JPH10506007A

JPH10506007A - 機能修飾されたｈｓｖ１−ｔｋ

Info

Publication number: JPH10506007A
Application number: JP8507824A
Authority: JP
Inventors: クラツマン，デビッド; サロモン，ベノワ
Original assignee: ユニベルシテピエールエマリーキュリー（パリシズイェーム）
Priority date: 1994-08-25
Filing date: 1995-08-17
Publication date: 1998-06-16
Also published as: WO1996006176A1; FR2723962A1; US6004803A; EP0777736A1; FR2723962B1

Abstract

(57)【要約】プロモーター依存キナーゼのコード遺伝子を担持し、かつベクターにより形質転換された細胞において表現されたとき、複製過程を遮断することにより細胞の死に導くアシクロビル(aciclovir)またはガンシクロビル(ganciclovir)のようなヌクレオシド類似体のリン酸化を引き出すことのできる組み換えベクター。前記組み換えベクターは、キナーゼ暗号遺伝子が完全なタンパク質のメチオニン４６に相当する第２のＡＴＧ開始暗号から上流の配列の全部または一部の５’位置において欠失したタイプ１の単純性疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子(HSTV1-TK)であることを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】機能修飾されたＨＳＶ１−ＴＫ本発明は自殺遺伝子による遺伝子治療に利用される医薬に、なかんずく特にウイルスにより感染した細胞の中の、またはガン細胞の中のチミジンキナーゼ遺伝子の発現システムを利用する医薬、そしてヌクレオシド類似体（A.N.）、特にガンシクロビル(GCV)、またはアシクロビル(ACV)、に特徴的に感受性の前記の細胞を回復させる医薬のすべてにもたらされる改良に関する。タイプ１の単純性疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ(HSV1-TK)の遺伝子は条件致死量の使用による抗ウイルスまたは抗ガン治療の発展においてかなりの重要性を獲得しており、そして HSV1-TKは自殺遺伝子に関する研究の最大数の対象である酵素である。真核生物類の細胞に無毒のこれらの酵素は、例えば、ＡＣＶまたはＧＣＶのようなある種のヌクレオシド類似体をモノリン酸塩分子に転換することができる特徴を示すが、それは普通なら細胞キナーゼには不可能である（文献１，２）。これらのヌクレオシドモノリン酸塩は次に前記の細胞酵素によりヌクレオシドトリリン酸塩に変換され、それはＤＮＡの合成の際に利用されそして伸長過程を妨げて細胞の死に導く。その他のウイルスのチミジンキナーゼは同様に利用されることができる同じ特性を有するが、特に欧州特許出願第４１５，７３１号に記載のようにゾナ・バリセル（Zona Varicelle）（ＶＺＶ）ウイルスの細胞においてそうである。次にHS V1-TK を参照させられるすべての場合において、それが同等の酵素に一般化することを専門家は知っている。この HSTV1-TK の条件毒性は最初に生体外で証明されており、次に現在ではいくつかの目的に生体内で使用されている。すなわち、 −病気の細胞、すなわち、ガンのまたはウイルス、特にレトロウイルスにより感染した細胞、の破壊による遺伝子治療（文献４，７，８）、 −HSV1-TK 遺伝子を有するトランジエニック動物の系統において例えば、リンパ球細胞、または成長ホルモン分泌細胞、または樹脂状細胞（C.D.）（文献１０）のような特定な型の細胞の特定の細胞プロモーターの制御の下における切除、このシステムはこれらの種類の細胞相互の生理学的役割を知るために非常に有効な研究方法である。抗ウイルス治療においてそれは、ウイルス感染の効果の下においてHSV1-TK の合成を制御するプロモーターのトランス活性化であり、後者はチミジンキナーゼの合成を増加させ、その際毒性効果はA.N.の存在で現れる。それゆえ遺伝子治療、特に抗ガンまたは抗ウイルス治療に適用されるこの型の条件毒素の利用から引き出されることのできるすべての利益が理解される。最初に、ただ一つの条件毒性がそのような伝達遺伝子を生産して自殺遺伝子を目標の細胞の中に移すことのできるウイルスの疑似粒子を生産する安定した細胞クローンを産むことを許す。HSV1 のチミジンキナーゼはそれらの薬物の不在で細胞について毒性でないから、ACV または GCVの不在でそれらの細胞を培養するだけで確かに十分である。次に、患者の家での治療の二次効果の場合には、ACV または GCVの投与の停止は伝達遺伝子に起因する毒性を直ちに中止させる。なおまたヌクレオシド類似体の投与の調整は、その中で遺伝子が弱く発現されている細胞を最大に保存しながら伝達遺伝子を強く発現する細胞を選択的に破壊することを許す。結局分裂している細胞の制限された毒性は特にガン細胞の処置のために重要な利点である。最後に、生体外および生体内の実験データは、HSV1-TK を発現しないが、それを表現する細胞と接触している細胞は ACVによる処置により同様に破壊されたことを証明した（「代謝協力」または「傍観者効果」）（文献３，４）。この効果の機構はまだ理解されないままに留まっているが、しかしヌクレオシド類似体トリリン酸塩は一つの細胞から他の細胞へ「間隙連結」（"gap junctio n"）または細胞間伝達の仲介により移ることができることはあり得る。外生遺伝子の真核生物の細胞、特にヒトの細胞、の中への移転において、レトロウイルスは選択ベクターであるように見える。しかし、治療目的へのその使用のために不可欠な前提条件はその使用の安全を確認することである。本発明は、チミジンキナーゼにつき暗号化する遺伝子を含む組み換えレトロウイルスの投与によるA.N.