【発明の詳細な説明】
組換え単鎖Ｆｖ抗体断片、及び組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原の免疫精製の
ためのその用途技術分野
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、特に組換えＤＮＡ技術を用いた
単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片の作製、及びワクチンの活性成分を構成する組換
えＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の精製のためのその用途に関する。背景技術
商業的に入手可能なＢ型肝炎に対する組換えワクチンは、基本的には遺伝子操
作された酵母内での組換えＨＢｓＡｇの産生によるものである。
酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は組換えＨＢ
ｓＡｇの大量生産に広く用いられている［Ｗ．Ｊ．マクアラー（W.J.McAleer）
他、ネイチャー（Nature）307:178、1984年；Ｎ．ハーフォード（N.Harford）他
、ポストグラジュエート・メディカル・ジャーナル（Postgraduate Medical Jou
rnal）63 付録2:65、1987年；Ｇ．Ａ．ビター（G.A.Bitter）他、ジャーナル・
オブ・メディカル・ヴァイロロジー（Journal of Medical Virology）25:123、1
988年］。ここでは抗原を細胞内で産生させ、様々な細胞破壊法で抽出し、種々
の物理化学的方法で精製している。これらの方法では、動物及びヒト中で証明さ
れているように、血漿
由来の抗原に類似の抗原作用を有する産生物を、９７％以上の純度で得ることが
できる［Ｐ．ハウザー（P.Hauser）他、ポストグラジュエート・メディカル・ジ
ャーナル（Postgraduate Medical Journal）63 付録2:83、1987年］。
欧州特許出願第４８０ ５２５号は酵母ピヒア・パストリス（Pichia pastori s
）内で産生した組換えＨＢｓＡｇの精製方法を開示している。この方法は、特
定のマウスモノクローナル抗体（ＭＡｂ）ＣＢ−Ｈｅｐ．１を用いたイムノアフ
ィニティークロマトグラフィー（immunoaffinity chromatography）を用いる工
程を含んでいる。組換えＤＮＡ技術によりサッカロミセス・セレビシエ（Saccha romyces
cerevisiae）を用いて製造し、スミスクライン・ビーカム・バイオロジ
カルズ社（SmithKline Beecham Biologicals）により販売されているワクチン「
エンゲリックスＢ（Engerix B）」と比較すると、免疫原として優れた免疫原性
を有するＨＢｓＡｇが上記精製方法により得られる。
天然又は組換え分子の精製法の開発のために、親和性支持体（affinity suppo
rt）の調製において、ＭＡｂをリガンドとして用いることは大変よく知られてい
る［Ｂ．マチアソン（B.Mattiasson）、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Me
thods in Enzymology）Vol.137、1988年；Ｓ．エイヴラミーズ（S.Avrameas）、
Ｔ．ターニンク（T.Ternynck）、イムノケミストリー（immunochemistry）6:53-
66、1969年；Ｇ．Ｓ．
ベテル（G.S.Bethell）他、J.Biol.Chem.254:2572-2574、1979年；Ｈ．Ａ．チェ
イス（H.A.Chase）、Chem.Eng.Sci.39:1099-1125、1984年；Ｅ．サダ（E.Sada）
他、Biotechnol.Bioeng.28:1497-1502、1986年］。
欧州特許出願第４８０ ５２５号が目的とする、ピヒア・パストリスからのＨ
ＢｓＡｇの精製法で最も重要な工程の一つは、ＭＡｂ ＣＢ−Ｈｅｐ．１を用い
る抗原の免疫精製操作であり、これが高い免疫原性を有する抗原分子を分離する
のに役立っていると思われる。ＭＡｂ ＣＢ−Ｈｅｐ．１を分泌するハイブリド
ーマ［フォンティロチ（Fontirrochi）
icada）10、1:24-30、1993年］は、組換え抗原で免疫処置されたＢＡＬＢ／ｃマ
ウスから得られるものであり、詳細には、該ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞とマ
ウスミエローマＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４とを細胞融合させたものである。セファロ
ースに結合させたＭＡｂは、調製した組換え酵母内に存在する抗原を効率的に精
製する。
上記のように用いられるＭＡｂの作製は、バイオリアクターの使用やハイブリ
ドーマ培養上清の採収といった「生体外」（in vitro）の方法［ハンダ−コリガ
ン(Hnada-Corrigan)、A.Bio/Technology 6:784-786、1988年］、あるいはハイブ
リドーマを腹腔内に接種して、ＭＡｂが豊富な分泌液を大量に含んだ腹水腫瘍を
発現させたマウスを用いる「生体内」（in
vivo）の方法［Ａ．キャンベル（A.Campbell）編、モノクローナル抗体テクノロ
ジー（Monoclonal Antibody Technology）Vol.13、“実験室．生化学と分子生物
学における技術（Laboratory.Techniques in Biochemistry and Molecular Biol
ogy）”、エルサビエ出版（Elsevier Pub.Co）、1984年］のいずれによっても行
