も、同組換え蛋白質を発現することが可 能な組換え微生物を用いる本発明により企画されている。 胞子形態をとる際に天然の状態では極端な環境に対して耐性を示し、かつその ためそれらが胃酸の効果に対して耐性を示すという理由で経口投与に特に適する 胞子形成性細菌（すなわち、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）およ びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））を用いることも可能である。そのような細菌 は動物に経口的に投与した場合には、無傷で変化を受けない状態で腸粘膜に到達 するはずである。発芽の際には、これらの細菌はその後に腸粘膜内で所望の活性 蛋白質を産生するが、その蛋白質は別の方法では胃酸の効果を耐え抜くことがで きないかもしれない。 胞子形成性細菌は追加的には、胞子を産生し、そしてそのことにより 身体の標的粘膜部位に蛋白質を送達する能力について活用されることがある。こ の事例では、所望の蛋白質をコードする増殖状態で胞子形成性である細菌は、経 口もしくは経腸投与に適する製剤として調製される。腸粘膜に到達する際には、 そのような生物体は胞子形成を行うように誘導され、その場合、その栄養細胞は その誘導により、発現された蛋白質を粘膜内に放出する。この様式では、所望の 蛋白質の詳細に特定された用量が粘膜内に放出される。腸内での細菌による胞子 形成の誘導もしくは胞子の発芽の誘導は、そのような現象を制御するそれらの生 物体の遺伝子を更に操作することにより達成される。胞子形成性細菌を、それら が胞子形成の過程を開始するように誘導されるが、ただし胞子は形成することが できないように工学的に操作されていてもよいことは重要である。この場合、所 望の発現蛋白質を含む細胞は溶解し、そしてそのことによりその蛋白質を放出す るが；胞子は実際には形成されてはいないため、生きた細菌が宿主内に留まるこ とは全くない。 その遺伝子が適切な発現ベクター内に挿入される治療用蛋白質は、有効に利用 される目的では以下の要件を満たす必要がある： − その蛋白質は無毒性かつ非病原性である必要がある； − その蛋白質は非ワクチン原性である必要があり、それはすなわちその蛋白質 はその蛋白質自体に対するその宿主の防御作用を行う有意な免疫応答は誘導して はならない； − その蛋白質は発現された形態で活性を示す必要があるか、あるいは少なくと もその蛋白質はその微生物により一旦放出されたら活性形態に変換される必要が ある。本発明に従って投与されることがある蛋白質の例は大抵は真核生物蛋白質 であり、特にＢ．ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂ ｔｉｌｉｓ ）におけるその発現がＭｉｃｒｏｂｉｏｌ：Ｒｅｖ．１９９３、５７ ：１０９、において既に開示されているものである。一層具体的には、組換え治 療用蛋白質として本発明に有用である蛋白質をコードする遺伝子は以下の遺伝子 であるが、それらには限定されない。ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５ 、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ− １２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、およびＩＬ−１５を初めとするが、これらには 限定されないインターロイキンファミリーの遺伝子のメンバー、ならびにこれら の受容体アンタゴニストをコードする遺伝子。エリスロポイエチン、顆粒球コロ ニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロ ニー刺激因子、幹細胞因子、白血病阻害因子、およびトロンボポイエチンを初め とするが、これらには限定されない造血細胞成長因子をコードする遺伝子も本発 明で企図されている。神経成長因子、脳由来の神経栄養因子、および毛様体神経 栄養因子を初めとするが、これらには限定されない神経栄養因子をコードする遺 伝子も企図されている。それに加え、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、およ びＩＦＮ−ガンマーを初めとするがこれらには限定されないインターフェロンを コードする遺伝子が含まれる。本発明では更に、例えばＣ−Ｃファミリーおよび Ｃ−Ｘ−Ｃファミリーのサイトカインのようなケモカインをコードする遺伝子、 例えばプロインシュリンおよび成長ホルモンのようなホルモンをコードする遺伝 子、ならびに組織プラスミノゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、ウロキナー ゼを初めとする血栓溶解酵素、もしくは例えばトリプシンインヒビターのような 他の酵素をコードする遺伝子が企図されている。本発明は更に、例えばオンコス タチンＭ、血小板由来の成 長因子、繊維芽細胞成長因子、上皮成長因子、肝細胞成長因子、骨形態形成蛋白 質、インシュリン−様成長因子、カルシトニン、ならびにトランスフォーミンン グ成長因子アルファーおよびベータのような（ただしこれらには限定されない） 組織修復因子ならびに増殖および調節因子をコードする遺伝子を含む。本発明で 用いられる予定の遺伝子がインターロイキン受容体アンタゴニストをコードする ことが好ましく、そしてその遺伝子がＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ ｒａ）をコードすることが最も好ましい。 グリコシル化された形態でのみ活性を示す蛋白質が、例えばイーストのような 微生物内で発現される必要があることがよく熟知されている。 しかしながら非グリコシル化形態で活性を示す真核生物性蛋白質をコードする 遺伝子の使用が好ましく、なぜならそれらの遺伝子が例えば、Ｂ．ズブチリス（Ｂ ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、もしくはラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ）種のような細菌内で発現され得るためである。プ ロ形態もしくは発現後プロセシングからの活性化を必要としない蛋白質の使用も 好ましい。 本発明に従って、工学的に操作された微生物を介して投与することのできる特 に好ましい蛋白質は、ＩＬ−１ｒａ、インターフェロン、ＩＬ−１０、成長ホル モン、アルファ−１−アンチトリプシンである。 本発明において用いられる予定の遺伝子はインターロイキン受容体アンタゴニ ストをコードすることが好ましく、そしてそれらの遺伝子がＩＬ−１受容体アン タゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）をコードすることが最も好ましい。 ＩＬ−１ｒａがＩＬ−１の生物学的活性を有さず；むしろＩＬ−１ｒ ａが細胞を活性化させることなくＩＬ−１細胞受容体に結合し、そしてそのこと によりＩＬ−１活性のアンタゴニストとして機能することが重要である。 本発明の好ましい態様である、治療用処置として細菌内で発現されるＩＬ−１ ｒａの使用は、野生型ＩＬ−１ｒａ蛋白質に限定されるものと解釈されるべきで はない。本明細書における実施例に記載されるように、本発明はＩＬ−１ｒａ活 性を有するＩＬ−１ｒａの他の形態を含み、これらのＩＬ−１ｒａ形態は典型的 には野生型蛋白質における突然変異体を含む。このような突然変異体は発現され る蛋白質の増強されたＩＬ−１ｒａ活性を付与することがあるか、あるいはそれ らは、発現される蛋白質に安定性の亢進、粘膜吸着の亢進、もしくは他の特性を 付与することがあり、こうして発現される蛋白質を本発明の方法における使用の ための治療剤として更に一層適切なものとする。従って「ＩＬ−１ｒａ」によっ ては、本明細書で用いられる場合にはＩＬ−１ｒａ活性を有する蛋白質を意味し 、この蛋白質は野生型蛋白質および、野生型ＩＬ−１ｒａに実質的に類似する特 性を有するＩＬ−１ｒａ活性を有するそれらの突然変異体を含む。これらの特性 には例えば、ＩＬ−１受容体に結合し、かつＩＬ−１の生物学的活性のアンタゴ ニストとして作用する突然変異蛋白質の能力が含まれる。ＩＬ−１ｒａ活性を保 持するＩＬ−１ｒａの突然変異には、点突然変異、欠失、挿入、フレームシフト 突然変異、およびＩＬ−１ｒａ活性を保存しながらもその蛋白質の一次配列を変 化させる他の突然変異が含まれる。 ＩＬ−１ｒａにおける突然変異は、アミノ酸９１でのアミノ酸置換（図４を参 照されたい）を含む一方でアミノ酸９１は、グルタミン、アルギ ニン、リシン、ヒスチジン、およびチロシンよりなる群から選択されるアミノ酸 により置換される。この突然変異は更に、位置１０９でのアミノ酸置換も含むこ とがあり、この場合、位置１０９のアミノ酸は、セリン、アラニン、フェニルア ラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびメチオニンよりなる群から選 択されるアミノ酸により置換される。幾つかの事例では、この蛋白質は、位置９ １および１０９の両方にその蛋白質のアミノ酸置換が存在するように突然変異を 受けることがある。突然変異を受けたＩＬ−１ｒａではアミノ酸９１はアルギニ ンにより置換され、そして／またはＩＬ−１ｒａアミノ酸１０９はアラニンによ り置換される。 他のアミノ酸置換も本発明により企図されており、かつ野生型蛋白質と比較し てアミノ酸の位置９１および１０９以外の位置に異なる保存アミノ酸配列を含む 置換も含む。例えば、保存的アミノ酸変化は、その蛋白質もしくはペプチドの一 次配列を変化させる一方で、通常はその機能は変化させないで生じていてもよい 。保存的アミノ酸置換は典型的には、以下の群内での置換を含み、それらの群は ： グリシン、アラニン； バリン、イソロイシン、ロイシン； アスパラギン酸、グルタミン酸； アスパラギン、グルタミン； セリン、スレオニン； リシン、アルギニン； フェニルアラニン、チロシン、 である。 ある遺伝子内への突然変異の導入方法は当該技術分野において周知であり、か つ例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐ ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）に記載されている。 本発明の薬物学的組成物の投与により治療可能なヒトの疾患の種類には、クロ ーン（Ｃｒｏｈｎ’ｓ）病および潰瘍性結腸炎を含む炎症性腸疾患（ＩＬ−１ｒ ａもしくはＩＬ−１０で治療可能である）；乾癬、リューマチ性関節炎、紅斑性 狼瘡が含まれるが、ただしこれらには限定されない自己免疫疾患（ＩＬ−１ｒａ もしくはＩＬ−１０で治療可能である）；アルツハイマー（Ａｌｔｚｈｅｉｍｅ ｒ’ｓ）病、パーキンソン（Ｐｅｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ）病、および筋萎縮性側索 硬化症を含むが、ただしこれらには限定されない神経学的障害（脳由来の神経栄 養因子および毛様体神経栄養因子で治療可能である）；癌（ＩＬ−１、コロニー 刺激因子、およびインターフェロン−γで治療可能である）；骨粗鬆症（トラン スホーミング成長因子βで治療可能である）；糖尿病（インシュリンで治療可能 である）；循環器疾患（組織プラスミノーゲン活性化因子で治療可能である）； アテローム性動脈硬化症（サイトカインおよびサイトカインアゴニストで治療可 能である）；血友病（凝固因子で治療可能である）；変性性肝臓疾患（肝細胞成 長因子もしくはインターフェロンαで治療可能である）；例えば嚢胞性繊維症の ような肺疾患（アルファ−１ アンチトリプシンで治療可能である）；ならびに ウイルス感染症（いずれかの数の上記組成物で治療可能である）が含まれる。 本発明は更に、イヌ、ウマ、ネコ、および鳥類を初めとする他の動物 における疾患の治療も企図している。イヌの疾患には、イヌジステンパー（パラ ミクソウイルス）、イヌの肝炎（アデノウイルス Ｃａｖ−１）、イヌ伝染性気 管気管支炎すなわち咽頭気管炎（アデノウイルス Ｃａｖ−２）、感染性イヌ腸 炎（コロナウイルス）、および出血性腸炎（パルボウイルス）が含まれるが、こ れらには限定されない。ネコの疾患には、ウイルス性鼻気管炎（ヘルペスウイル ス）、ネコカリシウイルス病（カリシウイルス）、ネコ感染性腹膜炎（パルボウ イルス）、およびネコ白血病（ネコ白血病ウイルス）が含まれるが、これらには 限定されない。ウマおよび鳥類における他のウイルス性疾患も、本発明の方法お よび組成物を用いて治療可能であるとして企画されている。この目的のためには 組換えインターフェロンを発現する微生物の使用が特に好ましいであろう。 本発明の組換え微生物は、治療予定の疾患を有するヒトもしくは動物への投与 のための薬物学的製剤中に懸濁される。このような薬物学的製剤は、生きた微生 物および投与に適する培地を含む。組換え微生物は、例えばラクトース、他の糖 類、アルカリおよび／またはアルカリ土類金属のステアリン酸塩、炭酸塩、およ び／または硫酸塩（例えば、ステアリン酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、およ び硫酸ナトリウム）、カオリン、ケイ素、矯味・矯臭剤、ならびに香料のような 一般的賦形剤の存在下で凍結乾燥されることがある。そのように凍結乾燥された 微生物は、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、および粉末剤として調製してもよく、こ れら各々は経口経路により投与することもできる。別法では幾つかの組換え細菌 もしくはそれらの胞子でさえも適切な培地中の水性懸濁物として調製してもよく 、あるいは凍結乾燥させた細菌もしくは胞子を使用直前 に適切な培地中に懸濁してもよく、このような培地は本明細書に引用される賦形 剤、ならびに例えばグルコース、グリシン、および糖酸ナトリウムのような他の 賦形剤を含む。経口投与のためには、胃耐性経口剤形として製剤してもよく、こ の剤形は更にその微生物の制御放出を提供する化合物を含み、こうして微生物内 にコードされる所望の蛋白質の制御放出を提供してもよい。例えば、経口剤形（ 錠剤、ペレット剤、顆粒剤、粉末剤を初めとする）は、胃内での溶解もしくは破 壊を阻止するが、ただし腸内ではそのような作用を持たない薄層賦形剤（通常は 、ポリマー、セルロース系誘導体、および／または親油性物質）でコートされ、 そしてそのことにより腸内での崩壊、溶解、および吸収に有利になるように胃を 通過することが可能となることがある。この経口剤形は、例えば、制御放出、徐 放出、持続放出、持続作用性の錠剤もしくはカプセル剤として、その微生物およ びその組換え蛋白質の緩和な放出を可能とさせるように設計してもよい。これら の剤形は通常は従来からよく知られている賦形剤（例えば、親油性、ポリマー系 、セルロース系、不溶性、膨潤性の賦形剤）を含む。制御放出製剤は更に、腸、 結腸、生物吸着、もしくは舌下（すなわち、下顎骨粘膜）での送達、および気管 支送達を初めとするいずれかの他の送達部位についても用いられることがある。 本発明の組成物が経直腸もしくは経膣的に投与される予定である場合には、薬物 学的製剤は座薬およびクリーム剤を含むことがある。この事例では、その微生物 は脂質も含む通常の賦形剤の混合物中に懸濁される。既述の各製剤は当該技術分 野で周知であり、かつ例えば以下の引用文献に記載されている：Ｈａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｏｓａｇｅ ｆｏ ｒｍｓ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅ ｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ、５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｗｉｌｌｉａｍ ａ ｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）；Ｃｈｉｅｎ １９９２、Ｎｏｖｅｌ ｄｒｕｇ ｄｅ ｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ）； Ｐｒｅｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９、Ｎｏｖｅｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉ ｖｅｒｙ、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｃａｚｚａｎｉｇａ ｅｔ ａｌ ．（１９９４、Ｏｒａｌ ｄｅｌａｙｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆ ｏｒ ｃｏｌｏｎｉｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐ ｈａｒｍ．１０８：７７）。 従って本発明に従うと、所望の遺伝子をコードする組換え微生物は、経口、経 腸、経膣、もしくは経気管支経路のいずれかを介して動物もしくはヒトに投与し てもよい。投与のための微生物の用量は、細菌およびそれらの細菌によりコード される遺伝子の種類、治療予定の疾患の種類および重篤度、ならびに用いられる 予定の投与経路を初めとするいずれかの数の因子に依存して変化するであろう。 従って厳密な用量を本発明の各態様および全ての態様について特定することはで きないが、本発明を一旦身につけた当業者には容易に明らかになるであろう。こ の用量はいずれにせよ、周知の方法（例えば、ＥＬＩＳＡもしくはＢｉａｃｏｒ ｅのようなもの）を用いて、予め決定された細胞数の投与後のその組換え蛋白質 の血清レベル濃度を測定することによるその場その場の方法で決定されるであろ う（実施例を参照されたい）。送達される組換え蛋白質の速度論的特性および半 減期の分析により、形質転換された微生物についての有効用量範囲の決定を可能 にさせるに十分な情報が提供される。一例として、ＩＬ−１ｒａをコードするバ チルス ズブチリス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が、約１０9コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｋ ｇ（体重）／日の用量で動物に投与されることがある。 本発明の好ましい態様では、組換え遺伝子はＩＬ−１ｒａであり、かつ細菌は バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。ＩＬ− １ｒａは、構造的にはＩＬ−１のものに類似し、高親和性でＩＬ−１受容体に結 合するが、ただし標的細胞は活性化しない蛋白質である（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １１：４０４）。従っ てＩＬ−１ｒａはＩＬ−１の作用に対するアンタゴニストとして機能し、そして ＩＬ−１の作用を通して媒介される炎症性かつマトリックス破壊性疾患の治療に 有用な治療剤としての可能性を有する。このような疾患には、リューマチ性関節 炎、骨粗鬆症、および敗血症性ショックが含まれる。しかしながら、治療剤とし てインビボで有用であるためには、幾つかの事例ではＩＬ−１ｒａは継続的に高 用量で投与される必要がある。 従って本発明に従うと、ＩＬ−１ｒａをコードするように予め操作されている バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が、動物の例え ば腹腔、小腸、もしくは大腸のような様々な解剖学的部位にインビボで投与され る。その後には、その細菌の投与部位で産生される組換えＩＬ−１ｒａは多くの 事例においては、その動物の前記領域におけるＩＬ−１の影響を打ち消すことが 可能な、持続的に産生される治療剤として機能する。 提供される実施例には、ヒトＩＬ−１ｒａの様々なプロモーター領域およびコ ーディング配列のためのヌクレオチド配列が含まれるが、本発明は本明細書に示 されるそれらの配列と実質的な相同性を共有する他の 配列も含むものと解釈されるべきである。 「相同」は本明細書で用いられる際には、２本の高分子量分子の間、例えば、 ２本の核酸分子、ＤＮＡ分子、もしくは２本のＲＮＡ分子の間、または２本のポ リペプチド分子の間のサブユニット配列の類似性を意味する。その２本の分子の 両方におけるサブユニットの位置が同一のモノマーサブユニットで占められてい る場合（例えば、２本のＤＮＡ分子の各々の位置がアデニンで占められている場 合）には、それらはその位置においては相同となる。２本の配列の間の相同性は 、適合するかもしくは相同な位置の数の直接的関数となり、例えば２本の化合物 配列の内の半分の位置（例えば、長さが１０のサブユニットのポリマーの内の５ つの位置）が相同である場合には、その２本の配列は５０％相同となり、９０％ の位置（例えば１０の内の９）が適合するかもしくは相同である場合には、その ２本の配列は９０％の相同性を共有する。一例として、ＤＮＡ配列 ３’ＡＴＴ ＧＣＣ５’と３’ＴＡＴＧＧＣとは５０％の相同性を共有する。「実質的な相同 性」は、本明細書で用いられる際には、本明細書に記載されるヌクレオチドもし くはアミノ酸の配列に対して少なくとも５０％相同、好ましくは６０％相同、一 層好ましくは８０％相同、および最も好ましくは９０％相同であるヌクレオチド もしくはアミノ酸の配列を意味する。 以下の記載により、本発明の幾つかの実施例が提供される。これらの実施例は 添付される請求の範囲の領域を制限するとして考慮されるべきではない。 実施例１． 細菌内での異種遺伝子の発現系の実施例 バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）。バ チルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内への異種遺伝子 の構造性発現は、発現される予定の蛋白質をコードするｃＤＮＡをバクテリオフ ァージＴ５プロモーター領域の下流にクローニングすることにより達成してもよ く、そのプロモーター領域は以下の配列（配列番号３）： を含む。 このＴ５プロモーターは例えばｐＳＭ２１４（Ｖｅｌａｔｉ Ｂｅｌｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１７７）のような適 切なベクター内にクローン化され；Ｂ．ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の 適切な株は例えばＳＭＳ１１８である。所望の蛋白質をコードするｃＤＮＡを先 に示されるポリリンカー領域内にクローン化させる。 Ｂ．ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内への異種遺伝子のクローニングは 周知であり、かつ例えば、Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３、Ｂ ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｇｒａｍ Ｐｏｓｉ ｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．Ｄ．Ｃ．）に記載されている 。 バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内での異種遺 伝子の誘導性発現は、所望の蛋白質をコードするｃＤＮＡを、Ｔ５プロモーター 領域およびｌａｃオペレーター領域を含む調節領域の下流にクローニングするこ とにより達成される。所望の蛋白質の誘導性発現は、適切な宿主株内で発現され るＬａｃＩ抑制因子遺伝子のＩＰＴＧ−媒介性阻害により実施される（Ｓｃｈｏ ｎ ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ｇｅｎｅ １４７：９１−９４）。この事例では 、おおまかには以下のヌクレオチド（配列番号４）： を含む最少Ｔ５プロモーター領域が用いてもよい。 ｌａｃオペロン領域は上流にクローン化され、そして異種遺伝子はこの配列の 下流にクローン化される。クローニングを達成するための方法は当業者には既知 であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９、Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）に記載されている。ｌａｃオペレー ターもしくは他の誘導性発現系を介する遺伝子発現の誘導のための方法も当該技 術分野ではよく知られており、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ（上述）に記載されてい る。 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ ｉａ ｃｏｌｉ）における異種蛋白質の構成性発現はバチルス ズブチリス（Ｂ ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）について記載されるのと同一様式で達成さ れることがある。追加的クローニングベクターおよび発現系がＳａｍｂｒｏｏｋ （１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）に記載されている。 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における誘導発現は、ここに記 載されるものを初めとするいずれかの数の方法を用いて達成される。所望の異種 蛋白質をコードするｃＤＮＡはバクテリオファージＴ７の遺伝子１０のプロモー ター領域の下流にクローン化され（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８６、 Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３−１３０）、「そしてＴ７−特異的ＲＮ ＡポリメラーゼをコードするｃＤＮＡは、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）のような細菌宿主株内のｌａｃプロモーター の制御下にクローン化される」。所望の蛋白質の誘導性発現は先に記載されるＬ ａｃＩ抑制因子遺伝子のＩＰＴＧ−媒介性阻害により実施される。Ｔ７プロモー ターのＤＮＡ配列は以下の（配列番号５）５′ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ ＴＡＧＧＧＡＧＡのとうりである。この領域は例えばブルースクリプトシリーズ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）のもの、Ｔ７系を使用す る発現ベクター（ｐＲＳＥＴシリーズ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａ ｔｉｏｎ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、もしくはｐＥＴシリーズ、Ｎｏｖａｇ ｅｎ Ｉｎｃ．社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のような適切なベクター内にクロー ン化することができる。リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、およびＡＴＧ翻訳開始 コドン、および以下に示す多重クローニング領域（配列番号６）： を提供する追加的因子がこの配列（およびバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内での遺伝子の発現のために先に記載される配列）に 添加してもよい。 ＮｄｅＩ部位は異種蛋白質をコードするｃＤＮＡのクローニングにとってはえ り抜きの部位である。 ラクトコックス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）。ラ クトコックス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）内にクロ ーン化される異種遺伝子の構成性発現は、ラクトコックス ラクティス（Ｌａｃ ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）のフルクトース−１，６−二リン酸アルドラ ーゼの発現を制御するｐ３２プロモーター（Ｖａｎ ｄｅ Ｇｕｃｈｔｅ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６： ２６０６−２６１１）を用いて達成される。この領域は例えば、ｐＷＶ０１もし くはｐＳＨ７１（Ｋｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８４、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８：７２６）に本質的には由来するもののような適切 なベクター内にクローン化することができる。他の適切な発現ベクターはｐＭＧ ３６ｅ（Ｖａｎ ｄｅ Ｇｕｃｈｔｅ、上述）であり、そして追加的配列（この 配列は、リボソーム結合性部位および翻訳開始コドンを含む）を先に記載される 要領で添加してもよい。 ラクトコックス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）内で の異種遺伝子の誘導性発現は、先に記載される要領でＴ７の遺伝子１０プロモー ターを用いて達成される（Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｍｏｌ．Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ．８：１１５５−１１６２）。 ラクトバチルス エスピーピー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ ｐ．）。ラクトバチルス エスピーピー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ ．）内での遺伝子の構成性発現は、ラクトバチルス カセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃ ｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）のＬ（＋）−ラクテートデヒドロゲナーゼプロモータ ー（Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｌａ ｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ：ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｏｎ、Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ ６４：８５−１０ ７）を用いて達成される。このプロモーターは以下の配列（配列番号７） を有する。 先に記載される要領で、リボソーム結合部位および翻訳開始コドンを含む追加 配列因子が添加されうる。 所望の異種遺伝子をコードするｃＤＮＡは、例えばＰｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａ ｌ．、１９９３、上述、およびＰｏｓｎｏ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ａｐｐｌ ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：１８８２、に開示されるものの ような適切なベクター内でこのプロモーター領域の下流にクローン化される。 