JPH1036396A - 高純度トランスサイレチン含有組成物の製造方法、高純度トランスサイレチン含有組成物および異型トランスサイレチン分泌抑制用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 トランスサイレチンを含有する原料組成
物から、該組成物の媒体に難溶性の夾雑物を除去し、次
いで陰イオン交換体に接触させてトランスサイレチン以
外の蛋白質の含有率が高い画分を分離し、陰イオン交換
体に吸着したトランスサイレチンを含む蛋白質画分を陰
イオン交換体から分離して回収し、さらに水に対する親
和性を利用してトランスサイレチンを分離する工程を含
むことを特徴とする、高純度トランスサイレチン含有組
成物の製造方法、高純度トランスサイレチン含有組成物
およびトランスサイレチンを含有する異型トランスサイ
レチン分泌抑制用組成物。 【効果】 本発明の方法によれば、トランスサイレチン
を含有する原料組成物中の夾雑物質が除去され、高純度
のトランスサイレチン含有組成物を提供することができ
る。また、本発明の異型トランスサイレチン分泌抑制用
組成物は異型トランスサイレチンの沈着を予防すること
ができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、高純度トランスサ
イレチン（以下、ＴＴＲと略する）含有組成物の製造方
法、高純度ＴＴＲ含有組成物、および異型ＴＴＲ分泌抑
制用組成物に関わる。

【０００２】

【従来の技術】ＴＴＲは主として肝臓で合成される分子
量が５４，９８０の蛋白質で、４個の同一のモノマーサ
ブユニットよりなる。血漿中では２０〜４０ｍｇ／ｄｌ
の濃度で存在し、通常の血漿蛋白質の電気泳動にてアル
ブミンよりさらに陽極側へ泳動されることから以前はプ
レアルブミンと呼ばれていた。その生理的機能が甲状腺
ホルモン（thyroxine)とビタミンＡの輸送蛋白質である
レチノール結合蛋白質の輸送に関与していることから、
トランスサイレチン（transthyretin)と名称が変更され
た。（生化学 ６７，ｐ４３３〜ｐ４５０，１９９５）

【０００３】ところでアミロイドーシスは、線維構造を
持つ特異な蛋白質であるアミロイドと呼ばれる物質が生
体内に沈着して組織障害をもたらす疾患群である。なか
でも、家族性アミロイドポリニューロパチー（ｆａｍｉ
ｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄｏｔｉｃ ｐｏｌｙｎｅｕｒ
ｏｐａｔｈｙ：ＦＡＰ）は、アミロイド沈着による末梢
神経障害（ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）が特徴的な
所見である。患者の多くは２５〜４０歳時に、下肢遠位
部から始まるしびれや温痛覚障害、頑固な下痢と便秘の
繰り返しあるいは排尿障害、陰萎、起立性低血圧などの
自律神経症状で発症する。感覚障害は下肢近位部へと上
行し、また上肢にも出現する。運動神経障害のために筋
力低下や筋萎縮が起こり、患者の多くは発症１０年前後
で寝たきりとなる。アミロイドは中枢神経を除く全身組
織に沈着し、特に心臓、腎臓、消化管への沈着が著し
く、これらの臓器障害のために発症後平均１４年で死の
転帰を辿る。一度沈着したアミロイド線維を除去する根
治的治療法はなく、本疾患は厚生省特定疾患に指定され
ている難病の一つである。（生化学 ６７，ｐ４３３〜
ｐ４５０，１９９５） この家族性アミロイドポリニューロパチーのＴｙｐｅＩ
は、正常ＴＴＲにおけるＮ末端から３０番目のＶａｌが
Ｍｅｔに置換している異型のＴＴＲが、アミロイドとし
て生体内に沈着することが原因となって発症する。しか
しながら、この異型ＴＴＲが組織に沈着するメカニズム
は不明である。アミロイドーシスに対する治療法は、ア
ミロイドの除去や低減化を図ることが有効とされている
ものの、上述したように現在の医療技術では一旦沈着し
たアミロイド線維を溶解し体外へ排出する特効薬はな
く、個々の臓器障害に対する対症療法に限られている。
最近では、ＴＴＲ産生組織である正常人からの肝移植が
試みられ、異型ＴＴＲの減少、臨床症状の進行の抑制と
いった効果が得られているが、日本においては、肝移植
術の施術自体が困難である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記の諸事情から、ア
ミロイドーシスに対する外科手術を伴わない根治的治療
法、すなわち、異型ＴＴＲの分泌抑制作用および／また
は沈着予防作用を有する治療剤の開発が待ち望まれてい
る。このような状況下において、正常ＴＴＲの製造が種
々試みられている。例えば、ヒトのプレアルブミン、す
なわちＴＴＲをコードするｃＤＮＡを組み込んだ組換え
プラスミドによる形質転換体を用いる方法（特公平８−
１１０７４号公報）や、カラムクロマトグラフィーを用
いたヒト血清からのプレアルブミンすなわちＴＴＲの単
離（米国特許第５３１０８７８号）などの方法がある。
しかし、いずれの場合も、製造されたＴＴＲが異型ＴＴ
Ｒの分泌抑制作用を有することは確認されていない。従
って、本発明の目的は、ＴＴＲを含有する原料組成物中
の夾雑物を除去し、純度の高いＴＴＲ含有組成物を高収
率で製造する方法を提供することである。また本発明の
他の目的は、薬剤として使用しうる程度の安全性の高い
高純度ＴＴＲ含有組成物を提供することである。さらに
本発明の目的は、ＴＴＲを含有する異型ＴＴＲ分泌抑制
用組成物を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題に関し種々研究を重ね、アミロイドーシスの根治的治
療法を検討し、低蛋白・低アルブミン血症を合併した家
族性アミロイドポリニューロパチー患者に新鮮凍結血漿
を投与したところ、血中の総ＴＴＲ濃度が上昇したのに
対し、異型ＴＴＲ濃度が著しく低下することを見出し
た。この結果から、外部からのＴＴＲ投与により血中の
総ＴＴＲが過剰になると、フィードバック機構によって
異型ＴＴＲの産生にダウンレギュレーションがかかり、
異型ＴＴＲの分泌が減少し、それにより異型ＴＴＲの組
織への沈着及びアミロイドーシスの進行を予防しうる可
能性が示唆された。さらに本発明者らは、ＴＴＲ含有組
成物をマウスに投与すると血中のマウス・ＴＴＲのｍＲ
ＮＡレベルが低下することを見い出した。このことか
ら、ＴＴＲ含有組成物には、本来生体内で保有されてい
るＴＴＲレベルを低下させる作用があることが示唆され
た。しかしながら、実際に家族性アミロイドポリニュー
ロパチー等のアミロイドーシス患者に対して、持続的か
つ長期間にわたり十分量の正常ＴＴＲ投与による治療を
行う場合、血漿交換療法を長期間、短間隔で実施するこ
ととなり、それに伴う副作用が生じる危険性があるた
め、純度の高い正常ＴＴＲを単独で投与する必要があ
る。そこで本発明者らは、さらに研究を重ねた結果、Ｔ
ＴＲを含有する原料組成物から、高純度ＴＴＲ含有組成
物を製造する方法を見出し、本発明を完成した。

