JPH10506272A

JPH10506272A - 敵対被標的薬物に対するｈｉｖプロテアーゼ進化応答のガラス器具内での予測法

Info

Publication number: JPH10506272A
Application number: JP8510398A
Authority: JP
Inventors: メルニック，ローレンス，エム．; ヒーフナー，ドナルド，エル．
Original assignee: セプラコー，インコーポレイテッド
Priority date: 1994-09-16
Filing date: 1995-09-18
Publication date: 1998-06-23
Also published as: EP0781351A4; AU699561B2; EP0781351A1; AU3635295A; US6063562A; WO1996008580A1; CA2199805A1

Abstract

(57)【要約】被標的にされる薬物に応答して生体内に出現し得る、別個の第１世代の薬物抵抗力のあく生物活性のＨＩＶプロテアーゼの突然変異体を同定するためのガラス器具内法は、（ａ）各々が逆トランスクリプターゼを随伴する蛋白重合体の部分として発生させられる、１つ乃至３つのアミノ酸置換分最初のプロテアーゼから相異しているプロテアーゼの第１世代の突然変異体全部のライブラリーを薬物の存在の下に調合することと、（ｂ）逆トランスクリプターゼの活性分析により薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体のプロテアーゼを分離することと、（ｃ）このように分離された活性のある突然変異体のプロテアーゼの薬物抵抗力へと導く別個のアミノ酸変化を同定することと、を包含する。ＨＩＶプロテアーゼの生物活性の突然変異体又は野性種の形態に対する薬物の効力を評価するためのガラス器具内法は、非活性ＨＩＶプロテアーゼとＨＩＶ逆トランスクリプターゼと１つ以上のプロテアーゼ開裂部位とを備える突然変異体の蛋白重合体と薬物とを組み合わせることと、生物活性の突然変異体の及び野性種の形態を加えることと、逆トランスクリプターゼの活性がテストされるＨＩＶプロテアーゼの突然変異体の又は野性種の形態に対する薬物の効目のなさを指示するものとして活性の逆トランスクリプターゼの解放分析をすることと、を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】敵対被標的薬物に対するＨＩＶプロテアーゼ進化応答のガラス器具内での予測法発明の技術分野ウイルス、バクテリア、及びその同類のような種々な微生物の病原性は、微生物の生存及び／又は繁殖に不可欠なある種の蛋白を不活性化することによって除去或いは少なくとも管理がなされ得る。本発明は、一般には、敵対被標的薬物に対するこのような蛋白の進化応答のガラス器具内での予測法に係る。特に、本発明は、プロテアーゼによる蛋白重合体の開裂によって触媒される生物活性を有して、第２蛋白を含有する蛋白重合体の一部として自然のままに発現されるＨＩＶプロテアーゼのようなプロテアーゼの、薬物に対する進化応答のガラス器具内での予測法に関する。本発明の方法は、例えば、臨床での使用に先立って、特定の抗菌作用物質の臨床での使用に応答して出現し得る蛋白の抵抗力のある生物活性の突然変異体の形態を同定するのに使用され得る。特に、臨床での使用に先立って、特定の抗菌作用物質の臨床での使用に応答して出現し得る第１世代の抵抗力のある生物活性の突然変異体の全ての可能性を予測するのに、本発明は使用され得る。この手法においては、抗菌作用物質及び前記第１世代の抵抗力のある蛋白の突然変異体の形態に対して効力を有する、１以上の補助薬物を包含する薬物のカクテルが同定され得るので、その後から蛋白の進化的逃避経路を排除するために臨床で使用され得る。同様な手法で、蛋白の野性種に対しても、第１世代の抵抗力のある突然変異体の形態に対しても、両方に対して効力を有し、且つ前記薬物のカクテルの代わりに対薬物抵抗力に打ち勝つために臨床で使用し得る単独の薬物が同定され得る。本方法は、又、例えば、臨床での使用に先立って、蛋白に対抗して使用する意図のある抑制因子の究極の効力の評価のためにも使用され得る。発明の背景過去半世紀に亘っての比較的重要な科学的技術的進歩の１つは、抗生物質及び抗ウイルス性作用物質のような抗菌薬物の発展であった。これらの薬物の広範な利用の可能性は数百万人の生命を救済し、数えきれない程のやり方で人類に利益をもたらした。このような薬物の有効性への唯一の制約は、薬物抵抗力のある病原体の進化発展であった。細菌性病原体は、薬物の標的を突然変異させることによるとか、薬物の摂取を制限することによるとか、薬物を破壊することによるとかなどの種々なやり方で抗生物質薬物に対して抵抗力を有するようになる。しばしば薬物の標的は、病原体の生存及び／又は繁殖に必要な蛋白であり、薬物に対する抵抗力は薬物の標的を暗号化している核酸連鎖の中での１以上の抵抗力授与突然変異の手段によって授与され、この抵抗力授与突然変異は、官能性を維持している間にも、敵対被標的薬物に対する親和性を薬物の標的が喪失するような薬物の標的の突然変異体の形態を産出する。今や公衆の健康に重大な脅威を提供する抗生物質に対する普及し且つ常に増大する細菌の抵抗力の問題が、最近“抗生物質抵抗力における危機”、科学第257 巻、第1064〜1073頁（1992年８月21日）の中で、ハロルドＣ・ノイによって指摘された。ノイによって中継されたように、過去数十年間に亘る抗生物質の広範な使用が薬物抵抗力のある細菌の繁殖を産みだした。１例として、ノイは、1941年には、世界中の黄色ブトウ球菌の実質的に全ての菌株がペニシリンＧに影響され易いものであったものが、今日では、９５％を超える黄色ブドウ球菌がペニシリン、アンピシリン、及び抗シュードモナスペニシリンに対する抵抗力を有すると注意している。他の１例として、ノイは、1941年には、１日４回４日間投与の 10,000単位のペニシリンからなる治療で肺炎球菌肺炎に倒れた患者を治癒させるのには充分であったものが、今日では、患者は１日当り２千４百万単位のペニシリンを受容することもあり得る状態であり、それでも尚、肺炎連鎖球菌によって引き起こされる肺炎球菌性髄膜炎で死ぬことさえもあり得ると注意している。抗生物質に対する細菌の抵抗力の問題の一部は、このような薬物が伝統的に開発使用されてきたやり方の中から派生している。典型的には、最初の抗生物質は、（例えば、単独又は少数の病原性細菌株、均質な酵素調合、均一受容体調合、又はその類似物のような）実質的に均一で静的な標的に対して開発され、それからこの薬物に対しての普遍的な抵抗力が展開するまで、水遠に進化して増え続ける異種起源性の標的に対して使用されている。それから第２の抗生物質が、抵抗力を有するが、尚同様に均一で静的な標的の形態に対して、同じようにして開発され、続いて第２の抗生物質に対する広範な抵抗力が展開するまで、最初の抗生物質に取って代えられる。新しい薬物が利用可能になると、増大する選択的圧力に応答して永続的に丈夫な激しい病原体が出現するまで、何年にも亘ってこの順序が繰り返されるのが普通である。多くの実例で、或る薬物に対する抵抗力は時間をかけて展開されるであろうという認識があってさえも、抵抗力のある菌株と成功裏に戦う為の将来の新薬物の利用が可能になるであろうという一致した意見が存在した。不幸にもこれが何時の場合にも起こることにはならなかった。そして効果的な新抗生物質の当面の開発速度は、過去に比べるとより遅くなっている。細菌は、敵対被標的薬物に対する抵抗力を取得する能力によって医学界に問題を提起した唯一の病原性微生物なのではない。ウイルス、特に注目するべきＨＩＶウイルスは、抗ウイルス作用物質に関して同様な問題を提起した。例えば、Ｈ．モーリー他の“治療、非治療の患者血液中のジドブジン抵抗力のある人免疫欠損ウイルスタイプ１の定量化”、米国科学アカデミー協会報第９０巻、第２５〜２９頁（1993年）、Ｍ．テイスデエイル他の“逆トランスクリプターゼのＹＭＤＤ領域においての突然変異による３’−チアノチシン抑制因子に抵抗力を有す 25る人免疫欠損ウイルスタイプ１の生体内での迅速選択”、米国科学アカデミー協会報第９０巻、第５６５３〜５６５６頁（1993年）、及びＲ．ヤーチャン他の “ＨＩＶ感染治療上の挑戦”、臨床展望第１４巻、第１９６〜２０２頁（1993年）を参照。 “ＨＩＶ治療に対する現状と将来展望”、科学第２６０巻、第１２８６〜１２９３頁（1993年５月28日）の中でマーガレットＩ．ジョンストン及びダニエルＦ．ホスは、抗ＨＩＶ作用物質開発に対する研究者の努力のいくつかを再吟味して、このような作用物質が何故充分に効果的でなかったのかに関する一般によく認められた説明のいくつかを報告した。薬物失敗に対するこのような説明の１つは、薬物抵抗力の出現である。ジョンストン及びホスは、ＨＩＶ抵抗力は、ＨＩＶ治療に使われる広範使用の抗レトロウイルス性ヌクレオシドの各々に対して観測されたと注意している。１例として、ジョンストン及びホスは、細菌培養においてはＨＩＶに対して活性であると１９８４年に同定されたか、今日では治療開始後６ヵ月の速さで個人の中での抵抗力を誘発することが観測される、このような抗レトロウイルス性ヌクレオシド、３’−アジドチミシン（ＡＺＴ）に言及している。ＨＩＶの薬物抵抗力の他の１つの例は、最近メルク社の開発した新しいＨＩＶプロテアーゼ抑制因子に関連して出現した。Ｍ．バルトホルツの“メルクは試験結果の上で落胆に直面：ＨＩＶがＡＩＤＳ新約の将来性に抵抗”、ウォールストリートジャーナル（1994年２月25）参照。メルクが商用名称Ｌ−７３５，５２４の下に同定したこの薬物に対する抵抗力は、人体の臨床試験に先立っての細胞培養研究では観察されなかったが、臨床評価をしている間に抵抗力の適応が出現した。抗ウイルス作用物質に対するウイルスの抵抗力は、典型的には、被標的ウイルス蛋白を暗号化するウイルスの核酸の中での１以上の抵抗力授与突然変異によって授与される。特にＨＩＶウイルスのような或る種のレトロウイルスの場合には、突然変異の頻度が極めて高くなり得る。事実、ＨＩＶウイルスに感染した特定の個人の中では、２０％程度のウイルスは突然変異を包含していることを発見されている。ウエイン−ホブソンの“今迄に記録された最高速のゲノム進化：現場でのＨＩＶ変貌”、遺伝学及び発展の現在意見第３巻、第８７８〜８８３頁（1993 年）参照。この突然変異の高頻度は、第１義的には、ＨＩＶ逆トランスクリプターゼ酵素の動作に起因するもので、この酵素は、ウイルスの生活周期の一部として、単一撚りのウイルスＲＮＡを２重撚りのＤＮＡに変換するのに使用されるが、しかし編集機構を欠いている。その突然変異的な高頻度性の故にＨＩＶウイルスは８８１で同定される“永続性突然変異機械”として特徴付けられてきた。事実、少なくともＨＩＶウイルス及び同類のウイルスに関しては、実質的に無制限な数の異なる進化の逃げ道が、実際的にはどのような薬物に関しても、蛋白の中に存在するという、当業界での普及した信仰が存在する。例えば、ホーネス他の “単純疱疹ウイルスのＤＮＡポリメラーゼ位置内の多くの部位での単一突然変異は、アフィジコリンに対する過敏症とホスホノ酢酸に対する抵抗力とを授与し得る”、遺伝子ウイルス学会誌第６５巻、第１〜１７頁（1984年）、サーグ他の“ 生体内の人免疫欠損ウイルスタイプ１の広域変貌”、自然第３３４巻、第４４０〜４４４頁（1988年８月４日）、リッチマンの“ＨＩＶの薬物抵抗力”薬理学及び中毒学レビュー年報第３２巻、第１４９〜１６４頁（1993年）、及びウエイン−ホブソンの“今までに記録された最高速のゲノム進化：現場でのＨＩＶ変貌 ”遺伝学及び発展の現在意見第３巻、第８７８−８８３頁（1993年）参照。言い換えれば、少なくとも或る特定の薬物に関しては、付与の蛋白にとって利用の可能な多くの異なった抵抗力授与突然変異の数は、極端に制限され得るという認識が当業界には現れてこない。従って、ＨＩＶの薬物抵抗力（及びより広く言えばウイルスの薬物抵抗力）は、現在、当業界では処理しにくい問題であると考えられている。将来の薬物の臨床での使用に先立って伝統的に評価されてきた１つの方法は、細胞培養選択と一般に呼ばれている技法によるものである。細胞培養選択を使用しての抗ウイルス作用物質の試験のためには、典型的には、将来の薬物の存在の下で、宿主細胞ラインの上で被標的ウイルスを養育する。それから薬物抵抗力のある菌株を選択するために、子孫ウイルスが、濃度を増強した将来の薬物の存在の下で宿主細胞ラインのなかを連続的に通過させられる。将来の薬物評価に対する細胞培養選択の例示的応用例は、テイスデエイル他の“逆トランスクリプターゼのＹＭＤＤ領域における突然変異による３’−チアシチジン抑制因子に抵抗力を有する人免疫欠損ウイルスタイプ１のガラス器具内での迅速選択”、米国科学アカデミー協会報第９０巻、第５６５３〜５６５６頁（1993年６月）の中に開示されている。テイスデエイルの中で、ＭＴ−４細胞が野性種のＨＩＶ−１又は野性種のＨＩＶ−１から誘導されたＡＺＴ−抵抗力のある菌株のいずれかに感染され、低濃度の（−）−２’−デオキシ−５−フルオル−３’−チアシチジン（ＦＴＣ）に晒された。子孫ウイルスは、回収され、増強された濃度のＦＴＣの存在の下でＭＴ−４細胞の中を連続的に通過させられた。野性種の子孫の第４通過及びＡＺＴ−抵抗力のある子孫の第２通過までで、ＩＣ₅₀（５０％抑制濃度）値が５０μモルを超過した。より高い化合物濃度で試験すると、通過６のウイルスのＩＣ₅₀値は２５０μモル超になった。抵抗力のあるウイルスの迅速出現を基盤に、テイスデエイル他は、可能な他のＨＩＶ−１の抑制因子との組合せを除くＦＴＣの治療の価値は制限され得る、と仮説を立てた。将来の薬物の評価に対する細胞培養選択の他の１つの例示的応用例は、タディ他の“ワクシニアウイルスＤＮＡポリメラーゼの遺伝的特性付け：薬物感受性の変化及び忠実度の低下を授与する点突然変異の同定”ウイルス学会誌第６５巻、第２号、第８６９〜８７９頁（1991年２月）の中に開示されている。タディの中では、野性種のワクシニアウイルスは、ニトロソグアニジンによって化学的に突然変異誘発性化させられ、それからアフィジコリン抵抗力のあるウイルスの分離努力の中で、８５μモルのアフィジコリンの存在下のアフリカ緑猿ＢＳＣ４０細胞を連続的に通過させられた。抗ウイルス作用物質に対する上記の細胞培養選択技法に類似の技法が、抗生物質の効能試験に用いられてきた。例えば、ハンドワーガー他の“臨床及び研究室での低レベルのペニシリン抵抗力を有する病原性肺炎連鎖球菌分離株のペニシリン結合蛋白の変貌”、感染症学会誌第１５３巻第１号、第８３〜８９頁（1986年１月）（この中ではベンジルペニシリンに抵抗力を有するクローンが、２倍増濃度のベンジルペニシリン中の血液寒天プレート上の連続しての通過により選択された）を参照。上記のやり方による抗生物質及び抗ウイルス作用物質両者の試験において、最も多くの研究者は、第１義的には、将来の薬物に対しての著しい抵抗力の出現速度及び薬物の潜在的治療価値測定用のキーファクターとして、将来の薬物のＩＣ₅₀値に焦点を絞ってきた。典型的には、抵抗力の展開がより速ければ将来の薬物はより望ましくないと判定されてきた。このように、将来の薬物の評価では、技法は、第１義的には、異なる薬物抵抗力のある変異体の性質又は数に関係無しに突然変異の速度に焦点を絞っている。広く用いられているとはいえ、細胞培養選択は制約に満ち満ちている。このような制約の１つは、細胞培養技法そのものが、生体内に現れたであろう或る突然変異菌株の選択に対して不公正なバイアスを掛けているかもしれないことである。メヤーハンズ他の“生体中のＨＩＶ類似種の中の一時性変動は逐次的なＨＩＶの分離菌に反映されていない”、細胞第５８巻、第９０１〜９１０頁（1989年９月８日）参照。上記のメヤーハンズの論文の中では、２年半の期間に亘った患者から入手されたＨＩＶ−１分離菌に加えて培養された抹消血液単核細胞（ＰＢＭＣ）から入手されたＨＩＶ−１分離菌が分析され、比較された。夫々の分離菌からのｔａｔ遺伝子がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅され、増幅ＤＮＡが哺乳類発現ベクターの中にクローン化された。各サンプルから２０クローンが配列された。ウイルスゲノムのＨＩＶ類似種−母集団は、対応する生体内及びガラス器具内の母集団の間で有意な差異を示した。例えば生体内分離菌のゲノムの大部分の形態は、ガラス器具内分離菌の対応ゲノムの少数形態から引き出された。これらの結果から、メヤーハンズ他は、培養は障害であるとの結論を導出した。細胞培養選択における固有の他の１つの制約は、生体内で出現し得る各全ての突然変異が可能な選択の間に発生されるであろうという保証のないことである。細胞培養選択における固有の尚他の１つの制約は、或る薬物授与突然変異が観察下にある遺伝子以外の遺伝子の中で同時発生の致命的突然変異によってマスクされ得ることである。これは、細胞培養選択が観察下にある遺伝子に対して制約的な突然変異誘発の手段を提供しないがためである。１９９４年１０月５日発行の英国出願第 2,276,621号公報及び引用することによって本願に編入された特許公報の中には、薬物抵抗力のあるＨＩＶプロテアーゼの突然変異体の同定及び分離において有用であるといわれる色素分析が記述されている。この分析は、又、例えばＨＩＶプロテアーゼの薬物抵抗力による影響を受けない抑制因子のような、新しいＨＩＶプロテアーゼ抑制因子のスクリーニングにも有用であると言われている。主題の色スクリーニング分析は、調節可能なプロモーターを備えるベクターを包含し、このプロモーターは、１つの連鎖がＨＩＶプロテアーゼ又はその突然変異体を暗号化し、他の１つの連鎖がＨＩＶプロテアーゼによる開裂の可能なアミノ酸基質インサートを随伴するβ−ガラクトシダーゼを暗号化する、２つの隣接する構造連鎖の転写を制御する。