ラクトバチルス エスピーピー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）内 での異種遺伝子の誘導性発現は、ラクトバチルス アミロビルス（Ｌａｃｔｏｂ ａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｉｒｕｓ）のアルファーアミラーゼプロモーター 配列を用いて達成される。このプロモーターはセロビオースの存在下で誘導され 、そしてグルコースの存在下で抑制される（Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．、１ ９９３、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ；ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅ ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ ６４ ：８５−１０７）。アルファーアミラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は以下のと うりである（配列番号８） この配列は適切なベクター内にクローン化され、そして先に記載される要領で 、翻訳開始コドンを初めとする追加的因子を添加することができる。 誘導性発現は、ラクトバチルス ペントスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ ）のＤ−キシロースイソメラーゼプロモーター領域を用いて達 成されることもある。このプロモーターはキシロースの存在下で誘導される（Ｐ ｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｌａｃｔｏ ｂａｃｉｌｌｉ：ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 、Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ ６４：８５−１０７）。 Ｄ−キシロースイソメラーゼプロモーター領域のヌクレオチド配列は以下のとう りである（配列番号９） 本明細書に記載されるように、リボソーム結合部位および翻訳開始コドンを初 めとする追加因子をこの配列に添加してもよい。 定着性細菌により発現される組換え蛋白質の誘導は例えば、ａｍｙ−稼働性発 現系のためにセルビオースを経口投与することにより、適切な誘導物質を局所的 に提供することにより獲得することができる。 実施例２． ＩＬ−１ｒａ活性を有するＩＬ−１ｒａの突然変異体および野生 型形態 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）におけるヒト組換えＩＬ−１ｒ ａのクローニングおよび発現は以下の要領で実施された。ＩＬ−１ｒａをコード するｃＤＮＡは、標準法を用い、単球／マクロファージ細胞内で発現されるＲＮ ＡのｃＤＮＡプールについてＲＴ−ＰＣＲを実施することにより得られた（Ｓａ ｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ Ｙ）。増幅用に用いられたプライマーは以下のとうりである（配列番号１０およ び１１） 正方向用プライマーは、ＡＴＧ翻訳開始コドンを有するＮｄｅＩ部位を操作す るために設計されており、このＮｄｅＩ部位は成熟ＩＬ−１ｒａ蛋白質の第一ア ミノ酸（アルギニン、Ｒ２６）の直ぐ上流に存在する。逆方向用プライマーは、 そのプライマーがＩＬ−１ｒａ ｃＤＮＡの翻訳停止コドンの下流のＰｓｔＩ部 位を含むように設計された。増幅させ た断片をプラスミドｐＲＥＳＥＴＡ−ＩＬ−１ｒａのＮｄｅＩおよびＰｓｔＩ部 位内にクローン化させた。このプラスミドを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）株 ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｆ-、ｏｍｐＴ、ｈｓｄＤB、（ｒB -ｍB -） ｇａｌ、ｄｏｍ、（ＤＥ３））内に、標準法を用いて組み込ませた。発現プラス ミドｐＳＥＴＡ−ＩＬ−１ｒａのマップが図１に示される。 ＩＬ−１ｒａ内に突然変異を起こすには、ＩＬ−１ｒａ遺伝子のコーディング 領域の一部（これはアミノ酸３０〜１５２をコードする）をプラスミドｐＲＳＥ ＴＡ−ＩＬ−１ｒａから切り出し、そしてＰｓｔＩ部位間の突然変異誘発Ｂｌｕ ｅｓｃｒｉｐｔプラスミドＳＫ+内に再クローン化させ、そのことによりプラス ミドＢＳＫ−ＩＬ−１ｒａを作出する。この遺伝子の突然変異誘発は、Ａｐｐｌ ｉｅｄ Ｂｙｏｓｙｓｔｅｍｓ ３９２オリゴヌクレオチド合成機およびホスホ ルアミダイト化学法を用いて得られる合成オリゴヌクレオチドを用いて実施され る。アミノ酸アスパラギン９１をコードするコドンでＩＬ−１ｒａ遺伝子を突然 変異させるためには、相補配列（配列番号１２） を用いた。プラスミドＢＳＫ−ＭＩＬＲＡ−１（コドン９１に突然変異を含む） を取得するためには、その合成オリゴヌクレオチドを、標準的ハイブリダイゼー ション用緩衝液中の一本鎖プラスミドＢＳＫ−ＩＬ−１ｒａ ＤＮＡ（１０ｍｌ の緩衝液中に５ｐモルのオリゴヌクレオチドおよび０．２ｐモルの一本鎖ＤＮＡ を含む）と混合させた。この混合物を７０℃に暖め、それをゆっくりと３０℃に まで４０分間冷まし、そし て氷上に置いた。１ｍＬの標準合成用緩衝液、１ｍＬ（３単位）のＴ４ ＤＮＡ リガーゼ、および１ｍＬ（０．５単位）のＴ７ ＤＮＡポリメラーゼをその混合 物に添加した。３７℃で１時間インキュベーションした後に、その混合物を用い てコンピテント細胞を形質転換させた。陽性クローンの同定はヌクレオチド配列 分析により実施する。 位置１０９でのアミノ酸置換を含む突然変異ＩＬ−１ｒａを、合成オリゴヌク レオチド ５′ＣＴＣ ＡＡＡ ＡＣＴ ＧＧＣ ＣＧＴ ＧＧＧ ＧＣＣ ３ ′（配列番号１３）を用い、類似様式で作製した。各事例では、違うコドンを用 いて位置９１もしくは１０９のいずれかもしくは両方に違うアミノ酸置換を有す る突然変異ＩＬ−１ｒａを、先に記載される方法およびオリゴヌクレオチドを用 いて適切な位置に所望のコドンを挿入することにより作出してもよい。 次に、各突然変異配列を発現ベクター内にクローン化させ、例えばその配列を 位置ＳｐｅＩとＰｓｔＩとの間でベクターｐＲＳＥＴＡ−ＩＬ−１ｒａ内にクロ ーン化させて戻すことで、突然変異ＩＬ−１ｒａを含む様々な発現ベクターを作 出することができる。このプラスミドはベクターＲＳＥＴＡ−ＩＬ−１ｒａ内に クローン化されたＩＬ−１ｒａのアミノ酸の位置９１内に突然変異を含む。この プラスミド（Ｔ７ＭＩＬＲＡ−１）は位置９１にアルギニン残基をコードし、そ してＩＬ−１ｒａの生物学的活性を有する突然変異ＩＬ−１ｒａを発現する（以 下を参照されたい）。同様に、プラスミドｐＴ７ＭＩＬＲＡ−２は位置１０９の Ｔｈｒの代わりにアミノ酸置換Ａｌａを含む突然変異ＩＬ−１ｒａをコードし、 かつプラスミドＢＳＫ−ＭＩＬＲＡ−２を生じ、そしてプラスミドｐＴ７ＭＩＬ ＲＡ−３は位置９１のＡｓｎの代わりのアミノ酸置換 Ａｒｇおよび位置１０９のＴｈｒの代わりのアミノ酸置換Ａｌａの両方を含む突 然変異ＩＬ−１ｒａをコードし、かつプラスミドＢＳＫ−ＭＩＬＲＡ−３を生じ る。 実施例３． 大量の組換え蛋白質を産生することが可能なバチルスズブチリス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の作製 バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の胞子形成の自然過程（この過程は栄養細胞の 自然溶解を誘導する）が、大量の異種蛋白質がこの生物体内で発現させられかつ そこから回収されうるように開発されている。本明細書に与えられる実施例はバ チルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に関連しているものの、本発明は他の胞子形成性 細菌（例えば、クロストリジウム （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属に含まれるも の）を包括するものと解釈されるべきである。 バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の胞子形成は胞子形成に適する培地内にその細 菌を入れることにより誘導される（Ｊｏｎｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８３、 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：２３０５）。栄養性増殖 および胞子形成の両方は、細胞濃度が高いことを前提に、同一培地内（すなわち 、ポテト抽出培地）で得ることができる（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９ ８１、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４６：９７２）。胞子形成中にこの細菌性栄 養細胞は溶解し；従って胞子形成後には発現蛋白質が溶解した細胞から放出され 、そしてその上清中に回収される。 従って我々は、胞子形成性細菌が胞子形成物上清中に組換え蛋白質を効果的に 産生するという証拠を得ている。 更に、以下のデータにより本発明の適用性についての指針が提供され る。 以下に記載される実験は、（ｉ）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）内での組換え 蛋白質ＩＬ−１ｒａのクローニング、発現、および放出；（ｉｉ）そのように発 現された組換え蛋白質の精製法、を例示する。 （ｉ）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）からの組換えＩＬ−１ｒａのクローニン グ、発現、および放出。ＩＬ−１ｒａをコードするｃＤＮＡは、標準法を用いて 単球／マクロファージ細胞内で転写されるＲＮＡのｃＤＮＡライブラリーから逆 転写酵素（ＲＴ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて取得した（Ｓａｍｂ ｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ ｒ、ＮＹ）。増幅用に用いたプライマーは以下とうりであった（配列番号１４お よび１５） 正方向のプライマーは、成熟蛋白質の第一コドン（Ｒ２６）の上流の開始用Ａ ＴＧコドンの直ぐ５’側にＥｃｏＲＩ部位を作製するように設計された。同様に 、逆方向のオリゴヌクレオチドは、その蛋白質の翻訳停止コドンの下流にＰｓｔ Ｉ部位を導入するために設計された。増幅された断片をベクターｐＳＭ２１４内 のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ部位内にクローン化し、そのことによりｐＳＭ４４１を 作製した（図２）。このプラスミドを用いてバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌ ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＳＭ１８（ｌｅｕ-、ｐｙｒＤＬ、ｎｐｒ-、ａｐ ｒ-）を、 標準技術を用いて形質転換させた。この形質転換培養物は、使用するまでグリセ ロール中、−８０℃で維持した。 バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内での突然変 異ＩＬ−１ｒａ蛋白質の作製は、ＢＳＫ−ＭＩＬＲＡ−１、ＢＳＫ−ＭＩＬＲＡ −２、もしくはＢＳＫ−ＭＩＬＲＡ−３のＳｐｅＩ−ＰｓｔＩ制限断片をｐＳＭ ４４１の同一部位間にクローニングすることにより実施される。 バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内でＩＬ−１ ｒａ（これは細胞外に発現される）を作製するためには、用いられる正方向プラ イマーは、細胞からのその蛋白質の分泌に必須なズブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）の蛋白質をコードする配列に加え、先に提供される正方向プライマー配列を含 む。この正方向プライマーのヌクレオチド配列は以下のとうりである（配列番号 １６） この反応における逆方向プライマーは先に記載されるものと同一である。これ らの配列を含む増幅断片を発現ベクターｐＳＭ２４１内の対応するＥｃｏＲＩお よびＰｓｔＩ部位内にクローン化させてプラスミドｐＳＭ４４２ｓｅｃを作製す る。このプラスミドでのバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ ｌｉｓ ）の形質転換はプラスミドｐＳＭ４４１について先に記載された要領で実 施される。 ＩＬ−１ｒａを作製するためには、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含む １００ｍｌのルリア（Ｌｕｒｉａ）ブイヨン培地の２本のアリ コートに、グリセロール保存物に由来する初期接種物の１：２００希釈物（ＬＢ 中）を接種した。この培養物を７時間、３７℃で震盪しながらインキュベートし た。細菌を、３０００×ｇで２０分間、４℃の遠心分離により回収した。細胞を 、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）− ＮａＯＨ溶液、ｐＨ６．２５（緩衝液Ａ（Ｂｕｆｆｅｒ Ａ））で一度洗浄した 。この時点で細胞を、溶解物の調製まで−８０℃に保存するか、あるいはそれら を胞子形成用に即座に処理するかのいずれかを行った。 溶解物調製するためには、細胞を解凍し、そして１０ｍＬの緩衝液Ａ中に再懸 濁させ、そしてその後に８０Ｗの出力でＸＬ２０２０超音波処理機（Ｈｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍ社、Ｆａｒｍｉｎｇ ｄａｌｅ、ＮＹ）を用いる３０秒の超音波処 理および３０秒の氷水中での処理を１４周期分行うことで破壊した。この細胞溶 解物を３０，０００×ｇで３０分間、４℃での遠心分離にかけ、そしてその上清 をその遠心管の上部の脂質層が混入しないようにしながら回収した。この溶解物 は、使用するまで−８０℃に保存した。この上清を「Ｓｃ」と命名した。 胞子形成を誘導するためには細菌を、クロラムフェニコールを含まない１０ｍ ＬのＤｉｆｃｏ胞子形成用培地（３ｇ／ｌのバクト（Ｂａｃｔｏ）ビーフ抽出物 、５ｇ／ｌのペプトン、０．２５ｍＭ ＮａＯＨ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、０． １％ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＭｎＣｌ2、１ｍＭ Ｃａ（ＮＯ3）2、および１ｍ Ｍ ＦｅＳＯ4、ｐＨ６．８）中に再懸濁させた。細胞をおおよそ１２時間、３ ５℃で震盪しながらインキュベートした。形成された胞子を、３，０００×ｇで ２０分間、４℃の遠心分離により回収した。この上清は、使用するまで−８０℃ に保存した。 この上清を「Ｓｓ」と命名した。 （ｉｉ）ＩＬ−１ｒａの精製および評定。ＩＬ−１ｒａを取得するためには、 上清ＳｃおよびＳｓを解凍し、そしてＭｉｌｌｅｘ ＨＶ ０．４５ｍｍ単位（ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を通して濾過した。上清ＳｓのｐＨをＨＣｌを用いて６ ．２５に調節した。両上清を３時間、４℃で緩和に震盪しながら、１ｍＬのＱ− Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ陰イオン交換体（Ｐｈａｒｍｃｉａ社 ）の存在下でインキュベートした。この陰イオン交換体は緩衝液Ａ中で平衡化さ せてから上清と共にインキュベートし、そして同一ワックスを含むカラムをＰｏ ｌｙ−Ｐｒｅｐディスポーザブルカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）内に形成した。非 吸着性物質を回収し、そして先に記載の要領で、予め緩衝液Ａで平衡化させてあ る１ｍｌのＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ陽イオン交換体（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ社）の存在下でインキュベートした。緩衝液Ａ中での洗浄後、こ のＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２ｍｌの緩衝液Ａを用 いてバッチ溶出した。溶出された物質を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ １０遠心分離式 濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ社）を用いて０．２５ｍＬの容積にまで濃縮した。 先に記載される要領で取得された蛋白質を、１３．５％のミニＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅを通す電気泳動により分析し、そして標準的技術を用いる染色により可視化さ せた。これらの蛋白質バンドを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｐｅ ｒｓｏｎａｌ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒを用いるレーザースキャニングにより 更に詳細に分析し、そしてデンシトメトリーによる画像をＩｍａｇｅ Ｑｕａｎ ｔソフトウエアー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ社）を用いて取得し た。この分析の結 果が図３および表１にまとめられている。ＩＬ−１ｒａがこれらの細胞内で発現 されたことはこれらの結果から明白である。 既述の各調製物内の蛋白質量は、製造業者の指示事項に従い標準的Ｂｉｏ−Ｒ ａｄ蛋白質アッセイを用いて評定した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ蛋白質標準Ｉは、出発物 質内の蛋白質量を評定する際の標準として用いた。組換えＩＬ−１ｒａの精製標 準は、精製分画中のＩＬ−１ｒａの量を評定するための標準として用いた。ＩＬ −１ｒａの濃度は、２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．５、中の６Ｍ 塩酸グア ニジン溶液中の蛋白質の２ ８０ｎｍでの吸収（Ａ280）を測定することにより決定した。これらの条件下で はＰＣ／ＧＥＮＥソフトウエアー（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ社）をい用 いて算出されるＩＬ−１ｒａのＡ280 0.1％は０．９１０であった。 ＩＬ−１ｒａの生物学的活性はマウス胸腺細胞増殖アッセイにおいて測定した 。９６ウエルプレートのウエルあたり６×１０5細胞の濃度でプレート培養した 胸腺細胞は、５〜７週令のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）から取得した。この胸腺細胞を、ＲＰＭＩ−１６４ ０（Ｇｉｂｃｏ社）および５％ 非働化ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、２ ５ｍＭ ベーターメルカプトエタノール、５０ｍｇ／ｍｌ ゲンタマイシン（Ｓ ｉｇｍａ社）、および１．５ｍｇ／ｍｌ ＰＨＡ（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ社）中で培 養した。単独、あるいは様々な量の標準ＩＬ−１ｒａかもしくはＩＬ−１ｒａ含 有性分画（１０ｐｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度）の存在下のいずれかでの 固定濃度での組換えＩＬ−１ベータ（１単位＝３０ｐｇ／ｍｌ）を三重検定とし てウエルに添加した。添加後、胸腺細胞を３７℃下、５％ ＣＯ2を含む湿潤空 気中で７２時間インキュベートした。０．５ｍＣｉの3Ｈ−チミジン（ＤｕＰｏ ｎｔ−ＮＥＮ社）を添加し、そしてインキュベーションを一晩継続させた。その 後に細胞をガラス線維フィルター上に回収した。細胞内への3Ｈ−チミジンの取 り込みレベルをシンチレーション計測により決定した。１単位のＩＬ−１ｒａは 、５０％のＩＬ−１誘導増殖を阻害する量として算出される。表１に提供される データにより、溶解物の調製物中もしくは本発明の胞子形成性細菌の調製物中の ＩＬ−１ｒａの活性の間には有意な差異は全く存在しないことが 示唆される。 実施例４． インビボでのバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ ｔｉｌｉｓ ）内でのＩＬ−１ｒａの発現 ヒトＩＬ−１ｒａのヌクレオチドおよび対応するアミノ酸の配列が図４に示さ れる。ＩＬ−１ｒａをコードするバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ ｕｂｔｉｌｉｓ ）をマウスに腹膜内投与した。投与後の様々な時期に（この時期 は添付される表２に示される）、腹膜試料を腹膜の灌注により取得し、そしてそ れに加え血清試料も取得した。ウエスタンブロット分析を各試料につき、ウサギ 抗−組換えヒトＩＬ−１ｒａ抗体を用いて実施した。 本質的にはバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉs）は 、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールの存在下、３７℃で一晩、ＬＢ培地中で撹 拌を継続させながら継代した。この細菌を遠心分離により回収し、そして細胞を リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させた。約２０ｇの体重を有するメスＣ ３Ｈ／ＨｅＯｕＪマウスに、０．２ｍｌのＰＢＳ中のマウス当たり３×１０7細 菌を接種した。非処理動物を対照として用いた。 投与後３、６、および２４時間目に３ｍｌの生理学的食塩水を用いて腹膜灌注 を実施した。各時点で２匹の動物を屠殺した。更に血清試料も示される時間でマ ウスから取得した。灌注試料は５，０００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離にか け、そしてその上清を回収した。上清の１および３μｌのアリコートを電気泳動 およびウエスタンブロットにより分析した。ウサギ抗−ＩＬ−１ｒａ抗体を１： １００，０００に希釈し、そして１：１５，０００の比率でＧＡＲ／ＢＲＰ（Ｂ ｉｏ−Ｒａｄ社） に結合させ、そしてＩＢＩ Ｅｎｚｙｇｒａｐｈｉｃ Ｗｅｂ（Ｋｏｄａｋ社） システムを用いてその蛋白質の存在を検出した。陽性対照として、１０ｎｇのＩ Ｌ−１ｒａをｒａ−陰性血清の試料に添加する実験を実施した。表２に示される 結果は、この方法を用いて各試料内で検出されるＩＬ−１ｒａの相対量を反映す る。ＩＬ−１ｒａがマウスにおいて、具体的には投与後３時間目までに検出され ることは明らかである。抗−ＩＬ−１ｒａ抗体は、標準法を用いて組換えＩＬ− １ｒａを接種したウサギ内で調製された（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．、１９８ ８、Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。陽性対照として、１０ｎｇの ＩＬ−１ｒａをＩＬ−１ｒａ陰性血清の試料に添加した実験を実施した。表２に 示される結果は、この方法を用いて各試料において検出されるＩＬ−１ｒａの相 対量を反映する。ＩＬ−１ｒａがそれらのマウスにおいて、具体的には同ＩＬ− １ｒａを発現する細菌の投与の後に、投与後３時間目までに検出されることがあ ることは明らかである。 実施例５． ラットにインビボで投与されたバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのＩＬ−１ｒａの放出 約２００〜２５０ｇの体重のオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを２ ４〜４８時間絶食させた。これらのラットにフェノバルビタール（４５ｍｇ／ｋ ｇで筋肉内投与した）もしくはエーテルでの麻酔を施した。白線に沿う開腹を行 って胃腸管へのアクセスを可能にさせた。結腸の末端部および／または回腸の末 端部（回盲弁の上方０．５〜１ｃｍ）を同定し、そして結紮術を用いてその部分 と分離させた。 大腸内への細菌の投与のためには、３〜６×１０8の細菌（本明細書に記載さ れる要領で継代されたもの）を含む５〜１０ｍｌの０．２５×ＬＢ（すなわち、 通常含まれる構成成分の１／４の濃度を有するＬＢ）の用量を注射針で吸引し、 そして盲腸および大部分の結腸が充填されるように回盲弁の上方に注入した。注 射針の注入部の真下での外科的結紮術により閉塞が形成され、その結果、細菌の 腹腔内への侵入は回避された。 小腸への細菌の投与のためには、３〜６×１０8の細菌を含む１〜１０ｍｌの 範囲の容積を幽門の下方約０．５〜１ｃｍの小腸の近位部内に注入した。先に記 載される要領で、注射針の注入部の真下での外科的結紮術により閉塞を形成して 、腹腔内への細菌の侵入を防いだ。 投与後３、４、６、８、および２４時間目に動物を屠殺し、そして開腹を施し て腸を露出させた。腸管腔を、投与の位置に依存して盲腸もしくは十二指腸内へ 導入させた注射針により定圧（１００ｃｍ Ｈ2Ｏ）下で、１０〜５０ｍｌの滅 菌生理食塩水で洗浄した。灌注液のアリコート（１〜２ｍｌ）を５，０００×ｇ で３０分間、４℃で遠心分離にかけ、 そしてそこに含まれるＩＬ−１ｒａの量を記載される要領でウエスタンブロット により評定した。これらの結果は表３に示される。このデータから、ＩＬ−１ｒ ａが、同ＩＬ−１ｒａをコードするバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）の投与後に大腸および小腸の両方において放出されたことは 明白である。小腸と比較すると大腸内に一層多量のＩＬ−１ｒａが存在し、そし てＩＬ−１ｒａは大腸内に一層長期間存続するようである。 実施例６． ＩＬ−１ｒａをコードするバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の腹膜内投与後のエンドトキシンショックからのマウ スの保護 約２５ｇの体重を有するメスのＣ３Ｈ／ＨｅＯｕＪマウスに、記載される要領 で単回用量のバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を 腹膜内投与した。マウスは各々０．２ｍｌのＰＢＳ中の３×１０6の細菌の投与 を受けた。対照マウスは、野生型のバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）を投与されたマウスおよびＰＢＳのみを投与されたマウスを 含んでいた。投与後２４時 間目には、全動物に１５〜２０ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを腹膜内注射により投与した 。各検査群は１０〜２０匹の動物を含んでいた。各群のマウスの死亡数をＬＰＳ の投与後５〜７日目（この時点では４８時間以内には更に続く死亡が生じなくな った）まで記録した。これらのデータが表４に示される。これらのデータから、 ＩＬ−１ｒａをコードするバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ ｉｌｉｓ ）でのマウスの接種によりこれらのマウスは致死量のＬＰＳを耐え抜く ことが可能となったことは明白である。 実施例７． ウサギに投与したバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ ｕｂｔｉｌｉｓ ）内でのＩＬ−１ｒａの発現 以下に記載される実験に用いられたバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の株は以下のとうりである：細胞内で発現されるヒトＩＬ −１ｒａをコードする、プラスミドｐＳＭ５３９を含む株ＳＭＳ１１８；細胞内 で発現されるヒト成熟ＩＬ−１ベータをコードする、プラスミドｐＳＭ２６１を 含む株ＳＭＳ１１８；分泌形態で発現されるベーターラクタマーゼをコードする 、ｐＳＭ６７１に由来する プラスミドｐＳＭ２１４を含む株ＳＭＳ１１８：遺伝子型ｌｅｕ-、ｐｙｒＤＲ 、ｎｐｒ-、ａｐｒ-を有する各株ｐＳＭ２６１およびｐＳＭ２１４がＶｅｌａｔ ｉ Ｂｅｌｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８ ：１７７、に開示されている。ｐＳＭ５３９はイタリア特許出願公開第ＭＩ９４ ００１９１６号に開示されている。細菌を継代し、そして溶菌物を本明細書に記 載される要領でその細菌から調製した。 １．９〜２．３ｋｇの体重を有するメスのニュージーランド（Ｎｅｗ Ｚｅａ ｌａｎｄ）ウサギを２２±１℃下、１２時間毎の明暗周期条件下、標準ケージ内 で維持した。ウサギには１００ｇの標準餌を毎日、そして水を任意に与えた。 ウサギの結腸へのバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ ｓ ）の投与のためには、ウサギを１６〜１８時間の処理期間中絶食させた。その 後にこれらのウサギを標準的ストック保定器内に入れ、そして処置前に１時間気 候順応させた。先丸尿道カテーテル（Ｒｕｓｈ社、Ｇｅｒｍａｎｙ）を肛門を介 して遠位結腸内にそっと挿入させた。２ｍｌのＰＢＳ中のバチルス ズブチリス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の懸濁物を、ウサギに意識を保たせた ままの状態でカテーテルを通して投与した。 ウサギの温度を決定するためには、ウサギを実験期間中ずっと通常のストック 内で緩和な状態に保定しており、そして実験前に各ケーブ内でそのストックに対 して約２時間気候順応させた。動物の体温は、左後足と腹部との間に置かれ、そ して２分間安定させる皮膚サーミスタプローブ（ＴＭ−５４／ＳおよびＴＭＮ／ Ｓ；Ｌ．Ｓ．Ｉ．社、Ｉｔａｌｙ） により測定した。バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）の懸濁物（プラスミドｐＳＭ２１４もしくはｐＳＭ５３９を含み、ウサギ当た り２×１０9の細胞）を耳辺縁静脈を通し、発熱物質非含有性食塩水中の高度に 精製されたＬＰＳ非含有性組換えヒトＩＬ−１ベータの静脈内投与以前１時間目 に遠位結腸内に点滴注入した。動物の温度を、ＩＬ−１ベータの投与の時期から 開始して３時間の間２０分毎に記録した。ウサギにおけるＩＬ−１誘導性低鉄血 症を測定するためには、ウサギの鉄濃度を、１マイクログラム／ｋｇの組換えヒ トＩＬ−１ベータの静脈内接種後２、４、６、８、および２４時間目に取得され た試料内で評定した。この鉄アッセイは、市販品として入手可能なキット（Ｆｅ ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａ ｎｙ）を用いる比色アッセイであった。ＩＬ−１ベータの投与以前の通常の鉄レ ベルは１３４．７±６．６マイクログラム／ｄｌ（２５匹の動物の平均値±ＳＥ Ｍ）であった。低鉄血症（血漿中の鉄レベルの６０〜７５％の減少）はＩＬ−１ ベータ投与後約４〜約２４時間で明らかになった。ウサギ当たり２×１０9細胞 の濃度でｐＳＭ２１４もしくはｐＳＭ５３９を含むバチルス ズブチリス（Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株を遠位結腸に２度点滴注入し、一回はＩＬ −１ベータ投与の３時間前、そしてもう一回はＩＬ−１ベータ投与後１０分目で あった。 