処置の治療指数を減らすことなしにこのシステムの安全を強化する方法を提供する。前記遺伝子は、もしそれが弱く発現されるならば GCVの存在で毒性でなく、またもしそれが強く表現されるならば毒性であるキナーゼ活性をその遺伝子が示すようにその５’部分において欠失または突然変異により修飾されている。治療指数は、自殺遺伝子を含む細胞のそれを含まない細胞に対する A.N．による治療の５０％致死投与量比として定義されている。ある場合には、治療指数は、もしそれらの細胞が A.N．毒性効果に鈍感のままに留まる弱い水準に自殺遺伝子を発現するならば増加されることがあり得る。ガン細胞の場合には、そのシステムの安全性は、治療される細胞集団または組織の中で再構成される自然発生的なウイルスの拡散をかくして避ける欠損レトロウイルスをもっぱら生産するエンベロープ細胞の使用により提供される。そのようなセルラインのエンベロープ細胞の開発は遺伝子治療におけるレトロウイルスの利用をかなり増加させた。その場合に、本来の意味でのウイルス媒介動物は不可欠の配列、すなわち、逆転写および組み込みの調節のための LTR、包膜に必要な配列ψ、ウイルスの複製に必要な配列 TB、を保存する。ウイルス遺伝子（gag ，pol，env）は欠除されて、その固有のプロモーターまたはより強い、特異性または調節可能と判定されるプロモーターの支配下に置かれたチミジンキナーゼの遺伝子により置換される。gag，pol，env ウイルス遺伝子は、時にはヘルパーと呼ばれ、そしてしばしば配列 LTVおよびψについて欠損している他のベクターの中に組み込まれている。それらの表現は、ウイルスゲノムの増殖および完全なウイルス粒子の形成に必要な遺伝子の排除においてトランス遺伝子の包膜を許す。ヘルパーのプロウイルスの形は一般にベクターのための宿主および欠如を作る機能のためのヘルパーの役割を同時に演ずるネズミのセルライン（例えば、NIH/ 3T3 繊維芽細胞系統）のゲノムの中に組み込まれている。ベクターのトランスフェクションの後、その細胞株は欠損伝染性ウイルス粒子の生産が可能になる。しかし、これらの粒子はトランス遺伝子（HSTV1-TK）だけを含むが、目的の細胞内に完全なウイルス粒子の再構成に必要な情報を含まない。このシステムはそれゆえ最初の感染の後に通常ウイルスのその後のすべての繁殖を妨げるために考案されている、すなわち、もしそのウイルスがヘルパーの型（gag，pol,env）の情報のない細胞の中に侵入したトランス遺伝子を持っているならば、その生産は停止される。分裂している細胞を感染させる可能性のある欠損組み換えウイルスの生産を許す種々のエンベロープシステムが既に文献に記載のされており、特に EP 0 243 204，WO 89/07150，WO/ 90/02806，WO 90/12087，EP 0 476 953，WO 93/04167および WO 93/12018などの特許出願明細書に記載されている。同様に Caruso M．et al（文献８）および Yves Panis et col．（文献９）は HSV1-TK 遺伝子を発現する組み換えレトロウイルス粒子を生産するネズミの繊維芽細胞の直接注入による効果を証明することができた。最後に、目標の細胞の中にまたはヒトまたは動物の組織の中にトランス遺伝子の発現を可能にする新しいシステムが最近発表されたが、このシステムはその中に次のものがトランスフェクションされたセルラインに置かれる真核生物の細胞から成ることを特徴とする。すなわち、 −一方では、その中で env遺伝子がその全体にまたは部分的に欠如されかつ前記のトランス遺伝子により env遺伝子のレベルに置換されており、したがって問題のトランス遺伝子は自然発生ウイルスのそれに類似の転写の上に発現され、但し envタンパク質は HSV1-TKタンパク質により置換されている、組み換えプソイドレトロウイルス配列、 −他方では、エンベロープまたは膜のタンパク質のためにコード化された配列を含む核酸の配列、その配列はプロモーターの支配下にあり、そして万一の場合には前記のトランス遺伝子と組み合わされてポリアデニル化の部位につきその末端３’に並べられている配列、組み換えウイルスゲノムおよびトランスに相互補完することができ、かつその宿主細胞にエンベロープタンパク質を持っているが対応する遺伝子を持っていない欠損感染性ウイルスを生産することを許すことができる envタンパク質のための配列を含む核酸配列。特許出願 FR 9401994 の対象であった、このシステムは発現するトランス遺伝子が HSV1-TK型の自殺遺伝子であるときに特に有利である。このシステムは特に HSV1-TK遺伝子をもっているがそれ自身エンベロープ遺伝子を持っていない感染性ウイルス粒子の第一段階での製造を可能にするが、これは二番目のから進行を中絶した感染サイクルに導く。 HSV1-TK/A.N.システムの治療的目標は、ウイルス特に VIHレトロウイルスにより感染されたまたは感染され得る細胞により構成される。これらの細胞は、ガン細胞とは反対に、殆ど分裂しない細胞であり、したがってレトロウイルスベクターにより直接にそして良い効率で感染されることはほとんどあり得ない。関連する細胞はそのとき HIVの LTRの制御の下にチミジンキナーゼの遺伝子を含む構造により感染させられる。その構造自身は、必要な効率を伴う形質導入を保証する組み換えレトロウイルスの中に含まれている。その場合、VIH のようなレトロウイルスによる感染後の細胞は LTRのトランスアクチベーターの信号を発生して、チミジンキナーゼの遺伝子の発現を導きかつそのとき医薬として投与されたA.N. に対して細胞を敏感にする（文献５）。その場合に、それはまさしくキラー遺伝子の発現を引き起こし、そしてその細胞にガンシクロビルまたはアシクロビルに対して特有の感応性を与えようとするウイルスによる感染それ自体である。どちらの場合も、特定のプロモーターの制御の下に、自殺遺伝子は、チミジンキナーゼの遺伝子を持つベクターによる細胞のトランスフェクションおよびアシクロビルまたはガンシクロビル型の医薬の投与を関与させる治療の全体がどんな場合にも健全な細胞に作用しないように調節されていることは重要である。