【０００６】すなわち、本発明は （１）ＴＴＲを含有する原料組成物より、ＴＴＲを含む
第１の蛋白質画分と、ＴＴＲ以外の蛋白質の含有率が高
い第２の画分とに分離する方法であって、（ａ）ＴＴＲ
を含有する原料組成物から、該組成物の媒体に難溶性の
夾雑物を除去する工程、（ｂ）（ａ）で調製されたＴＴ
Ｒ含有組成物を陰イオン交換体に接触させ、ＴＴＲを陰
イオン交換体に吸着させることにより第２の画分を分離
する工程、（ｃ）（ｂ）で陰イオン交換体に吸着したＴ
ＴＲを含む第１の蛋白質画分を陰イオン交換体から分離
し、ＴＴＲを含む蛋白質溶液を回収する工程、（ｄ）
（ｃ）で回収された蛋白質溶液から、水に対する親和性
差を利用してＴＴＲを分離する工程、の４つの工程を含
むことを特徴とする、純度９０％以上のＴＴＲからなる
高純度ＴＴＲ含有組成物の製造方法、 （２）ＴＴＲを含有する原料組成物が、血清、血漿、血
漿濃縮物、血漿の任意の沈殿画分、血漿の任意の上清画
分、細胞溶解物、および細胞において産生された蛋白質
からなる群から選ばれる（１）に記載の方法、 （３）任意の段階で、ウイルスを不活化するのに充分な
条件で加熱処理を施し、ウイルスに対して安全なＴＴＲ
含有組成物を得る工程が付加された、（１）に記載の方
法、 （４）工程（ａ）において該組成物の媒体に難溶性の夾
雑物を除去する工程が、ポリエチレングリコール処理ま
たは硫酸アンモニウム処理である、（１）に記載の方
法、 （５）陰イオン交換体の陰イオン交換樹脂が、ＤＥＡＥ
樹脂からなる（１）に記載の方法、 （６）工程（ｃ）においてＴＴＲを含む第１の蛋白質画
分を陰イオン交換体から分離し、トランスサイレチンを
含む蛋白質溶液を回収する方法が、塩溶液を用いる方法
である、（１）に記載の方法、 （７）工程（ｄ）において水に対する親和性差を利用し
てＴＴＲを分離する方法が、疎水性相互作用クロマトグ
ラフィーに付す方法である、（１）に記載の方法、 （８）工程（ｄ）において水に対する親和性差を利用し
てＴＴＲを分離する工程の後に、硫酸アンモニウム溶液
もしくは塩化ナトリウム溶液を用いてＴＴＲが含まれる
蛋白質画分を回収する工程が付加された、（１）に記載
の方法、 （９）実質的にウイルスを含まない、高純度ＴＴＲ含有
組成物、 （１０）純度９０％以上のＴＴＲからなる高純度ＴＴＲ
含有組成物、 （１１）ＴＴＲを含有する異型ＴＴＲ分泌抑制用組成
物、 （１２）（９）または（１０）のいずれかに記載の組成
物を含有する異型ＴＴＲ分泌抑制用組成物、に関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明におけるＴＴＲを含有する
原料組成物は、ＴＴＲを含有していれば特に限定される
ものではなく、例えば血清、血漿、血漿濃縮物、血漿の
任意の沈殿画分、血漿の任意の上清画分、細胞溶解物、
および細胞において産生された蛋白質等が挙げられる。
血漿を用いる場合は、例えば、コーンのアルコール分画
法の第ＩＶ画分、第ＩＩ＋ＩＩＩ画分など、薬剤の製造
に一般的に使用される血漿蛋白質分画における各種分画
の内、ＴＴＲを含有する分画に本発明の方法が適用され
る。

【０００８】上記のＴＴＲ含有原料組成物は、該組成物
の媒体に難溶性の夾雑物を除去する工程に付され、次い
で陰イオン交換体に接触させ、ＴＴＲを陰イオン交換樹
脂に吸着させる工程に付す。

【０００９】ＴＴＲ含有原料組成物から、該組成物の媒
体に難溶性の夾雑物を除去する操作としては、ポリエチ
レングリコール（以下、ＰＥＧという）処理、硫酸アン
モニウム処理が例示されるが、好ましくはＰＥＧ処理を
施す。これらの処理は常法に従って行うことができる。
ＰＥＧ処理を用いる場合、ＴＴＲ含有原料組成物を適当
な水性溶媒に懸濁する。水性溶媒の溶質として、例えば
塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、
酢酸、酢酸ナトリウム等を含有させてもよい。この懸濁
液を分子量１０００〜１００００のＰＥＧ、好ましくは
分子量４０００〜６０００のＰＥＧで処理する。当該処
理においては、ｐＨ６．０〜８．０程度、好ましくはｐ
Ｈ７．０〜８．０程度、ＰＥＧ濃度５〜２０W/V%、好ま
しくは１０W/V%、温度が０〜２０℃、好ましくは４〜１
５℃の条件下で適当な時間攪拌すると、ＴＴＲが上清画
分に移行する。当該上清画分を適当な方法、例えば遠心
分離、濾過等の方法で回収する。

【００１０】回収したＴＴＲ含有組成物を、陰イオン交
換体に接触させてＴＴＲを陰イオン交換体に吸着させる
ことにより、ＴＴＲ以外の蛋白質の含有率が高い第２の
画分を分離する。次いで、陰イオン交換体に吸着したＴ
ＴＲを含む画分を陰イオン交換体から分離し、ＴＴＲを
含む蛋白質溶液を回収する工程に付す。この陰イオン交
換体処理により、β蛋白質、アルブミン、α₂ 蛋白質、
γ蛋白質等の夾雑蛋白質が除去されＴＴＲ含有蛋白質溶
液が精製される。

【００１１】陰イオン交換体としては、陰イオン交換基
を有する不溶性担体であればいずれも使用することがで
きる。陰イオン交換基としては、ジエチルアミノエチル
基（通称はＤＥＡＥ）、四級アンモニウム基、例えば、
ジエチル〔２−ヒドロキシプロピル〕アミノエチル基
（通称はＱＡＥ）等が挙げられる。不溶性担体として
は、アガロース、セルロース、デキストラン、ポリアク
リルアミド、親水性ポリマー等が挙げられる。本発明で
使用する陰イオン交換体は、特に限定されないが、ＤＥ
ＡＥ樹脂からなる陰イオン交換体、より具体的にはＤＥ
ＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（商品
名、ファルマシア社製）等の陰イオン交換体を用いるの
が好ましい。

【００１２】上記の陰イオン交換体を用いる処理におい
ては、陰イオン交換体１ｍｌに対して、処理対象溶液２
〜１２ｍｌ程度を接触させる。本方法は、カラム法、バ
ッチ法のいずれの方法にて行ってもよいが、カラム法に
て行うのが好ましい。カラム法にて行う場合、ＴＴＲ含
有組成物を本発明の陰イオン交換体に接触させる条件と
して、接触させる環境の塩濃度は０〜１Ｍ、好ましくは
０．１〜０．５Ｍであり、またｐＨは６．５〜８．０程
度、好ましくはｐＨ７．０〜８．０程度である。使用す
る緩衝液は特に限定されないが、好ましくはトリス塩酸
緩衝液、リン酸緩衝液である。使用する緩衝液の濃度
は、５〜１００ｍＭ、好ましくは１０〜２０ｍＭであ
る。使用される塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリ
ウム、クエン酸ナトリウム等が例示されるが、好ましく
は塩化ナトリウムである。