ウサギ血清中のＩＬ−１ｒａを検出するためには、血清を、バチルス ズブチ リス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の投与後０、１、２、４、および ８時間目に耳辺縁静脈を通して動物から取得した。ＩＬ−１ｒａの定量的決定は 、製造業者の指示事項に従い、特異的ＥＬＩＳ Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｕ Ｋ）で達成された。このアッセイでは低い方の検出限界は２０ｐｇ／ｍｌである 。精製されたＩＬ−１ｒａを標準として用いた。 血清中のＩＬ−１ｒａも、表面プラスモン共鳴の光学的現象により実時間生物 特異的相互作用分析を可能にするＢｉｏｓｅｎｓｏｒ ＢＩＡｃｏｒｅ（商標） システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ社、Ｕｐｐｓａｌａ 、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて測定した（Ｌｏｆａｓ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｊ ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１：１５２６）。固定化作業 は記載される要領で、ｐＨ７．４でのＨＢＳ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）１５０ｍ Ｍ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎ ｐ２ ０）中、５μｌ／分の流速で実施した（Ｌｏｆａｓ ｅｔ ａｌ．、１９９０、 Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１：１５２６；Ｆａｇｅｒ ｓｔａｍ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎ．３：２０８） 。精製されたポリクローナルＩｇＧ抗−ＩＬ−１ｒａを、以下の至適方法に従い 、第一級アミノ基を介してＣＭ５センサーチップのデキストランマトリックスに 連結させた。センサーチップのカルボキシル化されたマトリックスを最初に、Ｎ −ヒドロキシスクシンイミドとＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノプロピ ル）カルボジイミドとの４５μｌの１：１混合物で活性化させた。その後に７０ μｌの抗体溶液（ｐＨ４．５での１０ｍｌの酢酸ナトリウム中の１５０μｇ／ｍ ｌ）を注入した。遊離のアミノ基を４０μｌの１Ｍ 塩酸エタノールアミンで遮 断した。ＩＬ−１ｒａを含む試料をセンサーチップの表面を通過する定常流中に 導入させて、固定化抗体との相互作用を可能にさせ た。相互作用は共鳴角によって検出され、そして共鳴単位（ＲＵ）で表示される 。血清ＩＬ−１ｒａ濃度の評定用にＨＢＳ中のＩＬ−１ｒａの標準曲線を構築し た（３μｌ／分の流速で０．１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ）。ウサギ血清試料は 分析前にＣｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ（Ａｍｉｃｏｎ社、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍ Ａ）上で濾過した。血清試料中のＩＬ−１ｒａの濃度は、プレフィット（Ｐｒｅ ｆｉｔ）プログラムを用いて標準曲線に対して試料ＲＵを比較することにより算 出した。 ここで記載される実験結果は、平均値±ＳＥＭとして表示される。体温差は一 方向ＡＮＯＶＡにより評定し、そして有意性を９５％の信頼係数レベルで表示し た。 ＩＬ−１ｒａを細胞内で発現するように操作したバチルス ズブチリス（Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるインビトロ胞子形成の誘導（図５Ａ ）によりこの細菌は、胞子形成の誘導後数時間の内に（図５Ｃ）大量で無傷の活 性組換えＩＬ−１ｒａ（図５Ｂ）を放出することが可能となる。ＩＬ−１ｒａは やはりＩＬ−１ｒａを産生することが可能な細菌（ｐＳＭ５３９）を結腸内投与 したウサギの血清内で検出することが可能であったが、対照であるベーターラク タマーゼ発現性細菌（ｐＳＭ２１４）では検出されなかった。ウサギに、ＩＬ− １ｒａを産生することが可能な細菌（ｐＳＭ５３９）もしくは対照としてのベー ターラクタマーゼ（ｐＳＭ２１４）を結腸内投与した場合には、やはりＩＬ−１ ｒａが発現されるのが観察された（図６）。この場合、特異的ＥＬＩＳＡにより 測定されるＩＬ−１ｒａの存在は、ｐＳＭ５３９を含む２×１０9の生のバチル ス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の単回接種の後にウサ ギ血清中に数時間の間観察された。 ｐＳＭ２１４を投与されたウサギはＥＬＩＳＡては陰性と判定された。処置後の ウサギ血清中のＩＬ−１ｒａの存在はＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいて確認され た（図７）。 非経口的に投与されたＩＬ−１ベータの効果を拮抗する、バチルスズブチリス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）により送達されたＩＬ−１ｒａの能力 を調査した。図８では、ＩＬ−１ベータの静脈内注射後にウサギにおいて誘導さ れた体温の上昇は、ｐＳＭ２１４を予め投与されたウサギと比較した際にはｐＳ Ｍ５３９を予め投与されたウサギにおいては有意に減少したことが観察され得る 。それに加え、この減少は用量依存的であった。更に、ＩＬ−１ベータにより誘 導される低鉄血症は、ｐＳＭ２１４での処置を施したウサギと比較すると、ｐＳ Ｍ５３９での処置を施したウサギでは逆行していた。 動物への細菌の投与が有効な薬物送達法であることを更に詳細に立証するため に、ウサギにｐＳＭ２６１（ＩＬ−１ベータをコードする）を含むバチルス ズ ブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を投与した。この種類の細菌 を投与されたウサギは最高４０℃（この温度では動物は死亡した）までの有意な 体温上昇を示し、そして一般的にはそれらのウサギはあたかもＩＬ−１ベータを 静脈内投与されたかのようであった（図９）。 実施例８． マウスに投与した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） 内でのＩＬ−１ｒａの発現 この大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）内でＩＬ−１ｒａを発現さ せるためには、プラスミドｐＴ７ＭＩＬＲＡ−３で形質転換させた大腸菌（Ｅｓ ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を、６００ｎｍでの ０．４〜０．６の光学密度が達成されるまで、１００ｍｇ／ｌのアンピリシンを 含むＬＢ中で増殖させた。 その後にこの蛋白質の発現を、その培地への最終濃度２〜４ｍＭのＩＰＴＧの 添加により誘導した。これらの細胞を２．５〜３．０時間、３７℃下で震盪しな がらインキュベートした。その後に遠心分離により細菌を回収し、そしてその細 菌をマウスへの投与に適する量の食塩水中に再懸濁させた。 約２０〜２５ｇの体重を有するメスのＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスに、プラスミドｐ Ｔ７ＭＩＬＲＡ−３を含む大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の単回 皮下用量を投与した。投与した細菌数は５×１０7〜１．５×１０10細胞／用量 の範囲であり；マウスへの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）投与の 時期をマウスへのＩＬ−１βの投与前１時間〜３時間までに変化させた。全事例 において、得られた結果、すなわちマウスにおけるＩＬ−１ｒａの効力を比較し た。 ０時間目には、マウスに４μｇ／ｋｇの組換えヒトＩＬ−１βを腹膜内投与し た。ＩＬ−１βの投与後２時間目にそのマウスを屠殺し、そして血清試料を取得 した。その血清中のグルコースレベルを、市販品として入手可能なキット（Ｇｌ ｕｃｏｓｅ ＧＯＤ Ｐｅｒｉｄ：Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社 ）を用いてグルコースオキシダーゼでの反応により評定した。この結果は図１０ に示される。腹膜内ＩＬ−１βにより誘導された低血糖症の度合いが示される（ 黒塗り棒）。低血糖症は、ＩＬ−１ｒａ発現性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で予備処理したマウスでは顕著に減少した（斜線模様の棒）。陽性 対照としては、精製したＩＬ−１ｒａ（４ｍｇ／ｋｇ）をＩＬ−１βの 投与前１５分目に皮下投与し、そしてＩＬ−１βの投与を施した（掛け線模様の 棒）。陰性対照としては、マウスに、プラスミドｐＲＳＥＴ−Ａ（すなわち、Ｉ Ｌ−１ｒａをコードしないプラスミド）を含む大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（Ｄ３）を、ＩＬ−１βの投与以前に皮下投与した。こ れらのマウスにおいてＩＬ−１βにより誘導される低血糖症はｐＲＳＥＴ−Ａを 含む大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の投与によっては影響を受け ず、このことにより、動物の低血糖症において観察されるの減少の原因となるの は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）内でのＩＬ−１ｒａの発現であ るということが立証される。 従って本明細書に記載されるデータにより、動物に投与した際に組換え蛋白質 を発現する細菌は、動物の疾患の治療にとって有効かつ効果的な薬物送達用媒介 体として働くことが立証される。 従って本明細書に記載されるデータにより、動物に投与した際に組換え蛋白質 を発現する細菌は、動物の疾患の治療にとって有効かつ効果的な薬物送達用媒介 体として働くことが立証される。細菌の結腸内投与により、治療効果を有する、 動物のための薬物源が樹立される。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                     Microorganisms as therapeutic delivery systems Field of the invention   The present invention relates to the use of microorganisms as vehicles for the delivery of therapeutic compounds to animals. About. Background of the Invention   With the advent of compounds made using recombinant DNA technology, animals, especially humans, Development of the majority of therapeutic agents capable of treating a wide variety of disease states in It became. These drugs are primarily proteins in nature.   Since the discovery of antibiotics, recombinant proteins have been one of the most promising therapeutic classes. On the other hand, their use has a number of problems. To be specific, Systemic administration of such proteins almost always provokes an immune response, The response may result in destruction of the protein. Therefore, it is troublesome and costly Many of the recombinant proteins obtained after such laborious work are due to proteolytic mechanisms. Are destined to be quickly destroyed in animals. The target site for the action of the drug is In situations where animal mucosa is a known site where white matter degradation is enhanced, May intensify. Such mucosal surfaces include the oral / intestinal tract, trachea of the animal. Includes the branch / nasopharyngeal duct and the reproductive system.   Local administration of a recombinant protein drug may result in enhanced efficacy of the protein and the protein Some of these obstacles are bypassed by facilitating the reduction of quality catabolism. You. However, for example, intestines, bronchial tubes, and Methods for local administration of drugs into areas such as the reproductive system are limited in number Have been.   B. engineered using the IL-1ra gene. Subtilis (B.sub tilis ) Has a detectable plasma level of expressed IL-1ra by in vivo administration of Resulting in transmucosal absorption of pharmacologically active proteins Surprisingly found here.   Therefore, based on this finding, it has been described to date for fermentative production of recombinant protein bulk. The above-mentioned drug having a protein structure is prepared by transforming a known transformed microorganism which has been used. Opens new therapeutic potential by using it as a carrier for in vivo release of It is.   Most microorganisms used to date for the production of recombinant proteins are actually human. Can be safely administered to animals and animals, It is a component or lacks any pathogenic risk . Widely used as a cloning vector for producing a large number of eukaryotic proteins Bacillus subtilis (Bacillus  subtilis) (M microbiol. Rev .. 1993, 57: 109) This is especially true given its advantageous properties.   It is non-pathogenic and meets the requirements for its ability to colonize human or animal mucosa. Use other species already used for the production of recombinant proteins, if any You can also. Therefore, the present invention has already been developed for protein Properly select the protein and expression vector to be expressed in the microorganism used for production. Select and apply to enable specific therapeutic issues to be addressed You.   Accordingly, the present invention relates to the engineered microorganism and a composition comprising the microorganism. Use in the field of therapeutic delivery of drugs to animals. Years of compelling needs.Conventional technology   In vivo administration of genetically engineered microorganisms is already an antigen of pathogenic microorganisms Has been proposed as a means for inducing immunity. In this case, the protection Genes encoding antigens have been appropriately inserted into bacterial DNA.   Examples of the antigen include an HIV protein or a fragment thereof (WO 92/213). No. 76, Nature, Vol. 351, p. 479-482, 1991), B . Anthracis (B.anthracis) Toxins (WO 92/19720) No.), E7 protein from human papillomavirus type 16 (Infecti on and Immunity,60, 1902-1907, 1997), Binding region BB of streptococcal protein G and human rous sarcoma virus (Rou s Sarcoma Virus (Gene, 128, 89) -94, 1993).   In most cases, these antigens are expressed on the cell surface of transformed microorganisms and The antigens are not released from the microorganism. Therefore, these microorganisms are Preferably, it should not be released to exercise the activity of the immunogen and the vaccine Act as a carrier and adjuvant for the selected antigen.   This approach can be defined as a vaccinological approach, Until now, Staphylococcus xylosus (Staphy lococcus   xylosus), Bacillus anthracis (Bacill us   anthracis), Streptococcus pyogenes (Strept ococcus   pyogenes) Or mycobacteria (Mycoba cteria ) (BCG) strain.   Rather majority on the use of genetically engineered microorganisms as vaccines In contrast to our reports, to our knowledge, deliver therapeutic proteins in vivo Salmonella typhimurium forSalmonella  typhimur ium ) Only one report suggests that vaccine strains can be engineered. (J. Immunol.,148, 1176-1181, 11 92).   However, the results obtained using human 1L-1β as a recombinant protein are: It is depressing, because the considered experimental model Intravenous administration of isolated bacteria only provides sufficient protection while oral or peritoneal Intravenous administration provides inconsistent protective effects even at higher doses It is. Practical possibility of injecting live bacteria into humans via intravenous route is ruled out Therefore, this report suggests the possibility of delivery of mucosal organisms by administration of engineered microorganisms Rather than suggesting that, in practice, ing. Summary of the Invention   The present invention relates to a recombinant non-vaccinogenic and pharmacologically active as an active ingredient. An engineered microorganism that expresses a therapeutic protein, wherein said microorganism is a monkey. It relates to a pharmaceutical composition that is not a Monella species. Description of the drawings   FIG. 1 is a schematic diagram of an IL-1ra expression plasmid, pSETA-IL-1ra. It is.   FIG. 2 is a schematic diagram of plasmid pSM441.   FIG. 3 shows that Bacillus subtilis expressing IL-1ra (Bacillus  subtilis ) Of the same sample containing IL-1ra obtained from SDS-PAGE Figure 7 shows the densitometric analysis of the protein later. 1: Obtained from Bio-Rad Molecular weight (expressed in kDa) marker (15 μl); 2: Cell lysate supernatant (15 μl) l); 3: partially purified IL-1ra obtained from cell lysate supernatant (15 μl ); 4: Sporulation supernatant (15 μl); 5: Partial purification obtained from sporulation supernatant Represents IL-lra (15 μl) produced. Arrows on IL-1ra electrophoresis Indicates movement.   FIG. 4 is the nucleic acid and corresponding amino acid sequence of human IL-1ra. Ami No acid sequence (one letter code) is numbered with the signal peptide (first 25 amino acids) This applies to complete proteins, including The mature protein is amino acid number 26 (R26) Start with the amino acid arginine.   FIG. 5 includes parts A, B, and C, in which (A) Bacillus including sporulation Subtilis (Bacillus  subtilisSchematic diagram of life cycle (B) shows Bacillus subtilis (Bacillus  subtili s ) To detect the presence of IL-1ra in the sporulated product supernatant of Western (West) (ern) A photograph of the blot experiment is shown. Lane 1, wild-type Bacillus subtilis Su (Bacillus  subtilis); Lane 2, contains pSM539 Bacillus subtilis expressing one recombinant IL-1ra (Bacillus  s ubti lis ); (C) shows SDS-PAGE and laser scanning densitometry. Graph showing detection of IL-lra in sporulation supernatant as assessed by tree. Is shown.   FIG. 6 shows that 2 × 109Raw Bacillus subtilis (Bacill us   subtilis) (Including pSM539 or pSM214) Graph showing the serum concentration of IL-1ra in rabbits administered intracolonic instillations. It is. IL-1ra was evaluated by ELISA.   FIG. 7 shows 2 × 109Raw Bacillus subtilis (Bacillus  sub tilis ) (Including pSM539 or pSM214) twice in the colon FIG. 4 is a graph showing the serum concentration of IL-1ra in rabbits administered with instillation. . Each circle represents an individual rabbit.   FIG. 8 shows that 2 × 109Raw Bacillus subtilis (Bacill us   subtilis) (Including pSM539 or pSM214) One hour after intracolonic instillation, 75 ng / kg of recombinant human IL-1β was administered intravenously. 4 is a graph showing an increase in the body temperature of a rabbit treated with administration.   FIG. 9 shows 2 × 109Raw Bacillus subtilis (Bacill us   subtilis) (Including pSM261 or pSM214) Figure 4 is a graph showing the rise in body temperature of rabbits administered intracolonic instillations. IL-1 In the group treated with β-expressing bacteria, 40% of the animals died from hypotensive shock.   FIG. 10 shows induction by IL-1β administered intraperitoneally at a dose of 100 ng / mouse. 6 is a graph showing the hypoglycemia performed. These animals also have Saline (black bars) or 100 μg of IL-1ra (oblique parallel lines) or 5 × 10 including pT7MILRA-38Raw E. coli (Escherichia   coli) (Shaded lines) were administered subcutaneously, and IL-1β was administered 2 hours after each administration. Processing was performed. Detailed description   The invention includes a recombinantly engineered microorganism, and wherein the microorganism is an animal. For the preparation of pharmacological compositions that are effective for the therapeutic treatment of various disease states in children Related. The present invention further provides disease states requiring treatment with a pharmaceutical composition of the present invention. It also includes a method of administering such a pharmaceutical composition to an animal having a.   