うことができる。いずれの場合も、ＭＡｂの使用に際してその品質及び安全性に
ついて国際規格が厳格に定められており［米国食品医薬品局（FDA）、センター
・フォー・ドラッグス・アンド・バイオロジクス（Center for Drugs and Biolo
gics）、オフィス・オブ・バイオロジクス・リサーチ・アンド・レビュー（Offi
ce of Biologics Research and Review）発行の“ヒトに使用するモノクローナ
ル抗体製品の製造及び試験法における注意事項（Points to Consider in the Ma
nufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use）”
、メモランダム（Memorandum）、1993年］、ＭＡｂを人体に直接用いたり、薬剤
及びワクチンの製造工程に用いたりする場合に、潜在的な生物学的危険を生ずる
怖れのある偶発体が存在しないことを確実にし且つ示す必要があり、製造と上記
の確認に莫大な費用がかかっている。
組換えＤＮＡ技術の発達によって、微生物内でのＦａｂ、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ
抗体断片の作製が可能になった［Ａ．プ
1年；Ｍ．ウィトロウ（M．Whitlow）、Ｄ．フィルプラ（D.Filpula）、方法：酵
素学における方法の手引（In METHODS:A.Companion to Methods in Enzymology
）Vol.2.No.2.pp97-105,1991年］。
ジェネックス社（Genex Corporation）の特許で、後にエンゾン社（Enzon Inc
orporated）が取得した米国特許第４，９４６，７７８号では、特異性と親和性
について、全抗体と本質的に類似する性質を有するｓｃＦｖ断片［ＳＣＡ：単鎖
抗原結合蛋白質（single-chain antigen-binding proteins）とも称される］の
製造にかかわる技術が開示されている。
ジェネンテック社（Genentech Incorporated）の有する米国特許第４，８１６
，５６７号には、組換え免疫グロブリンであるマウス−ヒトのキメラ抗体及びキ
メラＦａｂ断片の調製について記載されている。
１９９０年に米国カリフォルニア州サンディエゴで開催された「抗体工学：新
技術及びその応用（Antibody Engineering：New Technology and APPlication I
mplications）」の第１回国際会議［ＩＢＣ ＵＳＡ コンフェレンス社（IBC U
SA Conferences Inc.）により運営］の議事録、及び１９９３年に米国カリフォ
ルニア州コロナードで開催された第４回抗体工学国際会議（上記と同じ団体によ
り運営）の議事録には、ヒト血小板のフィブリノーゲン受容体に特異的なマウス
ＭＡｂのＨ鎖可変領域中の相補性決定部位（ＣＤＲ３）のア
ミノ酸配列に含まれる情報から合成したペプチドを、サイトゲン社（Cytogen Co
rporation）が報告している。合成ペプチドは、オリジナルの抗体と同じ抗原認
識性を有する。
近年、Ｍ．Ｊ．ベリー（M.J.Berry）他が、組換えＤＮＡ技術により作製した
Ｆｖ抗体断片を多孔性シリカに固定する方法、及び鶏卵リゾチームの精製におけ
る上記Ｆｖ抗体断片の使用について、全抗体を用いた場合との比較と共に報告し
ている［ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（Journal of Chromatography
）587:161-169、1991年］。著者は、イムノアフィニティークロマトグラフィー
に抗体断片の使用が有利である理由として、第一に、哺乳類の細胞培養内で全抗
体を作製するのに比べて、大腸菌（E.coli）内での抗体断片の作製には費用がか
からないことを挙げている。次に、質量比で考えた場合、断片は全抗体より高い
抗体価（antigen capacity）力を有することを挙げている。最後に、断片は充分
に小さいので、シリカ基質の小孔の大きさをそれほど損うことなく、小孔内に固
定できることを挙げている。
Ｍ．Ｊ．ベリー（M.J.Berry）とＪ．Ｊ．ピアース（J.J.Pierce）は、更に、
鶏卵リゾチームの免疫精製において、Ｆｖ断片とｓｃＦｖ断片の両方を、臭化シ
アンで活性化したセファロースに固定して用いることが可能であることを示した
［ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（Journal of Chromatography）629:1
61-168、1993年］。彼らの研究では、精
製サイクルを１００回繰り返した後でも、これら免疫吸着剤が抗原を捉える能力
を失わずに安定していることを示している。
最近、Ｔ．Ｍ．スピッツナゲル（T.M.Spitznagel）とＤ．Ｓ．クラーク（D.S.
Clark）は、固定化した全抗体及び抗体断片の、表面密度（surface density）及
び配向性（orientation）の研究に関する論文を発表した。そこでは、ＦｖはＦ
ａｂや全抗体より優れた抗原結合能力を有すると結論付けている。このように、
論文には、不必要な蛋白質部分（すなわち抗体の定常部）を除去することで免疫
吸着剤の全能力を向上できることが示されている（Bio/Technology、11:825-828
、1993年）。発明の概要
本発明は、ワクチン抗原の精製法のイムノアフィニティークロマトグラフィー
工程において、従来用いられているＭＡｂ ＣＢ−Ｈｅｐ．１（欧州特許出願第
４８０ ５２５号）の代替を提供するものである。ＭＡｂ ＣＢ−Ｈｅｐ．１の
可変領域をコードする遺伝子から構築したｓｃＦｖを用いることによって、培養