そしてこれが補足の安全要素を付け加える本発明の目的である。例えば、VIH による感染の場合に、トランス遺伝子はもっぱら造血株の細胞に導入されそして、もし可能ならば、発生するであろう分化した細胞、特にリンパ球Ｔ、単球および樹状細胞、の中で表現されねばならないであろう。そのうえ、前述のように、この遺伝子はレトロウイルスによる感染の存在でのみ活性であることが、したがって感染された細胞のみが GCVまたは ACVの投与により破壊されることが、必要であろう。しかし、VIH による感染の不在で、VIH のLTR は常に弱いが現実の基礎発現を、有することが指摘された（文献６）。この基礎発現はある自殺遺伝子およびあるヌクレオシド類似体に伴う問題であり得る。例えば、弱くかつ連続的にその遺伝子を表現するVIH のLTR の制御の下に HSV1-TK遺伝子を表現するリンパ球細胞、それはヌクレオシド類似体としてガンシクロビルを使用することを許さない、なぜならばそれは最近非常に毒性すぎると証明されているからである。反対に、アシクロビールとしては、この薬物は、感染されない細胞を大切にしそして感染された細胞を殺すことを可能にする１０ミクロロモル濃度で使用されることができる（文献７）。この HSV1 のチミジンキナーゼの基礎発現は使用されたA.N.の治療指数を制限するそしてこのシステムの使用により、アシシクロビルの濃度を１０ミクロモル以上に増すことができない、それはある場合には非常に望ましいことであり得るであろう。前述の「バイスタンダー」効果または代謝協力効果は、目標の、しかし始めは目標とされなかった細胞に類似の細胞にとって結果としてA.N.を毒性にすることができ、そして治療の二次効果をあたえる。この「バイスタンダー」効果を減少する方法はその構造の中に治療の目標の組織または細胞に特異性のプロモーターを含むことである。それでも、チミジンキナーゼの残留発現は特異性プロモーターの支配下にそれを組織の中にまたはプラスミドによりトランスフェクションされた細胞の中に存続させることができる。この型の状況において、自殺遺伝子が弱く発現される、つまりアシクロビルまたはガンシクロビルによる治療の間よく耐えることが重要であるが、しかしそれは HIVによる感染の際に例えば、トランス活性化によりその表現が活性化されるとき自然発生のHSV1-TK 遺伝子ほどに毒性であると証明されている。本発明はプロモーター支配下に自殺遺伝子を保持し、かつそれが前記ベクターにより形質転換された細胞において発現されたとき、複製過程を遮断することにより細胞の死に導くアシクロビルまたはガンシクロビルのようなヌクレオシド類似体をリン酸化することに適する組み換えベクターに関するものであり、前記組み換えベクターは、自殺遺伝子が完全なタンパク質のメチオニン４６に相当する第２のＡＴＧ開始暗号コドン上流の５’において配列の全部または一部のその５ ’部分を欠失したタイプ１の単純性疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ(HSTV1-TK) 遺伝子であることを特徴とし、特にそのとき欠失はメチオニンNo.1に相当する第１の開始コドンの全部または一部を含むことを特徴とする。本発明は、HSV1-TK遺伝子は、二つの第１のコドンATG の間に、一つの未解明のプロモーターおよび機能的なかつその末端のＮ部分に一部を欠いたチミジンキナーゼの合成におけるある状況に導く転写を開始する複数の部位を含むという発見から生じたものである。実際に示されたことによると、条件毒性にあるトランス遺伝子としてHSV1-TK 遺伝子を有する遺伝子伝達性の雄のマウスがある部類の細胞を破壊するためおよびその効果を研究するために無菌にされた。この無菌状態は非常に短い転写の形成に伴われたかつHSV1-TK のコード化配列内で開始されたその睾丸内のHSV1-TK 遺伝子の過度の表現によるものであった（文献１５）。その後の経験は、HSV1-T K 遺伝子に潜在するこのプロモーターはそれらの睾丸内で特異的に活性であって一部を欠いたかつそれでも機能的なHSV1-TK のこの過度の生産に導いたことを示した（文献１５）。 A.N.の存在で自殺遺伝子としてHSV1-TK を持つプラスミドの使用において、HS V1-TK の条件毒性は、HSV1-T遺伝子により合成される酵素とまつたく同様にヌクレオシド類似体の量に依存する。本発明の構造体において驚くべきことは、それが一部を欠くHSV1-TK 遺伝子からキナーゼの活性を表すことができるばかりでなく、なおまたこの活性は HSV1-TKと同じようにアシクロビルまたはガンシクロビルのようなヌクレオシド類似体をリン酸化することができることであるが、それはさらに先に例２においておよび引用文献１５において示される通りである。一部を欠いた HSV1-TK(HSV1-ΔTK)によるヌクレオチド類似体のリン酸化のこの特性は、それが発現の場合のように現れない、即ち遺伝子の転写および翻訳が強い、という驚くべきものを有する。それに反して、遺伝子の発現は弱く、そのとき合成された残留酵素は、HSV1-TK の完全なタンパク質に反して、ヌクレオチド類似体をリン酸化することができない（図２，３および５参照）（文献１５）。遺伝子治療における種々の方式が既にHIV により感染した細胞の場合と同様にトランスフェクションされた遺伝子の活性化に特有であるとして前に述べられた。その場合、ガン細胞の場合として、特許出願PCT WO 93/08844 に記載のように、ウイルス自身によるLTR 遺伝子のトランス活性化が問題であり、そこでは活性化は HSV1-ΔTK遺伝子を制御するガン細胞に固有のプロモーターを活性化する細胞の変則的な分裂の結果である。本発明の構造体および特にHSV1-TK コード化する配列の５’のプロモーターの性質は、ヌクレオシド類似体の存在で HSV1-ΔTK遺伝子の条件毒性を望まれる利用に関連して選択されるであろう。