The present invention is a recombinantly engineered, useful therapeutic treatment of various pathological conditions Pharmaceutical compositions comprising the isolated microorganisms. The method of the present invention is applied to the mucosal surface of an animal. Survived and / or undergo sporulation or lysis and are expressed on the mucosal surface Exploits the ability of certain microorganisms to release recombinant proteins Represents the interface between the outer and inner regions of a). Once administered to an animal, Recombinant microorganism of the present invention encoding a therapeutic protein for expressing and producing the same I do. The protein so produced is subsequently produced at the site of production with the desired therapeutic effect. Or selectively delivered to a desired anatomical site, and Then either exert the desired therapeutic effect.   In the present invention, a microorganism is manipulated to express a desired recombinant protein. These microorganisms make them suitable for producing the compositions of the invention and their use. Have properties that make them particularly useful. Certain characteristics of bacteria and other microorganisms Sex of the therapeutic recombinant protein in animals It is utilized to make them useful as vehicles for administration. this These properties include the ability of microorganisms to adhere to epithelial cells (Karlsson et al. l. 1989, Ann. Rev .. Biochem. 58: 309); disadvantaged article Forms spores that are resistant to the disease and are capable of producing large amounts of protein Microorganisms (Kaiser et al., Cell 1993, 73: 237). , But are not limited to these.   Microorganisms are intestinal mucosa, oral and esophageal mucosa, nose, pharynx, tracheal mucosa, vaginal mucosa Is known to retain selective directivity to the skin, broncho-pulmonary system, eyes and ears You.   Specifically according to the method of the present invention, a microorganism, preferably a bacterium, Gene, which is useful in the treatment of certain disease states in an animal. It is manipulated to encode the desired protein. Administer the microorganism to the animal However, after administration, the protein is produced from the microorganism and the desired protein is produced in the animal. Is provided.   In addition to containing the desired gene, the microorganism further contains the desired protein by the bacterium. It may be engineered to encode other sequence elements that facilitate the production of white matter. That Such sequence elements facilitate the constitutive or inducible expression of the protein Or a promoter that facilitates overexpression of the protein in the bacterium -/ Modulators, but are not limited to these. Additional array factors are Secretion of the protein from the bacterium, accumulation of the protein in the bacterium, and / or The programmed lysis of the bacterium, which releases its protein from the bacterium For the purpose). Array referenced earlier Many of the factors are known to those skilled in the art (Hodgson J., 1993). Bio / Technology 11: 887).   For example, heat induction, galactose induction, viral promoter induction, and heat induction Toshock protein induction systems are well described in the art and It is easily understood by the person. Additional inducible expression systems include stress, metal ions, and others. Gene expression systems that respond to metabolites and catabolites of Useful in the present invention Other factors that may be present include the type of bacteria to be used, the protein to be expressed. It will depend on the type of white matter and the type of target site in the animal. That Such factors will be readily apparent to one of ordinary skill in the art once skilled in the art. .   The present invention includes a microorganism capable of producing a pharmacologically active protein. This Pharmacologically active protein is produced in the microorganism and May be released when the protein is used by the microorganism. Sporulation during sporulation or to form vegetative cells May be released by the microorganism upon bud or lysis.   Microorganisms useful in the present invention include yeast and bacteria. It is not limited to these. Yeast microorganisms suitable for the present invention include Hansenula poly Morpha (Hansenula  polymorpha), Kluyveromyces Lactis (Kluyveromyces  lactis), Kluyveromyces   Marxanus (Kluyveromyces  marxianus) Variants A certain lactis (lactis), Pichia pastoris (Pichia  pas toris ), Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces  cerev isiae ), And Schizosaccharomyces pombe (Schizosach aromyces   pombe), But are not limited thereto.   Bacterial microorganisms suitable for use in the present invention include Bacillus subtilis (Bacil rus   sutilis) And other suitable sporulating bacteria, except for But not limited to); Bifidobacterium adulskentis (Bifidob acterium   adolescentis), Bifidobacterium ann Gratum (Bifidobacterium  angulatum), Bifi Bacterium bifidum (Bifidobacterium  bifid um ), Bifidobacterium breve (Bifidobacterium  breve ), Bifidobacterium catenulatum (Bifidact erium   catenulatum), Bifidobacterium infante This (Bifidobacterium  infantis), Bifid Bacte Lum Longum (Bifidobacterium  longum),and Bifidobacterium pseudocaenulatum (Bifidobacteri um   pseudocatenulatum) And other bifidobacteria (Bifidobacterium) Members of the genus (but not limited to Not); Brevibacterium epidermis (Brevibacterium   epidermis) And Brevibacterium lactofermentum (Brevibacterium   lactofermentum) Brevibacterium (Brevibacterium) Member of the genus (but But not limited to); Enterobacter Aerogenes (Ent erobacter   aerogenes), Enterobacter cloacae (Enterobacter   cloacae) And other enterobacters (Enterobacter ) Members of the genus (but not limited to); Enterococcus faecalis (Enterococcus  faecali s ) And other Enterocox (Enterococcus) Member of the genus (But not limited to); E. coli (Escherichia  col i ) And other Escherichia (Escherichia) Member of the genus (just But not limited to these); Lactobacillus achidophilus (Lactob acillus   acidophilus), Lactobacillus amylobolus (Lactobacillus   amylovorus), Lactobacillus Bull Galix (Lactobacillus  bulgaricus), Lacto wasp Luz Brevis (Lactobacillus  brevis), Lactobacill Su Kasei (Lactobacillus  casei), Lactobacillus Lispathus (Lactobacillus  crispatus), Lactoba Chils Culbatus (Lactobacillus  curvatus), LA Kuttobacillus delbrueki (Lactobacillus  delblue ckii ), Lactobacillus delbrueki (Lactobacillus  delbrueckii ) Variants of Bulgaricus (bulgaricus), Easy Tobacillus delbrueki (Lactobacillus  delbruec kii Variants of Lactis (lactis), Lactobacillus fermentu (Lactobacillus  fermentum), Lactobacillus gas Seri (Lactobaci lplus   gasseri), Lactobacillus hervetics (Lactob acillus   helveticus), Lactobacillus hilgardii (L actobacillus   hilgardii), Lactobacillus jense Nii (Lactobacillus  jensenii), Lactobacillus spa LAKASEI (Lactobacillus  paracasei), Lactobacill S Pentos (Lactobacillus  pentosus), Lactoba Chills plantarum (Lactobacillus  plantarum), Lactobacillus reuteri (Lactobacillus  reuterii ), Lactobacillus salmon (Lactobacillus  sake),and Lactobacillus vaginalis (Lactobacillus  vaginali s ) And other Lactobacillus (Lactobacillus) Member of the genus (But not limited to); Lactococcus lactis (Lacto coccus   lactis), Lactococcus lactis (Lactoco ccus   lactis) Variants of Cremoris (cremoris), And easy Tocox Lactis (Lactococcus  lactis) Variants Tis (lactis) And other lactocox (Lactococcus ) Members of the genus (but not limited to); Propionibacterium Jeseny (Propionobacterium  jesenii) Propionibacterium (Propionobacterium) Men of the genus Bar (but not limited to); Staphylococcus epidermidi Su (Staphylococcus  epidermidis) Tafilocox (Staphy lococcus ) Members of the genus (but not limited to them); strep Tocox Lactis (Streptococcus  lactis), Strike Leptocox foecalis (Streptococcus  foecali s ), Streptococcus gordonii (Streptococcus  gor donii ), Streptococcus pyogenes (Streptococcus   pyogenes), Streptococcus mutans (Streptococ cus   mutans), Streptococcus sermophilus (Strept ococcus   thermophilus), And Streptococcus sa Rivarius (Streptococcus  salivarius) Variant cells Mofilus (thermophilus) And other Streptococcal (S treptococcus ) Genus members (but not limited to), Is included.   Preferably, the microorganism of the invention is a bacterium. If this microorganism is an intestinal microorganism, Bacillus (Bacillus) Members of the genus, especially B. Subtilis (B.s ubtilis ), And the microorganism of the present invention is Lactobacillus. Chills (Lactobacillus) Is a member of the genus or its raw An object encodes a recombinant interleukin 1 receptor antagonist (IL-1ra). Bacillus subtilisBacillus  subtilis) Is even more preferred.   Examples of other microorganisms useful in the present invention include Streptococcus pyogenes (St reptococcus   pyogenes), Streptococcus mutans (Streptococcus  mutans),if Or Streptocox Gordonii (Streptococcus  gord onii ), Each of which settles on the oral mucosa, and Expressing and releasing anti-inflammatory proteins capable of ameliorating inflammatory diseases Is possible.   Similarly, for example, among others, ulcerative colitis and clones (Crohn 'S) Therapeutic proteins in that region of the body for the treatment of intestinal diseases, including diseases For the purpose of introducingEscherichia  coli) Is intestinal sticky It is possible to take advantage of the ability to settle on the film. These bacteria are orally May be administered to the animal either enterally. Take into account the high absorption capacity of the intestinal mucosa Then, according to the present invention, the expression of the recombinant protein by the recombinant bacteria in the intestinal mucosa Can result in the delivery of the produced recombinant protein into the bloodstream across mucosal surfaces You. Therefore, systemic delivery of a recombinant protein can also express the recombinant protein. It is designed according to the invention using functional recombinant microorganisms.   When in spore form, it is naturally resistant to extreme environments and Especially suitable for oral administration because they are resistant to the effects of gastric acid Spore-forming bacteria (ie, Clostridium (Clostridium) And And Bacillus (Bacillus)) Can also be used. Such bacteria Reaches the intestinal mucosa intact and unchanged when administered orally to animals Should do it. During germination, these bacteria then have the desired activity in the intestinal mucosa. Produces protein, which can otherwise survive the effects of stomach acid. May not come.   Spore-forming bacteria additionally produce spores, and thereby It may be exploited for its ability to deliver proteins to target mucosal sites in the body. This In the case of Bacteria that are sporulating in a growing state that encode the desired protein, It is prepared as a formulation suitable for buccal or enteral administration. When reaching the intestinal mucosa, Such organisms are induced to undergo sporulation, in which case the vegetative cells The induction releases the expressed protein into the mucosa. In this manner, the desired A well-defined dose of the protein is released into the mucosa. Bacterial spores in the intestine Induction of formation or spore germination is dependent on their production controlling such phenomena. This is achieved by further manipulating the gene of the object. Sporulating bacteria, Is induced to initiate the process of sporulation, although sporulation may occur. It is important that they can be engineered so that they cannot. In this case, Cells containing the desired expressed protein will lyse and thereby release that protein The spores are not actually formed, so that live bacteria can remain in the host. Not at all.   Therapeutic proteins whose genes are inserted into appropriate expression vectors can be used effectively The following requirements must be fulfilled for the purposes to be performed: -The protein must be non-toxic and non-pathogenic; -The protein must be non-vaccinogenic, which means that the protein Induces a significant immune response that protects the host against the protein itself Must not; -The protein must be active in the expressed form, or at least Must be converted to the active form once released by the microorganism. is there. Examples of proteins that may be administered according to the invention are mostly eukaryotic proteins And especially B.I. Subtilis (B.sub tilis ) Is expressed in Microbiol: Rev. 1993, 57 : 109, has already been disclosed. More specifically, Genes encoding proteins useful in the present invention as therapeutic proteins include the following genes But not limited to them. IL-2, IL-3, IL-4, IL-5 , IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL- 12, IL-13, IL-14, and IL-15, including Non-limiting members of the interleukin family of genes, as well as A gene encoding a receptor antagonist. Erythropoietin, granulocyte colo Knee stimulating factor, granulocyte-macrophage colony stimulating factor, macrophage colo Knee stimulating factor, stem cell factor, leukemia inhibitory factor, and thrombopoietin However, genes encoding hematopoietic cell growth factors, including but not limited to It is intended in the light. Nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, and ciliary nerve Genes that encode neurotrophic factors, including but not limited to trophic factors A den is also contemplated. In addition, IFN-alpha, IFN-beta, and And interferons including but not limited to IFN-gamma Includes the encoding gene. The invention further provides, for example, CC families and A gene encoding a chemokine, such as a CXC family cytokine, Genes encoding hormones such as proinsulin and growth hormone Offspring and tissue plasminogen activator, streptokinase, urokiner Thrombolytic enzymes, such as ze, or, for example, trypsin inhibitors Genes encoding other enzymes are contemplated. The invention further provides, for example, oncos Statin M, a component derived from platelets Long factor, fibroblast growth factor, epidermal growth factor, hepatocyte growth factor, bone morphogenetic protein Quality, insulin-like growth factor, calcitonin, and transformin Like, but not limited to, growth factors alpha and beta Includes genes encoding tissue repair factors and growth and regulatory factors. In the present invention Gene to be used encodes an interleukin receptor antagonist Preferably, and the gene is an IL-1 receptor antagonist (IL-1 It is most preferred to code ra).   