JPH10337183A - ヘリカーゼをコードするヒトの遺伝子，ｃｄｃ２８−＃４６ - Google Patents
ヘリカーゼをコードするヒトの遺伝子，ｃｄｃ２８−＃４６Info
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヘリカーゼ活性をもたらすタンパク質をコー
ドする遺伝子の提供。 【解決手段】 配列番号２で表されるアミノ酸配列又は
該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加された配列を含み、ヘリカーゼ活
性をもたらすタンパク質をコードする遺伝子。
ドする遺伝子の提供。 【解決手段】 配列番号２で表されるアミノ酸配列又は
該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加された配列を含み、ヘリカーゼ活
性をもたらすタンパク質をコードする遺伝子。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヘリカーゼ活性を
もたらすタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子がコ
ードするタンパク質、該タンパク質の製造方法、並びに
該タンパク質及び該遺伝子の用途に関する。
もたらすタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子がコ
ードするタンパク質、該タンパク質の製造方法、並びに
該タンパク質及び該遺伝子の用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】1996年、老化関連遺伝子のうちで、ウェ
ルナー（Werner）症候群の原因遺伝子がクローニングさ
れ、その原因遺伝子は、遺伝子構造解析によりヘリカー
ゼ遺伝子であることが明らかにされた。ヘリカーゼ遺伝
子は、ウェルナー症候群の他にBloom、Cockayne、Trich
othiodystrophy、色素性乾皮症等の病気の原因となる遺
伝子であり、各疾患の原因遺伝子はそれぞれ異なること
が知られている。ヘリカーゼ遺伝子の発現産物であるヘ
リカーゼは、前記病気の症状において標的として侵す細
胞・臓器も異なる。
ルナー（Werner）症候群の原因遺伝子がクローニングさ
れ、その原因遺伝子は、遺伝子構造解析によりヘリカー
ゼ遺伝子であることが明らかにされた。ヘリカーゼ遺伝
子は、ウェルナー症候群の他にBloom、Cockayne、Trich
othiodystrophy、色素性乾皮症等の病気の原因となる遺
伝子であり、各疾患の原因遺伝子はそれぞれ異なること
が知られている。ヘリカーゼ遺伝子の発現産物であるヘ
リカーゼは、前記病気の症状において標的として侵す細
胞・臓器も異なる。
【０００３】ヘリカーゼとは、一般にはＡＴＰ加水分解
のエネルギーを用いて二重鎖ＤＮＡを巻き戻す活性をも
つ酵素をいう。このヘリカーゼはまた、部分的にＲＮＡ
の高次構造又はＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッドを開く
作用を及ぼすことが知られている。ヘリカーゼは、非常
に複雑な生物反応の中心的役割を果たす酵素であり、そ
の種類も多数である。例えば、ヘリカーゼは、前記高次
構造を開き、細胞の増殖・分化に必須な生物反応、すな
わち1.複製、2.修復、3.組換え、4.分離、5.転写、6.ス
プライシング、7.伸長及び翻訳、8.細胞周期の各プロセ
スにそれぞれ関与している。このように多種類のヘリカ
ーゼが存在することは、とりもなおさず、それらが生体
においてうまく分業し、働く時期、標的DNA/RNA を異に
していることを想起させる。
のエネルギーを用いて二重鎖ＤＮＡを巻き戻す活性をも
つ酵素をいう。このヘリカーゼはまた、部分的にＲＮＡ
の高次構造又はＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッドを開く
作用を及ぼすことが知られている。ヘリカーゼは、非常
に複雑な生物反応の中心的役割を果たす酵素であり、そ
の種類も多数である。例えば、ヘリカーゼは、前記高次
構造を開き、細胞の増殖・分化に必須な生物反応、すな
わち1.複製、2.修復、3.組換え、4.分離、5.転写、6.ス
プライシング、7.伸長及び翻訳、8.細胞周期の各プロセ
スにそれぞれ関与している。このように多種類のヘリカ
ーゼが存在することは、とりもなおさず、それらが生体
においてうまく分業し、働く時期、標的DNA/RNA を異に
していることを想起させる。
【０００４】これら一群のヘリカーゼ酵素が、老化と発
癌を含め多くの難病に関連していることが次第に明らか
となり、今後、 Bloom、Cockayne、Trichothiodystroph
y、色素性乾皮症候群とは違うタイプの病気が見出され
て来る可能性がある。