残念ながら、本発明者が知る限り、前記の色素分析は、後続の臨床での使用で後に分離された、薬物抵抗力のある菌株の、ガラス器具内での同定における限定的な成功であった。本発明者は、前記色素分析の貧弱な予言的性質が、かなりの程度まで、使用されるＨＩＶ−プロテアーゼ β−ガラクトシダーゼ構造概念の確実性の不足に由来するものと信ずる。言い換えると、前記の色素分析におけるプロテアーゼ突然変異体は、分析中に記録されるべき前向きの結果に対しては、 β−ガラクトシダーゼ蛋白内の単一の人工的な開裂部位でのプロテアーゼ β− ガラクトシダーゼ融解蛋白の開裂が必要なだけであり、対照的に、自然のままのＨＩＶ蛋白重合体においては、プロテアーゼは、例えばＨＩＶ逆トランスクリプターゼを活性化するための、少なくとも３部位のような多数の部位での蛋白重合体の開裂をしなければならない。上記色素分析の構造概念での開裂部位の性質及び数の確実な変動が、効果的に分析を非信頼的なものにしている、と本発明者は信ずる。結果として、少なくとも上記の理由に対しては、細胞培養研究によって予測されなかったような薬物抵抗力のある菌株が生体内では観測された、との報告例が多数存在する。例えば、（ＨＩＶウイルス中のＡＺＴ抵抗力は、続く細胞培養選択で観測されなかったと報告した）スミス他の“アジドチミジン存在下でのＴリンパ球の、人免疫欠損ウイルス感染後のウイルス生産再開”、ウイルス学会誌第６１巻第１２号、第３７６９〜３７７３頁（1987年12月）、（ＨＩＶウイルス中のＡＺＴ抵抗力は続く細胞培養選択では観測されなかったが、続く臨床使用でのＡＺＴ抵抗力のある分離菌の存在は、注目に値すると報告した）ラーダー他の“ 変化した抑制因子感受性を有する人免疫結束ウイルスタイプ１の逆トランスクリプターゼ変異体の感染ポテンシャル”、米国科学アカデミー協会報第８６巻、第４８０３〜４８０７頁（1989年７月）、及び（野性種のＨＩＶを使った細胞培養でのジドブジン抵抗力のあるＨＩＶ菌株の選択の試みは成しなかったと警告し、臨床的に発見されるものと類似のジドブジン抵抗力のある菌株は部位指向の突然変異誘発性によって構築されたＨＩＶ変異体の細胞培養選択によって入手されたと報告した）ラーダー他の“細胞培養の中を通過することにより選択されたジドブジン抵抗力のある人免疫欠損ウイルス”ウイルス学会誌第６５巻第１０号、第５２３２〜５２３６頁（1991年10月）を参照。細胞培養選択でのその他の制約は、（１）無傷の病原体使用が要求されるので、安全性問題を避けるために厳格な取り扱い条件が使用されなければならないこと、（２）細胞培養技法そのものは、通常数個の通過が要求され、各通過は典型的には多数日かかるので、非常に時間のかかる（それ故高価な）ものであること、である。上記で言及したように、薬物抵抗力は非常に一般的であるが故に、薬物抵抗力が現れる実質的に全部の例の中で、薬物抵抗力が授与される又は授与され得る極めて多数の並列的進化逃避経路が存在するものと、多くの研究者は仮定してきた。（２人の慢性的感染者からのＨＩＶウイルスの逐次分離に従って顕著に多数の関連した、しかも区別可能な遺伝子型変異体の並行的進化の存在したことを報告した）サーグ他の“人免疫欠損ウイルスタイプ１の生体中での広範な変貌”、自然第３３４巻、第４４０〜４４４頁（1988年８月４日）、及び（アフィジコリンに対する単純ヘルペス過敏性は単一の充分隔離された多数の突然変異の共通的な結果であると報告した）ホーネス他の“単純ヘルペスウイルスのＤＮＡポリメラーゼ位置内の多数部位での単一突然変異はアフィジコリンに対する過敏性とホスホノ酢酸に対する抵抗力とを授与し得る”、遺伝子ウイルス学会誌第６５巻第１〜１７頁（1984年）を参照。事実、薬物抵抗力の問題は、何人かの研究者が、ＨＩＶのような病原体に関しての充分な治療及び抑制に対する将来予測は冷え冷えとしたものである、と結論付ける程のレベルにまで成長した。（ＨＩＶウイルスの遺伝子高変貌性とＨＩＶウイルスの高ウイルス負荷性とは、ＨＩＶの変貌に対して何らかの制約が存在するのか、との問題を提起すると説明した）ウエイン−ホブソンの“今までに記録された最高速のゲノム進化：現場でのＨＩＶ変貌”、遺伝学及び発展の現在意見第３巻、第８７８〜８８３頁（1993年）参照。これらの悲観的予測にも拘らず新しい薬物及び治療法は探究され続けている。しかしながら、潜在的な新薬の同定は、単一の静的な病原性標的に対しての可能性のある治療作用物質の評価の巻き込みを続けている。このような潜在的な新薬の同定に対して益々多く使用される技法は、合理的な薬物設計と組合せスクリーニングとを包含する。合理的な薬物設計においては、標的化合物の上の望みの結合部位の形態的化学的構造が同定され、単一標的化合物の上の結合部位に結合する相手としての官能能力を基礎に、将来の薬物が設計及び／又は評価される。合理的な薬物の設計の例示的適用例が以下の特許及び出版物の中で論議され、その全てを引用することによって本願の中に編み入れるものとする。即ち、米国特許第 5,300,425号公報、米国特許第 5,223,408号公報及びロバーツ他の“ペプチドを基礎に置くＨＩＶプロティナーゼ抑制因子”、科学第２４８巻第３５８〜３６１頁（1990年４月20日）である。組合せスクリーニングにおいては、短いオリゴヌクレオチド連鎖、アミノ酸連鎖、又は他の有機化合物の種々な組合せ配置が、単一標的化合物の上の結合部位に対する将来の結合相手としてスクリーニングに掛けられる。組合せスクリーニングの例示的適用例は、以下の特許及び出版物の中で論議され、その全てを引用することによって本願の中に編み入れるものとする。即ち、米国特許第5,288,51 4 号公報、米国特許第5,258,289 号公報、バーバスIII世他の“セミ合成の組合せ抗体ライブラリー：多様性問題に対する化学的な解”、米国科学アカデミー協会報第８９、第４４５７〜４４６１頁（1992年５月）、及びアルパーの“流れ作業配置上での薬物発見”、科学第２６４巻、第１３９９〜１４０１頁（1994年６月３日）である。最近、（“併用治療”、即ち、）付与の病原体、特にＨＩＶの異種蛋白向けの２以上の薬物の連携投与の概念が薬物抵抗力問題に打ち勝つ可能性のある方法として出現した。単一病原体の異種蛋白に対して標的を定められた２つ以上の薬物を利用するアプローチの例が、景山他の“単一作用物質又は組合せ作用物質としてのＣ₂対称性基盤のＨＩＶプロテアーゼ抑制因子による人免疫欠損ウイルス（ＨＩＶ）タイプ１複製のガラス器具内での抑制”、抗微生物作用物質と化学療法第３６巻第５号、第９２６〜９３３頁（1992年５月）、及び“組合せエイズ薬の臨床試験を始める薬剤組合”ウォールストリートジャーナル（1994年４月14 日）の中で論議されている。景山論文の中では、例えば、（逆トランスクリプターゼ抑制因子の）ＡＺＴ又はｄｄｌを伴ったＡ７５９２５、Ａ７７００３、及びＡ７６９２８”のような或るＣ₂対称性基盤のＨＩＶプロテアーゼ抑制因子の組合せがガラス器具内で研究された。薬物の或る組合せに対するガラス器具内刺激の結果が観測された。（例えば、ＡＺＴと組み合わせられたＡ７５９２５は、ガラス器具内では実質的に完全な抑圧の結果を生みだした。）しかしながら、上記タイプの併用治療は、生体中では、選択的圧力の下で、全ての被標的蛋白の抵抗力のある形態を包含する病原体を出現させるので、究極的には失敗するであろうと本発明者は信ずるものである。このような病原体の出現は、異種被標的蛋白の中の抵抗力授与突然変異を伴うゲノムが多重抵抗力を有する病原体形成のために相互に再結合する出来事の中で急かされさえされ得る。薬物抵抗力の問題に打ち勝つための可能な方法として最近出現した他の一つのアプローチは、（“集中併用治療”、即ち、）付与の病原体の同一蛋白上の異なる活性部位に向けて２つ以上の薬物を連携投与することである。このアプローチの例が、チュー他の“治療法最適化のためにＨＩＶ−１の多重薬物抵抗力向けの進化を制限する方法の採用”、自然第３６１巻、第６５０〜６５４頁（1993年２月18日）の中に開示されている。チュー論文の中では、野生種の逆トランスクリプターゼ抑制因子に対する多重薬物抵抗力を授与するＨＩＶ−１の逆トランスクリプターゼ遺伝子上の異なる活性部位の中での突然変異が、多重薬物抵抗力のウイルス複製との非共存性の有無の決定のために構築された。ＡＴＺ、ｄｄｌ、及びピリシノンに対する抵抗力授与の突然変異の組合せを包含するウイルスは、ウイルス複製に対して無能であると報告された。これらの突然変異体ウイルスの存在は、多重薬物抵抗力の展開を制約するような進化限界の存在を示した、とチュー他は仮説を立てた。しかしながら、上記で言及した多重薬物抵抗力のある変異体は、生活性欠如に対して責任を持つ突然変異を意図したものではなかったことが、後にチュー他の“ＨＩＶ−１のエラーが現れた”、自然第３６４巻、第６７９頁（1993年８月19日）の中で指摘された。更に、多重薬物抵抗力のあるチュー変異体は、多重抵抗力のある表現型を尚提示する間にも、野性種ウイルスに対する同様な抑制因子の存在の下でも成長動態を提示したことが、エミニ他の“ＨＩＶ及び多重薬物抵抗力”、自然第３６４巻、第６７９頁（1993年８月19日）の中で指摘された。上記の集中併用治療は、使用される薬物各々の全部が同一の静的な蛋白の種、即ち、最初の又は野性種の種の上の異なった部位に対して標的を定められているが故に、傷物であると本発明者は信ずる。言い換えると、前述の集中併用治療の薬物は、どれも、選択的圧力下で出現する突然変異体の薬物抵抗力のある形態に対抗する方向を特に指向している訳でもなく、或いは他の併用薬のどれかに対する抵抗力を授与する突然変異に対抗することを指向する前述の集中併用治療の薬物のどれかでもない。結果としては、併用薬の１つに抵抗力を有する全ての蛋白の突然変異体の形態が他の併用薬のいずれかによって非活性化させられることの保証はあり得ない。かくして、お解かりのように、将来の薬物のスクリーニング及び比較と同時に臨床治療の設計にも利用される従来の技術の技法は、効果的でないか或いは実用的でないかのいずれかである。従って、現在では、薬物抵抗力の問題に打ち勝つための病原性微生物に対抗する効果的な治療法に対するニーズが存在する。加えて、薬物に応答して出現し得る全ての可能性のある第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の、将来の薬物の臨床投与に先立っての予測、薬物に対抗する抵抗力展開の容易さの観点での薬物の比較、及びこのような薬物抵抗力のある突然変異体に対抗する効果的な薬物の同定に対するニーズが存在する。更に、従来型の細胞培養選択技法よりも時間効率がよくて経済的であるやり方での、主題の薬物に対しての蛋白の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の予測に使用可能なガラス器見内での技法に対するニーズが存在する。発明の概要本発明は、多くの実例で、蛋白に対抗する目標を立てられた効果的な抑制性薬物に対する感受性回避のために蛋白が採り得る別個の初期の進化経路は、極く少数に過ぎないということの発見を前提とする。極く少数の別個の抵抗力授与突然変異のみが、蛋白に対抗する目標を立てられた効果的な抑制性薬物の使用への応答において、初期に蛋白に利用可能にされているものであるというこの覚書きは、抗微生物治療の分野における現在思考に反するものである。従来技術における治療法設計は、抵抗力授与突然変異と抵抗力授与突然変異に組み合わされて薬物抵抗力の段階的なより高いレベルの授与をする他の突然変異との間を区別すること、にかくも遠く離れて失敗してしまったのである。前記発見の１応用例は、使用の予期される薬物に応答して生体内で出現する可能性の高い最初の（又は“野性種の”）蛋白の別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の全ての正体のガラス器具内での予測方法にある。本発明の教唆に従えば、このガラス器具内法は、少なくとも１つのそして望ましくは３つ以下のアミノ酸置換によって最初の蛋白或いはその区域と異なる第１世代の突然変異体を含む最初の蛋白の第１世代の突然変異体各々の包括的ライブラリーを産み出すステップと、問題の薬物に抵抗力を有する総括的ライブラリーからの生物活性の第１世代の突然変異体の全てをガラス器具内で分離するステップと、そのようにして分離された各第１世代の生物活性の突然変異体を同定するステップとを包含するが、この同定にあっては、そのようにして分離された同一アミノ酸連鎖を有する他の突然変異体が同定されることのないようにして同定された各突然変異体は、薬物に応答して生体内に出現し得る別個の第１世代の薬物抵抗のある生物活性の突然変異体を代表する。上記方法の５つの異なる実施例が以下に詳細に記述される。特別に好適な１実施例に従えば、自然のままではプロテアーゼによる蛋白重合体の開裂によって触媒される生物活性を有する第２蛋白を伴った蛋白重合体の一部として発現するタイプのプロテアーゼの別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体のガラス器具内での予測方法が開示される。例えば、プロテアーゼがＨＩＶプロテアーゼの場合には、好適にはガラス器具内法は、（ａ）各々がＨＩＶ逆トランスクリプターゼ蛋白を伴う蛋白重合体の一部として発生させられる、少なくとも１つのそして望ましくは３つ以下のアミノ酸置換によって差異を有するプロテアーゼの第１世代の突然変異体全ての包括的なライブラリーを、薬物の存在の下で調合するステップと、（ｂ）プロテアーゼによる蛋白重合体の開裂によって触媒される逆トランスクリプターゼ蛋白の生物活性の分析によって前記ライブラリーから第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体プロテアーゼをガラス器具内で分離するステップと、（ｃ）このようにして分離された別個の第１世代の生物活性の突然変異体プロテアーゼを同定するステップとを包含する。容易に理解され得るように、上記の一般的方法は、薬物抵抗力と生物活性との大きさを有して生体内に現れ得る実質的に全ての第１世代の突然変異体を許容するが故に、本発明は細胞培養選択との関連で上記で議論した本来的な制約の中の少なくとも幾つかは打破する。さらには、本発明は、病原体の官能性蛋白の単なる部分集合と一緒に実施に移すことが可能であり、それ故に、無傷の病原体使用に伴った安全性問題は回避される。その他の本方法の細胞培養選択に対する利点及びその他の技法が以下に記述され、或いは以下の本方法の詳細なる説明との関連で明らかとなるであろう。前述の本発明のガラス器具内法を使用する被標的蛋白の別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の制約された活動圏の同定のあとでは、該突然変異体に対して活性な補助薬の同定のために既知の方法が使用され得るし、又、最初の薬物と１つ以上の補助薬とのカクテル（或いは代替案としては最初の蛋白及び第１世代の突然変異体の形態の両者に対抗して使用される単一薬物）が、抵抗力の発生機会よりも以前に、初期の進化の逃げ道の全てを遮断するべく開発されることが可能である。このうよな薬物カクテルは、本発明に従って予期されるように、上記のチュー他の“集中併用治療”によって示唆された組合せ薬物とは異なっており、ここでは、チュー他の集中併用治療の薬物が、全て、単一の１時的に静的な標的の中の異なる部位を指向しているのに対して、本発明のカクテル薬物は、（好適には全ての進化的な経路遮断の手段として最初の蛋白の抵抗力授与突然変異の上に焦点を絞ることによって、）最初の蛋白及びその第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体を指向している。したがって、本発明に追従して開発される薬物カクテルは、薬物の抵抗力の問題に打ち勝つための現存技法よりも、より効果的であると期待される。上記発見の他の１つの応用例は、特定蛋白を標的にする薬物の究極の効力のガラス器具内での予測方法にある。本発明者は、薬物の究極の効力が、薬物使用応答で出現する別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の数に逆比例する、ことを発見した。結果として、ガラス器具内試験で比較的少数の別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の出現を許容する薬物は、カラス器具内試験で比較的多数の別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の出現を許容する薬物よりも、より大きな生体内での究極の効力を有することを現すことになるであろう。本明細書の中に記載される全ての第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の正体の決定に使われるのと同一の技法は、容易に別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の数の決定を可能ならしめる。本発明又、被標的薬物に応答して生体内に出現し得る蛋白の別個の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の斬新なガラス器具内予測技法を指向する。本発明の示唆に従えは、この技法は、少なくとも１つのアミノ酸置換により最初の蛋白と異なっている突然変異体の蛋白を暗号化するヌクレオチド連鎖のライブラリーを準備するステップと、突然変異体の蛋白のライブラリーを提供するための異形発現によって前記ヌクレオチド連鎖ライブラリーを発現させるステップと、前記突然変異体の蛋白のライブラリーから薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の蛋白をガラス器具内で分離するステップと、そのうようにして分離された各第１突然変異体の蛋白を同定するステップとを包含するが、この同定にあっては、そのようにして分離された同一アミノ酸連鎖を有する他の突然変異体が同定されることのないようにして同定された各突然変異体は、薬物に応答して生体内に出現し得る別個の薬物抵抗のある生物活性の突然変異体を代表する。