Proteins that are only active in glycosylated form, such as yeast It is well known that they need to be expressed in microorganisms.   However, it encodes a eukaryotic protein that is active in an unglycosylated form The use of genes is preferred because those genes are, for example, Subtilis (B .subtilis), E. coli (E.coli) Or Lactobacillus (Lactobacillus ) Because they can be expressed in bacteria such as species. Step Use of proteins that do not require activation from form or post-expression processing preferable.   In accordance with the present invention, features that can be administered via engineered microorganisms. Preferred proteins include IL-1ra, interferon, IL-10, and growth hormone. Mon, alpha-1-antitrypsin.   The gene to be used in the present invention is an interleukin receptor antagoni. Preferably, the genes encode the IL-1 receptor Most preferably, it encodes a tagonist (IL-1ra).   IL-1ra has no biological activity of IL-1; rather, IL-1r a binds to the IL-1 cell receptor without activating the cell, and Is important to function as an antagonist of IL-1 activity.   IL-1 expressed in bacteria as a therapeutic treatment, a preferred embodiment of the present invention The use of ra should be construed as being limited to the wild-type IL-1ra protein. There is no. As described in the Examples herein, the present invention relates to IL-1ra activity. And other forms of IL-lra, which are typical Include mutants in the wild-type protein. Such a mutant is expressed Or may impart enhanced IL-1ra activity of the protein Show that expressed proteins have enhanced stability, increased mucosal adsorption, or other properties. May be conferred, and the protein thus expressed may be used in the methods of the invention. More suitable as a therapeutic agent for Therefore, "IL-1ra" Means, as used herein, a protein having IL-1ra activity. This protein is a wild-type protein and features substantially similar to wild-type IL-1ra. And those mutants with IL-1ra activity. These characteristics Include, for example, antagonists that bind to the IL-1 receptor and Includes the ability of the mutein to act as a nest. Maintains IL-1ra activity Mutations in IL-1ra include point mutations, deletions, insertions, and frameshifts. Mutation and altering the primary sequence of the protein while preserving IL-1ra activity Other mutations that cause mutations are included.   The mutation in IL-lra was an amino acid substitution at amino acid 91 (see Figure 4). Amino acid 91 contains glutamine, argi An amino acid selected from the group consisting of nin, lysine, histidine, and tyrosine Is replaced by This mutation may also include an amino acid substitution at position 109. In this case, the amino acid at position 109 is serine, alanine, phenyla Selected from the group consisting of lanine, valine, leucine, isoleucine, and methionine. Replaced by the selected amino acid. In some cases, the protein is located at position 9 Mutations were made so that there was an amino acid substitution of the protein in both 1 and 109. May receive it. Amino acid 91 is arginine in the mutated IL-1ra. And / or IL-1ra amino acid 109 is replaced by alanine. Is replaced.   Other amino acid substitutions are also contemplated by the present invention and can be compared to the wild-type protein. Contains different conserved amino acid sequences at positions other than amino acid positions 91 and 109 Including substitutions. For example, a conservative amino acid change can result in a change in the protein or peptide. Changes may occur in the next sequence, but usually without changing its function . Conservative amino acid substitutions typically include substitutions within the following groups, which groups :   Glycine, alanine;   Valine, isoleucine, leucine;   Aspartic acid, glutamic acid;   Asparagine, glutamine;   Serine, threonine;   Lysine, arginine;   Phenylalanine, tyrosine, It is.   Methods for introducing mutations into a gene are well known in the art, For example, see Sambrook et al. , (1989, Molecular   Cloning; A Laboratory Manual, Cold Sp. ring Harbor, NY).   The types of human diseases that can be treated by administering the pharmaceutical compositions of the present invention include Inflammatory Bowel Disease (IL-1r), Including Crohn's Disease and Ulcerative Colitis a or IL-10); psoriasis, rheumatoid arthritis, erythematous Autoimmune diseases including, but not limited to, lupus (IL-1ra Or can be treated with IL-10); Alzheimer (Altzheim) r's) disease, Parkinson's disease, and amyotrophic lateral cord Neurological disorders, including but not limited to sclerosis, Can be treated with trophic factors and ciliary neurotrophic factors); cancer (IL-1, colonies Osteoporosis (can be treated with stimulants and interferon-γ); Diabetes (can be treated with insulin) Cardiovascular disease (treatable with tissue plasminogen activator); Atherosclerosis (can be treated with cytokines and cytokine agonists) Hemophilia (can be treated with coagulation factors); degenerative liver disease (hepatocyte formation) Can be treated with long factor or interferon alpha); eg, for cystic fibrosis Pulmonary disease such as can be treated with alpha-1 antitrypsin; and Viral infections, which can be treated with any number of the above compositions.   The invention further relates to other animals, including dogs, horses, cats, and birds. Treatment of disease in is also contemplated. Canine diseases include canine distemper (para Myxovirus), canine hepatitis (adenovirus Cav-1), canine infectious Tracheobronchitis or pharyngeal tracheitis (adenovirus Cav-2), infectious dog intestine Inflammation (coronavirus) and hemorrhagic enteritis (parvovirus). It is not limited to these. Cat diseases include viral rhinotracheitis (herpes virus) S), feline calicivirus disease (calicivirus), feline infectious peritonitis (parbow) Ills) and feline leukemia (feline leukemia virus), Not limited. Other viral diseases in horses and birds are also subject to the methods and methods of the present invention. And are treatable using the compositions. For this purpose It may be particularly preferred to use a microorganism that expresses the recombinant interferon.   Administration of the recombinant microorganism of the present invention to a human or animal having a disease to be treated Suspended in a pharmaceutical formulation for Such a pharmaceutical preparation is And media suitable for administration. Recombinant microorganisms include, for example, lactose, other sugars. , Alkali and / or alkaline earth metal stearates, carbonates and And / or sulfates (eg, magnesium stearate, sodium carbonate, and Sodium sulfate), kaolin, silicon, flavors / flavors, and fragrances May be lyophilized in the presence of common excipients. So freeze-dried Microorganisms may be prepared as capsules, tablets, granules, and powders. Each of them can also be administered by the oral route. Alternatively, some recombinant bacteria Or even their spores may be prepared as an aqueous suspension in a suitable medium Immediately before use, or freeze-dried bacteria or spores May be suspended in a suitable medium, such a medium comprising the excipients cited herein. Agents and other such as, for example, glucose, glycine, and sodium saccharinate. Contains excipients. For oral administration, they may be formulated as a gastric resistant oral dosage form. The dosage form further comprises a compound that provides for controlled release of the microorganism, May provide a controlled release of the desired protein encoded by For example, oral dosage forms ( Tablets, pellets, granules, powders, etc.) A thin excipient that prevents breakage, but does not have such an effect in the intestine (usually , Polymers, cellulosic derivatives, and / or lipophilic substances), And the stomach is thereby favored for disintegration, dissolution, and absorption in the intestine. It may be possible to pass. This oral dosage form can be, for example, controlled release, sustained release. Release, sustained release, sustained action tablets or capsules And its recombinant proteins may be designed to allow for a gradual release. these Dosage forms are generally known in the art from excipients (eg, lipophilic, polymer-based) , Cellulosic, insoluble, swellable excipients). Controlled release formulations can also be used in intestines, Colon, biosorption, or sublingual (ie, mandibular mucosal) delivery and trachea It may also be used for any other delivery site, including tributary delivery. If the composition of the invention is to be administered rectally or vaginally, a drug Pharmaceutical formulations may include suppositories and creams. In this case, the microorganism Are suspended in a mixture of conventional excipients also containing lipids. Each of the above-mentioned preparations is It is well known in the art and is described, for example, in the following references: Hansel et al. (1990, Pharmaceutical dose fo rms and drug de livery systems, 5th edition, William a nd Wilkins); Chien 1992, Novel drug de livery system, 2nd edition, M.P. Dekker); Prescott et al. (1989, Novel drug deli very, J.M. Wiley &Sons); Cazzaniga et al. . (1994, Oral delayed release system f or colonic specific delivery, Int. J. P harm. 108: 77).   Thus, according to the present invention, a recombinant microorganism encoding the desired gene can be administered orally, transdermally. Administered to animals or humans via either the intestinal, vaginal, or transbronchial route You may. The dose of microorganism for administration is coded by the bacteria and their bacteria Type of gene to be treated, type and severity of the disease to be treated, and It will vary depending on any number of factors, including the intended route of administration. Thus, it is not possible to specify an exact dosage for each and every aspect of the invention. Although not obvious, it will be readily apparent to those skilled in the art once the invention has been developed. This In any case, the dose of the compound may be determined by a well-known method (eg, ELISA or Biacor). e) using the recombinant protein after administration of a predetermined number of cells Determined in an in situ manner by measuring serum levels of (See Examples). Kinetic properties and half of the delivered recombinant protein Lifetime analysis allows determination of effective dose range for transformed organisms Enough information is provided. As an example, a bar encoding IL-1ra Chilus subtilis (Bac illus   subtilis) Is about 109Colony forming unit (cfu) / k Animals may be administered at a dose of g (body weight) / day.   In a preferred embodiment of the invention, the recombinant gene is IL-1ra and the bacterium is Bacillus subtilis (Bacillus  subtilis). IL- 1ra is structurally similar to that of IL-1 and binds to the IL-1 receptor with high affinity. But the target cell is a non-activating protein (Dinarello et al. 1991, Immunol. Today 11: 404). Follow IL-1ra acts as an antagonist to the action of IL-1 and For the treatment of inflammatory and matrix destructive diseases mediated through the action of IL-1 It has potential as a useful therapeutic agent. Such diseases include rheumatic joints Includes inflammation, osteoporosis, and septic shock. However, as a therapeutic agent In order to be useful in vivo, in some cases, IL-1ra is continuously high. It must be administered in doses.   Thus, according to the present invention, it has been previously manipulated to code for IL-1ra. Bacillus subtilis (Bacillus  subtilis) But the animal illustration Administered in vivo to various anatomical sites such as the abdominal cavity, small intestine, or large intestine You. Subsequently, the recombinant IL-1ra produced at the site of administration of the bacterium is In some cases, the effect of IL-1 in the area of the animal is counteracted. It functions as a possible, continuously produced therapeutic agent.   Examples provided include various promoter regions of human IL-1ra and The present invention provides the nucleotide sequences for Other sequences that share substantial homology with those sequences It should be construed to include sequences.   "Homology" as used herein, means between two high molecular weight molecules, for example, Between two nucleic acid molecules, DNA molecules, or two RNA molecules, or between two It refers to the similarity of the subunit sequences between the polypeptide molecules. Of the two molecules Subunit positions in both are occupied by the same monomeric subunit (Eg, when the position of each of two DNA molecules is occupied by adenine) ), They are homologous at that position. The homology between the two sequences is Is a direct function of the number of matching or homologous positions, eg two compounds Half of the sequence (eg, 5 of 10 subunit polymers) Two positions) are homologous, the two sequences are 50% homologous and 90% If the positions (e.g. 9 of 10) match or are homologous, The two sequences share 90% homology. As an example, the DNA sequence 3'ATT GCC5 'and 3'TATGGC share 50% homology. "Substantial homology `` Sex, '' as used herein, refers to any of the nucleotides described herein. Or at least 50% homology to the amino acid sequence, preferably 60% homology, Nucleotides that are preferably 80% homologous, and most preferably 90% homologous Alternatively, it means a sequence of amino acids.   