癌を含め多くの難病に関連していることが次第に明らか
となり、今後、 Bloom、Cockayne、Trichothiodystroph
y、色素性乾皮症候群とは違うタイプの病気が見出され
て来る可能性がある。
【０００５】ところで、老化そのものは病気ではない
が、老化に伴い多くの疾病が誘発される。細胞生化学的
研究から、老化には特定の遺伝子 (老化関連遺伝子) が
関与していることが示唆されている。そして、これまで
にヒトの第１、４、６、７染色体が、微小核細胞融合法
により、細胞老化に関連する遺伝子が存在する座位とし
て明らかにされている。また、その遺伝子の一部につい
ては正確な染色体上の位置及び遺伝子構造が判明してい
る。
が、老化に伴い多くの疾病が誘発される。細胞生化学的
研究から、老化には特定の遺伝子 (老化関連遺伝子) が
関与していることが示唆されている。そして、これまで
にヒトの第１、４、６、７染色体が、微小核細胞融合法
により、細胞老化に関連する遺伝子が存在する座位とし
て明らかにされている。また、その遺伝子の一部につい
ては正確な染色体上の位置及び遺伝子構造が判明してい
る。
【０００６】しかしながら、それら遺伝子の発現調節機
構、遺伝子産物の生理活性・機能及び他の疾病との関連
性の実体については、未だほとんど不明である。さら
に、老化と、老化に伴う疾病の発症メカニズムとの相関
関係については未だ明らかではない。
構、遺伝子産物の生理活性・機能及び他の疾病との関連
性の実体については、未だほとんど不明である。さら
に、老化と、老化に伴う疾病の発症メカニズムとの相関
関係については未だ明らかではない。
【０００７】したがって、細胞老化に関連すると思われ
る遺伝子を単離することにより、老化と病気の発症メカ
ニズムを明らかし、その遺伝子により発育不全及び早老
症モデル実験動物を作製することができ、そして老化に
伴う疾病に対する医薬品及び臨床検査薬への開発が期待
される。
る遺伝子を単離することにより、老化と病気の発症メカ
ニズムを明らかし、その遺伝子により発育不全及び早老
症モデル実験動物を作製することができ、そして老化に
伴う疾病に対する医薬品及び臨床検査薬への開発が期待
される。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヘリカーゼ
活性をもたらすタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝
子がコードするタンパク質、該タンパク質の製造方法、
並びに該タンパク質及び該遺伝子の用途を提供すること
を目的とする。
活性をもたらすタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝
子がコードするタンパク質、該タンパク質の製造方法、
並びに該タンパク質及び該遺伝子の用途を提供すること
を目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
基づいて鋭意研究を行った結果、ヒト精巣、胎盤、心
臓、膵臓又は脾臓由来のpoly(A)+ RNAからヘリカーゼ活
性をもたらすタンパク質をコードする遺伝子をクローニ
ングすることに成功し、本発明を完成するに至った。
基づいて鋭意研究を行った結果、ヒト精巣、胎盤、心
臓、膵臓又は脾臓由来のpoly(A)+ RNAからヘリカーゼ活
性をもたらすタンパク質をコードする遺伝子をクローニ
ングすることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１０】すなわち、本発明は、配列番号２で表され
るアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは
数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を
含み、ヘリカーゼ活性をもたらすタンパク質をコードす
る遺伝子である。該遺伝子としては、例えば配列番号１
又は３で表される塩基配列を含むものが挙げられる。
るアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは
数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を
含み、ヘリカーゼ活性をもたらすタンパク質をコードす
る遺伝子である。該遺伝子としては、例えば配列番号１
又は３で表される塩基配列を含むものが挙げられる。
【００１１】さらに、本発明は、前記遺伝子の少なくと
も一部とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレ
オチドプローブである。さらに、本発明は、前記遺伝子
を含む組換え体ＤＮＡである。
も一部とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレ
オチドプローブである。さらに、本発明は、前記遺伝子
を含む組換え体ＤＮＡである。
【００１２】さらに、本発明は、前記組換え体ＤＮＡに
よって形質転換された形質転換体である。さらに、本発
明は、前記形質転換体を培養し、得られる培養物からヘ
リカーゼ活性をもたらすタンパク質を採取することを特
徴とする該タンパク質の製造方法である。
よって形質転換された形質転換体である。さらに、本発
明は、前記形質転換体を培養し、得られる培養物からヘ
リカーゼ活性をもたらすタンパク質を採取することを特
徴とする該タンパク質の製造方法である。
【００１３】さらに、本発明は、配列番号２で表される
アミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数
個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含
み、ヘリカーゼ活性をもたらすタンパク質である。
アミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数
個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含
み、ヘリカーゼ活性をもたらすタンパク質である。
【００１４】さらに、本発明は、前記タンパク質と特異
的に反応するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗
体である。さらに、本発明は、前記モノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマである。
的に反応するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗
体である。さらに、本発明は、前記モノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマである。
【００１５】さらに、本発明は、前記オリゴヌクレオチ
ドプローブを含む、ヘリカーゼ活性をもたらすタンパク
質をコードする遺伝子の検出用試薬である。さらに、本
発明は、前記タンパク質、及び前記モノクローナル抗体
又はポリクローナル抗体を含む、老化に伴う疾患の検出
用試薬である。
ドプローブを含む、ヘリカーゼ活性をもたらすタンパク
質をコードする遺伝子の検出用試薬である。さらに、本
発明は、前記タンパク質、及び前記モノクローナル抗体
又はポリクローナル抗体を含む、老化に伴う疾患の検出
用試薬である。
【００１６】さらに、本発明は、前記遺伝子の機能が失
われるように処理されたノックアウトマウス又は前記遺
伝子の発現レベルを上昇若しくは下降するように修飾さ
れた遺伝子が導入されたトランスジェニック動物であ
る。以下、本発明を詳細に説明する。
われるように処理されたノックアウトマウス又は前記遺
伝子の発現レベルを上昇若しくは下降するように修飾さ
れた遺伝子が導入されたトランスジェニック動物であ
る。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
【発明の実施の形態】分裂酵母の cdc28+ 遺伝子は、本
来、細胞周期や分裂が異常である温度依存性変異株の異
常を、相補・回復させる能力のある遺伝子の一つとして
同定されたものであり、RNA ヘリカーゼとして報告され
ているが(Molecular Biology of theCell 7, 1083-109
4,1996) 、DNAヘリカーゼとして働く可能性もある。
来、細胞周期や分裂が異常である温度依存性変異株の異
常を、相補・回復させる能力のある遺伝子の一つとして
同定されたものであり、RNA ヘリカーゼとして報告され
ているが(Molecular Biology of theCell 7, 1083-109
4,1996) 、DNAヘリカーゼとして働く可能性もある。
【００１８】本発明の遺伝子は、その分裂酵母の cdc28
+ 遺伝子に対応する遺伝子としてヒト組織由来のpoly
(A)+RNA から単離されたものであり、ヘリカーゼ活性を
もたらすタンパク質をコードする遺伝子である。そし
て、本発明の遺伝子は、分裂酵母cdc28+遺伝子と相同性
を有することが明らかにされた。
+ 遺伝子に対応する遺伝子としてヒト組織由来のpoly
(A)+RNA から単離されたものであり、ヘリカーゼ活性を
もたらすタンパク質をコードする遺伝子である。そし
て、本発明の遺伝子は、分裂酵母cdc28+遺伝子と相同性
を有することが明らかにされた。
【００１９】一方、本発明のタンパク質は、図２に示す
ように、アミノ酸レベルではヒトと酵母との間で良く保
存された７つのヘリカーゼ・モチーフを含む。本発明の
ヒト CDC28-#46遺伝子は、図３に示す FISH の結果から
明白なように、ヒト第４染色体短腕、4p15.3に存在する
ことが確認された。
ように、アミノ酸レベルではヒトと酵母との間で良く保