例えば、HIV により感染したまたは感染の可能性のある細胞の処置において、特許 WO 93/08844に記載のように TAR型の TAT によりトランス活性化し得る配列を３’に持つHIV 特にHIV1またはHIV2の LTR型のプロモーターが好んで選択されるであろう。もしその代わりに、ガン細胞の遺伝子治療を実行することを望むならば、Caru so et al．1993（文献８）に記載のように Moloneyのウイルスそして特に変異形 Mov3および／または Mov9 および／または Mov13を有利に使用することができるであろう。本発明の構造体において意外なことには、HSV1- ΔTK遺伝子の次の二重の特性である。すなわち、 −一方では、ACV または GCVのような、ヌクレオシド類似体をリン酸化できるキナーゼ活性を示し、 −他方では、一部を欠いたチミジンキナーゼが強く表現されているときにはこの活性示さない。強く表現されるとは細胞につき少なくともおよそ５０の転写があることを意味する。この二重特性は、いくらかはその中に遺伝子が組み込まれているベクターであり、そしていくらかはその遺伝子の５’に位置する転写のプロモーターであることに帰する。 HSV1-ΔTK遺伝子を含む本発明の構造体は従来の技術特に上記に引用された技術に記載の全エンベロープセルラインの中に導き入れられることができる。本発明の構造体を含むこれらのエンベロープセルラインは、ヌクレオシド類似体の存在で分裂細胞特にガン細胞に対して毒性な薬物の有効な原理を転移することができる。全体のタンパク質の４６の位置にあるメチオニンのためにコード化する２番目の ATG開始コドンの上流に欠失を持つチミジンキナーゼの遺伝子を含む組み換えベクターにより形質転換されたそれらのエンベロープセルラインは本発明の一部をなす。その中でenv 遺伝子がその全体にまたは一部に欠失しており、そして HSV1-Δ TKおよびエンベロープタンパク質についてコード化する配列を含む核酸の配列により置換されているレトロウイルスを生産するセルラインについてもそれは同様である。前記の配列はプロモーターの支配下にありかつ必要があれば前記のトランス遺伝子と結びついており、そしてその末端３’において前記の組み換えウイルスゲノムにおよびトランスに補充されることができる前記の配列のポリアデニル化の位置に接し、かつ前記の宿主細胞にenv 遺伝子を欠いた感染性ウイルスの生産を許す、そしてすべては腫瘍細胞のレベルのものとして注入されることができるベクター宿主システムを形成する。セルラインの中に含まれる組み換えプソイドウイルス配列は Moloney MuLV ゲノムまたは HIVウイルスのそれより誘導されることができる。殆ど分裂しないがウイルスにより感染され易い細胞、特に造血細胞、の治療の場合に、前記の細胞は HSV1-ΔTK配列を含む構造により前記の細胞を感染させることができるウイルスに特有のプロモーター、例えば、HIV およびリンパ球Ｔ、の支配下にトランスフェクションされることができるであろう。そしてその構造体はその上TAT によりトランス活性化できる遺伝子を含み、そしてプロモーターの活性化および感染性ウイルスの存在で遺伝子の転写を引き起こす。細胞集団、特に造血性のそして本発明の構造体を含む細胞の集団は、同様に本発明の一部をなす。転写が活性化されているときヌクレオシド類自体をリン酸化するおよびその発現が弱いときリン酸化しない HSV1-ΔTKを含む構造の前記に引用された特性は、後者の場合に、前記の自殺遺伝子を表現する細胞がA.N.および特にGCV に０〜１０ミクロモルを含む投与量において無感覚であり、それからそれらの細胞のトランス活性化の後で細胞はGCV の１０^-2〜１０^-1ミクロモルを含む投与量において敏感であることを結果として招く。そのようにしてトランスフェクションされることができかつ本発明の構造を含むことができる細胞の集団は、 −特にHIV のより感染性のリンパ球系統の細胞、その場合プロモーターはHIの LTV であることができるであろう、 −あるいはリンパ球Ｔ、シトキンのプロモーターになることができるトランス活性化され易いプロモーター、 −あるいはまた骨髄の株の細胞、であることができる。本発明は同様に次のことに関する、即ち −ウイルス、特にある型の細胞特に造血細胞のために特有の屈性を有する病原性レトロウイルスにより誘導される病気の予防および治療を目的とする医薬の製造のための、トランス活性化性の特有プロモーターの支配下に自殺遺伝子を保持する構造体の使用において、前記の自殺遺伝子が完全なタンパク質のメチオニン４６に相当する第２のＡＴＧ開始コドンより上流の５’において配列の全部または一部を欠失したHSV1-TK のチミジンキナーゼの遺伝子であり、特に前記の欠失はメチオニンNo.1に相当する第１の開始コドンの全部または一部を含み、前記のレトロウイルスベクターが前記の細胞の中にすべての適当な方法により導入されることを特徴とする構造体の使用、 −抗原耐性を誘導するためおよび遺伝子治療により移植の拒絶を予防または治療するための速効性医薬を製造するための、HSV1-ΔTK遺伝子を保持する組み換え構造体の使用、 −ガンの遺伝子療法による治療を目的とする医薬の製造のための、同じHSV1- ΔTK遺伝子を保持する適当な組み換え構造体の使用、 −HSV1-TK 活性を表す遺伝子伝達性マウスを作るためのこの型の構造体の使用、しかし遺伝子の５’領域における欠失のために、この動物を無菌にするその睾丸の水準でトランスジエニックに観察される特有の活性化は関係する領域の欠失のため消滅される。本発明は、トランス活性化できる特有のプロモーターの支配下に自殺遺伝子を保持し、ヌクレオシド類似体の存在でその遺伝子の生産物の毒性は前記のトランス活性化に支配される組み換えウイルスベクターを調製する方法において、その自殺遺伝子が完全なタンパク質のメチオニン４６に相当する第２のＡＴＧ開始コドンより上流のその５’部分において配列の全部または一部を欠失したHSTV1-TK (HSV1-TK)のチミジンキナーゼの遺伝子であり、特にそのとき欠失はメチオニンN o.1に相当する第１の開始コドンの全部または一部を含むことを特徴とする前記の方法に関するものである。