【００１３】上記条件下の陰イオン交換体に接触させる
ＴＴＲ含有組成物は、陰イオン交換体と同一の緩衝液条
件に調整されていることが好ましい。

【００１４】このように調製されたＴＴＲ含有組成物
を、上記緩衝液で平衡化した陰イオン交換体に接触さ
せ、次いで同緩衝液で展開し、吸着成分を分離・溶出す
ることによってＴＴＲを含む蛋白質溶液を回収する。か
かる処理は、０〜１５℃、好ましくは２〜４℃にて行わ
れる。

【００１５】バッチ法にて行う場合、上記条件に調整し
たＴＴＲ含有組成物に、陰イオン交換体を添加して接触
させ、１５℃以下にて、１〜５時間程度混和した後、遠
心分離または濾過等の方法により陰イオン交換体と分離
し、上清を回収することにより行われる。

【００１６】上述の方法に従って精製されたＴＴＲ含有
蛋白質溶液は、必要に応じてｐＨ調整、濃度調整等がな
された後、水に対する親和性差を利用してＴＴＲを分離
する工程に付し、さらに精製する。以上の工程に付して
精製することにより、純度９０％以上のＴＴＲからなる
高純度ＴＴＲ含有組成物を得ることができる。該工程と
しては、疎水性相互作用クロマトグラフィー処理、ゲル
濾過クロマトグラフィー処理等が例示されるが、好まし
くは疎水性相互作用クロマトグラフィー処理を行う。疎
水性相互作用クロマトグラフィー用担体としては、フェ
ニル系樹脂、ブチル系樹脂等が例示されるが、好ましく
はフェニル系樹脂を用いる。本方法は、カラム法、バッ
チ法のいずれの方法にて行ってもよいが、カラム法にて
行うのが好ましい。

【００１７】例えばカラム法にて行う場合、塩濃度は０
〜５Ｍ、好ましくは０〜３．５Ｍであり、またｐＨは
６．５〜８．０程度、好ましくはｐＨ７．０〜８．０程
度である。使用する緩衝液は特に限定されないが、好ま
しくはトリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液である。使用す
る緩衝液の濃度は、０〜０．１Ｍ、好ましくは１０〜５
０ｍＭである。使用される塩としては、塩化ナトリウ
ム、硫酸アンモニウム等が例示される。

【００１８】疎水性相互作用クロマトグラフィー用担体
に接触させるＴＴＲ含有蛋白質溶液は、上記と同一の緩
衝液条件に調整されていることが好ましい。このように
調製されたＴＴＲ含有蛋白質溶液を、上記緩衝液で平衡
化した疎水性相互作用クロマトグラフィー用担体に接触
させ、次いで溶出溶媒にて非吸着画分を回収するが、か
かる処理は、０〜１５℃、好ましくは２〜４℃にて行わ
れる。溶出溶媒としては、平衡化に使用したものと同一
の上記緩衝液を用いる。また、疎水性相互作用クロマト
グラフィー用担体１ｍｌに対して、処理対象溶液５〜１
０ｍｌ程度を接触させる。

【００１９】上述したＴＴＲ含有原料組成物から高純度
トランスサイレチン含有組成物を製造する工程中、任意
の段階において、ウイルス不活化のための加熱処理を施
す事が好ましい。本工程は、ＴＴＲの薬剤成分としての
活性の減少は最小限にとどめるが、夾雑する可能性のあ
るウイルス、例えばＨＢウイルス、ＡＩＤＳウイルス等
は完全に不活化する条件で加熱処理する工程である。加
熱処理は、溶液状態、すなわちＴＴＲの水溶液状態（す
なわち液状加熱状態）で行う。液状加熱処理の場合は、
５６〜７０℃、好ましくは６０〜６２℃で５〜２０時
間、好ましくは１０時間程度処理を行い、その際、水溶
液のｐＨを６．５〜８．０程度、好ましくは７．０〜
８．０程度に調整する。液状加熱処理の場合は、出発原
料に対して、またはＴＴＲ含有原料組成物から該組成物
の媒体に難溶性の夾雑物を除去する工程の後、もしくは
イオン交換体処理後に行うのが好ましい。

【００２０】本発明の方法によれば、夾雑物が効果的に
除去され、実質的にウイルスを含まない、純度が９０％
以上のＴＴＲからなる高純度ＴＴＲ含有組成物を高収率
で得ることができる。

【００２１】本発明の、ＴＴＲを含有する異型ＴＴＲ分
泌抑制用組成物は、異型ＴＴＲの分泌抑制作用を有し、
発症初期、すなわち異型ＴＴＲが沈着していないか、あ
るいは沈着が軽度の家族性アミロイドポリニューロパチ
ー等のアミロイドーシス患者、または遺伝的背景から家
族性アミロイドポリニューロパチー等のアミロイドーシ
ス発症の可能性が高い者に投与することによって、異型
ＴＴＲの沈着を予防することができる。

【００２２】当該異型ＴＴＲ分泌抑制用組成物を医薬製
剤として用いる場合には、通常薬理学的に許容される添
加剤を配合してもよい。この添加剤としては、例えば、
担体、安定化剤、賦形剤、溶解補助剤、希釈剤、増量
剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、着色剤、防腐剤、酸化防
止剤などが挙げられる。諸成分を配合した後、その混合
物を公知の方法を用いて液剤、凍結乾燥製剤等の投与に
適した剤型に製剤化できる。上記製剤は、静注、点滴静
注、筋注等の方法で投与されるが、特に、点滴静注によ
り投与することが好ましい。

【００２３】上記製剤中には、当該異型ＴＴＲ分泌抑制
用組成物の有効量が配合される。投与量は、患者の年
齢、体重、病状、投与方法等によって異なるが、点滴静
注により投与する場合、通常成人、１回当たり、ＴＴＲ
として１００〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは４００
〜５００ｍｇ／ｋｇ程度である。

【００２４】本発明の異型ＴＴＲ分泌抑制用組成物は、
血中半減期が２．５日（Journal ofClinical Investiga
tion: 1965, 44 p1600-1609 Socolow EL et al.) と安
定性があるため、上記製剤の投与回数は、１週間に１〜
３回程度で効果が得られる。

【００２５】

【実施例】以下、本発明を具体的な実施例および試験例
を挙げてその詳細を説明するが、本発明はこれによって
限定されるものではない。

【００２６】実施例１（Ａ）加熱処理およびＰＥＧ処理 コーンの冷アルコール分画によって得られた血漿の第Ｉ
Ｖ分画ペースト１ｋｇ当たり、０．１５Ｍ ＮａＣｌ含
有２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）を
３Ｌ添加し、４℃で１時間抽出攪拌した後ｐＨ７．６に
調整し、この液を直径２４ｃｍの濾紙（ＴＯＹＯ，Ｎ
ｏ．２）の上にハイフロスーパーセル１００ｇをプリコ
ートしたブフナーを用いて吸引濾過を行い、濾液を採取
した。得られた濾液をｐＨ７．６に調整して６０℃、１
０時間の加熱処理を行い、その後冷却した後、この液１
Ｌ当たりＰＥＧ４０００を１５０ｇ添加し、４℃で１時
間攪拌した。次いで８，９００Ｇ×３０分間遠心分離し
て上清を採取した。得られた上清について、下記（イ）
〜（ハ）に記載する方法を用いて分析した。