存された７つのヘリカーゼ・モチーフを含む。本発明の
ヒト CDC28-#46遺伝子は、図３に示す FISH の結果から
明白なように、ヒト第４染色体短腕、4p15.3に存在する
ことが確認された。
【００２０】さらに、本発明者らは、サザンブロット解
析により、ヒト CDC28-#46遺伝子はヒトゲノム上でシン
グルコピーとして存在している可能性を明らかにした
(図４）。なお、ヒト CDC28-#46遺伝子に相当する他種
生物由来の遺伝子は、Zoo Blotによる解析結果より、ヒ
ト CDC28-#46遺伝子の塩基配列とホモロジーを有してい
たことから (図４）、公知技術によりクローニングする
ことが可能である。
析により、ヒト CDC28-#46遺伝子はヒトゲノム上でシン
グルコピーとして存在している可能性を明らかにした
(図４）。なお、ヒト CDC28-#46遺伝子に相当する他種
生物由来の遺伝子は、Zoo Blotによる解析結果より、ヒ
ト CDC28-#46遺伝子の塩基配列とホモロジーを有してい
たことから (図４）、公知技術によりクローニングする
ことが可能である。
【００２１】ヒト CDC28-#46遺伝子が各種臓器に於てど
のように発現しているかを調べる多組織 (Multi-Tissu
e) ノーザンブロットによる解析結果 (図５) から、ヒ
ト CDC28-#46遺伝子は、膵臓及び骨格筋において強く発
現し、心臓、脳、胎盤、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵
巣、小腸において中程度に発現し、肺、肝臓、腎臓、大
腸、及び末梢リンパ球においては僅かしか発現していな
いことがわかった。
のように発現しているかを調べる多組織 (Multi-Tissu
e) ノーザンブロットによる解析結果 (図５) から、ヒ
ト CDC28-#46遺伝子は、膵臓及び骨格筋において強く発
現し、心臓、脳、胎盤、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵
巣、小腸において中程度に発現し、肺、肝臓、腎臓、大
腸、及び末梢リンパ球においては僅かしか発現していな
いことがわかった。
【００２２】以上の結果を総合すると、ヒト CDC28-#46
遺伝子は、種を越えて比較的良く保存され (図４）、か
つ、ヒトのさまざまな組織において高い発現が認められ
たことから (図５）、生体の基本的な恒常性の維持に関
わる遺伝子の一つであることが強く示唆される。したが
って、本発明の遺伝子は、ヒトの恒常性維持及び老化と
の関連を解明するための研究に有用であると共に、この
遺伝子の発現制御の解明は、生体の恒常性維持を司るメ
カニズムを解明するうえでも有用であり、また、生命の
基本的な恒常性を維持するための新規医薬品の創製にも
有用である。本発明のヒト CDC28-#46遺伝子は、例えば
以下のようにして同定し取得することができる。
遺伝子は、種を越えて比較的良く保存され (図４）、か
つ、ヒトのさまざまな組織において高い発現が認められ
たことから (図５）、生体の基本的な恒常性の維持に関
わる遺伝子の一つであることが強く示唆される。したが
って、本発明の遺伝子は、ヒトの恒常性維持及び老化と
の関連を解明するための研究に有用であると共に、この
遺伝子の発現制御の解明は、生体の恒常性維持を司るメ
カニズムを解明するうえでも有用であり、また、生命の
基本的な恒常性を維持するための新規医薬品の創製にも
有用である。本発明のヒト CDC28-#46遺伝子は、例えば
以下のようにして同定し取得することができる。
【００２３】Ｉ．ヒト CDC28-#46遺伝子のクローニング ヒト CDC28-#46遺伝子は、Long-distance (LD) PCR法及
びSuppression PCR 法の２つの原理に基づいて RACE [R
apid Amplification of cDNA Ends; Frohman,M.A. et a
l., Methods Enzymol.Vol.218, pp340-358 (1993)]を行
うことにより得ることができる。すなわち、ヒト CDC28
-#46遺伝子は、既知の部分配列を有するＤＮＡ断片、並
びに５’末端及び３’末端を有する配列が未知の DNA
断片を増幅し、さらに、これらの DNA断片の融合によ
り、完全長の cDNA として得ることができる。本発明で
は、完全長の cDNA のクローニングは、例えば市販のキ
ット(MarathonTM cDNA Amplification Kit; CLONETECH
社) を用いて行うことができる。具体的な詳細は〔実施
例１〕に記す。
びSuppression PCR 法の２つの原理に基づいて RACE [R
apid Amplification of cDNA Ends; Frohman,M.A. et a
l., Methods Enzymol.Vol.218, pp340-358 (1993)]を行