The following description provides several embodiments of the present invention. These examples are It should not be considered as limiting the scope of the appended claims.   Embodiment 1 FIG. Example of expression system for heterologous gene in bacteria   Bacillus subtilis (Bacillus  subtilis). Ba Chilus subtilis (Bacillus  subtilisHeterologous gene into) Structural expression of bacteriologically isolated cDNA encoding the protein to be expressed Cloning downstream of the T5 promoter region. The promoter region has the following sequence (SEQ ID NO: 3): including.   This T5 promoter is, for example, pSM214 (Velati Bellini).   et al. , 1991, Biotechnol. 18: 177) B. cloned into a unique vector; Subtilis (B.subtilis)of A suitable strain is, for example, SMS118. CDNA encoding the desired protein Are cloned into the polylinker region shown in FIG.   B. Subtilis (B.subtilisCloning of the heterologous gene into These are well known and are described, for example, in Sonenstein et al. (1993, B acillus subtilis and Other Gram Posi five Bacteria, American Society for M microbiology, Washington. D. C. )It is described in .   Bacillus subtilis (Bacillus  subtilisHeterogeneous remains within) Inducible expression of the gene can be achieved by converting the cDNA encoding the desired protein into a T5 promoter. Cloning downstream of the regulatory region including the lac operator region and the lac operator region. Is achieved by Inducible expression of the desired protein is expressed in a suitable host strain. Performed by IPTG-mediated inhibition of the LacI repressor gene (Scho net et al. , 1994, Gene 147: 91-94). In this case , Roughly the following nucleotides (SEQ ID NO: 4): May be used.   The lac operon region has been cloned upstream and the heterologous gene has Cloned downstream. Methods for accomplishing cloning are known to those of skill in the art. And see, for example, Sambrook et al. (1989, Mole cultural Cloning: A Laboratory Manual, Co ld Spring Harbor, NY). lac operation Methods for inducing gene expression via a promoter or other inducible expression system are also described in the art. It is well known in the art and is described in Sambrook (supra). You.   E. coli (Escherichia  coli). E. coli (Escherich ia   coliConstitutive expression of heterologous proteins in Bacillus subtilis (B acillus   subtilisAchieved in the same manner as described for May be Additional cloning vectors and expression systems are available from Sambrook. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spr ing Harbor, NY).   E. coli (Escherichia  coliInduction expression in ()) is described here. Achieved using any number of methods, including those listed. Desired heterogeneity The cDNA encoding the protein is a promoter of gene 10 of bacteriophage T7. Cloned downstream of the promoter region (Studier et al., 1986, J. Mol. Biol. 189: 113-130), "and T7-specific RN. CDNA encoding A polymerase is, for example, E. coli (Escherichi a   coli) Lac promoter in bacterial host strains such as BL21 (DE3) Will be cloned under the control of The inducible expression of the desired protein is determined by L It is performed by IPTG-mediated inhibition of the acl repressor gene. T7 Promo The following DNA sequence (SEQ ID NO: 5): 5'TAATACGACTCACTA It is like TAGGGAGA. This area is for example the Blue Script series (Stratagene, La Jolla, CA) using T7 Expression vectors (pRSET series, Invitrogen Corpora) Tion, San Diego, CA, or pET series, Novag en Inc. In a suitable vector, such as Co., Madison, Wis. Can be Ribosome binding site (RBS) and ATG translation initiation Codons and multiple cloning regions shown below (SEQ ID NO: 6): Additional factors that provide for this sequence (and Bacillus subtilis (Bacill us   subtilisThe sequence described above for the expression of the gene within) It may be added.   NdeThe I site is critical for the cloning of cDNAs encoding heterologous proteins. It is a part of the punching.   Lactococcus lactis (Lactococcus  lactis). La Kutcox Lactis (Lactococcus  lactis) The constitutive expression of the heterologous gene to be transformed is determined by Lactococcus lactis (Lac tococcus   lactisFructose-1,6-diphosphate aldra) P32 promoter (Van de Guchte et.   al. , 1990, Appl. Environ. Microbiol. 56: 2606-2611). This region is, for example, if pWV01 Or pSH71 (Kok et al., 1984, Appl. Environ). . Microbiol. 48: 726), such as those derived essentially from Can be cloned into a simple vector. Another suitable expression vector is pMG 36e (Van de Guchte, supra) and additional sequences (this The sequence includes a ribosome binding site and a translation initiation codon) It may be added in a similar manner.   Lactococcus lactis (Lactococcus  lactis)At the inner Inducible expression of the heterologous gene of the T7 gene was promoted as previously described. (Wells et al., 1993, Mol. Mi. crobiol. 8: 1155-1162).   Lactobacillus sp.Lactobacillus  sp p. ). Lactobacillus sp.Lactobacillus  spp . Constitutive expression of the gene within Lactobacillus casei (Lactobac illus   casei) L (+)-lactate dehydrogenase promoter -(Pouwels et al., 1993, Genetics of la). ctobacilli: plasmids and gene express ion, Antonie van Leeuwenhoek 64: 85-10 7) is achieved. This promoter has the following sequence (SEQ ID NO: 7) Having.   Additional, including ribosome binding site and translation initiation codon, as described above Sequence factors can be added.   The cDNA encoding the desired heterologous gene is, for example, Pouwels et a l. 1993, supra, and Posno et al. , 1991, Appl. . Environ. Microbiol. 57: 1882, It is cloned downstream of this promoter region in such a suitable vector.   Lactobacillus sp.Lactobacillus  spp. ) Inducible expression of heterologous genes in Lactobacillus amylobilus (Lactob acillus   amylovirus) Alpha-amylase promoter Achieved using sequences. This promoter is induced in the presence of cellobiose And is inhibited in the presence of glucose (Pouwels et al., 1 993, Genetics   of lactobacilli; plasmids and gene e xpression, Antonie van Leeuwenhoek 64 : 85-107). The nucleotide sequence of the alpha amylase gene is as follows: Uri (sequence number 8)   This sequence is cloned into a suitable vector and processed as described above. Additional factors, including translation initiation codons, can be added.   Inducible expression is based on Lactobacillus pentosus (Lactobacillus  pentosus ) Using the D-xylose isomerase promoter region Sometimes it is done. This promoter is induced in the presence of xylose (P owels et al. , 1993, Genetics of lacto bacilli: plasmids and gene expression , Antonia van Leeuwenhoek 64: 85-107). The nucleotide sequence of the D-xylose isomerase promoter region is as follows: (SEQ ID NO: 9)   As described herein, the ribosome binding site and translation initiation codon Additional factors may be added to this sequence.   Induction of recombinant proteins expressed by colonizing bacteria can be performed, for example, by using amy-operable expression. Oral administration of cellobiose for the current system will provide the appropriate inducer locally Can be earned by providing   Embodiment 2. FIG. Mutants of IL-1ra having IL-1ra activity and wild Type form   E. coli (Escherichia  coli)) Human recombinant IL-1r The cloning and expression of a were performed as follows. Code IL-1ra The cDNAs to be expressed are expressed in RNs expressed in monocyte / macrophage cells using standard methods. A was obtained by performing RT-PCR on the cDNA pool of A (Sa mbrook et al. , Molecular Cloning: A La laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N Y). The primers used for amplification are as follows (SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 10). 11)   Forward primer has ATG translation initiation codonNdeOperate the I site This is designed forNdeThe I site is the first site of the mature IL-1ra protein. It is immediately upstream of the amino acid (arginine, R26). The reverse primer is The primer is located downstream of the translation stop codon of the IL-1ra cDNA.PstPart I Designed to include digits. Amplify Of the plasmid pRESETA-IL-1raNdeI andPstPart I Cloned in position. This plasmid is transformed into E. coli (Escherichia  coli ) Strain BL21 (DE3) (F-, OmpT, hsdDB, (RB -mB -) gal, dom, (DE3)) using standard methods. Expression plus A map of mid pSETA-IL-1ra is shown in FIG.   To mutate within IL-1ra, the coding of the IL-1ra gene A portion of the region (which encodes amino acids 30-152) is transformed into plasmid pRSE Cut out from TA-IL-1ra, andPstMutagenesis between I sites Blu script plasmid SK+To be re-cloned into Generate mid-BSK-IL-1ra. Mutagenesis of this gene is based on Appl Ied Byosystems 392 oligonucleotide synthesizer and phospho Performed using synthetic oligonucleotides obtained using luamidite chemistry You. Suddenly IL-1ra gene at codon encoding amino acid asparagine 91 To mutate, the complementary sequence (SEQ ID NO: 12) Was used. Plasmid BSK-MILRA-1 (contains mutation at codon 91) In order to obtain a synthetic oligonucleotide, the synthetic oligonucleotide is subjected to standard hybridization. Single-stranded plasmid BSK-IL-1ra DNA (10 ml 5 pmol of oligonucleotide and 0.2 pmol of single-stranded DNA in buffer ). Warm the mixture to 70 ° C and slowly bring it to 30 ° C. Let cool for 40 minutes And put it on ice. 1 mL of standard synthesis buffer, 1 mL (3 units) of T4 DNA Ligase and 1 mL (0.5 units) of T7 DNA polymerase Was added to the material. After incubation at 37 ° C. for 1 hour, the mixture was used. To transform competent cells. Identification of positive clones is nucleotide sequence Performed by analysis.   Mutant IL-1ra containing an amino acid substitution at position 109 was synthesized using a synthetic oligonucleotide. Reotide 5'CTC AAA ACT GGC CGT GGG GCC 3 '(SEQ ID NO: 13) in a similar fashion. Use different codons in each case Has a different amino acid substitution at either or both positions 91 and 109 Mutated IL-lra using the methods and oligonucleotides described above. And by inserting the desired codon at the appropriate position.   Next, each mutant sequence is cloned into an expression vector, for example, positionSpeI andPstI in the vector pRSETA-IL-1ra And return it to create various expression vectors containing the mutant IL-1ra. Can be issued. This plasmid is contained in the vector RSETA-IL-1ra. It contains a mutation within amino acid position 91 of the cloned IL-1ra. this The plasmid (T7MILRA-1) encodes an arginine residue at position 91 and To express a mutant IL-1ra having the biological activity of IL-1ra (hereinafter referred to as IL-1ra). See below). Similarly, plasmid pT7MILRA-2 is located at position 109. Encodes a mutant IL-1ra containing the amino acid substitution Ala instead of Thr, And yield the plasmid BSK-MILRA-2 and the plasmid pT7MIL RA-3 is an amino acid substitution for Asn at position 91 A projection containing both Arg and Ala, an amino acid substitution for Thr at position 109. Naturally encoding the mutant IL-1ra and generating the plasmid BSK-MILRA-3 You.   Embodiment 3 FIG. Bacillus subtilis capable of producing large amounts of recombinant proteins (Bacillus  subtilisProduction of   Bacillus (Bacillus), The natural process of sporulation (this process Induces spontaneous lysis), but large amounts of heterologous proteins are expressed in this organism and It is being developed so that it can be recovered from it. The example provided herein is a Chills (Bacillus) Although related to the genus, the present invention relates to other sporulating Bacteria (eg, those included in the genus Clostridium) ) Should be interpreted as inclusive.   Bacillus (Bacillus) Sporulation is carried out in a medium suitable for sporulation. Induced by inoculation of bacteria (Jongman et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. ScL USA 80: 2305). Vegetative growth And sporulation both take place in the same medium (ie, , Potato extraction medium) (Johnson et al., 19). 81; Bacteriol. 146: 972). During sporulation this bacterial The cultured cells are lysed; therefore, after sporulation, the expressed protein is released from the lysed cells. And recovered in the supernatant.   Therefore, we believe that sporulating bacteria can effectively integrate recombinant protein into sporulated product supernatants. There is evidence of production.   In addition, the following data provides guidance on the applicability of the present invention. You.   The experiments described below are based on (i) Bacillus (BacillusRecombination within) Cloning, expression, and release of the protein IL-1ra; (ii) A method for purifying the expressed recombinant protein is exemplified.   (I) Bacillus (Bacillus) Cloning of recombinant IL-1ra from , Onset, and release. CDNA encoding IL-1ra was prepared using standard methods. Reverse transcription from cDNA library of RNA transcribed in monocyte / macrophage cells Obtained using transcriptase (RT) polymerase chain reaction (PCR) (Samb Look et al. , 1989, Molecular Cloning: A   Laboratory Manual, Cold Spring Harbo r, NY). The primers used for amplification were as follows (SEQ ID NO: 14 and And 15)   The forward primer is a primer for initiation A upstream of the first codon (R26) of the mature protein. Immediately 5 'to the TG codonEcoDesigned to create RI sites. Likewise The reverse oligonucleotide is located downstream of the translation stop codon of the protein.Pst Designed to introduce an I site. The amplified fragment is placed in the vector pSM214. ofEcoRI-PstCloned into the I site, thereby creating pSM441 (FIG. 2). Using this plasmid, Bacillus subtilis (Bacil rus   subtilis) Strain SM18 (leu-, PyrDL, npr-, Ap r-), Transformation was performed using standard techniques. This transformed culture is glycated until use. Maintained at -80 ° C in the roll.   Bacillus subtilis (Bacillus  subtilisSudden change within Preparation of the different IL-1ra proteins was performed using BSK-MILRA-1, BSK-MILRA. -2 or BSK-MILRA-3SpeI-PstI restriction fragment to pSM This is done by cloning between the same 441 sites.   