最後に、本発明は、完全なタンパク質のメチオニン４６に相当する第２のＡＴＧ開始コドンより上流の配列の全部または一部をその領域５’においてを欠失し、特にそのとき欠失はメチオニンNo.1に相当する第１の開始コドンの全部または一部を含み、そしてヌクレオシド類似体のリン酸化の活性を保つことができ、かつ前記の遺伝子が弱く表現されるとき類似体の１０ミクロモル以下のGCV の存在で条件毒性を示し、そして遺伝子が活性のときA.N.、本質的にはGCV、の１０^-2 〜１０^-1ミクロモルの条件毒性を示す、一部を欠いた HSTV1-TK のチミジンキナーゼの遺伝子自身に関する。下記の実験は、さまざまな場合において一部を欠いたHSV1のチミジンキナーゼの遺伝子のこの驚くべき能力を例証することができるであろう、そして図面を使って、医師が危険／利益の比率が本来の病理学にとって処置の有利でないことを推定するとき、残留毒性の危険が彼を完全な遺伝子の使用を拒絶に導くことがあるたびに HSTV1-TK の代わりにHSV1- ΔTK遺伝子の使用の優れていることを証明することができるであろう。図面の簡単な説明列（TAT により誘導することのできる）をおよびHSV1-TK 遺伝子を持つ本発明の構造体の発現である。図1bは、２番目の ATGコドンの上流の区域を欠失した本発明の構造を表す。図2は、TAT の不在または存在でLTR-HIV(LTR-TKまたはLTR-ΔTK)の制御の下に遺伝子 HSV1-TKまたは HSV1-ΔTKを発現する細胞へのガンシクロビルの増加してゆく投与量の毒性を表す。表示C1はセルラインの１番目のクローンが使用されたことを示し、C2は２番目のクローンにおよびバルク《bulk》に混合物にまたはクローン化されないセルラインに関係する。図3 は、HSV1-TK を含む構造体（図3a）、トランス活性化されていないで従って弱く発現された HSV1-ΔTK構造体（図3b）、および Tatによりトランス活性化された HSV1-ΔTK構造体（図3c）による細胞のトランスフェクションの後に、GC V のリン酸化されたさまざまな形のFPLCにより得られたプロフィールを示す。図4 は、GM-CSFの存在で培養されたおよびあらかじめLTR-HIV の制御の下に H SV1-TK（黒い四角）または HSV1-ΔTK（-ΔTK40および -ΔTK72）を含む構造体によりトランスフェクションされた骨髄の細胞のガンシクロビルに対する感受性を示す。図5 は、対照のマウス（□）、弱くTKを表現する遺伝子伝達マウス（その中で TKはHIV-LTR の制御下にある遺伝子伝達マウス）（▲）、弱くΔ-TK を表現する遺伝子伝達マウス（その中でΔ-TK はHIV-LTR の制御下にある遺伝子伝達マウス）（■）、強くΔ-TK を表現する遺伝子伝達マウス（その中でΔ-TK はHIV-LTR の制御下にある遺伝子伝達マウスは、遍在するプロモーターの制御下にTat を表現する遺伝子伝達マウスと異種交配されている）（●）への生体内におけるGCV の効果を示す。グラフは、mg/kg/日で示されたGCV の処置の７日後に得られた樹枝状細胞の減少を示す。材料および方法ａ）構造体すべてのクローニングおよびサブクローニングは、Maniatis et al（1989 Mol ecular cloning laboratoy，Coldspring Harbour Laboratory，Coldspring Harb our NY）に記載のように慣用の技術を用いて行われた。 HSV1-TK 遺伝子または HSV1-ΔTK遺伝子は、Caruso et al 1992(文献7)および Salomon et al 1995(文献15)に記載の実験報告書に従って HIVの 5'LTRの制御下にプラスミドに組み込まれた。その LTRは二つの著しい特徴を示す。すなわち −われわれの条件下では弱いプロモーターであること、 −Tat タンパク質により容易にトランス活性化され得ること、である。プラスミド p LTR- ΔTKの構成のため、ΔTK配列はマトリックスとしてTK遺伝子を使用しながら PCRにより増幅される。PCR増幅のために使用される一対の糸口となるのは次のものである。すなわち、ａ）配列の5'にあるオリゴヌクレオチド 5'CC GAATTCAAGCTTATGCCCACGCTACTGCCGG3’は太く示されているTKの開始の２番目の ATGコドンの下流に付着した、Eco R1部位およびHindIII 部位を含む。ｂ）配列の3'にあるオリゴヌクレオチド 5'CCGGATCCACCCGTGCGTTTTATTCTGTCT3'は同様に太く示されているTKの２番目のポリアデニル化部位を取り囲む配列に付着した、Bam HI部位を含む。1.05 KbのP CR 断片はその後にHindIII およびBam HIと共に吸収され、そしてHindIII およびBam HIによる吸収によりその配列TKから欠失されたプラスミド p LTR- TKのHI V LTR 配列の下流に結ばれている。レトロウイルスのプラスミド pNCTat は、ベクター pNCのシトメガロウイルスよの早生の直接のプロモーターの下流にArya e t al（文献１２）に記載のようにプラスミドpCV-1 のTat 断片のBam HIによる吸収により得られた断片ADNcの挿入により構成された。この最後のものはネオミシンの遺伝子とシトメガロウイルスプロモーターをMoloney のウイルスMLV の二つのLTV の間に所有する。使用される構造体は、自殺遺伝子を毒性にすることを望む用途に応じて選択されるであろう。抗ガン剤としての利用においては、Caruso et al．1993（文献８）に記載のようにプラスミドpMTKが好んで使用されるであろう。専門家は彼が勧めるそしてベクター宿主システムをそれぞれの場合により選択することを知っており、そして従来の技術において上記に引用されたHSV1-TK のすべての型の構造は引用によりここに組み込まれる。