【００２７】次に、加熱処理液に対してＰＥＧ処理を行
う際に、比較例としてＰＥＧ４０００濃度を５W/V%〜２
０W/V%と変化させて、ＴＴＲ回収率、およびＴＴＲ含有
原料組成物の媒体に難溶性の夾雑物の除去に対するＰＥ
Ｇ４０００の濃度の影響を下記（イ）〜（ハ）に記載の
方法を用いて分析した。

【００２８】〔分析方法〕 （イ）ＴＴＲの定量方法 Ｍパルチゲン／プレアルブミン（ヘキスト社製）を用い
た放射状免疫拡散法（マンシニー法）により抗原量を測
定した。なお、標準品として同社ヒト標準血清を並行に
置き、定量値をｍｇ／ｍｌに換算した。 （ロ）蛋白質の定量方法 分光光度計により、光路長１０ｍｍにおける２８０ｎｍ
吸光度を測定した。 （ハ）セルロースアセテート膜電気泳動 検体をセルロースアセテート膜（ザートリウス社）に
０．２５μｌずつ塗布し、ベロナール緩衝液（常光製、
μ＝０．０６，ｐＨ８．６）にて２５０Ｖ定電圧で２０
分間泳動した。泳動終了後、直ちにポンソー３Ｒ染色液
（和光純薬製）にて１分間染色した後５％酢酸溶液に
て、バックグラウンドが白色となり脱色液が着色しなく
なるまで脱色した。

【００２９】コーンの血漿第ＩＶ分画ペースト抽出濾
液、６０℃、１０時間加熱処理液、ならびにＰＥＧ処理
液を上記（イ）及び（ロ）の方法で分析した結果を表１
に示す。

【００３０】

【表１】

【００３１】第ＩＶ分画ペースト抽出濾液から６０℃、
１０時間加熱処理までの工程間では少なくともＴＴＲ抗
原性に変性を起こす現象は観察されず、加熱前後でＴＴ
Ｒは１００％の回収率を示した。各濃度におけるＰＥＧ
処理効果の検討を行った結果、ＰＥＧ添加量依存的に、
ＴＴＲ含有原料組成物の媒体に難溶性の夾雑物の除去効
果が認められ、ＴＴＲ回収性と該難溶性夾雑物の除去の
点で、１５W/V%のＰＥＧ４０００濃度が適当と判断され
た。

【００３２】また、前述（ハ）の方法で行った分析の結
果を図１に示す。図１の各レーンは、以下の検体につい
ての分析結果を示す。 レーン１：正常ヒト血漿 レーン２：コーンの血漿第ＩＶ分画ペースト抽出濾液 レーン３：６０℃、１０時間加熱処理液 レーン４：５W/V%ＰＥＧ処理液 レーン５：１０W/V%ＰＥＧ処理液 レーン６：１５W/V%ＰＥＧ処理液 レーン７：２０W/V%ＰＥＧ処理液

【００３３】この結果は、ＰＥＧ処理液でα₂ とβに属
する蛋白質が部分的に除去されていることを示してお
り、これらの分画に属する蛋白質の部分除去がＰＥＧ処
理で効果を示すことが確認された。

【００３４】（Ｂ）陰イオン交換体処理 次に、あらかじめ０．１Ｍ ＮａＣｌ含有２０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で平衡化しておいたＤＥ
ＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（φ５
ｃｍ，ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅ＝１００ｍｌ，ファルマシ
ア社製）を用いて、（Ａ）で得られた１５W/V%ＰＥＧ処
理液についてイオン交換体処理を行った（流速：１０ｍ
ｌ／ｍｉｎ）。すなわち、カラムに上記ＰＥＧ処理液を
アプライした後、０．１Ｍ ＮａＣｌ含有２０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で洗浄し、０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ含有２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）
で展開して溶出液を回収した。上記操作におけるアプラ
イ液、通過液、洗浄液、溶出液の各画分について、前述
（イ）及び（ロ）記載の方法で分析した結果を表２に示
す。ＴＴＲの回収率で９５．７％、精製度としては６．
３倍の効果が観察された。

【００３５】

【表２】

【００３６】また、各画分を、（ハ）の方法でセルロー
スアセテート膜電気泳動により分析した結果を図２に示
す。図の各レーンは、以下の検体についての分析結果を
示す。 レーン１：正常ヒト血漿 レーン２：ＤＥＡＥ−アプライ液 レーン３：ＤＥＡＥ−通過液 レーン４：ＤＥＡＥ−洗浄液 レーン５：ＤＥＡＥ−溶出液 主としてβ蛋白質とアルブミンが効果的に分離されてお
り、溶出液には、ＴＴＲの泳動位置であるプレアルブミ
ン位のバンドが検出された。

【００３７】（Ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィー
処理 （Ｂ）で得られた溶出液にＮａＣｌを３ｍｏｌ／Ｌの濃
度で添加し、ｐＨ７．６に調整した後、３Ｍ ＮａＣｌ
含有２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で平衡
化したＨｉＬｏａｄ Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ファルマシア社
製）カラム（Ｇｅｌ ｖｏｌｕｍｅ＝５０ｍｌ）を用い
た疎水性相互作用クロマトグラフィーによって不純物を
吸着させる操作を行い、非吸着画分を採取した。これら
の操作におけるアプライ液、通過液＋洗浄液、溶出液の
各画分について、前述（イ）及び（ロ）の方法で分析し
た結果を表３に示す。

【００３８】

【表３】

【００３９】さらに、平衡化・洗浄用緩衝液ＮａＣｌ含
有２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）の塩濃度
を、０．５Ｍ〜４．０Ｍに変化させて同様の操作を行
い、上記（ハ）の方法でセルロースアセテート膜電気泳
動により分析した結果を図３に示す。図の各レーンは、
以下の検体についての分析結果を示す。 レーン１：正常血漿 レーン２：Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアプライ
液 レーン３：０．５Ｍ ＮａＣｌ−通過液＆洗浄液 レーン４：１．０Ｍ ＮａＣｌ−通過液＆洗浄液 レーン５：２．０Ｍ ＮａＣｌ−通過液＆洗浄液 レーン６：３．０Ｍ ＮａＣｌ−通過液＆洗浄液 レーン７：３．５Ｍ ＮａＣｌ−通過液＆洗浄液 レーン８：４．０Ｍ ＮａＣｌ−通過液＆洗浄液

【００４０】本Ｇｅｌは、吸着時のＮａＣｌ濃度の増加
に伴い、蛋白質をより吸着する性質を示すが、ＴＴＲは
混在する他の蛋白質より親水性を示すため、３．５Ｍ
ＮａＣｌまではＧｅｌに吸着しない現象が観察された。
また、図３のセルロースアセテート膜電気泳動の結果か
らＮａＣｌの濃度が０．５Ｍ〜２Ｍの場合には全く分離
の効果が認められなかった。以上の結果から、３．０〜
３．５Ｍ ＮａＣｌ含有２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．６）を吸着条件に用い、不純物を吸着除去す
ることが適当と判断された。この吸着条件で処理を行っ
た場合、本工程においては、ＴＴＲ回収率で７０％程
度、精製度として約２倍の効果を有することが認められ
た。