に真核細胞（ハイブリドーマ）を用いる必要や実験動物（ＢＡＬＢ／ｃマウス）
をＭＡｂの供給源として用いる必要がなくなる。ＭＡｂ及びその親和性支持体（
affinity support）を用いようとする場合には、国際的に定められたガイドライ
ンに従って、培養技術や実験マウスに
用いられる、ハイブリドーマや血漿に、生物学的危険を生ずる怖れのある偶発体
が存在しないことを保証しなければならない［米国食品医薬品局（FDA）、セン
ター・フォー・ドラッグス・アンド・バイオロジクス（Center for Drugs and B
iologics）、オフィス・オブ・バイオロジクス・リサーチ・アンド・レビュー（
Office of Biologics Research and Preview）、“ヒトに使用するモノクローナ
ル抗体製品の製造及びテストにおける考慮点（Points to Consider in the Manu
facture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human use）”、
メモランダム（Memorandum,1993年］が、全抗体の代わりにｓｃＦｖを用いるこ
とで、ＭＡｂ及びその親和性支持体（affinity support）を用いようとする場合
に必要となる面倒な調製工程及び確認の工程を実質的に軽減しかつ単純化できる
。イムノアフィニティーにより精製したワクチン抗原の、最終調製における確認
工程についても、同様のことがあてはまる［米国食品医薬品局（FDA）、センタ
ー・フォー・ドラッグス・アンド・バイオロジクス（Center for Drugs and Bio
logics）、オフィス・オブ・バイオロジクス・リサーチ・アンド・レビュー（Of
fice of Biologics Reseatch and Review）“組換えＤＮＡ技術により作製した
新薬及び新生物製剤の製造及び試験における注意事項(Points to Consider in t
he Production and Testing of New Drugs and Biologicals Produced by Recom
binant DNA Technology),”
草稿,1985年］。
ｓｃＦｖは大腸菌（E.coli）内で作製できるため、ＭＡｂを用いた場合に必要
だった調節工程を実質的に軽減しかつ単純化でき、その結果費用が節減でき、又
、大腸菌（E.coli）の発酵規模を拡大することで、ワクチン抗原を産生する能力
を向上できる。本発明の１つの目的は、抗体断片及びＨＢｓＡｇ抗原の精製にお
けるその用途を提供することにある。
本発明に関連して見出された驚くべきことは、ｓｃＦｖ抗体断片は、大腸菌（E.coli
）のバクテリアペリプラズム（periplasm）へ転送されずに、内膜に結合
することである。ＭＡｂ ＣＢ−Ｈｅｐ．１のＨ鎖可変領域中の特定のアミノ酸
配列に関連したこの特徴は、精製を容易にするために、大腸菌（E.coli）内で発
現する他の融合蛋白質に持たせることができる。本発明の他の１つの目的は、上
記のことを提供することにある。図面の簡単な説明
図１：１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル内でバイオマス試料を分析した
ところ、この条件下で、３２〜３３ｋＤａの不溶性で細胞構造に関連した蛋白質
が新たに発現したことを示している。大腸菌（E.coli）株ＭＭ２９４内でのその
発現レベルは、全バクテリア蛋白質の約１５〜２０％であった。発明の詳細な説明
ＨＢｓＡｇに特異なｓｃＦｖ抗体断片を構築するために、まず、ＭＡｂ ＣＢ
−Ｈｅｐ．１を分泌するハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出した。このＲＮ
Ａを第１のＤＮＡ鎖（ｃＤＮＡ）合成の鋳型として用いた。文献［Ｍ．アヤラ（
M.Ayala）他、バイオテクニークス（BioTechniques）13:790-799、1992年］にあ
るように、ｃＤＮＡに、ＰＣＲ法［ＰＣＲ、Ｃ．アスティ(C．Oste)、バイオテ
クニークス（BioTechniques）６：162-167、1988年］及び合成ヌクレオチド１セ
ットを用いて、Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）及びＬ鎖可変領域（ＶL）をコードする遺
伝子を特異的に増幅させた。
増幅したＶH及びＶLをサブクローンし、それらの共通ヌクレオチド配列の配列
決定をした。この配列から、ＶH−リンカー−ＶLの順序を有するｓｃＦｖを構築
するために、合成ヌクレオチドを新たに作製した。使用したリンカーの構造とし
ては、ショウドハリー（Chaudhary）他により報告されているもの（Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 87:1066-1070、1990年）を用いた。ＰＣＲ法で得たｓｃＦｖ断片を
、適当な制限酵素で切断した後、予め同じ制限酵素で切断した発現ベクターｐＰ
ＡＣＩＢ．１［Ｊ．ガヴィロンド（J.Gavilondo）他、第４回「抗体工学」国際
会議議事録、米国カリフォルニア州コロナード、1993年12月］に連結させた。連
結させた物質で大腸菌（E.coli）ＭＣ１０６１コンピテント細胞を形質転換させ
、半固形選択培地に形成された形質転換ＭＣ１０６１のコ
ロニーについて、制限酵素による切断を行って、クローン遺伝子の存在を調べた
。
上記で作製し選択したプラスミド（ＰＰＡＣＩＢ．１／ｓｃＦｖ抗ＨＢｓＡｇ
と称す）を、種々の大腸菌（E.coli）株（ＭＭ２９４，ｃｏｌｉＢ，Ｗ３１１０