うことにより得ることができる。すなわち、ヒト CDC28
-#46遺伝子は、既知の部分配列を有するＤＮＡ断片、並
びに５’末端及び３’末端を有する配列が未知の DNA
断片を増幅し、さらに、これらの DNA断片の融合によ
り、完全長の cDNA として得ることができる。本発明で
は、完全長の cDNA のクローニングは、例えば市販のキ
ット(MarathonTM cDNA Amplification Kit; CLONETECH
社) を用いて行うことができる。具体的な詳細は〔実施
例１〕に記す。
【００２４】図１に、cDNAのクローニングの概要を示
す。まず、ヒト由来の既知配列を有する DNA断片を増幅
する。既知配列は、ヒト精巣由来の poly(A)+ RNA から
得られるものである。すなわち、該 RNAから逆転写酵素
を用いてcDNAを合成し、RT-PCRにより部分cDNA断片を調
製する [図１(1),枠囲み部分]。次に、得られた部分 cD
NA 断片の配列を決定 (確認) した後、該部分 cDNA の
配列を基に４種類の遺伝子特異的プライマー (GSP)を設
計する (5'GSP1及び 5'GSP2 、3'GSP1及び 3'GSP2)。GS
P は、当該部分 cDNA 配列より5'又は3'側の領域に存在
する配列が未知である DNA断片を増幅するために必要と
されるプライマーである。GSP の配列は、当該部分 cDN
A 配列から任意に選択することができ、その配列は化学
合成により得ることができる。本発明では、当該部分 c
DNA よりも 5’側の未知配列を増幅する際に使用するGS
P を 5'GSP1 及び 5'GSP2 とし、当該部分cDNAよりも3'
側の未知配列を増幅する際に使用するGSP を3'GSP1及び
3'GSP2 とする [図１(1) の枠囲み部分]。
す。まず、ヒト由来の既知配列を有する DNA断片を増幅
する。既知配列は、ヒト精巣由来の poly(A)+ RNA から
得られるものである。すなわち、該 RNAから逆転写酵素
を用いてcDNAを合成し、RT-PCRにより部分cDNA断片を調
製する [図１(1),枠囲み部分]。次に、得られた部分 cD
NA 断片の配列を決定 (確認) した後、該部分 cDNA の
配列を基に４種類の遺伝子特異的プライマー (GSP)を設
計する (5'GSP1及び 5'GSP2 、3'GSP1及び 3'GSP2)。GS
P は、当該部分 cDNA 配列より5'又は3'側の領域に存在
する配列が未知である DNA断片を増幅するために必要と
されるプライマーである。GSP の配列は、当該部分 cDN
A 配列から任意に選択することができ、その配列は化学
合成により得ることができる。本発明では、当該部分 c
DNA よりも 5’側の未知配列を増幅する際に使用するGS
P を 5'GSP1 及び 5'GSP2 とし、当該部分cDNAよりも3'
側の未知配列を増幅する際に使用するGSP を3'GSP1及び
3'GSP2 とする [図１(1) の枠囲み部分]。
【００２５】次に、部分 cDNA よりも5'側及び3'側の D
NA断片を増幅する。鋳型としては、市販のヒト心臓又は
胎盤由来のcDNA [例えば、CLONETECH 社の cDNA Ready
TM)]を用いることができる。この鋳型となる DNA断片の
配列は未知であるが、各 DNA断片の末端にはアダプター
配列が付加されている。そこで、アダプター配列にハイ
ブリダイズするプライマー [アダプタープライマー (A
P) という] 及び前記 GSPをプライマーとして用いて、
アダプターが連結された、配列が未知の cDNA 断片の増
幅反応 (LD PCR) を２回行う。例えば、図１(2) の反応
では、まず AP1及び 5'GSP1 を用いて PCRを行い、得ら
れた断片を鋳型として、次は前記 AP1及び5'GSP1 の位
置よりも内側の領域にハイブリダイズすることができる
プライマー(AP2 及び 5'GSP2)を用いて PCRを行う (nes
ted PCR)。図１(3) 及び(4) の反応についても同様であ
る。但し、図１(3) の反応に用いる5'GSP3、5'GSP4、5'
GSP5については、図１(2) の反応で得られた反応産物の
配列を決定した後、当該配列を基に設計される。
NA断片を増幅する。鋳型としては、市販のヒト心臓又は
胎盤由来のcDNA [例えば、CLONETECH 社の cDNA Ready
TM)]を用いることができる。この鋳型となる DNA断片の
配列は未知であるが、各 DNA断片の末端にはアダプター
配列が付加されている。そこで、アダプター配列にハイ
ブリダイズするプライマー [アダプタープライマー (A
P) という] 及び前記 GSPをプライマーとして用いて、
アダプターが連結された、配列が未知の cDNA 断片の増
幅反応 (LD PCR) を２回行う。例えば、図１(2) の反応