【００４１】（Ｄ）濃縮・透析（Ｕｌｔｒａ−Ｆｉｌｔ
ｒａｔｉｏｎ）処理 （Ｃ）で回収された非吸着液については、限外濾過膜
（分画分子量３０ｋＤ）を用いて濃縮ならびに透析を行
い、精製ＴＴＲ検体（Ｌｏｔ♯７７７０−０４／ＴＴ
Ｒ）を得た。この精製ＴＴＲ検体（Ｌｏｔ♯７７７０−
０４／ＴＴＲ）について以下の各手法によって分析し
た。

【００４２】（１）セルロースアセテート膜電気泳動に
よる分析 上記の精製ＴＴＲ検体（Ｌｏｔ♯７７７０−０４／ＴＴ
Ｒ）について、（ハ）の方法でセルロースアセテート膜
電気泳動により分析した成績を図４に示す。図の各レー
ンは、以下の検体についての分析結果を示す。 レーン１：正常血漿 レーン２：精製ＴＴＲ検体（Ｌｏｔ♯７７７０−０４／
ＴＴＲ） この結果、α₂ に属する位置に極めて淡いバンドが認め
られた以外は、ＴＴＲの泳動位置であるプレアルブミン
位に強いバンドとして検出された。 （２）ＨＰＬＣ−Ｇｅｌｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｃｈｒ
ｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＧＰＣ）による分析 ＨＰＬＣ−ＧＰＣにより、精製ＴＴＲ検体の蛋白質濃度
を分析した。精製ＴＴＲ検体（Ｌｏｔ♯７７７０−０４
／ＴＴＲ）を希釈調整（Ａ２８０≒１）した液３０μｌ
を、あらかじめ０．３Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ６．７）で平衡化しておいたＴＳ
Ｋ−Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（東ソー）を装着したＨ
ＰＬＣにインジェクションした。同緩衝液を溶出液とし
て用い、０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で、サンプル成分の
分離を行った。検出はＡ₂₈₀ により行い、クロマトグラ
ムの面積から検体中のＴＴＲ純度を算出した。分析結果
を表すクロマトグラムを図５に示す。ＴＴＲは保持時間
２１．４分に展開されるｍａｉｎ ｐｅａｋとして検出
され、その積分値より、純度は９１％と算出された。

【００４３】以上の結果から、６０℃、１０時間加熱処
理ならびにＰＥＧ分画処理と陰イオン交換クロマトグラ
フィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーの組み
合わせにより、高純度のＴＴＲ含有組成物が製造された
ことが確認された。コーンの血漿第ＩＶ分画ペーストか
ら精製検体までの収量は０．４ｇ／ｋｇ第ＩＶ分画ペー
ストであり、コーンの血漿第ＩＶ分画ペーストから４０
倍にまで精製された。そして上述したように、本工程を
経て製造されたＴＴＲ含有組成物は、セルロースアセテ
ート膜電気泳動およびＨＰＬＣ−ＧＰＣ分析で、純度９
０％以上のＴＴＲからなる高純度のＴＴＲ含有組成物で
あることが示された。

【００４４】実施例２ （Ａ）硫酸アンモニウム処理 プール血漿に１リットルあたり硫酸アンモニウムを２０
０ｇ添加し、４℃で１時間攪拌した後８９００Ｇ×３０
分間遠心分離して上清を得た。この上清１リットルあた
り硫酸アンモニウムを２００ｇ添加して４℃で１時間攪
拌し、その後８９００Ｇ×３０分間遠心分離して沈殿を
採取し、これを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ７．６）に抽出溶解した。溶解液は、限外濾過膜（分
画分子量：１０ｋＤ−ｃｕｔ）を用いて脱硫酸アンモニ
ウム処理に付した。以上の工程における、プール血漿、
初回硫酸アンモニウム分画処理液上清、第２回硫酸アン
モニウム分画処理液上清および溶解液を、実施例１の
（イ）及び（ロ）に記載した方法を用いて分析した結果
を表４に示す。この結果から、本工程におけるＴＴＲの
工程回収率として７６．５％で約２倍の精製度が示され
た。

【００４５】

【表４】

【００４６】また、硫酸アンモニウム分画処理液を実施
例１の（ハ）の方法でセルロースアセテート膜電気泳動
により分析した結果を図６に示す。図の各レーンは、以
下の検体についての分析結果を示す。 レーン１：プール血漿 レーン２：初回硫酸アンモニウム分画処理液上清 レーン３：第２回硫酸アンモニウム分画処理液上清 レーン４：第２回硫酸アンモニウム分画処理液溶解液 この結果から、γ位の蛋白質が効果的に除去されている
ことが示された。

【００４７】さらに、脱硫酸アンモニウム処理に付した
上述の溶解液を、実施例（イ）及び（ロ）の方法を用い
て分析した結果を表５に示す。その結果、脱硫酸アンモ
ニウム処理前に比べたＴＴＲ回収率、蛋白質（Ａ２８
０）回収率は共に９０％以上であった。

【００４８】

【表５】

【００４９】（Ｂ）陰イオン交換体処理 （Ａ）で得られた脱硫酸アンモニウム処理液を、２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）で調整し、
イオン交換体処理に供した。すなわち、あらかじめ２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）で平衡化
しておいたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ
Ｆｌｏｗ（φ５ｃｍ，ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅ＝１００ｍ
ｌ，ファルマシア社製）カラムに、上述のように調整さ
れた脱硫酸アンモニウム処理液をアプライした後、Ｎａ
Ｃｌ不含２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）か
ら１Ｍ ＮａＣｌ含有２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．６）のリニアグラジエントで展開し、ＴＴＲを含
む溶液画分を分取した。上記操作においてフラクション
チューブに展開した液の吸光度を測定した結果（クロマ
トグラム）を図７に示す。また、アプライ液および得ら
れたクロマトグラムから適当にプールして集めた各画分
（Ａ〜Ｆ）を実施例１の（イ）および（ロ）に記載の方
法を用いて分析した結果を表６に示す。

【００５０】

【表６】

【００５１】ＴＴＲはＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗに対する親和性が、混在する他の蛋
白質よりも強く、ＮａＣｌグラジエントで展開された蛋
白ピーク中、最後に得られる画分（Ｆｒ．Ｆ）にＴＴＲ
が溶出された。また、本処理におけるＴＴＲの回収率は
８６．８％であり、精製度としては２１倍の効果が示さ
れた。また、各画分（Ｆｒ．Ａ〜Ｆ）を実施例１の
（ハ）の方法でセルロースアセテート膜電気泳動により
分析した結果、図８に示すように他の蛋白質が効果的に
分離されており、Ｆｒ．Ｆには、ＴＴＲの泳動位置であ
るプレアルブミン位のバンドが検出された。

【００５２】（Ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィー
処理 （Ｂ）で得られた溶液（Ｆｒ．Ｆ）に硫酸アンモニウム
を１ｍｏｌ／Ｌの濃度で添加し、１Ｍ硫酸アンモニウム
含有２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で平衡
化したＨｉｌｏａｄ Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ｂｅｄ ｖｏｌ
ｕｍｅ＝５０ｍｌ，ファルマシア社製）カラムにアプラ
イし、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって１Ｍ
硫酸アンモニウム含有２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．６）から硫酸アンモニウム不含２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）のリニアグラジエントで展開
し、ＴＴＲを含む溶液画分を分取した。上記操作におけ
るアプライ液および得られた各画分について、実施例１
の（イ）及び（ロ）に記載の方法を用いて分析した結果
を表７に示す。また、グラジエントで展開した時の吸光
度のクロマトグラムを図９に示す。