，ＢＭＨ７１−１８）の形質転換に用いて、発現を調べた。ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル内での電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて、組換えＭＭ２９４
細胞及び組換えｃｏｌｉＢ細胞において、分子量約３２−３３ｋＤａの細胞内不
溶性蛋白質が新たに発現したことを確認した。特定の抗血清を用いたウェスタン
ブロット法によって、上記の蛋白質が抗ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖであることが判明
した。
この新たな蛋白質の生物学的活性を調べるために、形質転換した細菌株ＭＭ２
９４を３００ｍｌシェーカーフラスコ（shaker flask）内で生育させ、６Ｍ尿素
を用いて細胞膜片からｓｃＦｖを抽出した。溶解したこの蛋白質をｐＨ８．０の
リン酸緩衝溶液で透析し、組換えＨＢｓＡｇでコートしたポリスチレンプレート
を用いてＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡにおいて、西洋ワサビペルオキシダー
ゼに結合させた、ＣＢ−Ｈｅｐ．１のＦａｂに特異性を有する複合抗体を用いた
ところ、抗体断片と抗原が反応していることが示された。
ｓｃＦｖがＨＢｓＡｇを特異的に認識することがＥＬＩＳＡにおいて示された
ので、その断片を、上記のように溶解し
透析した蛋白質から精製した。発現プラスミドｐＰＡＣＩＢ．１が、アミノ末端
に６−ヒスチジン領域（ヒスチジンを６個有する領域）を有するｓｃＦｖ蛋白質
を産生するという特性を利用して、固定金属アフィニティークロマトグラフィー
（Immobilized metal affinity chromatography）（セファロース−ＩＤＡを用
いる）を行った。
精製したｓｃＦｖについて、溶液中の組換えＨＢｓＡｇとの結合能力を調べた
。この実験では、種々の異なった濃度のｓｃＦｖと組換えＨＢｓＡｇを混合し、
上記のＥＬＩＳＡで分析し、信号阻害（シグナル・インヒビション）（signal i
nhibition）を記録した。ｓｃＦｖと組換えＨＢｓＡｇを反応させる前にインキ
ュベートすると、固相をコートしている抗原にｓｃＦｖが結合する量が減少する
ことが示された。
最後に、この抗ＨＢｓＡｇ抗体を臭化シアンで活性化したセファロースＣＬ−
４Ｂに固定し、得られた支持体（support）を用いて、精製ＨＢｓＡｇ及び未精
製の組換え酵母菌ＨＢｓＡｇ抽出物の両方について吸着及び脱着の試験を行なっ
た。このテストにより、抗ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖが抗原を精製する能力を有する
ことが明らかになった。実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれら
に限定されるものではない。実施例１
ＰＣＲ法による、ＭＡｂ ＣＢ−Ｈｅｐ．１のＨ鎖可変領域（ＶH）及びＬ鎖可
変領域（ＶL）をコードする遺伝子の増幅。クローニング及び塩基配列決定。
手順（ａ）ＲＮＡの単離
ＭＡｂ ＣＢ−Ｈｅｐ．１を分泌するハイブリドーマ細胞から、ゴーフ（Goug
h）他による方法（Anal．Biochem．173:93-95、1988年）を用いて、全ＲＮＡを
単離した。以下、単離の手順を簡単に述べる。５×１０6個の培養細胞を遠心分
離で採集し、リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄した。細胞を２００μｌの冷却し
た溶液Ａ（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2、０．６５％ＮＰ−４０、ｐＨ７．５）に渦巻ミキサー（vortex mixer）
で懸濁し、溶液を８，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、２００μｌの溶液Ｂ（
７Ｍ尿素、１％ＳＤＳ、３０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭト
リス／ＨＣｌ、ＰＨ７．５）が入った反応瓶に移し、静かに混合した。フェノー
ルとクロロフォルムの１：１の混合液を添加し、渦巻きミキサー（vortex mixer
）で１分間撹拌した。１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、新たに用意
した反応管に水相を移し、冷却した無水エタノールと塩でＲＮＡを沈澱させた。
手順（ｂ）ｃＤＮＡの合成
第１の相補的ＤＮＡ鎖（ｃＤＮＡ）の合成に、鋳型としてのＲＮＡ、様々なデ
オキシヌクレオチド、プライマーとして
のオリゴｄＴ、及び逆転写酵素を用いた。［Ｊ．Ｖ．ガヴィロンド（J.V.Gavilo
ndo）他、ハイブリドーマ９：407-417、1990年］。
手順（ｃ）ＰＣＲ法による増幅
ＶH及びＶLをコードするＣＢ−Ｈｅｐ．１の遺伝子の、リーダー（シグナルペ
プチド）からＣH１又はＣkまでをコードする領域を、ＰＣＲ法を用いて特異的に
増幅させた。免疫グロブリンの可変領域塩基配列について、入手可能なデータベ
ースに基づいて、オリゴヌクレオチドを合成した。ＰＣＲ法の条件については、
文献［Ｊ．Ｖ．ガヴィロンド（J.V.Gavilondo）他、ハイブリドーマ（Hybridoma
）９：407-417、1990年］と同様である。
増幅した配列を低融点のアガロースからフェノール抽出法により精製し、配列
決定用ベクター（シークエンシングベクター）に組み込んでクローニングするた
めＥｃｏＲＶ及びＳａｌＩで切断した[サムブルック(Sambrook)、フリッシュ(Fr
itsch)、マニアチス(Maniatis)、分子クローニング、実験マニュアル（Molecula
r Cloning，A Laboratory Manual）第２版、1989年]。