では、まず AP1及び 5'GSP1 を用いて PCRを行い、得ら
れた断片を鋳型として、次は前記 AP1及び5'GSP1 の位
置よりも内側の領域にハイブリダイズすることができる
プライマー(AP2 及び 5'GSP2)を用いて PCRを行う (nes
ted PCR)。図１(3) 及び(4) の反応についても同様であ
る。但し、図１(3) の反応に用いる5'GSP3、5'GSP4、5'
GSP5については、図１(2) の反応で得られた反応産物の
配列を決定した後、当該配列を基に設計される。
【００２６】本発明では、既知配列の断片の位置を基準
として、これよりも上流に位置するDNA断片を5'-RACE-1
産物、5'-RACE-2 産物 [それぞれ図１(2) 、(3) の反
応産物] 、既知配列よりも下流に位置する DNA断片を
3'-RACE産物 [図１(4) の反応産物] とする。
として、これよりも上流に位置するDNA断片を5'-RACE-1
産物、5'-RACE-2 産物 [それぞれ図１(2) 、(3) の反
応産物] 、既知配列よりも下流に位置する DNA断片を
3'-RACE産物 [図１(4) の反応産物] とする。
【００２７】なお、APはアダプターの突出末端と同じ配
列を持つため、アダプターにはアニーリングせず、一回
目の増幅では、遺伝子特異的プライマー(GSP) からのみ
伸長し、２回目以降のPCR によって得られる断片であっ
てAPと相補的なアダプターを有する断片のみが増幅する
（これを Suppression PCRという）。
列を持つため、アダプターにはアニーリングせず、一回
目の増幅では、遺伝子特異的プライマー(GSP) からのみ
伸長し、２回目以降のPCR によって得られる断片であっ
てAPと相補的なアダプターを有する断片のみが増幅する
（これを Suppression PCRという）。
【００２８】次に、前記のようにして得られた5'-RACE-
1 産物、5'-RACE-2 産物、既知配列及び 3'-RACE産物の
アセンブリを行う。すなわち、各断片間でオーバーラッ
プしている部分をアニーリングさせる。上記各産物のア
センブリは、キット (cDNA ReadyTM；CLONETECH 社) の
説明書に従って行うことができる。その結果、 5'-及び
3'- 両端を含む完全長の cDNA が得られる [図１(5)]。
1 産物、5'-RACE-2 産物、既知配列及び 3'-RACE産物の
アセンブリを行う。すなわち、各断片間でオーバーラッ
プしている部分をアニーリングさせる。上記各産物のア
センブリは、キット (cDNA ReadyTM；CLONETECH 社) の
説明書に従って行うことができる。その結果、 5'-及び
3'- 両端を含む完全長の cDNA が得られる [図１(5)]。
【００２９】得られた cDNA の塩基配列の決定は、Hatt
ori ら［Electrophoresis 13, pp560-565 (1992)］によ
り記載された PCRをベースにした方法により行う。すな
わち、Perkin Elmer社製の蛍光ダイデオキシターミネー
ターを含有する PRISM Sequenceing Kitを使って反応を
行い、Applied Biosystem 社製のオートシークエンサー
（モデル ABI 373) で塩基配列を読み取り、附属の Mac
intoshコンピューターによりデータの解析を行う。
ori ら［Electrophoresis 13, pp560-565 (1992)］によ
り記載された PCRをベースにした方法により行う。すな
わち、Perkin Elmer社製の蛍光ダイデオキシターミネー
ターを含有する PRISM Sequenceing Kitを使って反応を
行い、Applied Biosystem 社製のオートシークエンサー
（モデル ABI 373) で塩基配列を読み取り、附属の Mac
intoshコンピューターによりデータの解析を行う。
【００３０】なお、前記5'-RACE-1 産物、5'-RACE-2 産
物、既知配列及び 3'-RACE産物についても同様にして塩
基配列を決定し、それぞれヒトCDC28-#46 遺伝子の部分
断片として得ることができる。
物、既知配列及び 3'-RACE産物についても同様にして塩
基配列を決定し、それぞれヒトCDC28-#46 遺伝子の部分
断片として得ることができる。
【００３１】塩基配列が一旦決定されると、その後は、
化学合成によって、又は決定された当該塩基配列から合
成したプライマーを用いた PCR によって、あるいは該
塩基配列を有する DNA 断片をプローブとしてハイブリ
ダイズさせることによって、所望の遺伝子を得ることが
できる。
化学合成によって、又は決定された当該塩基配列から合
成したプライマーを用いた PCR によって、あるいは該
塩基配列を有する DNA 断片をプローブとしてハイブリ