本明細書及び請求の範囲の目的での表現“異形発現”は、突然変異体ヌクレオチド連鎖のライブラリーの発現に適用されるとき、対応する野性種乃至は最初のヌクレオチド連鎖の自然のままの位置と異なる位置での突然変異体ヌクレオチド連鎖のライブラリーの発現を意味するものと定義する。異形発現は、野性種乃至は最初のヌクレオチド連鎖誘導の発生する同一又は別の微生物の中で起こり得るものであり、或いはガラス器具内システムの中で起こり得るものである。前述の技法は突然変異体ヌクレオチド連鎖の絞り出しのために異形発現システムを利用するが故に、主題の技法は従来形の細胞培養技法に対して幾つかの利点を有する。このような利点の１つは、細胞培養で使えるよりも、より多数の変異体のより迅速な評価を行い得ることである。それ故、本技法を使用すれば、細胞培養を用いて同定することが実践上では不可能であったような或る突然変異体を同定することが可能になるかも知れない。比較可能な細胞培養技法を超える本技法の他の１つの利点は、細胞培養を使っては突然変異体を制約する効果的な制御の実践が不可能であるのに対して、本技法には特定遺伝子に対して突然変異の位置を制約する及び／又は突然変異のタイプ及び／又は数を定義する能力が存在する。結果として、細胞培養では或る突然変異に対して或る固有のバイアス掛けが行なわれるが故に細胞培養では姿を現し得ない或る突然変異を、本技法の使用によって同定することが可能になるかも知れない。本発明は、又、上記のやり方で同定されるこれらの薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の蛋白に対応するヌクレオチド連鎖にも向けられている。このような連鎖は診断及びその他の目的に対して有用であり得る。本発明の他の特徴に従って、プロテアーゼによる蛋白重合体の開裂によって触媒される生物活性を有する第２蛋白を伴っている蛋白重合体の一部として自然のままでは発現する、プロテアーゼである第１蛋白の生物活性の突然変異体の形態又は野性種の形態に対抗する薬物の効力に関するガラス器具内の評価方法が記述されている。本発明の示唆に従えば、前記方法は、（ａ）第２蛋白と、プロテアーゼの生物非活性の突然変異体の形態と、第２蛋白を活性化するやり方におけるプロテアーゼの生物活性の形態又は野性種の形態により開裂の可能な１つ以上の部位を包含する突然変異体の蛋白重合体を調合するステップと、（ｂ）この突然変異体の蛋白重合体に薬物を加えるステップと、（ｃ）それから突然変異体の蛋白重合体にプロテアーゼの生物活性の形態又は野性種の形態を加えるステップと、（ｄ）それから第２蛋白に対する生物活性の存在分析を行なうステップとを包含するが、この分析にあっては、第２蛋白に対する生物活性の存在は、薬物が被試験プロテアーゼの生物活性の突然変異体の形態又は野性種の形態に対して効能のないことを指示する。好適には、プロテアーゼはＨＩＶプロテアーゼであり、第２蛋白はＨＩＶ蛋白重合体の一部としてのＨＩＶプロテアーゼによって発現される逆トランスクリプターゼ蛋白である。上記方法の１応用例は、臨床使用時において得られるプロテアーゼの生物活性の突然変異体の形態に対抗する薬物のスクリーニングの中にある。このような突然変異体プロテアーゼは、例えば感染した患者の組織又は血液サンプル、細胞培養で成長させる病原体の臨床分離菌、或いは感染患者から入手されてガラス器具内トランスレーションで発現する増幅されたプロテアーゼ暗号化ＲＮＡ又はＤＮＡから入手され得る。本発明は、更に、プロテアーゼによる蛋白重合体の開裂後に発現される生物活性を有する第２蛋白を伴った蛋白重合体の一部として自然のままでは発現するプロテアーゼである、第１蛋白の生物活性の突然変異体の形態又は野性種の形態に対しての薬物の効力のガラス器具内での評価用のキットを指向する。本発明の示唆に従えば、前記キットは、（ａ）第２蛋白、プロテアーゼの生物非活性の突然変異体の形態及び第２蛋白を活性化するやり方におけるプロテアーゼの生物活性の形態又は野性種の形態により開裂の可能な１つ以上の部位を包含する突然変異体の蛋白重合体と、（ｂ）効力ある薬物の非存在状態で突然変異体の蛋白重合体と組み合わされると第２蛋白を活性化するやり方で突然変異体の蛋白重合体を開裂するプロテアーゼの生物活性の突然変異体の形態又は野性種の形態と、（ｃ）第２蛋白に対する生物活性の存在検出手段と、を備える。好適には、プロテアーゼはＨＩＶプロテアーゼであり、第２蛋白はＨＩＶ蛋白重合体の一部としてＨＩＶプロテアーゼによって発現される逆トランスクリプターゼ蛋白である。上記キットは、更に、３本の試験管セットを備え得るものであり、第１試験管は突然変異体の蛋白重合体を、第２試験管は活性プロテアーゼを、第３試験管は第２蛋白に対する生物活性の存在の検出手段を包含する。容易に理解され得るように、上記キットは、無傷の病原体及び／又は細胞培養を必要とすることなく活性プロテアーゼに対する将来の薬物の効力の迅速評価を可能ならしめている。最後に、本発明は、又、プロテアーゼによる蛋白重合体の開裂によって触媒される生物活性を有する第２蛋白を伴った蛋白重合体の一部として自然のままで発現するタイプのプロテアーゼの存在の検出分析法を指向する。本発明の示唆に従えば、前記分析法は、（ａ）プロテアーゼの生物非活性の突然変異体の形態と、第２蛋白と、第２蛋白を活性化させるやり方におけるプロテアーゼの活性の形態により開裂の可能な１つ以上の部位と、を包含する突然変異体の蛋白重合体と、（ｂ）第２蛋白に対する生物活性の存在の検出手段とを包含する。好適には、プロテアーゼはＨＩＶプロテアーゼであり、蛋白重合体はＨＩＶ蛋白重合体であり、そして第２蛋白はＨＩＶ逆トランスクリプターゼである。本発明の追加の応用例、使用方法、特徴、観点、及び効果は、部分的には以下の記述の中に説明されるであろうし、部分的には明細書の記述から明らかになるであろうし、或いは発明の実践から学習されるであろう。明細書の記述の中では、明細書の記述の一部を形成し、発明実践用の特定実施例を図解法によって示す付属図面を引用する。本発明の範囲を逸脱することなく他の実施例が利用可能であり、構成的変更がなされ得ることは理解されるべきである。図面の簡単な説明ここに本明細書の中に編入し、本明細書の一部を構成する付属図面は、本発明の種々な実施例を図解し、明細書の記述と共に本発明の原理を説明するのに役立っている。類似参照番号が類似部分を表現している図面の中では、図１は、１組の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の中に存在する抵抗力授与突然変異の同定方法の概略説明図であり、図２は、“Ｒ”が薬物に対する抵抗力を表わし、“Ｓ”が薬物感受性を表わしてなる、初期薬物に対する抵抗力授与突然変異に作用する補助薬物の同定方法の概略説明図であり、図３は、本発明の実施例２の技法の中に使用されるタイプの融解蛋白を暗号化するＤＮＡ連鎖の概略説明図であり、図４は、本発明の実施例２の技法の中で使用される７個の４２集団と１個の２７集団との概略説明書であり、図５は、生物活性を有して問題の薬物に対する抵抗力を有する第１世代の突然変異体のガラス器具内での分離のための、本発明の実施例２の技法中の詳細手順の概略説明図であり、図６は、ｐＩＩＩ／ＨＩＶ−１蛋白重合体融解蛋白を包含する蛋白被覆を有して本発明の実施例３の技法を使用して生産されるファージ粒子の概略説明図であり、図７は、ＨＩＶ−１プロテアーゼの生物非活性及び／又は薬物感受性のある突然変異体を包含する蛋白被覆を有する図６に示すタイプのファージ粒子の概略説明図であり、図８は、ＨＩＶ−１プロテアーゼの生物活性の薬物抵抗力のある突然変異体の形態を包含する蛋白被覆を有する図６に示すタイプのファージ粒子の概略説明図であり、図９は、ＨＩＶ−１蛋白重合体がＨＩＶ−１プロテアーゼ蛋白の薬物感受性のある及び／又は生物非活性の突然変異体の形態を包含しなる、本発明の実施例４の技法に従って生産されるＧＡＬ４転写賦活物質／ＨＩＶ−１蛋白重合体融解蛋白の概略説明図であり、図１０は、ＨＩＶ−１蛋白重合体がＨＩＶ−１プロテアーゼ蛋白の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の形態を包含してなる、本発明の実施例４の技法に従って生産されるＧＡＬ４転写賦活物質／ＨＩＶ−１蛋白重合体融解蛋白の概略説目図であり、図１１は、実施例４の技法に従って決定される、第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体に対して効果的である、補助薬物の同定に対する選択条件を図解する概略説明図であり、図１２は、実施例５の技法中に使用されるプラスミドｐＬ124.23の一部の概略説明図であり、図１３は、逆トランスクリプターゼ活性化のために必要なプロテアーゼ開裂を図解する概略説明図あり、図１４は、プラスミドｐＬ124.23を使用してプロテアーゼ突然変異体ライブラリーを発生させるために使われるステップの順序を図解する概略説明図であり、図１５は、実施例５の中で述べられる技法に従って同定された薬物抵抗力のあるプロテアーゼ突然変異体ＤＬＨ３１０を包含するマイクロ板の写真であり、図１６は、ＨＩＶプロテアーゼの生物活性の突然変異体の形態又は野性種の形態に対抗する将来の薬物をスクリーニングするための分析キットの構成部品を図解する概略説目図であり、図１７は、図１６の分析キット中の活性プロテアーゼによる突然変異体蛋白重合体の逆トランスクリプターゼ蛋白の相互活性化を図解する概略説明図である。好適な実施例の詳細説明本発明者の経験的観察から産み出された本発明は、多くの実例では、蛋白を標的とする効果的薬物に対する感受性克服のために蛋白に利用可能にされている極く少数の別個の初期の進化的逃避経路、（即ち、抵抗力授与突然変異）が存在しているに過ぎないという発見へと導いている。この発見を使用して本発明者は、特定の被標的薬物に応答して生体内に出現し得る蛋白の別個の第１世代の生物活性の突然変異の全ての性質と数とをガラス器具内で予測することによって、臨床での使用中の前記薬物に対する抵抗力を制約するために、或いは抑制するためにさえ使用し得る価値のある情報を入手することが可能であることを発見した。例えば、本発明者は、特定薬物に対して抵抗力を有する別個の第１世代の生物活性の突然変異体の全ての性質をガラス器具内で同定することによって、前記突然変異体に対して活性な１つ以上の補助薬物が、（例えば、合理的薬物設計、組合せスクリーニング、又はこれらの変形のような既存の技法によって）同定され得て、初期の薬物及びこのようにして同定された１つ以上の補助薬物を包含する薬物の“カクテル”（或いは、代替案として、初期の薬物及び１つ以上の補助薬物の両者の代わりに使用される単一の薬物）が、抵抗力の臨床での使用中に現れる機会の起こる前に最初の蛋白の個別の初期の進化的逃避経路の全てを遮断するために開発され得る。個別の第１世代の生物活性の薬物抵抗力のある突然変異体の数は限られているで、効果的な“カクテル”に対して要求される薬物の全数も同様に限度がある筈である。同様に、本発明者は、特定の薬物に抵抗力を有する別個の第１世代の生物活性の突然変異体の全ての数をガラス器具内で決定することによって、この薬物の究極の床臨上の効力の予測が可能であることを発見した。これは、薬物に抵抗力のある別個の第１世代の生物活性の突然変異体の数に、この薬物の究極の効力が逆比例することの本発明者の発見によるものである。このやり方で、このような突然変異体の数が或るしきい値の上にある場合には、本発明が、薬物抵抗力のある変異体のたやすい展開を予想せしめ、これらからこの薬物は臨床的に使用する薬物として適切ではないとの結論に至らしめる。上記のようにして薬物の究極の効力の評価に使用する適切なしきい値は、高い又は低い究極の効力を有すると事前に決定されている薬物を使用して同一又は同様な条件の下で得られるこのような突然変異体の数を観察することによって引き出し得る。容易に判断可能なように、臨床での使用に先立って２つの将来の薬物候補を比較して、どっちがより大きな究極の効力を有するのか、より効能のある薬物はより数の少ない別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体を引き出す方のものであることを見極めるために、上記で説明した原理が又使用され得るであろう。（従来の技術の関心の的であった）“長期間”の効力と（本発明の関心事である）“究極”の効力との間を区別することが重要である。事実、従来の技術的な方法から引き寄せられ得る結論と比較すると、本発明の方法は、相対的な薬物効力に関して膨大な相違を有する結論に導くことが可能であろう。例えば、蛋白が付与の薬物に応答して迅速に自ら発現する唯一の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体を有する場合、薬物抵抗力の迅速な展開が普通に熟練した当業者を、この薬物は限定的な長期間効力を有するとの結論に導いてしまったであろう。他方、同一の蛋白が第２の薬物に応答してゆっくりと自らを発現させる４つの別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体を有すれば、薬物抵抗力の遅れた展開が、普通に熟練した当業者を、この第２の薬物はより大きな長期間効力を有するとの結論に導くであろう。対照的に、本発明の教唆を利用する人は、突然変異の速度を無視して代わりに突然変異体の数と性質に焦点を当てるであろう。そうすることによって、第１の薬物はより大きな究極の効力を有しており、ここでは、唯一の他の治療作用物質、即ち、孤独な第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体に対して治療効力を伴った作用物質と組み合わされる必要があるとの結論を導き出すであろう。（十中八九、第２の薬物は、４つの別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体と戦うために、１つよりも余計に治療作用物質を追加して組み合わせる必要があるであろう。）ここで利用されるように、用語“薬物抵抗力のある”は野性種の蛋白の機能を不活性化乃至は抑制するのに充分な濃度の薬物の存在の下で活性乃至は機能を有意義なレベルで維持する突然変異体に適用される。このような抑制的濃度は、多くの薬物については公知であり、その他の薬物については、普通に熟練した当業者に利用可能な日常的手順によって容易に確認し得るものである。本発明の教唆に従えば、被標的蛋白の別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の性質及び／又は数が決定されるやり方は、以下の通りである。即ち、最初に、蛋白の第１世代の突然変異体の形態の包括的なライブラリーが創生されるがが、このライブラリーは、理想的には、少なくとも１つの、そして４つ以上の数までもの（しかし好適には、３つ以下の）アミノ酸置換によって野性種の蛋白からは相違している各第１世代の突然変異体を包含するものである。一般には、このような第１世代の突然変異体は、被標的蛋白を暗号化するＤＮＡ連鎖を隔離して被標的蛋白を暗号化するＤＮＡ連鎖の中に特定点突然変異で導入し、それから異形発現を使用して蛋白を発現させることによって創生される。次に、問題の薬物に対して抵抗力を有している包括的なライブラリーからの生物活性の第１世代の突然変異体の全てがガラス器具の中で分離される。このようにして分離された各第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体のアミノ酸連鎖は、それから、例えば、蛋白を暗号化するＤＮＡ部分を配列し（ここから引用することによって本明細書の中に編入するサンジャー他の“鎖終端抑制因子を随伴するＤＮＡ配列”米国科学アカデミー協会報第７４巻、第５４６３〜５４６７頁、1977年参照。）、そしてそれから対応するアミノ酸連鎖を推定することによって同定される。同一アミノ酸連鎖を有する他の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体が同様に同定されることのないようにして、このように同定された各第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体に注目することにより、薬物に応答して生体内に出現し得る別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の全てを推定することが可能である。好適には、第１世代の突然変異体の包括的なライブラリーは、最初の蛋白の３つ迄のアミノ酸置換によって被標的蛋白から相違している各突然変異体を包含する。より多くのアミノ酸置換を有する突然変異体も、又、このライブラリーの中に含まれ得るが、しかしながら、そのようにライブラリーを拡張することの効果を、生成、使用、及びそのようにサイズの拡大したライブラリーからの結果を分析するのに要する追加の時間及び原価との間で、個々のケース毎に天秤に掛けなければならない。ライブラリーを４つ以上のアミノ酸置換に迄拡張することの決定にインパクトを与えるかもしれないいくつかのファクターは、蛋白の大きさ（蛋白がより小さければ多重アミノ酸置換を含めるためのライブラリー増大化負担もより小さい。）、蛋白の突然変異体の形態のライブラリーが生成されるやり方（例えば、ＤＮＡ連鎖の“定義されたライブラリー”を使ってか、或いは“無作為化ライブラリー”を使ってかのいずれでライブラリーが作られるのか、これらの２タイプのライブラリー及びこれらの間の差異は以下に議論される。）、薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体のガラス器具内での同定技法としてはスクリーニング技法と或いは積極的選択技法とのいずれが使用されるのか（積極的選択技法は、多数の突然変異体の試験に対してはスクリーニング技法よりも、より良く適合する。）