【００５３】

【表７】

【００５４】ＴＴＲは、混在する他の蛋白質より親水性
を示し、高極性（１Ｍ硫酸アンモニウム）から開始する
グラジエントで展開された最初の蛋白ピーク（Ｆｒ．
ａ）にＴＴＲが検出された。本工程でのＴＴＲの回収率
は、９２．３％であって、精製度としては、約４倍の効
果が観察された。また、各画分（Ｆｒ．ａ〜ｆ）を、実
施例１の（ハ）の方法でセルロースアセテート膜電気泳
動により分析した結果、図１０に示すように、Ｆｒ．ａ
は、プレアルブミンのほぼ単一なバンドとして検出され
た。

【００５５】（Ｄ）濃縮・透析（Ｕｌｔｒａ−Ｆｉｌｔ
ｒａｔｉｏｎ）処理 （Ｃ）で得られた溶液について、限外濾過膜（分画分子
量１０ｋＤ）を用いて濃縮ならびに透析を行い、精製Ｔ
ＴＲ検体（ＧＣＣ−ＴＴＲ）を得た。このＴＴＲ検体に
ついて、以下の各手法によって分析した。尚、対照検体
としてシグマ社から市販されているプレアルブミン（Ｓ
ＩＧＭＡ−ＴＴＲ）を用いた。

【００５６】（１）吸光係数 ＴＴＲ抗原量と２８０ｎｍ吸光度から吸光係数を求めた
結果、表８に示す通り上記精製ＴＴＲ（ＧＣＣ−ＴＴ
Ｒ）のＥ２８０ｎｍ^1% _1cm は１３．５であり、生化学デ
ータブックの記載値（１３．２〜１４．１）からして満
足する値を認めた。

【００５７】

【表８】

【００５８】（２）セルロースアセテート膜電気泳動に
よる分析 精製ＴＴＲ検体（ＧＣＣ−ＴＴＲ）と対照検体（ＳＩＧ
ＭＡ−ＴＴＲ）につき、実施例１の（ハ）の方法でセル
ロースアセテート膜電気泳動により分析した結果を図１
１に示す。図の各レーンは、以下の検体についての分析
結果を示す。 レーン１：正常血漿 レーン２：精製ＴＴＲ検体（ＧＣＣ−ＴＴＲ） レーン３：対照検体（ＳＩＧＭＡ−ＴＴＲ） 精製ＴＴＲ検体（ＧＣＣ−ＴＴＲ）と対照検体（ＳＩＧ
ＭＡ−ＴＴＲ）については両者ともＴＴＲの泳動位置で
あるプレアルブミン位に単一バンドとして観察された。

【００５９】（３）ＨＰＬＣ−Ｇｅｌｐｅｒｍｅａｔｉ
ｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＧＰＣ）による
分析 ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムを用いたＨＰＬＣ−
ＧＰＣにより、上記の精製ＴＴＲ検体（ＧＣＣ−ＴＴ
Ｒ）および対照検体（ＳＩＧＭＡ−ＴＴＲ）を分析した
クロマトグラムを図１２に示す。その結果、ＧＣＣ−Ｔ
ＴＲは保持時間２０．５分に展開されるほぼ単一のピー
クとして検出され、その積分値より、ＧＣＣ−ＴＴＲな
らびにＳＩＧＭＡ−ＴＴＲの純度はそれぞれ９８．７％
および８８．０％であった。

【００６０】（４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析 ＧＣＣ−ＴＴＲとＳＩＧＭＡ−ＴＴＲをＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ ｍｉｎｉ〔Ｇｅｌ：４−２０％ ＳＤＳ−Ｐｏｌｙ
ａｃｒｙｌａｍｉｄｇｅｌ（ｇｒａｄｉｅｎｔ−ｇｅ
ｌ），１ｍｍ厚，ＴＥＦＣＯ社製〕を用いて、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより分析した。すなわち、ｓａｍｐｌｅ ｂ
ｕｆｆｅｒ（０．１％ＳＤＳ，０．１９２Ｍ Ｇｌｙｃ
ｉｎｅ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）で、約Ａ２８０
＝１に調整した検体を煮沸浴槽中で５分間加熱処理後、
１０μｌ／ｌａｎｅ添加し、１８ｍＡ定電流下で１２０
分間電気泳動した。その後、染色液（Ｃｏｏｍａｓｓｉ
ｅＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０，４０％
メタノール，１０％酢酸）によりゲルを染色後、脱色液
（１０％メタノール，７．５％酢酸）で脱色した。検体
は還元と非還元処理したサンプルにつき、それぞれｃｈ
ａｒｇｅした。この結果を図１３に示す。各レーンは、
以下の検体についての結果を表す。 ＧＣＣ−ＴＴＲ、ＳＩＧＭＡ−ＴＴＲともに分子量２０
ｋＤ以下の位置に単一バンドとして検出され、両者の泳
動位置は全く同一であった。

【００６１】（５）Ｏｕｃｔｈｅｒｌｏｎｙ法による抗
原性の定性分析 ＧＣＣ−ＴＴＲ、ＳＩＧＭＡ−ＴＴＲ、ならびに正常人
血漿につき、抗ＴＴＲ（プレアルブミン）抗体を用いた
Ｏｕｃｔｈｅｒｌｏｎｙ法によって抗原性の定性を行っ
た。以下にその手法を述べる。電気泳動用ベロナール緩
衝剤（常光）１袋を精製水１０００ｍｌで溶解し、アガ
ロース粉末（ＡｇａｒｏｓｅＬＥ，ＦＭＣ）とアジ化ナ
トリウムをそれぞれ最終１％および０．１％になるよう
に加えて煮沸溶解した。溶解液２０ｍｌを水平台の上で
ガラス平板（７５×１００ｍｍ）に注ぎ、湿潤容器中で
室温放置してゲルが固まった後、試料と抗体をアプライ
する穴をパンチで切り込み、寒天平沈降線の観察を行っ
た。その結果を図１４に示す。ＧＣＣ−ＴＴＲに由来す
る沈降線は正常血漿およびＳＩＧＭＡ−ＴＴＲのそれ
と、それぞれ完全に融合しており、ｓｐｕｒ形成などは
観察されなかった。