ｂ） HSV1- △TKを得るための遺伝子HSV1-TK の5'部分の欠失図１に示されそして上記に詳述された欠失はHindIII およびBam HIの制限酵素の作用により行われる。ｃ）本発明の構造体において欠失した潜在プロモーターの制御下の短い転写の長さの評価 HSV1-TK のコード化配列の中の潜在プロモーターの存在は最初に Northern Bl otの分析により提案された。プロモーターを持ってないHSV1-TK 遺伝子とのトランスフェクションとそれから機能的なタンパク質の産出基準に従う選択の実験においてRoberts et al（文献１３）は 1.1 kb と0.9 kbの二つの転写をHSV1-TKを持つ遺伝子伝達マウスの睾丸の中に検出した。その上Al Shawi et al（文献１４）はHSV1-TK を持つ遺伝子伝達マウスの睾丸の中に転写を検出した。特許出願による使用される技術は"RNase Protecton Assay"のための RPAの技術であり、その技術は下記に示されたようにあらかじめ確立された ARNゾンデとの雑種形成とそれから Salomon et al 1994（文献１０）に記載のような R- Naseの処置により、HSV1-TK を表現する遺伝子伝達マウスの睾丸の中に短い転写の存在と長さを分析することを可能にした。図１にはＳリボゾンデと呼ばれている、使用された第１のゾンデは Salomon e t al（文献１０）に記載されたものである。図１にはゾンデＰと呼ばれている、第２のゾンデは次のようにして得られた。チミジンキナーゼ HSV1-TKのBgIII-Sacl制限の断片がPromega 社により市販されているプラスミドPGEM3Zの中に組み込まれた。そのPGEM-TK は次にPvull 酵素により線形化され、それから ARNポリメラーゼT7がPGEM-TK の上に使用されて、最終的にリボゾンデＰを与えるために線形化された。ｄ）細胞の培養とトランスフェクション細胞の培養とその細胞のトランスフェクションは Salomon et al（文献１０）に記載された技術に従って行われた。ｅ）細胞の増殖と生育力の試験細胞の増殖と生育力の測定はHSV1-TK または HSV1-△TKを含むプラスミドによるトランスフェクションとそれからヌクレオシド類似体による処理の後にトリパンブルーを除く生きている細胞を数えることにより行われた。例１．HSV1-ΔTKを含む構造体によりトランスフェクションされた細胞Ｌのガンシクロビルに対する感受性 LTR-ΔTK、または制御されたLTR-TK、を保持する構造体が最初に細胞のチミジンキナーゼに欠陥のあるそしてHAT に対する選択により機能的チミジンキナーゼの存在により選択された細胞Ｌの中にトランスフェクションされた。 LTR-ΔTKによりトランスフェクションされた細胞のクローンが一時的に現れ次に選択培地の中で第２週の間に死ぬのにLTR-TKによりトランスフェクションされた細胞のクローンは正常に選択培地内で成長する。細胞のチミジンキナーゼに欠陥のある細胞ＬはハイグロマイシンとLTR-ΔTK構造を表現するプラスミドと共に新たにコトランスフェクションされた。さまざまなクローンがハイグロマイシンを含む培地の中で選択された。 LTR-ΔTKにより安定な形でトランスフェクションされたクローンC1は次に、HI V のLTR をΔTKの5'でトランス活性化し、それからHAT において選択を行う HIV のTAT タンパク質を発現するレトロウイルス（pNCTatレトロウイルスプラスミドから得られた）により感染された。さまざまなクローンがかくして選択されてからガンシクロビルに対するそれらの感受性について試験された。図２に、GCV の50% 抑制投与量（ID50）は親の細胞Ｌについて２０μM そして LTR-TK C1 と C2 クローンについて０．０２μM であることが見られる。 LTR-ΔTKクローン(C1)のID50は２０μM であり、すなわち、試験された二つのクローンLTR-ΔTK＋TAT のID50は０．０３〜０．０８μM であるのに、親の細胞と同じGCV に対する感受性である。従ってこの図から、一部欠けたチミジンキナーゼは遺伝子が活性化されている（LTR-ΔTK＋TAT）正常なチミジンキナーゼと同じ効力を有すること、それから表現の低い水準で、すなわちTAT によるトランス活性化されないで、ガンシクロビルに対する感受性の水準は、TKまたはΔTK遺伝子を持っていない対照の細胞に見つけられたそれと同一であると結論することができる。他方で、我々はこの観察を HAT選択のないヒトのHeLa細胞において確かめた。単にハイグロマイシンの選択の後に得られた Tatによりトランス活性化されたLT R-ΔTKを発現するクローンは０．１μM より少ないGCV の濃度で殺された。例２．ガンシクロビルのリン酸化度の FPLC による分析図３は、LTR-TKにより（図３ａ）、あるいはLTR-ΔTKにより（図３ｃ）または LTR-ΔTK＋TAT により（図３ｂ）トランス活性化されたＬ細胞の溶解物のFLPC(P harmacia)によるクロマトグラフィーの後に得られた図表を示す。図の観察は、それらのクロマトグラフィー図表は二つの始めの場合（３ａと３ｂ）において似ていること、即ち一部を欠いた遺伝子のトランス活性化の存在で一部を欠いたチミジンキナーゼのリン酸化の活性は一部も欠いてないチミジンキナーゼのそれに似ていることを示す。すなわち、GCV、CGV モノリン酸塩、ジリン酸塩およびトリリン酸塩に関する百分率は比較し得るものである。反対に、トランス活性化のないときLTR-ΔTK遺伝子は弱く発現されそして細胞溶解物は、リン酸化された形を除いて、GCV しか含まない。例３．マウスの系統におけるLTR-ΔTK遺伝子のトランスフェクション１３のLTR-ΔTKを持つトランスジェニックラインがつくられたが、これらの系統のすべての雄は生産性が高くて、メンデルの法則の伝達に従ってその子孫にトランス遺伝子を伝えた。どんな HSV1-ΔTKの短い転写も睾丸の中に上記の RPA試験により検出されなかった。