ダイズさせることによって、所望の遺伝子を得ることが
できる。
【００３２】配列番号20に5'-RACE-1 産物、配列番号21
に5'-RACE-2 産物、配列番号19に既知配列、配列番号22
に3'-RACE 産物、並びに配列番号１及び３にヒトCDC28-
#46遺伝子の塩基配列を例示するが、本質的に CDC28-#4
6遺伝子活性を担持する配列であればこの配列に限定さ
れるものではなく、欠失、挿入、置換、付加などによっ
てその塩基配列に変異を導入することが可能である。な
お、変異の導入は、公知の突然変異導入法 (例えば宝酒
造社の TAKARA LA PCR in vitro Mutagenesiskit を用
いた方法) 等により行われる。
に5'-RACE-2 産物、配列番号19に既知配列、配列番号22
に3'-RACE 産物、並びに配列番号１及び３にヒトCDC28-
#46遺伝子の塩基配列を例示するが、本質的に CDC28-#4
6遺伝子活性を担持する配列であればこの配列に限定さ
れるものではなく、欠失、挿入、置換、付加などによっ
てその塩基配列に変異を導入することが可能である。な
お、変異の導入は、公知の突然変異導入法 (例えば宝酒
造社の TAKARA LA PCR in vitro Mutagenesiskit を用
いた方法) 等により行われる。
【００３３】また、本発明の遺伝子によってコードされ
るタンパク質がヘリカーゼ活性を有する限り、当該タン
パク質に含まれるアミノ酸配列に欠失、置換、付加、挿
入等の変異が生じてもよいことを意味する。従って、例
えば配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１番目のメ
チオニン (Met)が欠失しているものなども、このアミノ
酸配列の変化によるタンパク質に含まれる。
るタンパク質がヘリカーゼ活性を有する限り、当該タン
パク質に含まれるアミノ酸配列に欠失、置換、付加、挿
入等の変異が生じてもよいことを意味する。従って、例
えば配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１番目のメ
チオニン (Met)が欠失しているものなども、このアミノ
酸配列の変化によるタンパク質に含まれる。
【００３４】さらに、本発明のタンパク質に含まれるア
ミノ酸をコードする塩基配列のほか、縮重コドンにおい
てのみ異なる同一のタンパク質をコードする縮重異性体
も本発明の遺伝子に含まれる。
ミノ酸をコードする塩基配列のほか、縮重コドンにおい
てのみ異なる同一のタンパク質をコードする縮重異性体
も本発明の遺伝子に含まれる。
【００３５】II. cDNAクローンのスクリーニング (1) プローブDNAの作製 cDNAライブラリーの中から目的のcDNAクローンをスクリ
ーニングするため、プローブを作製する。ここで、プロ
ーブとして使用するDNA 断片は、RT-PCR法により得られ
た437bp の断片（配列番号１又は３で表される塩基配列
の第284 〜第720 番の配列）である。この断片をPCR に
より増幅させ、又はバクテリアプラスミド中へ挿入して
大腸菌内で増幅させた後、純粋な単一 DNA鎖として精製
する。これら一連の方法は、Sambrookら［Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1989)］の記載に従い行う。
得られた DNA断片をランダムヘキサマー法又は PCR法に
より [32P]でラベルする。
ーニングするため、プローブを作製する。ここで、プロ
ーブとして使用するDNA 断片は、RT-PCR法により得られ
た437bp の断片（配列番号１又は３で表される塩基配列
の第284 〜第720 番の配列）である。この断片をPCR に
より増幅させ、又はバクテリアプラスミド中へ挿入して
大腸菌内で増幅させた後、純粋な単一 DNA鎖として精製
する。これら一連の方法は、Sambrookら［Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1989)］の記載に従い行う。
得られた DNA断片をランダムヘキサマー法又は PCR法に
より [32P]でラベルする。
【００３６】(2) λgt 11 ライブラリーからのスクリー
ニング λファージをベクターとするライブラリーは、保持でき
る cDNA の鎖長が最大20Kbpと大きいこと、またサイズ
による挿入効率の偏向が少ないことから、あらゆる種類
の cDNA を効率良く保持していると考えられている。ま
た、スクリーニングに際して、数多くのファージクロー
ンを比較的小さなナイロン膜上に固定できるので少ない
スクリーニング回数で多くのファージクローンを調べる
ことができるという利点がある。前記方法により調製さ
れた cDNA 断片を、[32P] で標識後それをプローブとし
て、λファージライブラリーのスクリーニングを行う。