【００６２】（６）免疫電気泳動による分析 ＧＣＣ−ＴＴＲを、以下の手法により免疫電気泳動によ
り分析した。電気泳動用ベロナール緩衝剤（常光）１袋
を精製水１０００ｍｌで溶解し、アガロース粉末（Ａｇ
ａｒｏｓｅＬＥ，ＦＭＣ）とアジ化ナトリウムをそれぞ
れ最終１％および０．１％になるように加えて煮沸溶解
した。溶解液２０ｍｌを水平台の上でガラス平板（７５
×１００ｍｍ）に注ぎ、湿潤容器中で室温放置してゲル
が固まった後、試料と抗体をアプライする穴および溝を
それぞれ切り込み、寒天平板を作製した。泳動緩衝液
は、前述ベロナール緩衝剤１袋を精製水５００ｍｌに溶
解した液（ｐＨ８．６，μ＝０．０６）を用い、寒天平
板と緩衝液を濾紙で架橋後、ＧＣＣ−ＴＴＲ、ＳＩＧＭ
Ａ−ＴＴＲ、および対照検体としてブロムフェノールブ
ルー（ＢＰＢ）を含む正常血漿をそれぞれ１０μｌアプ
ライして１〜２ｍＡ／ｃｍ定電圧で電気泳動した。対照
検体としたブロムフェノールブルーを含む血漿が原点か
ら約２ｃｍ泳動された位置で停電し、寒天平板上の溝に
抗ヒト血清・ウサギ抗体（ＤＡＫＯ）および抗ＴＴＲ
（プレアルブミン）・ウサギ抗体（ＤＡＫＯ，Ａ０３
０）をそれぞれ１００μｌ加え、湿潤容器中で一晩室温
放置して沈降線の観察を行った。この結果を図１５に示
す。抗ＴＴＲ（プレアルブミン）抗体および抗ヒト血清
抗体に対する反応性について、正常血漿およびＳＩＧＭ
Ａ−ＴＴＲによって示されるＴＴＲ由来のそれぞれの沈
降線と、ＧＣＣ−ＴＴＲの示す沈降線とで、よく一致し
た結果が認められた。

【００６３】（７）加熱処理 生理食塩水を溶媒とした精製ＴＴＲ検体（ＧＣＣ−ＴＴ
Ｒ）にソルビトールを５０W/V%の濃度で添加し、無添加
群と併せて各々６０℃で１０時間加熱処理を行い、ＨＰ
ＬＣ−ＧＰＣにより、凝集物生成等を指標として加熱に
対する影響を調べた。その結果（クロマトグラム）を図
１６に示す。観察したそれぞれの溶媒系（生理食塩水お
よび５０W/V%ソルビトール添加生理食塩水）での６０
℃、１０時間の加熱処理に対し、少なくともＴＴＲはＨ
ＰＬＣ−ＧＰＣのパターンに影響は認められず、高分子
の凝集物の生成は観察されなかった。

【００６４】以上の結果から、硫酸アンモニウム分画処
理、陰イオン交換体処理および疎水性相互作用クロマト
グラフィー処理の組み合わせにより、ほぼ単一なＴＴＲ
が分離されたことが示された。血漿から精製検体までの
収量は０．１３ｇ／Ｌ血漿であり、全工程の回収率とし
ては５０％程度であって血漿から１９５倍にまで精製さ
れた。得られた精製ＴＴＲ検体は、定性および定量分析
において、それぞれＴＴＲの性質を満足する結果を示
し、また６０℃、１０時間の加熱処理に対してＴＴＲは
比較的安定である傾向にあった。

【００６５】試験例１ 低蛋白低アルブミン血症を合併する家族性アミロイドポ
リニューロパチー患者に、新鮮凍結血漿６００ｃｃを約
３〜４時間かけて点滴静注により投与した。新鮮凍結血
漿投与前、投与直後、投与後１日、２日、３日、および
４日にこの患者から採血し、得られた血液サンプルにつ
いて、血中総ＴＴＲおよび異型ＴＴＲの濃度を単純放射
状免疫拡散法およびＲＩＡ法で測定した。血中総ＴＴＲ
および異型ＴＴＲの濃度の経時的変化を図１７に示し
た。その結果、投与後１５分で、血中総ＴＴＲが増加し
たにも関わらず、異型ＴＴＲレベルが低下することが認
められた。さらに新鮮凍結血漿の投与量を８００ｃｃに
増加させたところ、図１８に示したように、同様の効果
が顕著に認められた。これらの結果より、新鮮凍結血漿
中のある成分が異型ＴＴＲレベルを下げる効果があるこ
とが考えられた。

【００６６】試験例２ Ｃ５７Ｂｌａｃｋ６マウス（ｎ＝３）に、実験例２で得
られた高純度ＴＴＲ含有組成物を、ＴＴＲ抗原量に換算
して３ｍｇ〔マウス１個体（平均体重５０〜６０ｇ）当
たり〕、静注により投与した。投与直後、投与後６時
間、２４時間、４８時間に該マウスの血中マウス・ＴＴ
ＲのｍＲＮＡレベルをノーザンブロットハイブリダイゼ
ーションおよびドットブロットハイブリダイゼーション
による方法で測定し、その経時的変化を図１９に示し
た。その結果、投与後６時間でマウス血中のマウス・Ｔ
ＴＲのｍＲＮＡレベルが低下し、以降少しずつ正常レベ
ルに回復した。従って、ＴＴＲ含有組成物を投与するこ
とによって、本来生体内に保有するＴＴＲレベルを低下
させる効果が確認された。即ち、ＴＴＲ含有組成物を投
与することにより、家族性アミロイドポリニューロパチ
ー（ＦＡＰ）患者が本来生体内に持つ異型ＴＴＲの分泌
を抑制する効果を持つことが示唆された。

【００６７】試験例３毒性試験 実施例２で得られた高純度ＴＴＲ含有組成物をＴＴＲ抗
原量に換算して１５００ｍｇ／ｋｇの容量で、Wisterラ
ット３匹（体重：２６０ｇ、２８５ｇ、および２９５
ｇ）、及びウサギ２匹（体重：２６５０ｇおよび３１２
０ｇ）にそれぞれ静注により投与した。これらのラット
およびウサギについて、該高純度ＴＴＲ含有組成物投与
後２週間にわたり観察を行ったが、体重等の生理学的所
見および一般状態に変化は認められなかった。以上の結
果から、本発明の高純度ＴＴＲ含有組成物の安全性の高
いことが確認された。

【００６８】

【発明の効果】本発明の方法によれば、夾雑物が除去さ
れ、高純度のＴＴＲ含有組成物を高収率に提供すること
ができる。また、本発明の工程によれば、実質的にウイ
ルスを含まず、安全性が高い高純度ＴＴＲ含有組成物を
製造することができる。さらに、本発明の、ＴＴＲを含
有する異型ＴＴＲ分泌抑制用組成物は、異型ＴＴＲの分
泌抑制作用を有し、発症初期、すなわち異型ＴＴＲが沈
着していないかあるいは沈着が軽度の家族性アミロイド
ポリニューロパチー等のアミロイドーシス患者、または
遺伝的背景から家族性アミロイドポリニューロパチー等
のアミロイドーシス発症の可能性が高い者に投与するこ
とによって、異型ＴＴＲの沈着を予防することができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＰＥＧ処理を施したＴＴＲ含有組成物を、セ
ルロースアセレート膜電気泳動により分析した結果を示
す図である。

【図２】 ＰＥＧ分画処理を施したＴＴＲ含有組成物を
陰イオン交換体（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａ
ｓｔ Ｆｌｏｗ）に供し、分離された各画分についてセ
ルロースアセテート膜電気泳動により分析した結果を示
す図である。

【図３】 疎水性相互作用クロマトグラフィーにおける
溶媒中のＮａＣｌ濃度の変化によるＴＴＲ分離精製効果
につき、セルロースアセテート膜電気泳動により分析し
た結果を示す図である。