手順（ｄ）配列決定を目的とする、増幅したＶH及びＶLのプラスミド ブルー
スクリプト（Bluescript）（ｐＢＳ）IIｋｓ+/-内でのクローニング
ｐＢＳを上記制限酵素で切断し、このベクターとＰＣＲで増幅させた２つの挿
入物とを次の２つの異なる反応［（１）ｐＢＳ＋ＶH（２）ｐＢＳ＋ＶL］で連結
させた。連結による生成物を、コンピテント大腸菌（E.coli）細胞（株ＭＣ１０
６１）の形質転換に用い、半固形選択培地上で、３７℃で生育させた[サムブル
ック(Sambrook)、フリッシュ（Fritsch）、マニアチス(Maniatis)、分子クロー
ニング、実験マニュアル（Molecular Cloning，A Laboratory Manual）第２版、
1989年]。
培地上の多数のバクテリアコロニーからプラスミドを精製し、制限酵素で切断
して、予想される連結生成物を確認［サムブルック(Sambrook)、フリッシュ(Fri
tsch)、マニアチス(Maniatis)、分子クローニング、実験マニュアル（Molec
ular Cloning，A Laboratory Manual）第２版、1989年］、すなわち、ｐＢＳ（
約２．７ｋｂ）に相当するバンド及び挿入された可変領域（約５００ｂｐ）に相
当するバンドを確認した後、組換えベクターを選択した。ＶH及びＶLの各領域に
ついて少なくとも５個のクローンを、塩基配列決定用に選択した。
手順（ｅ）ＭＡｂ ＣＢ−Ｈｅｐ．１のＶH及びＶLをコードする遺伝子の塩基
配列決定
サンガー（Sanger）法［サムブルック(Sambrook)、フリッシュ(Fritsch)、マ
ニアチス(Maniatis)、分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning
，A Laboratory Manual）第２版、1989年］により（１０ＮのＮａＯＨで処理し
て）変性させたプラスミドの二重らせん鎖について、万能プライマー［プラスミ
ドの多重クローニング領域（multiple cloning region）の外側とハイブリッド
を形成し、クローニングされた遺伝子の両方向の配列決定を可能にする］を用い
て配列決定した。
１９９１年までに報告されている、免疫グロブリン可変領域配列のデータベー
ス｛カバット（Kabat）他[Ｅ．Ａ．カバット(E.A．Kabat)、Ｔ．Ｔ．ウー(T.T．
Wu)、Ｈ．Ｍ．ピーリー(H.M．Peery)、Ｋ．Ｓ．ゴッテスマン(K.S．Gottesman)
、Ｃ．フォウラー(C．Foeller)]、免疫学的に重要な蛋白質の配列（Sequences o
f Proteins of immunological i
nterest）Vol．11、第５版．米国厚生省．ＮＩＨ出版No．91-3242、1991年）に
基づき、新たに配列決定した可変領域を、既存の幾つかのサブグループのうちの
１つに分類した。上で配列決定したＶHはサブグループIIICに、ＶLはサブグルー
プＩに分類された。
ＶHの塩基配列（小文字）及びアミノ酸配列（大文字）
Ｍａｂ ＣＢ−Ｈｅｐ．１：［配列（ａ）］
ＶLの塩基配列（小文字）及びアミノ酸配列（大文字）
ＭＡｂ ＣＢ−Ｈｅｐ．１：［配列（ｂ）］
実施例２
ＶH及びＶLを末端に有するｓｃＦｖ抗体断片（ＶＨ−リンカー−ＶL）の構築；
大腸菌（E.coli）発現ベクター内でのクローニング。
手順（ａ）単鎖Ｆｖの構築
まずＰＣＲ法による増幅を通じて、制限酵素認識部位を有するリンカーの半分
をコードする塩基［ショウドハリー（Chaudhary）他、Proc．Natl．Acad．Sci．
USA 87:1066-1070、1990年］を更に含むように、実施例１で配列決定したＶH及び
ＶLをコードする領域を変形させた。この制限酵素認識部位を有するリンカーは
、変形させたＶH及びＶLの連結を可能にし、発現ベクターにｓｃＦｖを挿入して
ｓｃＦｖのクローニングを可能にする。表IIにＶH及びＶLの正確な配列に基づい
て合成し、ＰＣＲ法による増幅に用いたオリゴヌクレオチドを示す。
増幅の後、変形させたＶH及びＶLを精製し、ＢａｍＨＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて等量を連結させた［サムブルック（Sambrook）、フリッシュ（
Fritsch）、マニアチス（Maniatis）、分子クローニング、実験マニュアル（Mol
ecular Cloning，A Laboratory Manual）第２版、1989年］。この連結による生
成物（約７２０ｂｐの遺伝子断片）を、ｓｃＦｖを増加させるために、オリゴヌ
クレオチド５及び８（表II）を用いて２回目のＰＣＲ法による増幅を行った。次
に、ｓｃＦｖを精製し、ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶで切断し、同じ制限酵素で予
め切断したｐＰＡＣＩＢ．１ベクターに連結させた。ｐＰＡＣＩＢ．１は、大腸
菌（E.coli）のペリプ
ラズムで異種蛋白質を発現するプラスミドである。このプラスミドは以下に挙げ
る調節配列を有する。すなわち、それらの調節配列は、プロモーター（トリプト
ファン）、蛋白質分泌に用いられるｏｍｐＡシグナルペプチドをコードする領域
、固定金属イオンアフェニティークロマトグラフィー（immobilized metal ion
affinity chromatography）を用いた精製に利用され、完全に発現した蛋白質の
Ｎ末端に現われる、６−ヒスチジンをコードする領域［Ｊ．Ｖ．カヴィロンド（
J.V.Gavilondo）他、第４回抗体工学会議議事録（Proceedings of the IV Annua
l Conference on Antibody Engineering）、ＩＢＣコンフェレンス社（IBC Conf