Bacillus subtilis (Bacillus  subtilis) Within IL-1 ra (which is expressed extracellularly) requires the Immer is a subtilis (essential for secretion of that protein from cells)subtilis ) In addition to the protein-encoding sequence No. The nucleotide sequence of this forward primer is as follows (SEQ ID NO: 16)   The reverse primer in this reaction is the same as described above. this The amplified fragment containing these sequences is used for the corresponding fragment in the expression vector pSM241.EcoRI AndPstClone into the I site to create plasmid pSM442sec You. Bacillus subtilis (Bacillus  subti lis ) Was performed as described above for plasmid pSM441. Will be applied.   To make IL-1ra, include 5 mg / l chloramphenicol Two ants of 100 ml Luria broth medium The coat was coated with a 1: 200 dilution (LB) of the initial inoculum from the glycerol stock. Medium) was inoculated. The culture was incubated for 7 hours at 37 ° C. with shaking. Was. Bacteria were harvested by centrifugation at 3000 × g for 20 minutes at 4 ° C. Cells 50 mM morpholinoethanesulfonic acid (MES) containing 1 mM EDTA Washed once with NaOH solution, pH 6.25 (Buffer A) . At this point, cells are stored at -80 ° C until lysate preparation or Were either processed immediately for sporulation.   For lysate preparation, thaw cells and resuspend in 10 mL of Buffer A Cloudy and then at a power of 80 W XL2020 sonicator (Heat 30 second sonication using System, Farmingdale, NY) The substrate was broken by 14 cycles of treatment in ice water for 30 seconds. This cell lysis The lysate is centrifuged at 30,000 × g for 30 minutes at 4 ° C. and the supernatant Was collected while keeping the lipid layer at the top of the centrifuge tube free from contamination. This melt Was stored at -80 ° C until use. This supernatant was named "Sc".   To induce sporulation, the bacteria were cultivated in 10 m without chloramphenicol. L Difco sporulation medium (3 g / l Bacto beef extract) 5 g / l peptone, 0.25 mM NaOH, 10 mM MgSOFour, 0. 1% KCl, 0.1 mM MnClTwo, 1 mM Ca (NOThree)Two, And 1m M FeSOFour, PH 6.8). Allow cells for approximately 12 hours, 3 Incubate at 5 ° C with shaking. The spores formed are 3,000 xg Collected by centrifugation at 4 ° C. for 20 minutes. The supernatant is kept at -80 ° C until use. Saved. This supernatant was named "Ss".   (Ii) Purification and evaluation of IL-1ra. To obtain IL-1ra, The supernatants Sc and Ss are thawed and Millex HV 0.45 mm units ( (Millipore). The pH of the supernatant Ss was adjusted to 6 using HCl. . Adjusted to 25. Both supernatants were shaken gently at 4 ° C for 3 hours, and 1 mL of Q- Sepharose Fast Flow Anion Exchanger (Pharmcia) ). This anion exchanger is equilibrated in buffer A. And incubated with the supernatant, and the column containing the same wax It was formed in a ly-Prep disposable column (Bio-Rad). Non The adsorbent is recovered and pre-equilibrated with buffer A as described above. 1 ml of S-Sepharose Fast Flow cation exchanger (Ph (Armacia). After washing in buffer A, Of S-Sepharose in 2 ml of buffer A containing 0.5 M NaCl. And eluted in batches. The eluted substance was centrifuged by Centricon 10 It concentrated to the volume of 0.25 mL using the concentrator (Amicon).   The protein obtained in the manner described above was combined with 13.5% mini SDS-PAG. Analyze by electrophoresis through E and visualize by staining using standard techniques. I let you. These protein bands were labeled with Molecular Dynamics Pes. By laser scanning using an rson Densitometer Analyzed in more detail, and imaged by densitometry, Image Quan t software (Molecular Dynamics) Was. The conclusion of this analysis The results are summarized in FIG. IL-1ra is expressed in these cells What was done is evident from these results.   The protein content in each of the preparations described above is determined by standard Bio-R according to the manufacturer's instructions. Ratings were made using the ad protein assay. Bio-Rad protein standard I is the starting material It was used as a standard in assessing protein content in the mass. Purification standard for recombinant IL-1ra The standard was used as a standard to assess the amount of IL-1ra in the purified fraction. IL The concentration of -1ra is 6M guar hydrochloride in 20 mM phosphate buffer, pH 6.5. 2 of protein in Niidine solution Absorption at 80 nm (A280) Was determined. Under these conditions Uses PC / GENE software (Intelligenetics) A of IL-1ra calculated280 0.1% Was 0.910.   Biological activity of IL-1ra was measured in a mouse thymocyte proliferation assay . 6x10 per well of 96 well plateFivePlated at cell concentration Thymocytes were obtained from 5-7 week old C3H / HeJ mice (The Jackson L.). laboratories). The thymocytes were converted to RPMI-164. 0 (Gibco) and 5% inactivated fetal bovine serum (Hyclone), 2 5 mM beta-mercaptoethanol, 50 mg / ml gentamicin (S igma) and 1.5 mg / ml PHA (Wellcome) Nourished. Alone or with varying amounts of standard IL-1ra or IL-1ra Either in the presence of a sexual fraction (concentration between 10 pg / ml and 100 ng / ml) Recombinant IL-1 beta at a fixed concentration (1 unit = 30 pg / ml) was used as a triplicate test. And added to the wells. After the addition, thymocytes were incubated at 37 ° C. in 5% CO 2.TwoIncluding wet sky Incubated in air for 72 hours. 0.5mCiThreeH-thymidine (DuPo) nt-NEN) was added and the incubation was continued overnight. That The cells were later collected on glass fiber filters. Into cellsThreeRemoval of H-thymidine The penetration level was determined by scintillation counting. One unit of IL-1ra is , Calculated as the amount that inhibits 50% of IL-1-induced proliferation. Provided in Table 1 According to the data, in the preparation of the lysate or in the preparation of the spore-forming bacteria of the invention The absence of any significant difference between the activities of IL-1ra It is suggested.   Embodiment 4. FIG. Bacillus subtilis in vivo (Bacillus  sub tilis Expression of IL-1ra within   The nucleotide and corresponding amino acid sequences of human IL-1ra are shown in FIG. It is. Bacillus subtilis encoding IL-1ra (Bacillus  s ubtilis ) Was administered intraperitoneally to mice. At various times after administration (at this time Is shown in attached Table 2), a peritoneal sample was obtained by peritoneal irrigation and In addition, serum samples were also obtained. Western blot analysis was performed on rabbits for each sample. Performed using anti-recombinant human IL-1ra antibody.   Essentially Bacillus subtilis (Bacillus  subtilis) Is And stirred in LB medium at 37 ° C. overnight in the presence of 5 mg / l chloramphenicol. The passage was continued while stirring was continued. The bacteria are recovered by centrifugation and the cells are Resuspended in phosphate buffered saline (PBS). Female C weighing about 20 g 3H / HeOuJ mice receive 3 × 10 3 per mouse in 0.2 ml PBS.7Fine The bacteria were inoculated. Untreated animals were used as controls.   Peritoneal irrigation with 3 ml of physiological saline at 3, 6, and 24 hours after administration Was carried out. Two animals were sacrificed at each time point. In addition, serum samples are Obtained from Us. Irrigation samples should be centrifuged at 5,000 xg for 30 minutes at 4 ° C. And the supernatant was collected. Electrophoresis of 1 and 3 μl aliquots of supernatant And Western blot analysis. Rabbit anti-IL-1ra antibody: Diluted to 100,000 and GAR / BRP (B io-Rad) And IBI Enzygraphic Web (Kodak) The system was used to detect the presence of the protein. As a positive control, 10 ng of I An experiment was performed in which L-1ra was added to a sample of ra-negative serum. Shown in Table 2 The results reflect the relative amount of IL-1ra detected in each sample using this method. You. IL-1ra is detected in mice, specifically by 3 hours after administration It is clear that. The anti-IL-1ra antibody was prepared using recombinant IL-Ira using standard methods. 1ra (Harlow et al., 198). 8, In: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY). As a positive control, 10 ng An experiment was performed in which IL-1ra was added to a sample of IL-1ra negative serum. Table 2 The results shown indicate the phase of IL-1ra detected in each sample using this method. Reflect the volume. IL-1ra is specifically expressed in those mice, After administration of bacteria expressing 1ra, it may be detected by 3 hours after administration. It is clear that.   Embodiment 5 FIG. Bacillus subtilis administered to rats in vivo (Baci lplus   subtilisRelease of IL-1ra from   Two male Sprague-Dawley rats weighing approximately 200-250 g Fasted for 4-48 hours. Phenobarbital (45 mg / k) was given to these rats. g) or anesthesia with ether. Perform laparotomy along the white line Allowed access to the gastrointestinal tract. End of colon and / or end of ileum The end (0.5-1 cm above the ileo-cecal valve) was identified and the part was ligated using ligation. And separated.   For administration of bacteria into the large intestine, 3-6 × 108Bacteria (described herein) 5 to 10 ml of 0.25 × LB (ie, those passed on in the manner A dose of LB) having a concentration of 1/4 of the normally contained component is aspirated with a syringe needle, It was then injected above the ileocecal valve so that the cecum and most of the colon was filled. note Surgical ligation just below the injection point of the shooting needle creates an occlusion, resulting in bacterial Invasion into the abdominal cavity was avoided.   For administration of bacteria to the small intestine, 3-6 x 1081 to 10 ml of bacteria The volume of the range was injected into the proximal part of the small intestine approximately 0.5-1 cm below the pylorus. Written earlier In the manner described, an occlusion is created by surgical ligation just below the injection site of the injection needle. , Preventing bacteria from entering the abdominal cavity.   Animals were sacrificed at 3, 4, 6, 8, and 24 hours after dosing and laparotomy was performed. To expose the intestine. Intestinal lumen into cecum or duodenum depending on location of administration Constant pressure (100 cm HTwoO) Under 10-50 ml of elimination The cells were washed with physiological saline. Aliquots (1-2 ml) of irrigation solution were 5,000 xg For 30 minutes at 4 ° C. Then, Western blot according to the description of the amount of IL-1ra contained therein. Was rated by These results are shown in Table 3. From this data, IL-1r a is Bacillus subtilis encoding the same IL-1ra (Bacillus  subtilis ) Was released in both large and small intestine It is obvious. Compared to the small intestine, a larger amount of IL-1ra is present in the large intestine, and Thus, IL-1ra appears to persist for longer periods in the large intestine.   Embodiment 6 FIG. Bacillus subtilis encoding IL-1ra (Bacill us   subtilis) Mouse from endotoxin shock after intraperitoneal administration Protection   Procedure described in a female C3H / HeOuJ mouse weighing about 25 g A single dose of Bacillus subtilis (Bacillus  subtilis) It was administered intraperitoneally. Mice were 3 x 10 in 0.2 ml PBS each.6Administration of bacteria Received. Control mice were wild-type Bacillus subtilis (Bacillus  subtilis ) And mice receiving only PBS Included. 24 hours after administration In the meantime, all animals received 15-20 mg / kg LPS by intraperitoneal injection . Each test group contained 10-20 animals. LPS for the number of dead mice in each group 5 to 7 days after administration of the compound (at which point no further deaths occur within 48 hours) ). These data are shown in Table 4. From these data, Bacillus subtilis encoding IL-1ra (Bacillus  subt ilis ) These mice survive a lethal dose of LPS It is clear that this is possible.   Embodiment 7 FIG. Bacillus subtilis administered to rabbits (Bacillus  s ubtilis Expression of IL-1ra within   Bacillus subtilis used in the experiments described below (Bacillus   subtilis) Is as follows: human IL expressed in cells Strain SMS118 containing plasmid pSM539, encoding -1ra; intracellular Plasmid pSM261 encoding human mature IL-1 beta expressed in Includes strain SMS118; encodes beta-lactamase expressed in secreted form Derived from pSM671 Strain SMS118 containing plasmid pSM214: genotype leu-, PyrDR , Npr-, Apr-Strains pSM261 and pSM214 with i Bellini et al. 1991, J.A. Biotechnol. 18 : 177. pSM539 is an Italian patent application publication no. No. 001916. The bacteria are passaged and the lysate is noted here. Prepared from the bacteria as described.   Female New Zealand (New Zea) weighing 1.9-2.3 kg Land) Rabbits in standard cages at 22 ± 1 ° C. under 12 hour light / dark cycle conditions Maintained. Rabbits received 100 g of standard diet daily and water ad libitum.   Bacillus subtilis to rabbit colonBacillus  subtili s Rabbits were fasted for a treatment period of 16-18 hours for the administration of (1). That Later the rabbits are placed in a standard stock retainer and allowed to air for 1 hour before treatment. Adapted to the weather. Transanal urethral catheter (Rush, Germany) through the anus And gently inserted into the distal colon. Bacillus subtilis in 2 ml of PBS (Bacillus  subtilisThe rabbit suspension was kept conscious It was administered through the catheter as it was.   Rabbits should be kept in normal stock throughout the experiment to determine rabbit temperature. Within each cave prior to the experiment. And acclimated for about 2 hours. The animal's temperature is placed between the left hindpaw and the abdomen, Skin thermistor probe (TM-54 / S and TMN / S; S. I. (Italy) Was measured by Bacillus subtilis (Bacillus  subtilis ) (Containing plasmids pSM214 or pSM539, 2 × 109Cells) through the marginal ear vein and into a highly pyrogen-free saline 1 hour before intravenous administration of purified LPS-free recombinant human IL-1beta Was instilled into the distal colon. The temperature of the animal was determined from the time of IL-1 beta administration. Recorded every 20 minutes for 3 hours starting. IL-1-induced hypoironemia in rabbits To measure disease, the iron concentration of rabbits was increased by 1 microgram / kg of recombinant humans. Obtained at 2, 4, 6, 8, and 24 hours after intravenous inoculation of IL-1beta Was evaluated within the sample. This iron assay is based on a commercially available kit (Fe Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany ny). Normal iron level before administration of IL-1beta Bell is 134.7 ± 6.6 micrograms / dl (mean ± SE of 25 animals) M). Hypoironemia (a 60-75% decrease in plasma iron levels) is due to IL-1 It became apparent about 4 to about 24 hours after beta administration. 