【図４】 精製ＴＴＲ検体（Ｌｏｔ♯７７７０−０４／
ＴＴＲ）を、セルロースアセテート膜電気泳動により分
析した結果を示す図である。

【図５】 精製ＴＴＲ検体（Ｌｏｔ♯７７７０−０４／
ＴＴＲ）を、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムを用い
たＨＰＬＣ−ＧＰＣにより分析したクロマトグラムを示
す図である。

【図６】 硫酸アンモニウム分画処理を施したＴＴＲ含
有組成物を、セルロースアセテート膜電気泳動により分
析した結果を示す図である。

【図７】 硫酸アンモニウム分画処理液を陰イオン交換
体処理に供し、グラジエントで展開し吸光度を測定した
結果（クロマトグラム）を示す図である。

【図８】 硫酸アンモニウム分画処理したＴＴＲ含有組
成物を陰イオン交換体に供し、分離された各画分につい
てセルロースアセテート膜電気泳動により分析した結果
を示す図である。

【図９】 硫酸アンモニウム分画処理並びに陰イオン交
換体処理を施したＴＴＲ含有蛋白質溶液を疎水性相互作
用クロマトグラフィー処理に供し、グラジエントで展開
し吸光度を測定した結果（クロマトグラム）を示す図で
ある。

【図１０】 硫酸アンモニウム分画処理並びに陰イオン
交換体処理を施したＴＴＲ含有蛋白質溶液を疎水性相互
作用クロマトグラフィーに供し、分離された各画分につ
いてセルロースアセテート膜電気泳動により分析した結
果を示す図である。

【図１１】 精製ＴＴＲ検体（ＧＣＣ−ＴＴＲ）および
対照検体（ＳＩＧＭＡ−ＴＴＲ）を、セルロースアセテ
ート膜電気泳動により分析した結果を示す図である。

【図１２】 精製ＴＴＲ検体（ＧＣＣ−ＴＴＲ）および
対照検体（ＳＩＧＭＡ−ＴＴＲ）をＴＳＫ−Ｇ３０００
ＳＷＸＬカラムを用いたＨＰＬＣ−ＧＰＣにより分析し
たクロマトグラムを示す図である。

【図１３】 精製ＴＴＲ検体（ＧＣＣ−ＴＴＲ）および
対照検体（ＳＩＧＭＡ−ＴＴＲ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より分析した結果を示す図である。

【図１４】 精製ＴＴＲ検体（ＧＣＣ−ＴＴＲ）、対照
検体（ＳＩＧＭＡ−ＴＴＲ）および正常人血漿を、抗Ｔ
ＴＲ（プレアルブミン）抗体を用いたＯｕｃｔｈｅｒｌ
ｏｎｙ法によって抗原性の定性分析を行った結果を示す
図である。

【図１５】 精製ＴＴＲ検体（ＧＣＣ−ＴＴＲ）、対照
検体（ＳＩＧＭＡ−ＴＴＲ）および正常人血漿の、抗Ｔ
ＴＲ（プレアルブミン）抗体および抗ヒト血清抗体に対
する反応性を、免疫電気泳動により分析した結果を示す
図である。

【図１６】 加熱前および加熱処理を施した精製ＴＴＲ
検体（ＧＣＣ−ＴＴＲ）をＨＰＬＣ−ＧＰＣにより分析
したクロマトグラムを示す図である。

【図１７】 新鮮凍結血漿６００ｃｃを投与した低蛋白
低アルブミン血症を合併する家族性アミロイドポリニュ
ーロパチー患者の、血中総ＴＴＲおよび異型ＴＴＲの濃
度の経時的変化を示す図である。

【図１８】 新鮮凍結血漿８００ｃｃを投与した低蛋白
低アルブミン血症を合併する家族性アミロイドポリニュ
ーロパチー患者の、血中総ＴＴＲおよび異型ＴＴＲの濃
度の経時的変化を示す図である。

【図１９】 精製ＴＴＲ検体（ＧＣＣ−ＴＴＲ）を投与
したマウスの、血中マウス・ＴＴＲのｍＲＮＡレベルの
平均値の経時的変化を示す図である。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 トランスサイレチンを含有する原料組成
   物より、トランスサイレチンを含む第１の蛋白質画分
   と、トランスサイレチン以外の蛋白質の含有率が高い第
   ２の画分とに分離する方法であって、（ａ）トランスサ
   イレチンを含有する原料組成物から、該組成物の媒体に
   難溶性の夾雑物を除去する工程、（ｂ）（ａ）で調製さ
   れたトランスサイレチン含有組成物を陰イオン交換体に
   接触させ、トランスサイレチンを陰イオン交換体に吸着
   させることにより第２の画分を分離する工程、（ｃ）
   （ｂ）で陰イオン交換体に吸着したトランスサイレチン
   を含む第１の蛋白質画分を陰イオン交換体から分離し、
   トランスサイレチンを含む蛋白質溶液を回収する工程、
   （ｄ）（ｃ）で回収された蛋白質溶液から、水に対する
   親和性差を利用してトランスサイレチンを分離する工
   程、の４つの工程を含むことを特徴とする、純度９０％
   以上のトランスサイレチンからなる高純度トランスサイ
   レチン含有組成物の製造方法。
2. 【請求項２】 トランスサイレチンを含有する原料組成
   物が、血清、血漿、血漿濃縮物、血漿の任意の沈殿画
   分、血漿の任意の上清画分、細胞溶解物、および細胞に
   おいて産生された蛋白質からなる群から選ばれる請求項
   １に記載の方法。
3. 【請求項３】 任意の段階で、ウイルスを不活化するの
   に充分な条件で加熱処理を施し、ウイルスに対して安全
   なトランスサイレチン含有組成物を得る工程が付加され
   た、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 工程（ａ）において該組成物の媒体に難
   溶性の夾雑物を除去する工程が、ポリエチレングリコー
   ル処理または硫酸アンモニウム処理である、請求項１に
   記載の方法。
5. 【請求項５】 陰イオン交換体の陰イオン交換樹脂が、
   ＤＥＡＥ樹脂からなる請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 工程（ｃ）においてトランスサイレチン
   を含む第１の蛋白質画分を陰イオン交換体から分離し、
   トランスサイレチンを含む蛋白質溶液を回収する方法
   が、塩溶液を用いる方法である、請求項１に記載の方
   法。
7. 【請求項７】 工程（ｄ）において水に対する親和性差
   を利用してトランスサイレチンを分離する方法が、疎水
   性相互作用クロマトグラフィーに付す方法である、請求
   項１に記載の方法。
8. 【請求項８】 工程（ｄ）において水に対する親和性差
   を利用してトランスサイレチンを分離する工程の後に、
   硫酸アンモニウム溶液もしくは塩化ナトリウム溶液を用
   いてトランスサイレチンが含まれる蛋白質画分を回収す
   る工程が付加された、請求項１に記載の方法。
9. 【請求項９】 実質的にウイルスを含まない、高純度ト
   ランスサイレチン含有組成物。
10. 【請求項１０】 純度９０％以上のトランスサイレチン
    からなる高純度トランスサイレチン含有組成物。
11. 【請求項１１】 トランスサイレチンを含有する異型ト
    ランスサイレチン分泌抑制用組成物。
12. 【請求項１２】 請求項９または請求項１０のいずれか
    に記載の組成物を含有する異型トランスサイレチン分泌
    抑制用組成物。