erence Inc.）、米国カリフォルニア州コロナード、1993年12月8日〜10日］、で
ある。
ベクターにｓｃＦｖ遺伝子を挿入連結して生成されたものは、大腸菌（E.coli
）ＭＣ１０６１コンピテント細胞の形質転換に用いられた。半固形選択培地に上
記の菌を播種し、３７℃で成育させた。組換えベクターの選択のために、上で得
たバクテリアコロニーを液体培地に播種し、プラスミドＤＮＡの抽出を行った[
サムブルック(Sambrook)、フリッシュ(Fritsch)、マニアチス(Maniatis)、分子
クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning，A Laboratory Manual）第
２版、1989年]。プラスミドＤＮＡをエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＥｃｏ
ＲＶで切断し、アガロースゲルに導入
し、紫外線を照射して明視化した。切断物のパターンとして表われた線形ＰＰＡ
ＣＩＢ．１（約２．９ｋｂ）に相当するバンド及びｓｃＦｖ（約７２０ｂｐ）に
相当するバンドの２つのバンドを示すものから、組換えクローンを選択した。
手順（ｂ）大腸菌（E.coli）内でのｓｃＦｖの発現
４種の大腸菌（E.coli）株（ＢＭＨ７１−１８、ｃｏｌｉＢ、Ｗ３１１０、及
びＭＭ２９４）を、手順（ａ）で選択した組換えプラスミドを２つ用いて形質転
換させ、発現を調べた。基本的には、組換えバクテリアをアンピシリンを加えた
液体培地（ＬＢ）内で、３７℃で一晩生育させた。アンピシリンを加えたＬＢで
新たに培養を始め、３７℃で３時間インキュベートした。培養にβ−インドール
アクリル酸（beta-indoleacrylic acid）を加えて蛋白質の発現を誘導した。１
５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル内でバイオマス試料を分析したところ、こ
の条件下で、３２〜３３ｋＤａの不溶性で細胞構造に関連した蛋白質が新たに発
現したことが示された。ＭＭ２９４内での発現水準は、全バクテリア蛋白質の約
１５〜２０％であった（図１）。
ウサギポリクロナル抗体を、ＣＢ−Ｈｅｐ．１のＦａｂ断片（パパインにより
切断）に対応するように作製し、バックグラウンドになるのを避けるためにＦａ
ｂ断片を大腸菌（E.coli）の蛋白質に吸着させ、組換え抗原を用いて抗体を免疫
精製した。このウサギポリクロナル抗体を用いてウエスタン
ブロット［サムブルック(Sambrook)、フリッシュ(Fritsch)、マニアチス(Maniat
is)、分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning，A Laboratory M
anual）第２版、1989年］を行ったところ、上記の蛋白質は抗ＨＢｓＡｇ ｓｃ
Ｆｖであることが判明した。ウエスタンブロット法又は特殊ＥＬＩＳＡでは、ペ
リプラズム中にｓｃＦｖ蛋白質を検出しなかった（下記参照）。実施例３
バクテリア培養からのｓｃＦｖの作製、再生及び抗原に対する特異性のアッセイ
。
手順（ａ）抗ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖの抽出及び再生
組換えバクテリアからｓｃＦｖを抽出するために、超音波でバクテリアを破壊
し、可溶性と不可溶性の細胞片を分離し、ＳＤＳ−ボリアクリルアミドゲル電気
泳動を行い、ニトロセルロースに転写し、ウエスタンブロットを行った。その結
果、ｓｃＦｖ蛋白質は不溶性の細胞片に結合していることが判明した。透過型電
子顕微鏡で調べたところ封入体は存在していなかった。これはｓｃＦｖ蛋白質が
バクテリアの内膜に結合していることを示している。ＶH先端の２４残基のうち
幾つかをコードする塩基を突然変異させたところ、ＶH中のある基本アミノ酸が
、ｓｃＦｖとバクテリアの内膜との結合に関与し、ｓｃＦｖがバクテリアのペリ
プラズムへ移転するのを防げていることが示された。この予想外の状況により、
以下
の段階を含む工程から単離できる蛋白質の精製度は７０％であった。すなわち、
（ａ）超音波破壊及び遠心分離による不溶性及び可溶性細胞物質の分離、（ｂ）
低尿素モル濃度（２Ｍ）での洗浄、（ｃ）高尿素モル濃度（６Ｍ）での溶解、で
ある（図１に結果を示した）。蛋白質を再生するために可溶性物質をｐＨ８．０
、低温下で、ＰＢＳにより繰り返し透析した。透析した物質を遠心分離にかけ、
再生したｓｃＦｖを含む可溶相を更なる研究に用いた。
手順（ｂ）ｓｃＦｖによる（ＥＩＡボリスチレンプレート上の）固定抗原の認
識
ウエスタンブロットにより免疫同定された大腸菌（E.coli）ｓｃＦｖ蛋白質に
ついて上記の再生工程を行い、ＥＩＡプレートをコートしたＨＢｓＡｇを認識す
る能力を検定した。以下簡単に手順を述べる。炭酸塩−重炭酸塩溶液中に５μｇ
／ｍｌの濃度に調整した組換えＨＢｓＡｇをポリスチレンプレート（コースター
）に導入し、ｐＨ９．６、４℃で一晩置いてポリスチレンプレートをコートした
。２％スキムミルクを含むｐＨ７．２のＰＢＳを用いて、３７℃で２時間、プレ
ートをブロックした。以下の異なる試料をプレートに添加した。すなわち、（ａ
）再生したｓｃＦｖをＰＢＳ−１％スキムミルクで１：２から１：３２まで希釈
したもの、（ｂ）ＭＡｂ ＣＢ−Ｈｅｐ．１を酵素で切断して得たＦａｂを様々
な濃度にしたもの、（ｃ）ネガティブコントロールとしての、１
μｇ／ｍｌの抗癌胎児性抗原（抗ＣＥＡ）ｓｃＦｖ［アヤラ（Ayala）他、バイ
オテクニークス（BioTechniques）13:790-799、1992年］、である。これらの試
料を室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳ−１％スキムミルク中に４μｇ／ｍ