2 × 10 per rabbit9cell Bacillus subtilis containing pSM214 or pSM539 at a concentration ofBa chillus   subtilis2) Instill the strain twice in the distal colon and once with IL 3 hours before -1beta administration and another 10 minutes after IL-1beta administration there were.   To detect IL-1ra in rabbit serum, the serum was purified from Bacillus subtilis. Squirrel (Bacillus  subtilis0), 1, 2, 4, and Eight hours later, the animals were obtained through the marginal ear vein. Quantitative determination of IL-1ra Specific ELIS according to manufacturer's instructions A (Amersham International, Amersham, U.S.A.) K). The lower detection limit in this assay is 20 pg / ml . Purified IL-1ra was used as a standard.   IL-1ra in serum is also a real-time organism due to the optical phenomenon of surface plasmon resonance. Biosensor BIAcore ™ to enable specific interaction analysis System (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala) (Lofas et al., 1990, J. . Chem. Soc. Chem. Commun. 21: 1526). Fixation work Is HBS (10 mM HEPES) 150m at pH 7.4 as described. M NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.05% Surfactan p2 0) at a flow rate of 5 μl / min (Lofas et al., 1990; J. Chem. Soc. Chem. Commun. 21: 1526; Fager stam et al. 1990; Mol. Recogn. 3: 208) . Purified polyclonal IgG anti-IL-1ra was purified according to the following optimal method. To the dextran matrix of CM5 sensor chip via primary amino group Connected. The carboxylated matrix of the sensor chip is first -Hydroxysuccinimide and N-ethyl-N '-(3-diethylaminopropyl B) Activated with 45 μl of a 1: 1 mixture with carbodiimide. Then 70 μl of antibody solution (150 μg / m in 10 ml of sodium acetate at pH 4.5) l) was injected. Free amino groups were blocked with 40 μl of 1 M ethanolamine hydrochloride. Refused. The sample containing IL-1ra is placed in a steady flow passing through the surface of the sensor chip. To allow interaction with the immobilized antibody Was. Interactions are detected by resonance angle and are expressed in resonance units (RU) . A standard curve of IL-1ra in HBS was constructed for assessment of serum IL-1ra concentration. (0.1 ng / ml to 1 mg / ml at a flow rate of 3 μl / min). Rabbit serum samples Prior to analysis, Centricon Plus (Amicon, Beverly, M A) Filtered on. The concentration of IL-1ra in the serum sample was determined by the Prefit (Pre- by calculating the sample RU against a standard curve using the program Issued.   The experimental results described here are expressed as mean ± SEM. Body temperature difference is one Assessed by directional ANOVA and displayed significance at 95% confidence level Was.   Bacillus subtilis engineered to express IL-1ra in cells (Ba chillus   subtilis) Induction of in vitro sporulation (FIG. 5A) ), This bacterium was transformed into a large amount of intact activity within hours after the induction of sporulation It is possible to release sex recombinant IL-1ra (FIG. 5B). IL-1ra is A bacterium capable of producing IL-1ra (pSM539) is also administered to the colon Was detectable in the serum of rabbits It was not detected in tamase expressing bacteria (pSM214). In rabbits, IL- Bacteria capable of producing 1ra (pSM539) or a control as a control When taractamase (pSM214) was administered into the colon, IL-1 was also observed. The expression of ra was observed (FIG. 6). In this case, by specific ELISA The presence of measured IL-1ra is 2 × 10 with pSM539.9Raw Bacill S. subtilis (Bacillus  subtilis) After a single inoculation It was observed for several hours in goat serum. Rabbits receiving pSM214 were determined to be negative by ELISA. After treatment The presence of IL-1ra in rabbit serum was confirmed in a BIAcore assay. (FIG. 7).   Bacillus subtilis antagonizes the effects of parenterally administered IL-1 beta (Bacillus  subtilis) Delivered by IL-1ra investigated. In FIG. 8, induced in rabbits after intravenous injection of IL-1 beta. Increased body temperature was associated with pS214 when compared to rabbits previously administered pSM214. Significant reduction can be observed in rabbits pre-administered with M539 . In addition, this reduction was dose dependent. In addition, induced by IL-1 beta The induced hypoironemia was higher than pS214 when compared to rabbits treated with pSM214. Rabbits treated with M539 were retrograde.   To further demonstrate that bacterial administration to animals is an effective drug delivery method Bacillus subtilis containing pSM261 (encoding IL-1 beta) in rabbits Butyris (Bacillus  subtilis) Was administered. This kind of bacteria Rabbits received significant up to 40 ° C (at which temperature animals died) Exhibit increased body temperature, and generally the rabbits are treated with IL-1 beta It appeared as if administered intravenously (Figure 9).   Embodiment 8 FIG. E. coli administered to mice (Escherichia  coli) Of IL-1ra in Escherichia coli   This E. coli (Escherichia  coliExpression of IL-1ra in For transformation, E. coli transformed with plasmid pT7MILRA-3 (Es cherichia   coli) At 600 nm 100 mg / l of ampicillin until an optical density of 0.4-0.6 is achieved Grow in LB containing.   The expression of this protein was then converted to a final concentration of 2-4 mM IPTG in the medium. Induced by addition. Do not shake these cells for 2.5-3.0 hours at 37 ° C. Incubated. The bacteria are then recovered by centrifugation and the cells Bacteria were resuspended in an amount of saline suitable for administration to mice.   Plasmid p3 was introduced into female C3H / HeJ mice weighing about 20-25 g. E. coli containing T7 MILRA-3 (Escherichia  coliSingle) A subcutaneous dose was administered. The number of bacteria administered was 5 × 107~ 1.5 × 10TenCells / dose E. coli (Escherichia  coli) Of administration The timing was varied from 1 hour to 3 hours before administration of IL-1β to the mice. All cases In which the results obtained, ie the efficacy of IL-1ra in mice, were compared. Was.   At time 0, mice received 4 μg / kg of recombinant human IL-1β intraperitoneally. Was. Two hours after administration of IL-1β, the mice were sacrificed and serum samples were obtained did. The serum glucose level was determined using a commercially available kit (Gl ucose GOD Perid: Boehringer Mannheim ) Was evaluated by the reaction with glucose oxidase. This result is shown in FIG. Is shown in The degree of hypoglycemia induced by intraperitoneal IL-1β is indicated ( Black bar). Hypoglycemia is caused by E. coli expressing IL-1ra (Escherichia   coli) Significantly decreased in the mice pretreated with () (shaded bars). Positive As a control, purified IL-1ra (4 mg / kg) was Subcutaneous administration was performed 15 minutes before administration, and administration of IL-1β was performed (lined pattern). rod). As a negative control, mice received plasmid pRSET-A (i.e., I E. coli containing a plasmid not encoding L-1ra)Escherichia   coli) Strain BL21 (D3) was administered subcutaneously prior to IL-1β administration. This Hypoglycemia induced by IL-1β in these mice resulted in pRSET-A E. coli containingEscherichia  coliAffected by the administration of This, in turn, is responsible for the reduction observed in hypoglycemia in animals. Is E. coli (Escherichia  coliExpression of IL-1ra within It is proved that   Therefore, the data described herein suggest that when administered to animals, -Expressing bacteria are effective and effective mediators of drug delivery for the treatment of animal diseases Proven to work as a body.   Therefore, the data described herein suggest that when administered to animals, -Expressing bacteria are effective and effective mediators of drug delivery for the treatment of animal diseases Proven to work as a body. Having a therapeutic effect by intracolonal administration of bacteria, A drug source for animals is established.

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年１０月２１日 【補正内容】 請求の範囲 １． 有効成分としての、非ワクチン原性で薬理学的かつ組織的に活性な組換 え治療用蛋白質を発現する工学的に作製された微生物を含み、前記微生物がサル モネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種ではない薬物学的組成物。 ２． 前記微生物が細菌である、請求の範囲１に記載の組成物。 ３． 前記細菌が、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、大腸菌 （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） からなる群より選択される、請求の範囲２に記載の組成物。 ４． 前記細菌がバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ ｓ ）である、請求の範囲３に記載の組成物。 ５． 前記治療用蛋白質が、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、成 長ホルモン、トリプシン阻害剤、インターフェロンからなる群より選択される、 請求の範囲１〜４の内のいずれかに記載の組成物。 ６． 前記治療用蛋白質が、ＩＬ−１ｒａもしくはその突然変異体、ＩＬ−１ ０、インターフェロン、α1−アンチトリプシンから選択される、請求の範囲５ に記載の組成物。 ７． 非痘苗原性で薬理学的に活性な組換え治療用蛋白質を発現する工学的に 作製された、患者への投与後の前記蛋白質のインビボ送達のための微生物。 ８． 非痘苗原性で薬理学的に活性な組換え治療用蛋白質を発現する工学的に 作製された微生物の、前記工学的に作製された微生物の投与後 に発現される際には前記治療用組換え蛋白質により治療もしくは軽減される疾患 の治療のための医療薬の調製のための使用。[Procedure for Amendment] Article 184-8 of the Patent Act [Date of Submission] October 21, 1996 [Details of Amendment] Claims 1. Pharmaceuticals comprising engineered microorganisms expressing non-vaccinogenic, pharmacologically and systematically active recombinant therapeutic proteins as active ingredients, wherein said microorganisms are not of the species Salmonella Composition. 2. The composition according to claim 1, wherein the microorganism is a bacterium. 3. Wherein the bacterium is Lactobacillus (Lactobacillus), E. (Escherichia coli), and is selected from the group consisting of Bacillus (Bacillus), composition according to claim 2, wherein. 4. Wherein the bacterium is a Bacillus subtilis (Bacillus subtili s), composition according to claim 3, wherein. 5. The composition according to any one of claims 1 to 4, wherein the therapeutic protein is selected from the group consisting of a cytokine, a cytokine antagonist, a growth hormone, a trypsin inhibitor, and an interferon. 6. The composition according to claim 6, wherein the therapeutic protein is selected from IL-1ra or a mutant thereof, IL-10, interferon, α 1 -antitrypsin. 7. An engineered microorganism that expresses a nonpox seedling pharmacologically active recombinant therapeutic protein for in vivo delivery of said protein after administration to a patient. 8. Non-pox seedling, pharmacologically active recombinantly engineered microorganisms expressing recombinant therapeutic proteins, when expressed after administration of the engineered microorganisms, the therapeutic recombinant Use for the preparation of a medicament for the treatment of a disease to be treated or alleviated by a protein.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 マツキア， ジヨバンニ イタリア・アイ−67051アベツツアノ・ビ アモンテベリノ57 (72)発明者 マウリツツイ， ジヨバンニ イタリア・アイ−67100ラキラ・ビアアル バフセンス６ (72)発明者 ポルツイオ， ステフアノ イタリア・アイ−67100ラキラ・ビアプラ テレベトイオ (72)発明者 ルツジーロ， パオロ イタリア・アイ−67100ピツツオリ・ビア テラマナ３──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI (C12N 1/21 C12R 1:01) (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12N 1/21 C12R 1: 125) (81 ) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI) , CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, MW, SD, SZ, UG), AL, AM, AT, AU, BB, BG, BR, BY, C A, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IS, JP, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LT, LU, LV, MD, MG , MK, MN, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TT, UA, US, UZ, VN (72)・ Ai-67051 Abetzano Via Amonteverino 57 (72) Inventor Mauritsi, Giovanni Italy Ai-67100 Rakira Via Al Bahusen 6 (72) Inventor Portuio, Stefano Italy Ai-67100 Lakira Biapra Televetio (72) Inventor Luziro , Paolo Italy Eye-67100 Pittsuoli Via Terramana 3

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． 有効成分としての、非ワクチン原性で薬理学的に活性な組換え治療用蛋 白質を発現する工学的に操作された微生物を含み、前記微生物がサルモネラ（Ｓ ａｌｍｏｎｅｌｌａ ）種ではない薬物学的組成物。 ２． 前記微生物が細菌である、請求の範囲１に記載の組成物。 ３． 前記細菌が、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、大腸菌 （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） からなる群より選択される、請求の範囲２に記載の組成物。 ４． 前記細菌がバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ ｓ ）である、請求の範囲３に記載の組成物。 ５． 前記治療用蛋白質が、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、成 長ホルモン、トリプシン阻害剤、インターフェロンからなる群より選択される、 請求の範囲１〜４の内のいずれかに記載の組成物。 ６． 前記治療用蛋白質が、ＩＬ−１ｒａもしくはその突然変異体、ＩＬ−１ ０、インターフェロン、α1−アンチトリプシンから選択される、請求の範囲５ に記載の組成物。 ７． 治療剤としての使用のための、非痘苗原性で薬理学的に活性な組換え治 療用蛋白質を発現する工学的に作製された微生物。 ８． 非痘苗原性で薬理学的に活性な組換え治療用蛋白質を発現する工学的に 作製された微生物の、前記治療用組換え蛋白質により治療もしくは軽減される疾 患の治療のための医療薬の調製のための使用。[Claims] 1. As an active ingredient, it includes non-vaccine immunogenic in the engineered microorganisms expressing the pharmacologically active recombinant therapeutic proteins, wherein the microorganism is Salmonella (S almonella) not species pharmacological composition . 2. The composition according to claim 1, wherein the microorganism is a bacterium. 3. Wherein the bacterium is Lactobacillus (Lactobacillus), E. (Escherichia coli), and is selected from the group consisting of Bacillus (Bacillus), composition according to claim 2, wherein. 4. Wherein the bacterium is a Bacillus subtilis (Bacillus subtili s), composition according to claim 3, wherein. 5. The composition according to any one of claims 1 to 4, wherein the therapeutic protein is selected from the group consisting of a cytokine, a cytokine antagonist, a growth hormone, a trypsin inhibitor, and an interferon. 6. The composition according to claim 6, wherein the therapeutic protein is selected from IL-1ra or a mutant thereof, IL-10, interferon, α 1 -antitrypsin. 7. An engineered microorganism that expresses a nonpox seedling, pharmacologically active recombinant therapeutic protein for use as a therapeutic. 8. Preparation of a medicament for the treatment of a disease which is treated or alleviated by said therapeutic recombinant protein of an engineered microorganism expressing a nonpox seedling pharmacologically active recombinant therapeutic protein Use for.
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