、生体内での蛋白の変貌可能性（例えば、ＨＩＶウイルスの蛋白は、編集機構欠如のために他の多くの微生物よりも突然変異頻度がより高い。）、及び感染した個人の中に典型的に発見される病原体コピーの数（例えば、“病原体負荷”）を包含する。生体内で生産される野性種の蛋白の第１世代の突然変異体の性質及び数は、病原体負荷及び病原体の突然変異速度のような病原体の特性に依存する。従って、実例の中の極めて大きな部分では、感染した個人の中で起こる３点以上で同時に発生する突然変異の確立は非常に低いので、３つを超えるアミノ酸置換を有する突然変異体を包含する迄にライブラリーの拡張をするべき理由は存在しないであろう。説明すると、バクテリア又はウイルスの中での特定塩基対での置換突然変異は、１世代当り１０^-10より低い頻度の範囲で、ＨＩＶの極端な場合で１０^-4 の高さの頻度の範囲で起こり得る。ＨＩＶの極めて高い推定突然変異頻度に対してさえも、３つの同時発生的特定塩基置換は１０^-12の頻度で発生し得るに過ぎない。比べると、感染した個人の中に存在する病原体の数は、上記の確率で３つ以上のアミノ酸置換を有する突然変異体の存在を保証するのに要求される病原体の数より大幅に少ないものとなるであろう。例えば、ＨＩＶウイルスに感染した細胞のプロウイルス負荷は、一人の研究者によると１０⁸乃至５×１０¹⁰であると推定されている。ウエイン−ホブソンの“今までに記録された最高速のゲノム進化：現場でのＨＩＶ変貌”、遺伝学及び発展の現在意見第３巻、第８７８〜８８３頁（1993年）参照。ＨＩＶ以外の多くの病原体に対しては、感染した個人の中に存在する病原体のコピー数は、かなり低いものである。従って、感染した個人の中に典型的に存在する病原体の数及び突然変異頻度を基礎にすると、典型的には突然変異体のライブラリーには３つのアミノ酸置換迄のみを含ませることが必要となるであろう。本明細書及び請求項の目的に対しては、本発明の突然変異体の包括的ライブラリーは、最初の蛋白から少なくとも１つのアミノ酸置換だけ相違するこれらの最初の蛋白の第１世代の突然変異体の包括的部分集合に限定され得る。このような包括的部分集合は、例えば、少なくとも１つのアミノ酸置換が触媒ポケットのような蛋白の特定官能区域に限定されているような最初の蛋白から少なくとも１つのアミノ酸置換分相違する第１世代の突然変異体の全てを包含し得るであろう。上記の包括的部分集合に類似する突然変異ライブラリーは、例えば、種々な蛋白の構造機能との間の関係を決定するために予め使用されている。ＨＩＶプロテアーゼの構造と機能との間の関係を洞察するための突然変異ライブラリー使用の例が“ＨＩＶ−１プロテアーゼの突然変異誘発”、自然第３４０巻、第３９７〜４００頁（1989年）の中にローブ他によって記述されており、これを引用することによって本明細書の中に編入する。しかしながら、薬物抵抗力授与突然変異の発見のため、及び／又は薬物抵抗力のある突然変異体の予測知識を基礎にして薬物を発見するための突然変異ライブラリーの使用は、以前に記述されたことはない。このように、本発明の好適な実施例の包括的なライブラリーとは異なり、従来の技術の突然変異ライブラリーは、蛋白の局部的区域に限定されていようとなかろうと少なくとも１つのアミノ酸置換によって最初の蛋白から相違している全ての突然変異体の包括的な収集を必要としていない目的に対してのみ使用されてきた。さらに、本発明の中で予期される包括的ライブラリーは、蛋白の中の付与の場所で潜在的に利用可能な２０のアミノ酸の全ての１つでの置換を包含する必要のないことが正しく判断されるであろう。幾つかの実例の中では、２次的構造を維持するため或いは蛋白分子の中での構造的制約のためにライブラリーの中の突然変異体の蛋白の中の特定場所から特定蛋白を慎重に省略することが望ましいであろう。かくて、ここに使用されるように、（少なくとも１つのアミノ酸置換によっ最初の蛋白又はその区域から相違している）“各”又は“全ての”蛋白を包含するライブラリーは、残余のアミノ酸、即ち、慎重に省略されなかったアミノ酸の各々による置換に関しては包括的であるライブラリーと定義される。上記で言及されているように、望みの最初の蛋白の第１世代の突然変異体の上述の包括的なライブラリーを合成するためには、種々な技法が存在する。このような技法の１つは、本明細書及び請求項の目的に対しては、“定義されたライブラリー”として言及する分離ＤＮＡ連鎖のライブラリーの発現を包含する。このような技法の他の１つは、本明細書及び請求項の目的に対しては、“無作為化ライブラリー”として言及するＤＮＡ連鎖のライブラリーの表現を包含する。定義されたライブラリー及び無作為化ライブラリーの両者は、一連のＤＮＡプライマーを発生させることによって合成されるが、各プライマーは、野性種の蛋白を暗号化する遺伝子部分に対応し、１つ以上の塩基置換によって前記遺伝子部分からは相違しており、それから、中に追加の突然変異を導入することなくプライマーを使って遺伝子の残余の部分を合成するためにプライマー伸長不適切組合せの周知技法を適用する。前記一連のプライマー作成のやり方は、しかしながら、プライマーが定義されたライブラリーを作るのに使われるのか、無作為化ライブラリーを作るのに使われるのかに依存して差異を生ずる。定義されたライブラリーの場合には、単一変異体コドン（又は多重変異体コドン）の塩基の所を除く各塩基の位置での野性種の蛋白の一部に対応するＤＮＡ連鎖と一致した、定義されたＤＮＡ連鎖をＤＮＡ合成装置を使って合成することにより、プライマーは作られる。前記単一変異体コドン（又は多重変異体コドン）の３つの置換塩基の位置では、等モル量の４つの可能塩基（即ち、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴ）の全てが、コドンの６４配列全てを発生させるためにＤＮＡ合成装置で利用可能になっている。対照的に、無作為化ライブラリーの場合には、４つの可能塩基（即ち、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴ）の全ての混合物が、合成される連鎖の全ての塩基の位置でＤＮＡ合成装置で利用可能になっている。この混合物は、小さな等モル量の追加の３つの代替塩基を伴った野性種の塩基を主に構成する。１プライマー当りの突然変異の平均数は変異体塩基に対する野性種の割合で制御され得る。このタイプの合成結果は、ガウス分布に相当するプライマー当りの突然変異数でもって全長さに亘って無作為に分布する変異体を随伴するプライマー産品である。正しく判断され得るように、“無作為化ライブラリー”とは反対の“定義されたライブラリー”を使用する１つの利点は、プライマー当りの突然変異のタイプと数とを“定義されたライブラリー”においてはより綿密に制御し得ることである。又、無作為化ライブラリーにおける突然変異のガウス分布の故に、無作為化ライブラリーの中には、望みの突然変異数より多い突然変異数を有する多くの連鎖がしばしば存在することになるであろう。対応する突然変異体の蛋白の分離及び配置に先立って突然変異を過剰に有する連鎖を、望みの突然変異数を有する連鎖から容易には区別し得ないので、“無作為化ライブラリー”の中の連鎖の全てを発現させてから対応する薬物抵抗力のある突然変異体の全てを分離し、それから分離された薬物抵抗力のある突然変異体の全てを配列してから後に、望みの数より多い数の突然変異を有する突然変異体を無視する以外の選択は残されていない。明らかに、このアプローチは、不必要な努力を産む結果になり兼ねない。反対に、定義されたライブラリーに対する無作為化ライブラリー使用の利点の１つは、多重の突然変異を有する突然変異体に対応するＤＮＡ連鎖がより容易により迅速に発生され得ることである。上記で言及したように、初期の薬物に抵抗力を有する野性種の蛋白の別個の第１世代の生物活性の突然変異体の全てが一度上記のやり方で同定されると、前記突然変異体の全てに対して効果的である補助薬物の同定が望まれることになるであろうし、その結果、臨床での使用中に抵抗力の現れる機会が出現する前に最初の蛋白の別個の初期の進化的逃避経路の全てを遮断するために、このようにして同定された補助薬物が初期の薬物と一緒に（或いは、このようにして同定された１つの補助薬物が野性種の蛋白及びその蛋白の全ての可能性のある突然変異体の形態の両者に対して効果的である場合にはその補助薬物だけで）使用され得る。このような補助薬物を同定する１つの方法は、第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体を分離するのに使用したのと同一タイプの手順を使って、既に同定された第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の全てに対する潜在的な補助薬物を単純に試験することである。第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体に対するスクリーニングに適する潜在的な補助薬物は、組合せ化学によるような既存の技法によって発生され得る。アルパーの“流れ作業配置の上での薬物発見”、科学第２６巻、第１３９９〜１４０１頁（1994年６月３日）参照。この文献は引用することによって本明細書に編入されるものとする。単独或いは１つ以上の他の薬物との組合せのいずれかで第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の全てに対して効果的であると決定される薬物は、薬物抵抗力を阻害しそうな補助薬物として適格である。このような補助薬物を同定する代替方法の１つは、“抵抗力授与突然変異”の全ての正体を決定するために、最初に別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の全てを分析することを包含する。本明細書及び請求の範囲の目的に対しては、表現“抵抗力授与突然変異”は、蛋白との関連で使用される時、生物活性を失うことなく特定薬物に対する感受性に打ち勝つために最小限蛋白が保有しなければならない単一のアミノ酸置換又は組合せのアミノ酸置換のいずれかに関連する。本明細書及び請求の範囲の目的に対しては、蛋白は、蛋白の上に抵抗力を独立に授与する能力を有する２つ以上の“抵抗力授与突然変異”を有し得る。表現“抵抗力授与突然変異”は、本明細書及び請求の範囲の目的に対しては、蛋白に適用される時に蛋白の上に特定薬物に対する抵抗力を授与するのに必要ではない（がしかし、抵抗力授与突然変異と組み合わされて抵抗力のレベルを増大させる結果を産み出し得る）単一のアミノ酸置換又は組み合わせのアミノ酸置換のいずれかに関連する“中立的突然変異”の表現と対照されるべきである。容易に正しい判断がなされ得るように、第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異は、１つ以上の“抵抗力授与突然変異”と１つ以上の“中立的突然変異 ”との両者を包含し得る。抵抗力授与突然変異の正体は、以下のやり方で決定され得る。最初に、各同定された第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体のアミノ酸連鎖が、野性種の蛋白のアミノ酸連鎖に比較される。同定された第１世代の突然変異体のアミノ酸連鎖が、単一のアミノ酸置換分のみ野性種の蛋白のアミノ酸連鎖と相違している場合には、そのアミノ酸置換が即ち抵抗力授与突然変異を表わしている。しかしながら、同定された第１世代の突然変異体が２つ以上のアミノ酸置換分、野性種の蛋白のアミノ酸連鎖と相違している場合には、前記２つ以上のアミノ酸置換の各々は同定され、それから最初の１組の野性種の蛋白の新突然変異体が創生されるが、前記第１組の各“新突然変異体”は同定された２つ以上のアミノ酸置換の別々の１つ分、野性種の蛋白から相違するものである。上記の新突然変異体は、この蛋白を暗号化する遺伝子の突然変異体の形態の発現によって生産され得るが、前記突然変異体の遺伝子は、好適には野性種の蛋白の標準部位指向突然変異誘発を使用して作られて欲しい。例えば、プロメガプロトコルと応用ガイド、第２版、１９９１年、第９８〜１２２頁、ウイルコンシン州、マジソンのプロメガコーポレーション参照。この文献は引用することによって本明細書の中に編入するものとする。各新突然変異体は、それから問題の薬物に対する抵抗力をテストされる。薬物抵抗力のあるものとして同定されたこれらの新突然変異体の中に存在する各単一のアミノ酸置換は、従って抵抗力授与突然変異体を代表する。同定された第１世代の突然変異体のアミノ酸連鎖が厳密に２つのアミノ酸置換分、野性種の蛋白のアミノ連鎖から相違する場合には、そして、これらの置換の１つが上記手順によって抵抗力授与突然変異体であると同定された場合には、他のアミノ酸置換は、通常、対応する新突然変異体が（他の単一のアミノ酸置換を含めて）薬物感受性ありと同定されたとしても“中立的突然変異”を代表する。上記手順に従った後、抵抗力授与突然変異が未だ２つ以上のアミノ酸置換を有する突然変異体に対して同定されていないか、或いは、突然変異体が３つ以上のアミノ酸置換を有して個別に調査した少なくとも該置換の２つが抵抗力授与突然変異であると決定されていないか、であっても、第２の組の新突然変異体が生産され、上記のやり方でテストされるが、この第２の組の各“新突然変異体”は、事前に個別に“抵抗力授与突然変異”であると同定されていない別の組合せの２つのアミノ酸置換の分、野性種の蛋白と異なっているものである。このやり方で “組合せ”抵抗力授与突然変異は同定される。それからこのプロセスは、適用可能な場合、全ての可能な組合せのアミノ酸置換がテストされてしまうまで、全ての系統的な整数組合せのアミノ酸置換に対して繰り返される。１組の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体から抵抗力授与突然変異を同定するための上記の手順の例示的適用例が、概略図として図１に図示されているが、ここでは、仮説の野性種の蛋白（Ｐ）から発現する６つの第１世代の突然変異（突然変異体No.１乃至６）が同定され、この６つの突然変異体は５つの異なったアミノ酸置換（Ｎ⁴→Ｓ⁴；Ｃ⁶→Ｎ⁶；Ｄ⁹→Ｒ⁹；Ｅ¹²→Ｑ¹²；Ｈ¹⁴ →Ｄ¹⁴）の種々な組合せを表わしている。単一のアミノ酸置換（Ｃ⁶→Ｎ⁶）が突然変異体No.１に薬物抵抗力を授与したので、この置換は直ちに抵抗力授与突然変異と認知可能である。解かるように、他の抵抗力授与突然変異の同定における初期のステップは、（Ｃ⁶−Ｎ⁶を除く）前述のアミノ酸置換の各々が野性種の蛋白（Ｐ）に関連する１分子当りの単なる１アミノ酸置換として現れる第１の組の新突然変異体（第１新突然変異体No.１乃至４）を生産することである。新突然変異体の各々は、それから薬物抵抗力をテストされる。本実施例では、第１新突然変異体No.４が薬物抵抗力のある（ＤＲ）ものであることが見つかり、一方、第１新突然変異体No.１乃至３は薬物感受性のある（ＤＳ）ものであることが見つかっている。この情報からはＥ¹²−Ｑ¹²のアミノ酸置換も、又、個別の抵抗力授与突然変異を構成すると推定可能である。しかしながら、Ｃ⁶−Ｎ⁶及びＥ¹²→ Ｑ¹²は、突然変異体No.２がＣ⁶→Ｎ⁶又はＥ¹²→Ｑ¹²のアミノ酸置換のいずれをも包含していないので、単なる抵抗力授与変異ではなり得ない。それ故、次に、いずれかの組合せのアミノ酸置換が組合せ抵抗力授与突然変異を構成するか否かを決定しなければならない。これは、既に抵抗力授与であると判明したものではないもの（即ち、Ｎ⁴→Ｓ⁴；Ｄ⁹→Ｒ⁹；及びＨ¹⁴→Ｄ¹⁴）の種々な組合せの２つのアミノ酸置換が野性種の蛋白（Ｐ）に関連する分子当りに導入された第２の組の新突然変異体（第２新突然変異体No.１乃至３）を生産してテストすることによって達成される。本実施例では、第２新突然変異体No.１が薬物抵抗力のある（ＤＲ）ものであることが判明し、一方、第２突然変異体No.２乃至３は薬物感受性のある（ＤＳ）ものであることが見つかっている。この情報からは、Ｎ⁴ →Ｓ⁴及びＤ⁹→Ｒ⁹のアミノ酸置換は、一緒になって組合せの抵抗力授与突然変異を構成し、Ｈ¹⁴→Ｄ¹⁴のアミノ酸置換は、中立的突然変異であると推定することが可能である。一度“抵抗力授与突然変異”が上記のやり方で同定されると、将来の補助薬物が、単に（例えば、図１の突然変異体No.１、第２新突然変異体No.１、及び第１新突然変異体No.４のような）個別又は組合せの“抵抗力授与突然変異”分、野性種の蛋白から相違しているこれらの突然変異体の各々に対してスクリーニングされる。このような将来の補助薬物は初期の薬物としての使用をあらかじめテストされた薬物であるかも知れないが、しかし、この場合、この薬物は初期薬物とて究極的に選定された薬物よりも究極的効力のより小さなものと決定されたものとなる。その他の諸裏の補助薬物は、組合せ化学又はその他の手段で発生された新しい薬物であり得る。前記補助薬物がスクリーニングされるやり方は以下である。即ち、最初に将来の補助薬物が一度に１薬物ずつ抵抗力授与突然変異の各々に対してテストされる。単独補助薬物が抵抗力授与突然変異の全てに対して効果的ではないことが判ると、２つの補助薬物の（それから３つの補助薬物の、４つの補助薬物の等々の）組合せが抵抗力授与突然変異の全てに対してテストされる。一度単一の将来の補助薬物又は組合せの将来の補助薬物が抵抗力授与突然変異に対して効果的であることが判明すると、それから将来の補助薬物は、初期の薬物の随伴の有無両方の状態で、第１世代の突然変異体のライブラリー全体に対してテストが行なわれる。（単一の将来の補助薬物が初期の薬物として熨斗用に対して予めテストされていない場合には、野性種の蛋白及び第１世代の突然変異体のライブラリー全体に対して単独で効力を有していることが発見されるかも知れない。）薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体が出現しない場合には、効果的治療法が同定されたことになる。薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体が出現するのであれば、第１世代の突然変異体のライブラリー全体からの薬物抵抗力のある突然変異体が同定されなくなるまで、別の薬物組合せがテストされる。薬物抵抗力のある突然変異体は、初期の薬物に関する“中立的”突然変異がテストされる補助薬物に関する“抵抗力授与”突然変異の働きをなす抵抗力授与突然変異のグループからは出現しない未定のライブラリーから出現し得る。適切な補助薬物を同定する代替的方法の１つ、即ち経路指向アプローチは、（例えば図１の突然変異体No.１、第２新突然変異体No.１、及び第１新突然変異体 No.４のような）個別の或いは組合せの“抵抗力授与突然変異”分だけ野性種の蛋白から相違している上記と同一の突然変異体の各々に対して将来の補助薬物のスクリーニングをおこなってから、これらの突然変異体に対して効果的であり且つ抵抗力授与突然変異の部位で突然変異体との相互作用を有するこれらの薬物を同定することである。前述の技法の例示的適用例が概略図的に図２に図示されているが、ここでは、単純化のために、単一の抵抗力授与突然変異Ｌ₂→Ｉ₂が、野性種の蛋白に最初の薬物、即ち、薬物１を投与することに応答して出現するものとして示されている（図２のステップＡ参照）。Ｉ₂含有突然変異体に対抗する多数の将来の補助薬物をスクリーニングに掛けた後、１対の薬物、即ち薬物２及び薬物３が効果的であると決定されるが、しかしながら、Ｉ₂含有突然変異体と薬物２及び薬物３の各々との間の相互作用部位はこの時点では未知である。それ故、相互作用の夫々の部位を決定するために、Ｉ₂突然変異体の包括的なライブラリーを発生させて、、Ｉ₂含有突然変異体に対して効果的であることを予め決定してある薬物の各々をＩ₂含有突然変異体について包括的て突然変異体のライブラリーに対してスクリーニングを掛ける。図２のステップＢの中に見られるように、薬物の中の１つのみに対する抵抗力が抵抗力授与突然変異に対する突然変異の結果として生ずるのならば、薬物と蛋白との間の相互作用部位は抵抗力授与突然変異の部位のところにある。しかしながら、薬物の１つに対する抵抗力が、（薬物３でのケースにあるように）蛋白の中の他のどこかでの突然変異の結果として生ずるのであるならば、薬物と蛋白との間の相互作用の部位は抵抗力授与突然変異の部位とは別の部位の所にある。図２のステップＣの中に見られるように、薬物２に抵抗力のある突然変異体が薬物１に感受性あることが予め決定されているが故に、薬物１と薬物２との組合せは、蛋白の突然変異的逃避経路を完全に抑制することに使用可能であり、これによって薬物抵抗力の展開を遮断する。対照的に、薬物１と薬物３との組合せは、薬物１がＩ₂突然変異とＴ₃₀突然変異との両者を含有する突然変異体に対して効果的であるようには見えないので、薬物抵抗力を遮断し得ない。以下の説明は、特定の薬物に応答して人体内に出現し得る別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の全ての性質及び数を予測するのに使用し得る、ガラス器具内での技法の５つの実施例である。第１技法は、実質的にどのようなタイプであっても差し支えない蛋白の進化的応答の評価の使用に適している。他の４つの技法は、自触反応性活性を有して蛋白重合体の部分とて発現されるＨＩＶプロテアーゼのような蛋白の進化的応答の評価に使用するのに、より特異的に適合するものである。これらの５つの技法の方法論を説明するためには、蛋白重合体の部分としてＨＩＶウイルスによって人体内に発現されるＨＩＶ−１プロテアーゼ蛋白が５つの技法の全てに対する蛋白として使用される。ＨＩＶ−１プロテアーゼは、比較的小さな蛋白（で９９アミノ酸の相同性２量体）であり、ウイルスの成熟及び感染能にとって必要なものであり、ギャグーポル蛋白重合体を配列方法で加水分解する。酵素が活性の形態で幾つかの発現システムの中で発現され、感受性のガラス器具内分析法が開発された。実施例１（本実施例の技法は、労働集約型のスクリーニングステップを包含していて、それ故に、第１世代の突然変異体の蛋白分子の数が比較的小さい、即ち平均して１蛋白分子当り２つのアミノ酸置換迄のものの存在する状況に、より適している。）ＤＮＡ合成装置は、２９７塩基対（ｂｐ）のＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子全体を合成するのと、各対応変異体蛋白分子の中に平均して３つの無作為化アミノ酸置換を編み入れるのとの両方に使用される。好適には、遺伝子は、５’及び３ ’端が適切な発現ベクターの中への結紮を許容されている４つの別個の８０塩基対の部分的重複を有するＤＮＡ単一撚りとして合成される。重複を有する８０塩基対区域は、それから大腸菌ポリメラーゼのクレナウフラグメンを使って１つの二重撚りＤＮＡ区域に転換される。二重撚りの区域はそれから適切な発現ベクターの中に結紮されて適切な発現宿主の中に変態される。種々な適切なバクテリア及び酵母の発現ベクター及び発現宿主は、最近はＨＩＶ −１プロテアーゼの発現に利用可能であり、又適してもいる。これらは（分泌物及び内部生成物の両方の）エス．ケレビシアエと（不溶性及び可溶性蛋白と加えて血漿周囲局在の両者としての）大腸菌とを包含する。他の発現システムは、細胞有孔性を増大させるバクテリア解放蛋白用の遺伝子を包含するピキアパストリス又は大腸菌を包含する。適切な発現システムに対しての鍵になる要求事項は、このシステムが分析に充分な量で活性な蛋白の発現を許容することである。発現システムの中でのバイアスを掛けられるポテンシャルのために（例えば分泌物及び内部生成物のような）２つの異なった相補的な発現システムの使用が望まれるのかもしれない。変態された発現宿主は、それから生長させられ、分離菌が薬物抵抗力のあるＨＩＶ−プロテアーゼの活性に対してスクリーニングされる。これは、ＨＩＶ−１プロテアーゼの活性及びＬ−７３５，５２４又はＡ７７００３のようなＨＩＶ− １プロテアーゼの抑制因子に対する測色計分析を包含する微量滴定量容器に接種するための単一分離菌を使用してなされる。（ホー他の“Ｃ₂−対称性プロテアーゼ抑制因子に対する抵杭力の増強された人免疫欠損ウイルスタイプ１変異体の特性明確化”、ウイルス学会誌第６８巻第３号、第２０１６〜２０２０頁（19 94年３月）、及び景山他の“単一の作用物質又は組合せの作用物質としてのＣ₂ 対称性基盤のＨＩＶプロテアーゼ抑制因子による人免疫欠損ウイルス（ＨＩＶ）タイプ１複製のガラス器具内での抑制”、抗微生物作用物質と化学療法第３６巻第５号、第９２６〜９３３頁（1992年５月）参照。この両者は引用することによって本明細書の中に編入されるものとする。）種々のＨＩＶ−１プロテアーゼ活性分析法が最近は利用可能である。（例えばリチャード他の“ＨＩＶ−１プロテアーゼに対する感受性のある可溶性の色素基質”、生物化学学会誌第２６５巻、第７７３３〜７７３６頁（1990年）、及びナシェド他の“ＨＩＶ−１及びＡＭＶのレトロウイルスプロテアーゼに対する連続分光光度計分析法”、ＢＢＲＣ第２６３巻、第１０７９〜１０８５頁（1989年）参照。両文献は引用することによって本明細書に編入されるものとする。）抑制因子の存在の下でプロテアーゼの活性を示す分離菌のいずれもがＤＮＡ連鎖分析によって分析されて同定され、最初の蛋白基質の別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の形態の正体がそれから推定される。実施例２本実施例の技法は、ＨＩＶ−１プロテアーゼの蛋白及びＨＩＶ−１逆トランスクリプターゼの蛋白がＨＩＶ−１蛋白重合体の部分としてのＨＩＶ−１ウイルスによって初期に発現される。個別のプロテアーゼの蛋白及び逆トランスクリプターゼの蛋白を生産するためのＨＩＶ−１蛋白重合体の開裂は、蛋白重合体内の特定開裂部位の上のプロテアーゼ蛋白の自触反応性活性から産みだされる。低誤差取込みベントポリメラーゼを使用してのポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）は、（国立保健研究所エイズ研究及び標準試薬プログラムの）ベクターｐＡＲＴ−２から、ＨＩＶ−１蛋白重合体を暗号化するＤＮＡ連鎖を増幅するために使用される。ＰＣＲ増幅に使用されるプライマーは、増幅されたＨＩＶ−１蛋白重合体の融解蛋白ベクターの中にサブクローン化することを許容して、融解構造全体を別の発現ベクターの中にサブクローン化することを許容する為の制約部位を包含するように設計されている。ＤＮＡ連鎖分析は、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡにエラーの存在しないことを確認するために使用される。増幅されたＨＩＶ−１蛋白重合体ＤＮＡは、それから、麦芽糖融解蛋白の部分として蛋白重合体の発現を可能ならしめるために、（ニューイングランドバイオラブスの）大腸菌麦芽糖結合蛋白用の融解蛋白ベクターの中に挿入される。以下で解るように、麦芽糖結合蛋白は、特定樹脂への融解蛋白結合用の親和性リガンドとして後で使用される。ＨＩＶ−蛋白重合体が適切に融解され得て同様に親和性リガンドとして役立てることの可能な他の蛋白は、例えば（ＩＢＩの）フラグ抗原及び（プロメガ社の）“ピンポント”ビオチン標識付融解蛋白である。以下で明らかになるであろう理由のために、融解蛋白は、自分自身の活性成分プロテアーゼの影響の場合除いて自発的開裂を経験しなければならないことにはなっていない。更に、プロテアーゼは、融解蛋白構造の中で活性でなけれはならない。融解蛋白構造（図３参照）は、それからｐＡＬＴＥＲ／融解蛋白の生産に使用するため、ファージミドベクターの中に挿入され、突然変異誘発が“定義されたライブラリー”のプライマーの以下のシリースを使っての周知のプライマー伸長不適切組合せ法によって実行される。即ち、５８２４の異なる４２集団及び５１２の異なる２７集団から成り、ＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子の２９７塩基対（に加えて蛋白重合対の残余の次の３塩基対）の長さを累積的に伸張させる、６３３６の異なるＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子プライマーのシリースがＤＮＡ合成装置によって合成される。図４に見られるように、５８２４の異なる４２集団及び５１２の異なる２７集団は、それぞれ７組の８３２の異なる４２集団及び１組の５１２の異なる２７集団に対応する。７組の４２集団の各々は、６４のヌクレオチド順列の全てが３’端の所にあるコドンを除く全てのコドンに対しての１分子当りの１コンドの中に導入されること以外、対応する野性種の４２集団と一致する１組のＤＮＡ連鎖を合成することによって発生される。１組の２７集団は、６４のヌクレオチド順列の全てが３’端の所にあるコドンを除く全てのコドンに対しての１分子当りの１コトンの中に導入されること以外、対応する野性種の２７集団と一致する１組の連鎖を合成することによって同様に発生される。６４のヌクレオチド順列は、無作為化コドンの３位置にある等モル量のＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ塩基を使用して発生される。それぞれの４２集団及び２７集団の３’端の所にあるコドンは、貧弱なプライマー伸長の可能性を低下させるように一定に保持される。プロテアーゼ伸長不適切組合せ方法における上記のプライマーシリースの使用に続いて、６，３３６の異なる突然変異体のｐＡＬＴＥＲ／融解蛋白ベクターのライブラリーが生成され、各変異体ベクターは、プロテアーゼ暗号化連鎖の単一コドンの中の１つ乃至３つの塩基対間の置換に対するものを除き、上記の最初のｐＡＬＴＥＲ／融解蛋白ベクターに一致している。（容易に正しい判断が可能なように、変異体のｐＡＬＴＥＲ／融解蛋白ベクターのライブラリーは、プロテアーゼ暗号化連鎖の２つ又は３つのコドンの中の１つ乃至３つの塩基対間のものだけ野性種の遺伝子から相違している全ての突然変異体プロテアーゼを包含する。しかしながら、２つ又は３つのコドンの中での突然変異を有する“定義されたライブラリー”のプライマーを使用してのこのような突然変異体の発生は、労働集約的なものに見える。）上記の突然変異体のｐＡＬＴＥＲ／融解蛋白ベクターのライブラリーは、それからベクター含有バクテリアを変態させてこのバクテリアを成長せしめることによって増幅される。増幅に続いて、融解蛋白構造は、それぞれのｐＡＬＴＥＲ／融解蛋白ベクターから切除されて発現ベクターの中に挿入される。代替案としては、ｐＡＬＴＥＲも又発現ベクターとして使用され得る。バクテリアは、それから、好適には、１つのバクテリア当り唯一のベクターの割合での発現ベクターと一緒に変態させられる。バクテリアはそれから成長させられ、その後、バクテリアは（シマーク社の）薬１ｍｌの容器容量を有する９６容器マイクロ板の容器の中に分配される。好適には、少数細胞のみ（より好適には１細胞のみ）が各容器内に配分される。株培養の光学的密度が細胞濃度の判断に使用可能であり、培養は望みの数の細胞が各容器に分配可能なように希釈され得る。さて、図５を参照すると、生物活性で問題の薬物に抵抗力のあるＨＩＶ−１プロテアーゼの蛋白のこれらの第１世代の突然変異体の形態を分離するための手順が概略図で示されている。見られるように、細胞がそれぞれの容器に分配された後、プロテアーゼ抑制性薬物が容器に加えられ、融解蛋白の発現が誘引される。融解蛋白が生物活性でこのプロテアーゼ抑制因子に抵抗力のあるプロテアーゼの突然変異体の形態を包含するようになる瞬間に、融解蛋白は突然変異体のプロテアーゼで麦芽糖結合蛋白（ＭＢＰ）、突然変異体のプロテアーゼ（ＰＲ）、及び逆トランスクリプターゼ蛋白（ＲＴ）に相当する離れた３つの蛋白に切り離される。対照させると、融解蛋白が生物活性であり、及び／又はプロテアーゼ抑制因子に感受性のあるプロテアーゼの突然変異体の形態を包含するようになる瞬間にも、融解蛋白は麦芽糖結合蛋白、突然変異体のプロテアーゼ、及び逆トランスクリプターゼ蛋白を包含する１つの長いペプチド重合体としてとどまる。バクテリア細胞による融解蛋白の発現に続いて、蛋白が、凍結／解凍サイクル法を使ってとか、細胞にリゾチームを加えるとか、血漿周辺に運び出された蛋白構造体に対する冷浸透ショックを使用するとか、或いはバクテリオシン解放蛋白（ＢＲＰ）を誘引可能に生産し得る細胞を使用するとかのような周知の抽出技法によって容器の中にバクテリア細胞から解放される。この最後の可能性は、融解蛋白発現プラスミドとの共同変態の行なわれたバクテリア細胞及びプラスミド発現ＢＲＰが、発現した融解蛋白の解放の結果を産むよう外側膜の浸透可能を誘引され得るので好適である。次に、（麦芽糖結合蛋白以外の親和性リガンド使用の場合に選択される樹脂が麦芽糖結合蛋白に対する親和性を有するような）麦芽糖結合蛋白に対しての親和性を有するアミロース樹脂又は他の樹脂が各容器に加えられ、容器は樹脂を沈澱させるように遠心分離される。麦芽糖結合蛋白がアミロース樹脂と錯体をつくり出すので、生物非活性の及び／又は薬物感受性のプロテアーゼの突然変異体を包含するこれらの無傷の融解蛋白は、樹脂と共に沈澱され、一方、生物活性の薬物抵抗力のあるプロテアーゼの突然変異体を包含するこれらの融解蛋白の場合には、融解蛋白の麦芽糖結合蛋白部分のみが、上澄液の中にとどまっている樹脂、生物活性の薬物抵抗力のあるプロテアーゼ突然変異体、及び逆トランスクリプターゼ蛋白と共に沈澱される。各容器からの上澄液が、それから、（ジマーク社の）９６チップの多重ピペット計量器及びバイオ−ラッド９６容器の“バイオ−ドット微量濾過ユニットを使用してニトロセルロース膜に移入される。標準の免疫学的技法が、それから、（国立保健研究所エイズ研究及び標準試薬プログラムの）多クローン性ＨＩＶ−１逆トランスクリプターゼ抗体を使用するニトロセルロース膜上の逆トランスクリプターゼを検出するために使用される。代替案としては、上澄溶液の中での逆トランスクリプターゼの活性が直接分析され得る。逆トランスクリプターゼの存在は、生物活性の薬物抵抗力のあるプナテアーゼの変異体を示している。プラスの信号を生成する容器に対しては、その容器対応の細胞が単一コロニーを採取するために再度平板培養されるか、各コロニーは、それから、薬物抵抗力のある自触反応性活性を上記と同一の方法で再試験される。標準のＤＮＡ連鎖分析が、それらか、別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体を決定するために、確認された薬物抵抗力のある突然変異体各々の２９７塩基の長さ全体の上で行なわれた。実施例３本実施例の技法は、周知のファージ展示選択技法上での変形である。例えばマシュース他の“基質ファージ：１価のファージ展示によるプロテアーゼ基質の選択”、科学第２６０巻、第１１１３〜１１１７頁（1993年５月21日）、マックキャファテイ他の“ファージ抗体：糸状構造のファージは抗体の変化可能領域を展示”、自然第３４８巻、第５５２〜５５４頁（1990年12月６日）、及びアムベルク他の“ズルトツァップベクター：ファージミド展示ライブラリーに対する表現型と遺伝子型との結合”、分子生物学上の戦略第６巻、第２〜４頁、参照。これらの出版物全てを引用することによって本明細書に編入するものとする。本実施例に従えば、ＨＩＶ−１蛋白重合体のＨＩＶ−１プロテアーゼ部分の中の単一のアミノ酸置換の全てを暗号化するＤＮＡ連鎖の“定義されたライブラリー”は、実施例２の中に記載されたやり方で入手される。ＨＩＶ−１蛋白重合体のプロテアーゼ部分の中の平均３つ迄の無作為配分のアミノ酸置換を暗号化するＤＮＡ連鎖の“無作為化ライブラリー”も又発生される。上記のＤＮＡ連鎖は、それから、発現するとｐＩＩＩ／ＨＩＶ−１蛋白重合体融解蛋白が生産されるように、Ｍ１３ファージのｐＩＩＩ暗号化遺伝子の中に挿入される。このように構成された組替え型Ｍ１３ファージ粒子は、それから、無傷の大腸菌細胞に対して使用される。