ｌの濃度に調整した、ＣＢ−Ｈｅｐ．１ Ｆａｂに特異性を有するウサギ抗体を
添加した。３７℃で１時間置いた後、ＰＢＳ−１％スキムミルクに、１：３００
０の割合で希釈したプロテインＡ−西洋ワサビペルオキシダーゼを添加し、ＯＰ
Ｄ−過酸化水素を反応させた。オートマチック・プレート・リーダー（automati
c plate reader）［マルチスキャンＭＣ３４０（Multiscan MC340）、フロー研
究所（Flow Laboratories）］を用いて、４９２ｎｍでの吸光度を測定した。各
段階の後に、プレートを繰り返し（１０回）洗浄した。
手順（ｃ）固定金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を
用いたｓｃＦｖの精製
手順（ａ）で得たｓｃＦｖを、ｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸ナトリウム及び０
．５Ｍ ＮａＣｌ［結合溶液（coupling solution）］で透析した後、セファロ
ース−ＩＤＡ−Ｎｉ+2に導入し、蛋白質中の６−ヒスチジン領域を利用して精製
した。このような特徴の領域を有する蛋白質は、上記のような型のクロマトグラ
フィー支持体に対し高い親和性を有することが報告されており、この特徴を利用
して精製工程を単純且つ再現性よく行うことができる［スケラ（Skerra）他、バ
イオテクノロジー（Biotechnology）９:273-278、1991年；Ｊ．ポラス（J．Pora
th）、蛋白質の発現と精製（Protein Expression and Purification）３: 263-2
8L1992年］。
ｓｃＦｖとセファロースの結合を行った後、［大腸菌（E.coli）の不要な蛋白
質を溶出させるために］ｐＨ６．３で、ゲルの１０倍の体積の結合溶液（coupli
ng solution）でゲルを洗浄し、ＰＨ５．０で同様に洗浄した。同じ溶液を用い
てｐＨ４．０でｓｃＦｖを溶出させた。
１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に現われた結果は、精製度が
約９０％であることを示した。ｓｃＦｖを含むフラクションをトリス塩で直ちに
中和した。抗原に対する特異的認識性をＥＬＩＳＡで調べたところ、溶離したＳ
ｃＦｖは活性を維持することが示された（表III）。
手順（ｄ）溶液中における、ｓｃＦｖの抗原に対する結合能力
ポリスチレンプレートにコートされた組換え抗原に対する、（ＭＡｂ ＣＢ−
Ｈｅｐ．１を切断し、精製して得た）精製ｓｃＦｖ及びＦａｂの最適結合濃度（
飽和度）を、上で説明したように調べた。ｓｃＦｖ及びＦａｂの最適結合濃度は
それぞれ３７μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌであった。最適結合濃度の各タイプの
抗体断片を、溶液中の様々なモル比（ｓｃＦｖについては１：３．５から、Ｆａ
ｂについては１：１０からそれぞれ順に５倍、２倍に希釈した）の抗原と共に、
室温で２時間インキュベートした。２時間後、抗原でコートされたプレートに混
合液をそれぞれ導入した。ＥＬＩＳＡの手順は上記のように行った。コートした
抗原に対する、抗体断
片の結合を阻害する割合（％）は、吸収値から算出した（この％を、溶液中での
抗原に対する、抗体断片の結合能力の指標とした）。
実施例４
組換えＨＢｓＡｇの免疫精製に用いるｓｃＦｖの検定
手順（ａ）抗ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖのセファロースＣＬ−４Ｂへの固定。精製
した抗原との結合及びその溶離の研究。
ｓｃＦｖを臭化シアンで活性化したセファロースに固定するために、精製断片
を、塩化ナトリウムを含むｐＨ８．６の
炭酸塩−重炭酸塩緩衝溶液で透析した。３．０ｍｇ／ｍｌの濃度のｓｃＦｖ溶液
を、予め水和し炭酸塩−重炭酸塩／塩化ナトリウム緩衝溶液で洗浄したゲルに、
素速く添加した。室温で一晩インキュベートした後、結合しなかった断片を除去
した。ネガティブコントロールとして、リガンドを固定させないゲルを同じ手順
で調製した。結合−溶離アッセイ（binding elusion assay）用に、ｐＨ７．８
、２０ｍＭのトリスＨＣｌ及びＮａＣｌを含む溶液中に、飽和量の組換えＨＢｓ
Ａｇを添加した。溶液を導入したゲルを洗浄後、ＰＨ７．８、２０ｍＭのトリス
ＨＣｌに３Ｍのチオシアン酸カリウムを溶解したものを用いて抗原を溶離した。
表Ｖの結果は、固定されたｓｃＦｖが、組換えＨＢｓＡｇと結合しそれを溶離す
る能力を有することを示している。
手順（ｂ）粗抽出物からのＨＢｓＡｇの免疫精製を目的とした組換えｓｃＦｖ
抗体断片の使用
セファロースＣＬ−４Ｂゲルの製造元［スウェーデン国ファルマシア（Pharma
cia）社］が推薦するように、精製した組換えｓｃＦｖを、臭化シアンで活性化
したセファロースＣＬ−４Ｂゲルに結合させた。結合したリガンドの密度は、活
性化ゲル１ｍｌに対して蛋白質約５ｍｇであった。実験のコントロールとして、
モノクローナル抗体ＣＢ−Ｈｅｐ．１を、同じ方法で、同じ基質に結合させた。
ゲルを線流速（linear flow rate）５０ｃｍ／ｈで１．２ｍｌカラム（直径０．
７ｃｍ）に詰めた。
形質転換した酵母菌ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）を遺伝子処理し
て得たＨＢｓＡｇの半精製物をカラムに入れた。このＨＢｓＡｇは細胞内で産生
され、細胞破壊、酸を用いた沈澱、及びセライトによる吸着によって抽出した（
欧州特許出願第４８０ ５２５号）。この半精製物は１５〜２０％の純度のＨＢ
ｓＡｇを含んでいた。この実験のコン
トロールとして、高度に精製されたＨＢｓＡｇを用いた（純度９５％以上）。