トランス遺伝子の発現に関して分析された８のトランスジェニックラインのうち６は皮膚にLTR-ΔTK転写の有効水準を有していたが、その水準は前記（文献１０）のLTR-TK遺伝子転写マウスにおけるTK転写の水準と比較し得るものである。一部を欠いたチミジンキナーゼのこの表現の機能性は、前記の遺伝子伝達マウスにおける樹枝状細胞の可能性のある減少に関して試験された。それらの骨髄の細胞はGM-CSFの存在で６日間培養されたが、それは増殖性の樹枝状細胞の発生を許す。図４には、あるいはLTR-TKを保持する、あるいはLTR-ΔTKを保持する遺伝子伝達マウスからの骨髄の樹枝状細胞のGCV に対する感受性が比較された。LTR-ΔTK を保持するトランスジェニックライン40と72により得られた結果がそこに示されている。 ID50は遺伝子伝達性でないマウスについては４０μM であり、LTR-TKを保持するトランスジェニックラインについては０．０３５μM であり、LTR-ΔTKを保持するトランスジェニックライン72については２μM そしてLTR-ΔTKを保持するトランスジェニックライン40については２０μM である。なおまた若干のGCV がさまざまな１２のトランスジェニックラインのマウスに投与された。すなわち、LTR-TKトランスジェニックライン14の細胞の消耗のために使用された毎日kg当たり２０〜５０mgの投与量はLTR-ΔTK系統にはどんな効果もない。遺伝子伝達性でないマウスに無毒なGCV の高い投与量（毎日kg当たり７０〜１２０mg）はそれらの系統の６に適度の効果を有する。樹枝状細胞は、それらが脾臓細胞の0.4 〜 0.9％を示すので、部分的に減少されている。 LTR-ΔTKのマウスにおいて、Δ-TK の表現は非常に弱いので樹枝状細胞の部分的減少を証明する。ΔTKの発現を増強するために、我々はLTR-ΔTKの遺伝子伝達マウスをTAT 遺伝子を表現する遺伝子伝達マウスと遍在するプロモーターの制御下に異種交配させた。GCVで処理された二重に遺伝子伝達性のマウスは図５に示されるように GCVで処理されたLTR-TK遺伝子伝達マウスに対応する脾臓に樹枝状細胞の減少を持つ。これらの実験の全体は、僅かな投与量で HSV1-Δ-TK を示す細胞はGCV に対して感受性がないのに、HSV1-TK の僅かな投与量を示す細胞がGCV の毒性効果に敏感なままであることを示す。本発明の構造体の利益のすべては上記の実験のおかげでよく現れており、特に患者のためのこの型の治療の安全および危険の減少に関連した点で現れている。なぜなら遺伝子に活性な転写の状況のみが自殺遺伝子にその条件毒性を付与するからである。弱い発現の（またはプロモーターのトランス活性化のない）場合に、一部を欠いた遺伝子はヌクレオシド類似体をリン酸化することができない、従ってそれは細胞のために、その類似体の存在においても、どんな毒性も示さない。自殺遺伝子による遺伝子治療は、危険／利益の評価が完全な遺伝子の使用により不利になる場合に考慮されることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/12 9/12 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．プロモーター支配下にキナーゼについてコード化する遺伝子を保持する組み換えベクターであって、かつそれが前記媒介動物により形質転換された細胞において表現されたとき、複製過程を遮断することにより細胞の死に導くアシクロビルまたはガンシクロビルのようなヌクレオシド類似体をリン酸化することに適する組み換え媒介動物であり、キナーゼについてコード化する遺伝子が完全なタンパク質のメチオニン４６に相当する第２のＡＴＧ開始コドンより上流の５’において配列の全部または一部の５’部分を欠失したタイプ１の単純性疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ(HSTV1-TK)遺伝子であることを特徴とする前記の組み換えベクター。２．HSTV1-TKの遺伝子の５’における欠失はメチオニンNo.1に相当する第１の開始コドンの全部または一部を含むことを特徴とする請求項１に記載の組み換えベクター。３．該構造体は特に HIVまたはMoMuLVから生まれたレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項１または２に記載の組み換えベクター。４．該プロモーターは HIV、特にHIV1またはHIV2、の LTRであることを特徴とする請求項１より３までに記載のベクター。５．該プロモーターは Moloneyのウイルスおよび特に変異型MOV3、および／またはMOV9および／またはMOV13 から生まれた LTRであることを特徴とする請求項１より３までに記載のベクター。６．請求項１より５までに記載の組み換えウイルス媒介動物により形質転換されることを特徴とするエンベロープセルライン。７．ａ）その中でenv 遺伝子が自殺遺伝子により置換された組み換えプソイドウイルス配列により、ｂ）その配列はプロモーターの支配下にありかつ必要があれば前記のトランス遺伝子と結びついており、そしてその末端３’において前記の組み換えウイルスゲノムにおよびトランスに補充されることができる前記の配列のポリアデニル化の位置に接し、かつ前記の宿主細胞にenv 遺伝子を欠いた感染性ウイルスの生産を許すエンベロープタンパク質についてコード化する配列を含む核酸の配列により、トランスフェクションされたセルラインであり、かつ自殺遺伝子が完全なタンパク質のメチオニン４６に相当する第２のＡＴＧ開始コドンより上流の５’において配列の全部または一部の５’部分を欠失したのHSV1のチミジンキナーゼの遺伝子であることを特徴とする前記のセルライン。８．HSTV1-TKの遺伝子の５’における欠失はメチオニンNo.1に相当する第１の開始コドンの全部または一部を含むことを特徴とする請求項１に記載のトランスフェクションされたセルライン。９．