大腸菌細胞は順番に子孫のファージ粒子をプロテアーゼ抑制性薬物の存在の下に生産するように誘引される。ｐＩＩＩがファージプラスミド上の表面露出抗原であるため、ｐＩＩＩに融解されたＨＩＶ −１蛋白重合体も又、ファージ粒子の表面上への近接可能作用物質として露出される。図６の中に見られるように、ｐＩＩＩＨＩＶ−１蛋白重合体融解蛋白は、ｐＩＩＩ蛋白とプロテアーゼとの間にＨＩＶ逆トランスクリプターゼ蛋白を包含する。従って、プロテアーゼの突然変異体が生物活性で薬物抵抗力のあるものであるならば、プロテアーゼの突然変異体はｐＩＩＩＨＩＶ−１蛋白重合体の残余の部分から自分自身を開裂し、それによって分離された抗体又は逆トランスクリプターゼに対する特別の親和性を伴っている他の作用物質に結合するために逆トランスクリプターゼ蛋白を露出させる（図８参照）。しかしながら、プロテアーゼの突然変異体が生物非活性の及び／又は薬物感受性のあるものであるならば、ｐＩＩＩ／ＨＩＶ−１蛋白重合体は、無傷のままにとどまり、逆トランスクリプターゼ蛋白は結合の為に露出されることはない（図７参照）。このようなやり方で、生物活性の薬物抵抗力のあるプロテアーゼの突然変異体に対応するファージ粒子は、結合作用物質に結合する能力を基盤に選択されることが可能である。（幾つかの同位体濃縮が、生物活性の薬物抵抗力のある突然変異体を高百分率で分離するのには必要である。）選択されたファージ粒子からのＤＮＡが、それから薬物抵抗力授与突然変異の性質決定のために配列される。実施例１及び実施例２の中に記述したスクリーニング技法とは対照的に、本実施例の技法は、積極的選択技法であり、そのようなものとして、各々の全ての変異体がスクリーニングされることを必要とせずに（例えば薬１０¹²の変異体を包含するライブラリーのような）大きな変異体ライブラリーからの探査後の変異体の迅速選択を許容する。実施例４本実施例の技法は、付与の蛋白に対する親和性に基礎を置く蛋白選択に対する周知の“２ハイブリッド”相互作用トラップ技法の上での変形である。フィールズ他の“蛋白−蛋白相互作用検出用の斬新な遺伝学的システム”、自然第３４０巻、第２４５〜２４６頁（1989年７月20日）参照。この文献は引用することによって本明細書の中に編入するものとする。“２ハイブリッド”技法は、酵母サツカロミセスケレビシアエのＧＡＬ４転写活性化剤が、２つの空間的及び機能的に別個の区域を包含して、一方が特定ＤＮＡ連鎖に結合し他方が転写を活性化させるという事実の使用を作り出すものである。ＧＡＬ４転写活性化剤は、ＤＮＡ結合区域及び転写活性化区域が、それぞれに、（例えば、この２区域を相互結合する無傷の蛋白によるように）共有結合形態によって、或いは（例えば、各区域が親和性区域に共有結合状態に結合されている場合やこの２つの親和性区域が相互に独特の高親和性を有する場合のように）親和力によってのいずれかによって何らかの方法で一緒に結合されるならば、その時だけは官能的である。本技法に従えば、ＨＩＶ−１蛋白重合体のＨＩＶ−１プロテアーゼ部分の中の全ての単一のアミノ酸置換を暗号化するＤＮＡ連鎖の“定義されたライブラリー ”及ぴＨＩＶ−１蛋白重合体のプロテアーゼ部分の中の１分子当り平均３つの無作為化分布のアミノ酸置換を暗号化するＤＮＡ連鎖の“無作為化ライブラリー” が上記のやり方で準備される。ＨＩＶ−１蛋白重合体を暗号化するこれらのＤＮＡ連鎖は、それから、ＨＩＶ−１蛋白重合体がＤＮＡ結合要素（要素ａ）とＧＡＬ４転写活性化剤の転写活性化剤要素（要素ｂ）との間に配置されている、発現する時には、ＧＡＬ４転写活性化剤／ＨＩＶ−１蛋白重合体融解蛋白が生産されるように、ＧＡＬ４転写活性化剤を暗号化するＤＮＡ連鎖を包含する第１のサッカロミセスケレビシアエの中に挿入される（例えは、図９参照）。サツカロミセスケレビシアエ酵母の菌株は、それから、自然のままのゲノム位置でのＧＡＬ４遺伝子、（ウラシル生合成に必要な発現製品の）ＵＲＡ３遺伝子、及びリシン生合成に必要な発現製品の）ＬＹＳ２遺伝子の欠失突然変異を包含するように計画される。加えて統合化変態が、酵母のゲノムの中で、ＧＡＬ１プロモーターの転写制御の下にあるように構築されるＵＲＡ３遺伝子及びＬＹＳ２遺伝子のコピーを配置するために使用される。上記のＧＡＬ４／ＨＩＶ−１蛋白重合体の融解蛋白を暗号化するプラスミドは、それから酵母菌株によって吸収される。このように計画されたサッカロミセスケレビシアエの菌株によるＵＲＡ３遺伝子及びＬＹＳ２遺伝子の発現は、ＧＡＬ４の転写活性化剤の要素ａと要素ｂとが無傷のＨＩＶ−１蛋白重合体によって一緒に結合されることを必要とする。プロテアーゼ抑制性薬剤の存在の下では、結合は、プロテアーゼの突然変異体が薬物感受性のある及び／又は生物非活性のものである場合に発生するであろう（図９参照）。結合は、プロテアーゼの突然変異体が薬物抵抗力のあるものであり且つ生物活性であるものである場合のプロテアーゼ抑制性薬物の存在の下では発生しないであろう（図１０参照）。以下の表に見られるように、結合は、ウラシル（ｕｒａ^-）及びリシン（ｌ^ys-）の欠乏する媒体の中で菌株を生長させることによって選択され得るものであり、或いは反対選択は５弗化オロチン酸（５−ＦＯＡ）及びαアミノアジピン酸塩（αＡＡ）を包含する媒体の中で菌株を生長させることによって作られ得る。５−ＦＯＡはＵＲＡ３遺伝子を発現する細胞を殺し、αＡＡはＬＹＳ２遺伝子を発現させる細胞を殺す。したがって、αＡＡ及び５ −ＦＯＡを包含する（及びウラシル及びリシンを補足された）媒体の中でのこの菌株の生長は、２つの補完的ＧＡＬ４融解蛋白が相互に結合していない場合にのみ起こり得る。上記の酵母細胞菌株は、プロテアーゼ抑制性薬物及び遺伝子特定毒物５−ＦＯＡ及びαＡＡの両者を包含する媒体の中で生長した。薬物感受性のあるプロテアーゼの突然変異体又は生物非活性のプロテアーゼの突然変異体は、ＵＲＡ３遺伝子及びＬＹＳ２遺伝子のＧＡＬ４転写によって殺された。対照的に、薬物抵抗力のある突然変異体随伴細胞は、ＧＡＬ４活性化剤の２つの補完的部分が、ＨＩＶ −１プロテアーゼの蛋白によって一度開裂すると、一緒に再結合され得ないので、生き残る。上記の手順で選択される細胞は、それから、ＨＩＶ−１プロテアーゼ暗号化遺伝子を包含するプラスミドＤＮＡの分離及び配列によって分析される。本技法は、ＨＩＶ−１プロテアーゼの薬物抵抗力のある突然変異体の選択に限定されるものではなく、より大きな蛋白から自身を解放するために自触反応の突然変異的開裂を受けるウイルス性プロテアーゼ、又は活性なプロテアーゼ成分により融解蛋白から開裂されるプロテアーゼ基質の開裂標的を包含する人工的な融解蛋白として組替え形態で発現され得るプロテアーゼ、或いは、１つのペプチドが高特定性を有して変形又は非変形形態の２者の中の１つとのみ選択的に結合する方法で自分自身か或いは自然の融解蛋白又は人工的に構築された融解蛋白かを変形させる活性蛋白、のいずれかでもその突然変異体における薬物抵抗力に対しての選択のためにも使用が可能である。実施例３の技法との関連で上に書きとめたように、本実施例の技法は非常に多数の突然変異体を評価するの使用可能な積極的選択技法である。薬物抵抗力のある突然変異体の同定によく適合しているのに加えて、上記の技法は又はこのようにして同定された薬物抵抗力のある突然変異体に対して効果的である補助薬物を同定するのにも使用可能である。これは、例えば、（例えば６〜１２アミノ酸のような）ペプチド又は（例えばＲＮＡのうよな）ヌクレオチドに対して記号化する組合せプラスミドライブラリーを発生させ、それから、前記プラスミドと共に蛋白の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の形態を運搬する細胞に変態させることによって達成され得る。図１１の中に見られるように、薬物抵抗力のあるプロテアーゼを発現する細胞が、薬物抵抗力のある突然変異体の蛋白の効果的な抑制因子を暗号化するプラスミドを吸収すれば、この細胞は、補足物を加えられていない媒体の上では生長するであろうが、しかし、５−ＦＯＡ及びαＡＡを包含する媒体の上では生長しないであろう。対照すると、薬物抵抗力のある突然変異体の蛋白の効果的な抑制因子を暗号化するプラスミドを薬物抵抗力のある細胞が吸収及び／又は発現しない場合には、この細胞は補足物を加えられていない媒体上では生長しないであろうが、５−ＦＯＡ及びαＡＡを包含する媒体上では生長するであろう。したがって、このようなやり方で、多数の潜在的な補助薬物が迅速にスクリーニングされ得る。その後補足物を加えられていない媒体の中で生き残る細胞からのプラスミドが、抑制因子の正体を決定するために分離され配列され得る。同様な方法が既存の化学ライブラリーの中からの抑制因子に対するスクリーニングに使用され得る。容易に正しい判断がなされ得るように、上記の手順は、プロテアーゼの現在及び将来の薬物に抵抗力のある形態の抑制因子からの、プロテアーゼの突然変異的乃至は進化的逃避経路を包括的に定義するための制限のない回数の繰り返しに応用され得る。実施例５本実施例はの技法は、プロテアーゼの活性を監視するために逆トランスクリプターゼ分析を使用する。プラスミドｐＡＲＴ−２が、ＨＩＶ−１蛋白重合体の部分（即ち、ＨＩＶ−１プロテアーゼ蛋白、ＨＩＶ−１逆トランスクリプターゼ蛋白、及びＨＩＶ−１インテグラーゼ蛋白の１部分）を記号化するヌクレオチド連鎖を入手するために、ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩと共に蒸解された。分離された２・３ｋｂの断片が、それから、プラスミドｐＬ１２４．２３を生産するために予め同一の制限酵素と共に蒸解してある（カリフォルニア州サンジエゴのインビトロゲンから入手した）ｐＴｒｃＨｉｓＣプラスミドの中に挿入された。ｐＬ１２４・２３プラスミドは、挿入された断片と全てが同一骨格内にある遺伝子１０の区域に融合されている６つのヒスチジン残基のシリースに対して記号化する上流の連鎖を包含する。エンテロキナーゼ開裂認識部位が、又、遺伝子１０と長軸に直角に切断されたように見える蛋白重合体との間に配置され得る。挿入された連鎖に加えて記載の上流15の連鎖は、全てＴ７プロテアーゼの制御の下に置かれる。（インビトロゲンのトップ１０の）宿主細胞の中のＴ７ポリメラーゼはＩＰＴＧで誘引可能である。図１２は、プラスミドｐＬ１２４．２３の一部に加えてＨＩＶ−１プロテアーゼが蛋白重合体を消化する部位のいくつかを概略図の形で示している。（逆トランスクリプターゼ蛋白の中に位置して、逆トランスクリプターゼの活性に必要な２つ20の逆トランスクリプターゼの部分ユニットｐ６４及びｐ５１を形成するのに必要である追加のプロテアーゼ開裂部位が図１３の中に示されている。）実験は、長軸に直角に切断されたように見えるＨＩＶ蛋白重合体が誘引で発現されて、この発現された蛋白重合体が、活性の逆トランスクリプターゼの異質性２量体を解放するために、ＨＩＶプロテアーゼによって適切に加工された。誘引に先立つ宿主25細胞の生長には、プロテアーゼ抑制因子Ｌ−７３５，５２４の追加によるプロテアーゼの抑制が蛋白重合体の発現を許容したが、蛋白重合体の加工処理は許容されなかった。今度は図１４を参照すると、プラスミドｐＬ１２４．２３を使用しての蛋白重合体内のプロテアーゼの突然変異体のライブラリーを発生させるのに使用するステップの順序が、概略図の形で示されている。最初に、ステップＡの中に見られるように、プラスミドｐＬ１２４．２３の断片が示される。次に、ステップＢの中に見られるように、プラスミド断片のプロテアーゼ暗号化区域の突然変異誘発性のＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）増幅が、プロテアーゼを引き伸ばすプライマーＢ１０５及びＢ１０８を使用して達成される。マンガンイオンの使用に加えて他の突然変異誘発性の技法が、ＰＣＲ増幅において標識付ポリメラーゼの貧弱な信頼性を助けるのに使用される。次に、ステップＣの中に見られるように、プラスミド断片の逆トランスクリプターゼ部分が、高信頼性ＰＣＲ増幅に味方する条件の下でプライマーＢ１０９及びＢ１０４を使用して増幅される。次に、ステップＤの中に見られるように、突然変異体のプロテアーゼ蛋白及び逆トランスクリプターゼ蛋白に対する記号化をするＤＮＡの断片は折り重ね区域を包含した。これはプライマーＢ１０５及びＢ１０４を使用してこれらのＤＮＡ断片を接合させることをＰＣＲに許容した。再構築された蛋白重合体の断片は、平均しての２つのアミノ酸置換と野性種の逆トランスクリプターゼとを有するプロテアーゼの突然変異体に対しての記号化を行なっている。最後に、ステップＥの中に見られるように、連鎖のライブラリーは、大腸菌の中での蛋白重合体の調整された発現を仲介するＤＮＡを包含するベクターｐＴｒｃＨｉｓＣの中に結紮される。上記の突然変異体ベクターのライブラリーは、それから、このベクターで大腸菌を変態させることによって増幅される。増幅に続いて、バクテリアがマイクロ板の容器内に分配された。好適には少数の細胞のみ（より好適なのは１細胞のみ）が各容器内に分配される。細胞がそのそれぞれの容器内に分配されて数時間の生長を許容された後に、プロテアーゼ抑制性薬物Ｌ−７３５，５２４が容器に加えられた。蛋白重合体の発現がそれから誘引された。発現蛋白重合体がプロテアーゼの生物活性の薬物抵抗力のある突然変異体の形態を包含する場合には、蛋白重合体は、活性の逆トランスクリプターゼの異形２重体を生産するために、突然変異体プロテアーゼによって切断された。対照すると、発現蛋白重合体がプロテアーゼの生物非活性の及び／又は薬物感受性のある突然変異体の形態を包含する場合には、蛋白重合体は開裂されず、活性の逆トランスクリプターゼの異形２重体は生産されなかった。バクテリア細胞による蛋白重合体の発現に続いて、（包含される突然変異体のプロテアーゼに依存して無傷の或いは開裂されたかのいずれかの形態での）蛋白重合体がバクテリア細胞から容器内に抽出された。（例えばベーリンガーマンハイムゲーエムベーハーからの市販品利用の可能な）逆トランスクリプターゼ活性の測色計分析が、各容器内に活性な逆トランスクリプターゼが存在するか否かに対する分析のために使用されたが、容器内に濃い色が存在することがその中に活性な逆トランスクリプターゼの存在することを、（そしてそれによって生物活性の薬物抵抗力のあるプロテアーゼがその中に存在していることを）示している。図１５を参照すると、生物活性の薬物抵抗力のあるプロテアーゼの突然変異体が本技法を使用して（プロテアーゼ変異体はここでは“ＤＬＨ３１０”であることが）同定されている。ＤＬＨ３１０のＤＮＡ連鎖分析は、アミノ酸変化Ｋ５５ＮとＬ９０Ｍとを結果的に生ずる２つの突然変異の姿をのぞかせた。容易に正しい判断が可能なように、本技法の大いに望まれる観点の一つは、この技法が高度の確実性を有すること、即ち、プロテアーゼの突然変異体が自然界で遭遇する実際の基質、即ち、逆トランスクリプターゼを活性化するのに必要な蛋白重合体の開裂部位に対する活性を試験されていることにある。本技法に関する確実性のレベルは、単一の人工的開裂部位がβ−ガラクトシダーゼを開裂するのに必要な全てであるとする英国特許出願番号第 2,276,621号公報の技法の中に見出されるものと対照されるべきである。本実施例の技法が、プロテアーゼの１つ以上の突然変異体の形態又は野性種の形態に対する潜在的なプロテアーゼ抑制因子をテストするのに容易に使用され得るであろうことは理解されるべきである。今度は図１６を参照すると、ＨＩＶプロテアーゼの生物活性の突然変異体の形態又は野性種の形態に対する将来の薬物の効力を評価するための分析キットの概略図が示してあり、この分析キットは一般的に参照番号１０１で示されている。キット１０１は第１チューブ１０３を包含し、チューブ１０３はＨＩＶ−１蛋白重合体の突然変異体の形態を内包（突然変異体の蛋白重合体はプロテアーゼの蛋白と逆トランスクリプターゼの蛋白とを包含）している。突然変異体の蛋白重合体は、突然変異体の蛋白重合体がプロテアーゼの生物非活性の形態を包含するという点でのみ野性種の蛋白重合体と相違している。突然変異体の蛋白重合体の開裂部位及び逆トランスクリプターゼの蛋白は、野性種の蛋白重合体から区別するのが不可能である。キット１０１は、又、第２チューブ１０５を包含し、チュープ１０５はＨＩＶ −１プロテアーゼの生物活性の形態を内包している。ＨＩＶ−１プロテアーゼの生物活性の形態は、プロテアーゼの野性種の形態か或いはプロテアーゼの生物活性の突然変異体の形態かであり得る。効果的なプロテアーゼ抑制因子の存在しない状態でチュープ１０５のＨＩＶ−１プロテアーゼとチューブ１０３の突然変異体の蛋白重合体とが組み合わされると、逆トランスクリプターゼは、トランス反応の中では生物活性のプロテアーゼにより突然変異体の蛋白重合体から開裂される（図１７参照）。キット１０１は、更に、第２チューブ１０７を包含し、チューブ１０７は、逆トランスクリプターゼの活性の存在を検出するための従来型の逆トランスクリプターゼ活性分析を包含する。キット１０１は、プロテアーゼの抑制的活性に対する将来の薬物をテストするために、以下のように使用され得る。即ち、最初に、将来の薬物が第１チューブ１０３の突然変異体の蛋白重合体に加えられる。次に、プロテアーゼの生物活性の突然変異体の形態又は野性種の形態が薬物と突然変異体の蛋白重合体との組合せ品に加えられる。最後に、逆トランスクリプターゼ活性分析に薬物、突然変異体の蛋白重合体、及び活性のプロテアーゼの組合せ品がさらされる。将来の薬物が効果的であるならば、逆トランスクリプターゼは突然変異体の蛋白重合体から解放されることはないだろうし、否定的分析結果が続くことになるであろう。将来の薬物が効果のないものならば、逆トランスクリプターゼが突然変異体の蛋白重合体から解放されて肯定的分析結果が続くことになるでろあろう。キット１０１の背後にある原理が、臨床的に導出されたＨＩＶプロテアーゼの突然変異体の将来の薬物に対する感受性の評価に使用され得る、ことは理解されるべきである。