ｐＨ７．２で、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ及び３ｍＭ ＥＤＴ
Ａで希釈した、２ｍｇのＨＢｓＡｇを、全てのクロマトグラフィーに線流速（li
near flow rate）２５ｃｍ／ｈで導入した。この段階の後、カラム体積の５倍の
体積の上記緩衝液を、ポンプにより５０ｃｍ／ｈの速度で送りカラムを洗浄した
。溶離の段階は、上記緩衝液に３ＭのＫＳＣＮを加えたものを用いて行った。カ
ラム出口において、２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、結合した
ｓｃＦｖは表面抗原を特異的に認識したことが判明した。溶離したＨＢｓＡｇは
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、完全なモノクローナル抗体と同様に９０％以上の純度
を示した。更に、吸着能力はＣＢ−Ｈｅｐ．１と同じ位であった（表VI参照）。
実施例５
ＭＡｂ ＣＢ−Ｈｅｐ．１ ＶH先端の２４個のアミノ酸及びトレポネーマ・
パリダム（Treponema pallidum）細胞膜抗原から構成される不溶性融合蛋白質の
大腸菌（E.coli）内における発現並びに精製
トレポネーマ・パリダム（Treponema pallidum）細胞膜抗原（ＴｍｐＡ）を、
患者から採取した標本にＰＣＲ法を行い、大腸菌（E.coli）内でクローンした。
ＴｍｐＡは、可溶性細
胞質蛋白質として、全バクテリア蛋白質の約３０％のレベルで発現した。様々な
クロマトグラフィー（ゲル内でのサイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換
クロマトグラフィー）を組み合わせたが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで得られた純度は６
０％未満であった。主要な不純物はバクテリア可溶性細胞質蛋白質であった。
このような不純物を排除し、目的の抗原の精製工程を促進させるために、目的
の蛋白質を、そのアミノ酸末端にＭＡｂＣＢ−Ｈｅｐ．１ ＶH先端の２４個の
アミノ酸を融合させることにより「不溶化」した。このためにまずＰＣＲ法でク
ローニングしたＴｍｐＡ塩基配列の５’末端に上記２４個のアミノ酸をコードす
る合成アダプターをつなげ、融合遺伝子を構築し、発現ベクターｐＰＡＣＩＢ．
１に挿入した。
新たな蛋白質が、大腸菌（E.coli）Ｗ３１１０に、全バクテリア蛋白質を１０
％より高いレベルで、不溶性蛋白質として発現した。患者の血清を用いてウエス
タンブロットを行ったところ、新たな蛋白質はＴｍｐＡを含有することが確認さ
れた。新たな融合蛋白質を精製するために、組換えバクテリアを超音波で破壊し
て得た不溶性断片を、尿素及び塩化グアニジウムで処理し、セファロース−ＩＤ
Ａ−Ｃｕ2+ゲルに導入し［固定金属アフィニティークロマトグラフィー（immobi
lized metal affinity chromatography）］、融合蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よって、最終純度９０％以上で選択的に
溶離させた。
図１の説明。１５％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
。株ＭＭ２９４内における抗ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖの発現。組換え蛋白質抽出工
程。
レーン１：組換えＭＭ２９４内の全蛋白質
レーン２：バクテリアペレットをＰＢＳ−リゾチームと共
にインキュベートした後の上清み
レーン３：レーン２のペレット
レーン４：レーン３のペレットを超音波破壊した後の上清
み
レーン５：壊破したペレット
レーン６：レーン５のペレットをＰＢＳ−２Ｍ尿素で洗浄
して得た上清み
レーン７：ＰＢＳ−２Ｍ尿素で洗浄した後のペレット
レーン８：６Ｍ尿素で可溶化した後の上清み
レーン９：可溶化後のペレット
註：矢印は３２−３３ｋＤａ ｓｃＦｖの位置を示す。
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(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
//(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 ハヴィロンド コウレイ、ジョルヘ ヴィ
クトル
キューバ国、シー．デ ラ ハバナ、プラ
ザ デ ラ レヴォルシオン、カレ ジー
ナンバー 460 エントレ 19 イ 21
(72)発明者 フェルナンデズ デ コシオ ドルタ−ド
ゥク、マリア エレナ
キューバ国、シー．デ ラ ハバナ、プラ
ーヤ、アプト 27 ピソ ６、アヴェニュ
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イ 184
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ミフエル
キューバ国、シー．デ ラ ハバナ、プラ
ーヤ、アプト ３ ディー、カレ 186
ナンバー 3117 エントレ 31 イ 33
(72)発明者 デル カルメン ドミンフエズ ホルタ、
マリア
キューバ国、マタンザス、マタンザス、カ
レ 13 ナンバー 2016 エントレ 20
イ 22
【要約の続き】
るため、抗体断片は、ＨＢｓＡｇを認識又は検出するイ
ムノアッセイにも用いることができる。ＭＡｂ ＣＢ−
Ｈｅｐ．１のＨ鎖可変領域の蛋白質配列の一部を、大腸
菌（E.coli）内で発現しバクテリアの内膜に結合する融
合蛋白質の構築に用いることで、精製工程を容易にする
ことができる。