組み換えプソイドウイルス配列はMoloney MuLVのゲノムまたは HIVのゲノムから生まれていることを特徴とする請求項７に記載のセルライン。 10．発現の生産物、特に弱く発現されたものは、その生産がプロモーターのトランス活性化により増加されるとき、その細胞の破壊に導く生産物を形成するための物質と反応することができる自殺遺伝子についてコード化された配列を含む細胞、特に造血性細胞の集団であって、かつその自殺遺伝子が完全なタンパク質のメチオニン４６に相当する第２のＡＴＧ開始コドンより上流の５’において配列の全部または一部を欠失したHSV1のチミジンキナーゼの遺伝子であり、そして前記の欠失は、トランス活性化の不在で、前記の自殺遺伝子を弱く発現するそれらの細胞が１０^-2〜１０μM を含む投与量においてヌクレオシド類似体に対して無感覚であり、そしてトランス活性化の後にそれらの細胞はそこで１０^-2〜１０^-1 μM を含む投与量において GCVに対してかつ１〜１０μM を含む投与量において ACVについて敏感であるようなものであることを特徴とする前記の細胞の集団。 11．HSTV1-TKの遺伝子の５’における欠失はメチオニンNo.1に相当する第１の開始コドンの全部または一部を含むことを特徴とする請求項９に記載の細胞の集団。 12．一部を欠いたHSV1-TK は、それが弱く発現されるときにはガンシクロビルを代謝しないと同時にその合成がレトロウイルスによる感染によって活性化されるときガンシクロビルを効果的にリン酸化する特性を有することを特徴とする請求項１０または１１に記載の細胞の集団。 13．造血系の細胞、特にリンパ細胞Ｔ、が問題であることおよび活性化されることができるプロモーターが HIVの LTRであることを特徴とする請求項１０より１２までのいずれか１項に記載の細胞の集団。 14．造血系の細胞、特にリンパ細胞Ｔ、が問題であることおよびトランス活性化されることができるプロモーターがサイトキン（またはサイトキンの受容体）であることを特徴とする請求項１０より１２までのいずれか１項に記載の細胞の集団。 15．骨髄の細胞が問題であることを特徴とする請求項１０より１２までのいずれか１項に記載の細胞の集団。 16．トランス活性化できる特有のプロモーターの支配下に自殺遺伝子を保持し、ヌクレオシド類似体の存在でその遺伝子の生産物の毒性は前記のトランス活性化に依存する組み換えウイルスベクターの製造方法において、その自殺遺伝子が完全なタンパク質のメチオニン４６に相当する第２のＡＴＧ開始コドンより上流のその５’部分において配列の全部または一部を欠失したHSV1のチミジンキナーゼの遺伝子であることを特徴とする前記の方法。 17．HSTV1-TKの遺伝子の５’における欠失はメチオニンNo.1に相当する第１の開始コドンの全部または一部を含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。 18．ウイルス、特にある型の細胞、特に造血細胞のために特有の屈性を有する病原性レトロウイルスにより誘導される病気の予防および治療を目的とする医薬の製造のための、トランス活性化性の特有プロモーターの支配下に自殺遺伝子を保持するレトロウイルス媒介動物の使用において、前記の自殺遺伝子が完全なタンパク質のメチオニン４６に相当する第２のＡＴＧ開始コドンより上流の５’において配列の全部または一部を欠失したHSV1（HSV1-TK）のチミジンキナーゼの遺伝子であり、前記のレトロウイルスベクターは前記の細胞の中にすべての適当な方法により導入されることを特徴とする前記の使用。 19．抗原耐性を誘導するためおよび遺伝子治療により移植の拒絶を予防または治療するための速効性医薬を製造するための、トランス活性化性の特有のプロモーターの支配下に自殺遺伝子を保持する組み換え構造体の使用において、前記の自殺遺伝子が完全なタンパク質のメチオニン４６に相当する第２のＡＴＧ開始コドンより上流の配列の全部または一部をその５’の部分において欠失したHSV1（ HSV1-TK）のチミジンキナーゼの遺伝子であり、前記のレトロウイルス媒介動物は拒絶の免疫反応に責任のある前記の細胞の中にすべての適当な方法により導入されることを特徴とする前記の使用。 20．ガンの遺伝子療法による治療を目的とする医薬の製造のための、トランス活性化性の特有のプロモーターの支配下に自殺遺伝子を保持する適当な組み換え構造体の使用において、前記の自殺遺伝子が完全なタンパク質のメチオニン４６に相当する第２のＡＴＧ開始コドンより上流の配列の全部または一部をその５’ の部分において欠失したHSV1（HSV1-TK）のチミジンキナーゼの遺伝子であり、前記のレトロウイルスベクターは腫瘍細胞の中にすべての適当な方法により導入されることを特徴とする前記の使用。 21．HSV1-TK の遺伝子の５’における欠失はメチオニンNo.1に相当する第１の開始コドンの全部または一部を含むことを特徴とする請求項１８より２０までいずれか１項に記載の使用。 22．欠失されたHSV1-TK の遺伝子が特有のプロモーターの支配下に直接または間接に外因性の物質によりトランスに活性化でき、その結果そのような活性化の不在では、前記の遺伝子を保持する細胞の集団がヌクレオシド類似体の添加に無感覚であり、かつそのような活性化の存在では自殺遺伝子の生産物の増大した生産に導くようになり、そしてその遺伝子を保持する細胞の集団に毒性であるを特徴とする請求項１８より２１までいずれか１項に記載の使用。 23．欠失されたHSV1-TK の遺伝子の生産物がヌクレオシド類似体、特にガンシクロビルおよびアシクロビル、をリン酸化することができることを特徴とする請求項１８より２２までに記載の使用。 24．完全なタンパク質のメチオニン４６に相当する第２のＡＴＧ開始コドンより上流の５’において配列の全部または一部の欠失を含むことを特徴とするHSV1 のチミジンキナーゼの遺伝子。 25．HSV1-TK の遺伝子の５’における欠失はメチオニンNo.1に相当する第１の開始コドンの全部または一部を含むことを特徴とする請求項２４に記載の遺伝子。