ＨＩＶプロテアーゼの突然変異体は、例えば組織サンプル及び／又は流体サンプルからの、或いは細胞培養される臨床でのＨＩＶ分離菌からの取得がある。しかしながら、ＨＩＶ逆トランスクリプターゼ活性の背景的なレベルが、無傷のウイルスを使用する場合に、突然変異体のＨＩＶ蛋白重合体の逆トランスクリプターゼ部分のトランス活性化の発生の有無に拘らず、存在することは理解されるべきである。これは、無傷のＨＩＶウイルスが、大多数の例で、活性なプロテアーゼによる蛋白重合体自身の開裂の結果として活性な逆トランスクリプターゼを生産するからである。上記のようではあっても、逆トランスクリプターゼ活性の背景的なレベルからの分析への干渉の低減が多数の方法の中のいずれかによって行なわれ得る。１方法によれば、プロテアーゼによる突然変異体の蛋白重合体の加水分解によって活性化される逆トランスクリプターゼに大きな影響を及ぼすことなく背景的な逆トランスクリプターゼを中和するのに充分なレベルの反応混合液に、非ヌクレオシド逆トランスクリプターゼ抑制因子（ＮＮＲＴＩ）が加えられる。第２の方法によれば、部位指向の突然変異誘発が使用されて、ＮＮＲＴＩに対する薬物抵抗力を授与するために突然変異体の蛋白重合体、即ちチューブ１０３の蛋白重合体の逆トランスクリプターゼ部分の中に１つ以上の突然変異を挿入する。突然変異Ｙ１８１Ｃ、Ｙ１８８Ｃ、及びＫ１０３Ｎは、ＨＩＶ−１逆トランスクリプターゼに対してＮＮＲＴＩ抵抗力を授与することで知られている。（リッチマン他の、米国科学アカデミー協会報第８８巻、第１１２４１〜１１２４５頁（1991年）、リッチマン他の、薬物学及び毒物学レビュー第３２巻、第１４９〜１６４頁（1993年）、及びデビサー他の、分子薬物学第３６５巻、第４５１〜６２６頁参照。これらの全文献は引用することによって本明細書に編入するものとする。）このやり方でＮＮＲＴＩは背景的な逆トランスクリプターゼを抑制するであろうが、しかし、ＨＩＶプロテアーゼによる突然変異体の蛋白重合体から解放される逆トランスクリプターゼを抑制することはないであろう。第３のアプローチに従って、突然変異体の蛋白重合体の逆トランスクリプターゼ部分は、突然変異体の蛋白重合体の加水分解によって標識に対しての特定抗体の中に吸収される、（例えば、コネクチカット州、ニューヘイブンのコダックサイエンティフィックイメージングシステムからの市販品利用可能なフラグ抗原のような）容易に検出可能な標識を以て標識付けされる。抗体は勿論蛋白重合体と反応性であってはならない。代替案としては、ＨＩＶプロテアーゼの突然変異体は、臨床主体から採取されたＨＩＶのＲＮＡ又はＤＮＡのプロテアーゼ部分を増幅する標準のＰＣＲ技法を使用して入手され得る。増幅された核酸連鎖は、それから、活性なＨＩＶプロテアーゼを発現させるために、（例えば、うさぎの網状赤血球、麦芽エキス、又は大腸菌抽出物のような）多数の市販品利用可能なガラス器具内トランスレーションシステムのいずれかにおいて利用され得る。これらの臨床的に導出されたプロテアーゼの突然変異体は、それから、将来の薬物の効力を評価するために、将来のプロテアーゼ抑制性薬物の存在の下で上記の突然変異体の蛋白重合体及び逆トランスクリプターゼ分析に加えられ得る。上記のアプローチは、およそ数日で種々な将来の薬物に対するプロテアーゼの突然変異体の感受性を決定するのに使用可能である。これは、従来型の細胞培養技法を使用してのＨＩＶ臨床分離菌の薬物感受性の決定に典型的に必要とされる３０乃至４０日に比較すると、極めて有利なものである。上記した本発明の実施例は、単に説明的であることを意図するものであり、当業者なら、本発明の精神を逸脱することなくそれに対する多数の変更及び修正を加え得る筈である。このような変更及び修正の全ては、付録の請求の範囲内に定義する本発明の範囲の中にあることを意図するものである。

【手続補正書】【提出日】１９９７年１２月２日【補正内容】請求の範囲１．（ａ）各々がプロテアーゼによる蛋白重合体の開裂によって触媒される生物活性を有する第２蛋白を随伴する蛋白重合体の部分として調合される、プロテアーゼの突然変異体のライブラリーを薬物の存在の下で調合するステップと、（ｂ）前記第２蛋白の生物活性を分析することによって前記ライブラリーから薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体のプロテアーゼをガラス器具内で分離するステップと、（ｃ）このように分離された突然変異体のプロテアーゼを同定するステップと、を包含してなる、前記第２蛋白を随伴する蛋白重合体の部分として自然のままに発現されるプロテアーゼである、被標的となっている薬物に応答して生体内に出現し得る第１蛋白の別個の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体をガラス器具内で決定する方法。２．前記プロテアーゼの突然変異体のライブラリーが、少なくとも１つのアミノ酸置換分最初のプロテアーゼから相違する各突然変異体を包含してなる、請求項１に記載した方法。３．前記プロテアーゼの突然変異体のライブラリーが、少なくとも１つの、しかも３つ以下のアミノ酸置換分最初のプロテアーゼから相違する各突然変異体を包含してなる、請求項２に記載した方法。４．前記プロテアーゼの突然変異体のライブラリーが、少なくとも１つの、しかも２つ以下のアミノ酸置換分最初のプロテアーゼから相違する各突然変異体を包含してなる、請求項２に記載した方法。５．前記プロテアーゼの突然変異体のライブラリーが単一のアミノ酸置換分最初のプロテアーゼから相違する各突然変異体を包含してなる、請求項２に記載した方法。６．前記プロテアーゼがＨＩＶプロテアーゼである、請求項１に記載した方法。７．前記第２蛋白が逆トランスクリプターゼである、請求項６に記載した方法。８．プロテアーゼの突然変異体を包含する各蛋白重合体が、自然に発生している蛋白重合体の中に発見されるのと同一の、蛋白重合体から第２蛋白を開裂するのに必要な、開裂部位の数とタイプとを有してなる、請求項１に記載した方法。９．プロテアーゼの突然変異体を包含する前記蛋白重合体が、対応するヌクレオチド連鎖の異形発現によって調合されてなる、請求項１に記載した方法。 10．（ａ）プロテアーゼの野性種の形態による蛋白重合体の開裂によって触媒される生物活性を有する第２蛋白を随伴する蛋白重合体の部分として調合されるプロテアーゼの突然変異体の形態又は野性種の形態を第１薬物の存在の下で調合するステップと、（ｂ）前記第２蛋白に対する生物活性の存在が、テストされるプロテアーゼの突然変異体の形態又は野性種の形態に対する第１薬物の効目のなさを示してなる、前記第２蛋白に対する生物活性の存在を分析するステップと、を包含してなる、前記第２蛋白を随伴する蛋白重合体の部分として自然のままに発現されるプロテアーゼである第１蛋白の突然変異体の形態又は野性種の形態に対する第１薬物の効力をガラス器具内で評価する方法。 11．（ａ）（ｉ）各々がプロテアーゼによる蛋白重合体の開裂によって触媒される生物活性を有する第２蛋白を随伴する蛋白重合体の部分として調合される、少なくとも１つのアミノ酸置換分最初のプロテアーゼから相違してなるプロテアーゼの第１世代の突然変異体の全てのライブラリーを第１薬物の存在の下で調合するステップと、（ｉｉ）前記第２蛋白の生物活性を分析することにより前記ライブラリーから薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体のプロテアーゼをガラス器具内で分離するステップと、（ｉｉｉ）前記で分離されて同一アミノ酸連鎖を有する他の突然変異体が同定されることがないものとして同定される全ての突然変異体のプロテアーゼは、別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体を表わすものとして、前記で分離された各突然変異体のプロテアーゼを同定するステップと、（ｉｖ）前記で同定された別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の数を計数するステップと、を包含してなる、第１薬物に対する抵抗力を表示する、前記第２蛋白を随伴する蛋白重合体の部分として自然のままに発現されるプロテアーゼである第１蛋白の別個の第１世代の生物活性の突然変異体の数をガラス器具内で決定することと、（ｂ）相対的な生体内での効力が既に判明している他の薬物から得られている標準と前記の突然変異体の数とを比較することと、をステップとして包含してなり、前記第１薬物に対する抵抗力を表示する別個の第１世代の生物活性の突然変異体の数が前記の他の薬物に対する抵抗力を表示する別個の第１世代の生物活性の突然変異体の数より少ない場合に前記第１薬物は相対的に前記他の薬物より大きな究極の臨床上の効力を有するものと予測されてなる、前記第１蛋白に対する第１薬物の究極の臨床上の効力の評価方法。 12．（ａ）プロテアーゼによる蛋白重合体の開裂によって触媒される生物活性を有する第２蛋白と、プロテアーゼの生物非活性の突然変異体の形態と、該第２蛋白を活性化する方法でプロテアーゼの生物活性の形態又は野性種の形態による１つ以上の開裂可能な部位とを包含する突然変異体の蛋白重合体を調合するステップと、（ｂ）第１薬物を前記突然変異体の蛋白重合体に加えるステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の後で、プロテアーゼの生物活性の形態又は野性種の形態を前記突然変異体の蛋白重合体に加えるステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の後での前記第２蛋白に対する生物活性の存在が、テストされるプロテアーゼの生物活性の突然変異体の形態又は野性種の形態に対する第１薬物の効目のなさを示してなる前記第２蛋白に対する生物活性の存在を分析するステップと、を包含してなる、前記第２蛋白を随伴する蛋白重合体の部分として自然のままに発現されるプロテアーゼである第１蛋白の生物活性の突然変異体の形態又は野性種の形態に対する第１薬物の効力をガラス器具内で評価する方法。 13．（ａ）プロテアーゼによる蛋白重合体の開裂によって触媒される生物活性を有する第２蛋白と、プロテアーゼの生物非活性の突然変異体の形態と、該第２蛋白を活性化する方法でプロテアーゼの生物活性の形態又は野性種の形態による１つ以上の開裂可能な部位とを包含する突然変異体の蛋白重合体と、（ｂ）効果的な薬物の存在しない中で突然変異体の蛋白重合体と組み合わされる時に前記第２蛋白を活性化させる方法によって突然変異体の蛋白重合体を開裂させるプロテアーゼの生物活性の突然変異体の形態又は野性種の形態と、（ｃ）前記第２蛋白に対する生物活性の存在を検出する手段と、を備える、前記第２蛋白を随伴する蛋白重合体の部分として自然のままに発現されるプロテアーゼである第１蛋白の生物活性の突然変異体の形態又は野性種の形態に対する薬物の効力をガラス器具内で評価するためのキット。 14．（ａ）プロテアーゼの生物非活性の突然変異体の形態と、プロテアーゼによる蛋白重合体の開裂によって触媒される生物活性を有する第２蛋白と、該第２蛋白を活性化する方法を使用してのプロテアーゼの活性な形態による１つ以上の開裂可能な部位とを包含する突然変異体の蛋白重合体と、（ｂ）前記第２蛋白に対する生物活性の存在を検出する手段と、を備える、前記第２蛋白を随伴する蛋白重合体の部分として自然のままに発現されるタイプのプロテアーゼの分析。 15．（ａ）少なくとも１つのアミノ酸置換分最初の蛋白から相違する突然変異体の蛋白を暗号化するヌクレオチド連鎖のライブラリーを調合するステップと、（ｂ）突然変異体のライブラリーを調合するために異形発現による前記ヌクレオチド連鎖のライブラリーを発現させるステップと、（ｃ）前記突然変異体のライブラリーから薬物抵抗力のある生物活性の突然変異の形態をガラス器具内で分離するステップと、（ｄ）前記で分離されて同一アミノ酸連鎖を有する他の突然変異体が同定されることがないものとして同定される全ての突然変異体の蛋白は、薬物に応答して生体内に出現し得る別個の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体を表わするものとして前記で分離された突然変異体の蛋白を同定するステップと、を包含してなる、被標的とされる薬物に応答して生体内に出現し得る蛋白の別個の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体をガラス器具内で予測する方法。 16．（ａ）少なくとも１つのアミノ酸置換分最初の蛋白から相違する突然変異体の蛋白を暗号化する分離されたヌクレオチド連鎖のライブラリーを合成するステップと、（ｂ）突然変異体の蛋白のライブラリーを調合するために前記分離されたヌクレオチド連鎖のライブラリーを発現させるステップと、（ｃ）前記突然変異体のライブラリーから薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の蛋白をガラス器具内で分離するステップと、（ｄ）前記で分離されて同一アミノ酸連鎖を有する他の突然変異体が同定されることがないもきとして同定される全ての突然変異体の蛋白は、薬物に応答して生体内に出現し得る別個の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体を表わすものとして前記で分離された突然変異体の蛋白を同定するステップと、を包含してなる、被標的とされる薬物に応答して生体内に出現し得る蛋白の別個の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体をガラス器具内で予測する方法。 17．（ａ）少なくとも１つのアミノ酸置換分最初の蛋白又は該蛋白の区域から相違する全ての蛋白を包含する蛋白の突然変異体のライブラリーを生産するステップと、（ｂ）前記ライブラリーから各薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の蛋白をガラス器具内で分離するステップと、（ｃ）前記で分離されて同一アミノ酸連鎖を有する他の突然変異体が同定されることがないものとして同定される全ての突然変異体の蛋白は、薬物に応答して生体内に出現し得る別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体を表わすものとして前記で分離された各突然変異体の蛋白を同定するステップと、を包含してなる、被標的とされる薬物に応答して生体内に出現し得る蛋白の別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の各々をガラス器具内で予測する方法。 18．（ａ）第１薬物に抵抗力を表示する蛋白の別個の第１世代の生物活性の突然変異体の数をガラス器具内で決定するステップと、（ｂ）相対的な生体内での効力が既に判明している他の薬物から得られた標準と前記数とを比較するステップと、を包含してなり、前記第１薬物に抵抗力を表示する別個の第１世代の生物活性の突然変異体の数が前記他の薬物に抵抗力を表示する別個の第１世代の生物活性の突然変異体の数より少ない場合には前記第１薬物は相対的に前記他の薬物よりもより大きな究極の臨床上での効力を有するものと予測され得てなる、蛋白の活性を抑制する第１薬物の究極の臨床上での効力を評価する方法。 19．（ａ）単一の蛋白に対して標的を定めた２つ以上の異なったそれぞれの薬物の各々に抵抗力を表示する別個の第１世代の生物活性の突然変異体の相対数をガラス器具内で実質的に一致している条件の下に決定するステップと、（ｂ）前記のような突然変異体の数の最小のものを引き出す薬物が最大の究極の臨床上での効力を有するものと決定されるものとして相対数を比較するステップと、を包含してなる、単一の蛋白に対して標的を定めた２つ以上の異なった薬物の相対的な究極の臨床上での効力を先験的に比較する方法。 20．（ａ）第１薬物に応答して起こり得る、制約された数の抵抗力授与突然変異を包含する、蛋白の別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の形態の各々の正体をガラス器具内で決定するステップと、（ｂ）前記第１薬物と、前記蛋白の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の形態の全てに対して効果的な１つ以上の補助薬物との組合せ品が所謂効果的な薬物の組合せ品を構成してなる該１つ以上の補助薬物の正体をガラス器具内で決定するステップと、を包含してなる、薬物抵抗力の蛋白による展開がないように、蛋白に対して効果的である薬物の組合せ品を同定するステップ。 21．（ａ）第１薬物に応答して生体内に起こり得る蛋白の抵抗力授与突然変異の正体をガラス器具内で決定するステップと、（ｂ）前記抵抗力授与突然変異を包含する突然変異体の蛋白に対して効果的で該抵抗力授与突然変異の部位で該突然変異体の蛋白と相互作用を有する補助薬物の正体をガラス器具内で決定するステップと、を包含する、前記第１薬物と１つ以上の前記補助薬物との組合せ品が薬物組合せ品を構成してなる、蛋白に対抗して使用するための前記薬物組合せ品を同定する方法。 22．（ａ）少なくとも１つのアミノ酸置換分最初の蛋白又は該蛋白の区域から相違する蛋白全部を包含する蛋白の第１世代の突然変異体のライブラリーを生産するステップと、（ｂ）前記突然変異体のどれが生物活性を有するのかを決定するステップと、（ｃ）１つの薬物が１つの第１世代の生物活性の突然変異体に対して効果的であることが同定されるまで前記ライブラリーの中の生物活性の複数の突然変異体に対してガラス器具内で将来の薬物をテストするステップと、を包含してなる、最初の蛋白の第１世代の生物活性の１つの突然変異体に対して効果的な薬物を同定する方法。 23．（ａ）少なくとも１つのアミノ酸置換分最初の蛋白又は該蛋白の区域から相違する蛋白全てを包含する蛋白の第１世代の突然変異体のライブラリーを生産するステップと、（ｂ）前記突然変異体のどれが生物活性を有するのかを決定するステップと、（ｃ）無作為化されたペプチド又はヌクレオチドを発生させるステップと、（ｄ）前記ライブラリーの中の生物活性の突然変異体に対するガラス器具内での前記無作為化されたペプチド又はヌクレオチドの効力をテストするステップと、（ｅ）１つの無作為化されたペプチド又はヌクレオチドが１つの第１世代の生物活性の突然変異体に対して効果的であることが同定されるまで（ｃ）と（ｄ）とのステップを繰り返すステップと、を包含してなる、最初の蛋白の第１世代の生物活性の突然変異に対して効果的な１つの無作為化されたペプチド又はヌクレオチドを同定する。24 ．（ａ）蛋白の多数の第１世代の突然変異体が第１薬物に対して抵抗力を有するようになる蛋白の活性に対して標的を定めて抑制性である第１薬物と、（ｂ）前記第１薬物に対して抵抗力を有する前記蛋白の前記第１世代の突然変異体の全てに対して標的を定めて抑制性である１つ以上の補助薬物と、を包含する薬物の組合せ品。 25 ．前記第１薬物が病原性微生物の蛋白の活性を抑制し、前記１つ以上の補助薬物が病原性微生物の蛋白の第１世代の薬物抵抗力のある突然変異体の全ての活性を抑制してなる、請求項２４に記載した薬物の組合せ品。 26 ．前記第１薬物がＨＩＶ蛋白の活性を抑制し、前記１つ以上の補助薬物かＨＩＶ蛋白の第１世代の薬物抵抗力のある突然変異体の全ての活性を抑制してなる、請求項２４に記載した薬物の組合せ品。 27 ．前記第１薬物がＨＩＶプロテアーゼの活性を抑制し、前記１つ以上の補助薬物がＨＩＶプロテアーゼの第１世代の薬物抵抗力のある突然変異体の全ての活性を抑制してなる、請求項２４に記載した薬物の組合せ品。 28 ．前記第１薬物と前記１つ以上の補助薬物との少なくとも１つが、無作為化されたペプチド又はヌクレオチドを備えてなる、請求項２４に記載した薬物の組合せ品。 29 ．（ａ）第１世代の突然変異体が第１薬物に抵抗力のあるものであり、該第１世代の薬物抵抗力のある突然変異体が抵抗力授与突然変異を有する蛋白の活性に対して標的を定めて抑制性である第１薬物と、（ｂ）前記抵抗力授与突然変異の部位での前記第１世代の薬物抵抗力のある突然変異体との相互作用により前記第１世代の薬物抵抗力のある突然変異体に対して標的を定めて抑制性である補助薬物と、を包含する薬物の組合せ品。 30 ．前記第１薬物が病原性微生物の蛋白の活性を抑制し、前記補助薬物が前記抵抗力授与突然変異の部位での前記病原性微生物の蛋白の第１世代の薬物抵抗力のある突然変異体の活性を抑制してなる、請求項２９に記載した薬物の組合せ品。 31 ．前記第１薬物がＨＩＶ蛋白の活性を抑制し、前記補助薬物が前記抵抗力授与突然変異の部位でのＨＩＶ蛋白の第１世代の薬物抵抗力のある突然変異体の活性を抑制してなる、請求項２９に記載した薬物の組合せ品。 32 ．前記第１薬物がＨＩＶプロテアーゼの活性を抑制し、前記補助薬物が前記抵抗力授与突然変異の部位でのＨＩＶプロテアーゼの第１世代の薬物抵抗力のある突然変異体の活性を抑制してなる、請求項２９に記載した薬物の組合せ品。 33 ．前記第１薬物と前記補助薬物との少なくとも１つが無作為化されたペプチド又はヌクレオチドを包含してなる、請求項２９に記載した薬物の組合せ品。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）各々がプロテアーゼによる蛋白重合体の開裂によって触媒される生物活性を有する第２蛋白を随伴する蛋白重合体の部分として調合される、プロテアーゼの突然変異体のライブラリーを薬物の存在の下で調合するステップと、（ｂ）前記第２蛋白の生物活性を分析することによって前記ライブラリーから薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体のプロテアーゼをガラス器具内で分離するステップと、（ｃ）このように分離された突然変異体のプロテアーゼを同定するステップと、を包含してなる、前記第２蛋白を随伴する蛋白重合体の部分として自然のままに発現されるプロテアーゼである、被標的となっている薬物に応答して生体内に出現し得る第１蛋白の別個の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体をガラス器具内で決定する方法。２．前記プロテアーゼの突然変異体のライブラリーが、少なくとも１つのアミノ酸置換分最初のプロテアーゼから相違する各突然変異体を包含してなる、請求項１に記載した方法。３．前記プロテアーゼの突然変異体のライブラリーが、少なくとも１つの、しかも３つ以下のアミノ酸置換分最初のプロテアーゼから相違する各突然変異体を包含してなる、請求項２に記載した方法。４．前記プロテアーゼの突然変異体のライブラリーが、少なくとも１つの、しかも２つ以下のアミノ酸置換分最初のプロテアーゼから相違する各突然変異体を包含してなる、請求項２に記載した方法。５．前記プロテアーゼの突然変異体のライブラリーが単一のアミノ酸置換分最初のプロテアーゼから相違する各突然変異体を包含してなる、請求項２に記載した方法。６．前記プロテアーゼがＨＩＶプロテアーゼである、請求項１に記載した方法。７．前記第２蛋白が逆トランスクリプターゼである、請求項６に記載した方法。８．プロテアーゼの突然変異体を包含する各蛋白重合体が、自然に発生している蛋白重合体の中に発見されるのと同一の、蛋白重合体から第２蛋白を開裂するのに必要な、開裂部位の数とタイプとを有してなる、請求項１に記載した方法。９．プロテアーゼの突然変異体を包含する前記蛋白重合体が、対応するヌクレオチド連鎖の異形発現によって調合されてなる、請求項１に記載した方法。 10．（ａ）プロテアーゼの野性種の形態による蛋白重合体の開裂によって触媒される生物活性を有する第２蛋白を随伴する蛋白重合体の部分として調合されるプロテアーゼの突然変異体の形態又は野性種の形態を第１薬物の存在の下で調合するステップと、（ｂ）前記第２蛋白に対する生物活性の存在が、テストされるプロテアーゼの突然変異体の形態又は野性種の形態に対する第１薬物の効目のなさを示してなる、前記第２蛋白に対する生物活性の存在を分析するステップと、を包含してなる、前記第２蛋白を随伴する蛋白重合体の部分として自然のままに発現されるプロテアーゼである第１蛋白の突然変異体の形態又は野性種の形態に対する第１薬物の効力をガラス器具内で評価する方法。 11．（ａ）（ｉ）各々がプロテアーゼによる蛋白重合体の開裂によって触媒される生物活性を有する第２蛋白を随伴する蛋白重合体の部分として調合される、少なくとも１つのアミノ酸置換分最初のプロテアーゼから相違してなるプロテアーゼの第１世代の突然変異体の全てのライブラリーを第１薬物の存在の下で調合するステップと、（ｉｉ）前記第２蛋白の生物活性を分析することにより前記ライブラリーから薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体のプロテアーゼをガラス器具内で分離するステップと、（ｉｉｉ）前記で分離されて同一アミノ酸連鎖を有する他の突然変異体が同定されることがないものとして同定される全ての突然変異体のプロテアーゼは、別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体を表わすものとして、前記で分離された各突然変異体のプロテアーゼを同定するステップと、（ｉｖ）前記で同定された別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の数を計数するステップと、を包含してなる、第１薬物に対する抵抗力を表示する、前記第２蛋白を随伴する蛋白重合体の部分として自然のままに発現されるプロテアーゼである第１蛋白の別個の第１世代の生物活性の突然変異体の数をガラス器具内で決定することと、（ｂ）相対的な生体内での効力が既に判明している他の薬物から得られている標準と前記の突然変異体の数とを比較することと、をステップとして包含してなり、前記第１薬物に対する抵抗力を表示する別個の第１世代の生物活性の突然変異体の数が前記の他の薬物に対する抵抗力を表示する別個の第１世代の生物活性の突然変異体の数より少ない場合に前記第１薬物は相対的に前記他の薬物より大きな究極の臨床上の効力を有するものと予測されてなる、前記第１蛋白に対する第１薬物の究極の臨床上の効力の評価方法。 12．（ａ）プロテアーゼによる蛋白重合体の開裂によって触媒される生物活性を有する第２蛋白と、プロテアーゼの生物非活性の突然変異体の形態と、該第２蛋白を活性化する方法でプロテアーゼの生物活性の形態又は野性種の形態による１つ以上の開裂可能な部位とを包含する突然変異体の蛋白重合体を調合するステップと、（ｂ）第１薬物を前記突然変異体の蛋白重合体に加えるステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の後で、プロテアーゼの生物活性の形態又は野性種の形態を前記突然変異体の蛋白重合体に加えるステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の後での前記第２蛋白に対する生物活性の存在が、テストされるプロテアーゼの生物活性の突然変異体の形態又は野性種の形態に対する第１薬物の効目のなさを示してなる前記第２蛋白に対する生物活性の存在を分析するステップと、を包含してなる、前記第２蛋白を随伴する蛋白重合体の部分として自然のままに発現されるプロテアーゼである第１蛋白の生物活性の突然変異体の形態又は野性種の形態に対する第１薬物の効力をガラス器具内で評価する方法。 13．（ａ）プロテアーゼによる蛋白重合体の開裂によって触媒される生物活性を有する第２蛋白と、プロテアーゼの生物非活性の突然変異体の形態と、該第２蛋白を活性化する方法でプロテアーゼの生物活性の形態又は野性種の形態による１つ以上の開裂可能な部位とを包含する突然変異体の蛋白重合体と、（ｂ）効果的な薬物の存在しない中で突然変異体の蛋白重合体と組み合わされる時に前記第２蛋白を活性化させる方法によって突然変異体の蛋白重合体を開裂させるプロテアーゼの生物活性の突然変異体の形態又は野性種の形態と、（ｃ）前記第２蛋白に対する生物活性の存在を検出する手段と、を備える、前記第２蛋白を随伴する蛋白重合体の部分として自然のままに発現されるプロテアーゼである第１蛋白の生物活性の突然変異体の形態又は野性種の形態に対する薬物の効力をガラス器具内で評価するためのキット。 14．（ａ）プロテアーゼの生物非活性の突然変異体の形態と、プロテアーゼによる蛋白重合体の開裂によって触媒される生物活性を有する第２蛋白と、該第２蛋白を活性化する方法を使用してのプロテアーゼの活性な形態による１つ以上の開裂可能な部位とを包含する突然変異体の蛋白重合体と、（ｂ）前記第２蛋白に対する生物活性の存在を検出する手段と、を備える、前記第２蛋白を随伴する蛋白重合体の部分として自然のままに発現されるタイプのプロテアーゼの分析。 15．（ａ）少なくとも１つのアミノ酸置換分最初の蛋白から相違する突然変異体の蛋白を暗号化するヌクレオチド連鎖のライブラリーを調合するステップと、（ｂ）突然変異体のライブラリーを調合するために異形発現による前記ヌクレオチド連鎖のライブラリーを発現させるステップと、（ｃ）前記突然変異体のライブラリーから薬物抵抗力のある生物活性の突然変異の形態をガラス器具内で分離するステップと、（ｄ）前記で分離されて同一アミノ酸連鎖を有する他の突然変異体が同定されることがないものとして同定される全ての突然変異体の蛋白は、薬物に応答して生体内に出現し得る別個の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体を表わするものとして前記で分離された突然変異体の蛋白を同定するステップと、を包含してなる、被標的とされる薬物に応答して生体内に出現し得る蛋白の別個の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体をガラス器具内で予測する方法。 16．（ａ）少なくとも１つのアミノ酸置換分最初の蛋白から相違する突然変異体の蛋白を暗号化する分離されたヌクレオチド連鎖のライブラリーを合成するステップと、（ｂ）突然変異体の蛋白のライブラリーを調合するために前記分離されたヌクレオチド連鎖のライブラリーを発現させるステップと、（ｃ）前記突然変異体のライブラリーから薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の蛋白をガラス器具内で分離するステップと、（ｄ）前記で分離されて同一アミノ酸連鎖を有する他の突然変異体が同定されることがないもきとして同定される全ての突然変異体の蛋白は、薬物に応答して生体内に出現し得る別個の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体を表わすものとして前記で分離された突然変異体の蛋白を同定するステップと、を包含してなる、被標的とされる薬物に応答して生体内に出現し得る蛋白の別個の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体をガラス器具内で予測する方法。 17．（ａ）少なくとも１つのアミノ酸置換分最初の蛋白又は該蛋白の区域から相違する全ての蛋白を包含する蛋白の突然変異体のライブラリーを生産するステップと、（ｂ）前記ライブラリーから各薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の蛋白をガラス器具内で分離するステップと、（ｃ）前記で分離されて同一アミノ酸連鎖を有する他の突然変異体が同定されることがないものとして同定される全ての突然変異体の蛋白は、薬物に応答して生体内に出現し得る別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体を表わすものとして前記で分離された各突然変異体の蛋白を同定するステップと、を包含してなる、被標的とされる薬物に応答して生体内に出現し得る蛋白の別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の各々をガラス器具内で予測する方法。 18．（ａ）第１薬物に抵抗力を表示する蛋白の別個の第１世代の生物活性の突然変異体の数をガラス器具内で決定するステップと、（ｂ）相対的な生体内での効力が既に判明している他の薬物から得られた標準と前記数とを比較するステップと、を包含してなり、前記第１薬物に抵抗力を表示する別個の第１世代の生物活性の突然変異体の数が前記他の薬物に抵抗力を表示する別個の第１世代の生物活性の突然変異体の数より少ない場合には前記第１薬物は相対的に前記他の薬物よりもより大きな究極の臨床上での効力を有するものと予測され得てなる、蛋白の活性を抑制する第１薬物の究極の臨床上での効力を評価する方法。 19．（ａ）単一の蛋白に対して標的を定めた２つ以上の異なったそれぞれの薬物の各々に抵抗力を表示する別個の第１世代の生物活性の突然変異体の相対数をガラス器具内で実質的に一致している条件の下に決定するステップと、（ｂ）前記のような突然変異体の数の最小のものを引き出す薬物が最大の究極の臨床上での効力を有するものと決定されるものとして相対数を比較するステップと、を包含してなる、単一の蛋白に対して標的を定めた２つ以上の異なった薬物の相対的な究極の臨床上での効力を先験的に比較する方法。 20．（ａ）第１薬物に応答して起こり得る、制約された数の抵抗力授与突然変異を包含する、蛋白の別個の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の形態の各々の正体をガラス器具内で決定するステップと、（ｂ）前記第１薬物と、前記蛋白の第１世代の薬物抵抗力のある生物活性の突然変異体の形態の全てに対して効果的な１つ以上の補助薬物との組合せ品が所謂効果的な薬物の組合せ品を構成してなる該１つ以上の補助薬物の正体をガラス器具内で決定するステップと、を包含してなる、薬物抵抗力の蛋白による展開がないように、蛋白に対して効果的である薬物の組合せ品を同定するステップ。 21．（ａ）第１薬物に応答して生体内に起こり得る蛋白の抵抗力授与突然変異の正体をガラス器具内で決定するステップと、（ｂ）前記抵抗力授与突然変異を包含する突然変異体の蛋白に対して効果的で該抵抗力授与突然変異の部位で該突然変異体の蛋白と相互作用を有する補助薬物の正体をガラス器具内で決定するステップと、を包含する、前記第１薬物と１つ以上の前記補助薬物との組合せ品が薬物組合せ品を構成してなる、蛋白に対抗して使用するための前記薬物組合せ品を同定する方法。 22．（ａ）少なくとも１つのアミノ酸置換分最初の蛋白又は該蛋白の区域から相違する蛋白全部を包含する蛋白の第１世代の突然変異体のライブラリーを生産するステップと、（ｂ）前記突然変異体のどれが生物活性を有するのかを決定するステップと、（ｃ）１つの薬物が１つの第１世代の生物活性の突然変異体に対して効果的であることが同定されるまで前記ライブラリーの中の生物活性の複数の突然変異体に対してガラス器具内で将来の薬物をテストするステップと、を包含してなる、最初の蛋白の第１世代の生物活性の１つの突然変異体に対して効果的な薬物を同定する方法。 23．（ａ）少なくとも１つのアミノ酸置換分最初の蛋白又は該蛋白の区域から相違する蛋白全てを包含する蛋白の第１世代の突然変異体のライブラリーを生産するステップと、（ｂ）前記突然変異体のどれが生物活性を有するのかを決定するステップと、（ｃ）無作為化されたペプチド又はヌクレオチドを発生させるステップと、（ｄ）前記ライブラリーの中の生物活性の突然変異体に対するガラス器具内での前記無作為化されたペプチド又はヌクレオチドの効力をテストするステップと、（ｅ）１つの無作為化されたペプチド又はヌクレオチドが１つの第１世代の生物活性の突然変異体に対して効果的であることが同定されるまで（ｃ）と（ｄ）とのステップを繰り返すステップと、を包含してなる、最初の蛋白の第１世代の生物活性の突然変異体に対して効果的な１つの無作為化されたペプチド又はヌクレオチドを同定する方法。