具体的な詳細は〔実施例２〕に記す。
ニング λファージをベクターとするライブラリーは、保持でき
る cDNA の鎖長が最大20Kbpと大きいこと、またサイズ
による挿入効率の偏向が少ないことから、あらゆる種類
の cDNA を効率良く保持していると考えられている。ま
た、スクリーニングに際して、数多くのファージクロー
ンを比較的小さなナイロン膜上に固定できるので少ない
スクリーニング回数で多くのファージクローンを調べる
ことができるという利点がある。前記方法により調製さ
れた cDNA 断片を、[32P] で標識後それをプローブとし
て、λファージライブラリーのスクリーニングを行う。
具体的な詳細は〔実施例２〕に記す。
【００３７】III. P1 DNA を用いた Dual-color FISH
解析 本発明では、ヒト CDC28-#46遺伝子の染色体上の存在位
置を確認することを目的として、前記クローニングによ
り得られた cDNA を含む P1 DNA を用いた Dual-color
FISH解析が行われる。 FISH (Fluorescence in situ hy
bridization)とは、細胞核に蛍光標識をした DNAプロー
ブをハイブリダイズさせ、細胞核上でその DNAの位置を
目に見える形で検出する方法である。
解析 本発明では、ヒト CDC28-#46遺伝子の染色体上の存在位
置を確認することを目的として、前記クローニングによ
り得られた cDNA を含む P1 DNA を用いた Dual-color
FISH解析が行われる。 FISH (Fluorescence in situ hy
bridization)とは、細胞核に蛍光標識をした DNAプロー
ブをハイブリダイズさせ、細胞核上でその DNAの位置を
目に見える形で検出する方法である。
【００３８】標本としては、分裂間期又は染色体がはっ
きり見える分裂中期の細胞が用いられる。分裂中期の細
胞は次の手順で得ることができる。ヒト末梢リンパ球細
胞をフィトヘムアグルチニン (PHA)で刺激して細胞分裂
を促進し、コルセミドを用いて分裂中期で分裂を停止さ
せる。細胞は酢酸／メタノール溶液で固定した後に、ス
ライドグラスの上に広げる。スライドグラス上の標本
は、ホルムアミド及び SSC [Standard Saline Citrate;
0.15M NaCl, 0.015M Sodium Citrate (pH 7.0)]により
変性させる。次に、ジゴキシゲニン又はビオチンで標識
した DNAプローブを反応させると、この標識 DNAは標本
とハイブリダイズする。次に、ロダミン標識した抗ジゴ
キシゲニン抗体又は FITC-標識アビジンなどで処理して
蛍光標識すると、DNA プローブがハイブリダイズした位
置を、ロダミンについては赤色、FITCについては緑色の
シグナルとして見ることができる。具体的な詳細は〔実
施例３〕に記す。
きり見える分裂中期の細胞が用いられる。分裂中期の細
胞は次の手順で得ることができる。ヒト末梢リンパ球細
胞をフィトヘムアグルチニン (PHA)で刺激して細胞分裂
を促進し、コルセミドを用いて分裂中期で分裂を停止さ
せる。細胞は酢酸／メタノール溶液で固定した後に、ス
ライドグラスの上に広げる。スライドグラス上の標本
は、ホルムアミド及び SSC [Standard Saline Citrate;
0.15M NaCl, 0.015M Sodium Citrate (pH 7.0)]により
変性させる。次に、ジゴキシゲニン又はビオチンで標識
した DNAプローブを反応させると、この標識 DNAは標本
とハイブリダイズする。次に、ロダミン標識した抗ジゴ
キシゲニン抗体又は FITC-標識アビジンなどで処理して
蛍光標識すると、DNA プローブがハイブリダイズした位
置を、ロダミンについては赤色、FITCについては緑色の
シグナルとして見ることができる。具体的な詳細は〔実
施例３〕に記す。
【００３９】IV. cDNA クローンの解析 (1) サザンブロットによる解析 サザンブロットとは、制限酵素などによって切断した D
NA断片の中から目的とする遺伝子を検出する手法であ
る。まず、DNA 断片をアガロース・ゲルの電気泳動でサ
イズの違いに従い分離する。次に、アルカリ及び塩によ
って DNAを変性させ、ニトロセルロース・フィルターに
移す。このフィルターを [32P]で標識したプローブとハ
イブリダイズさせ、フィルターをオートラジオグラフィ
ーにかける。その結果、ハイブリダイズした DNA断片が
検出される。この方法を用いることで、遺伝子数 (コピ
ー数）、ファミリーの存在等を知ることができる。プロ
ーブとしては、配列番号１又は３で示す完全長 cDNA 又
はその少なくとも一部を含む断片 (オリゴヌクレオチ
ド) が用いられる。具体的な詳細は〔実施例４〕に記
す。
NA断片の中から目的とする遺伝子を検出する手法であ
る。まず、DNA 断片をアガロース・ゲルの電気泳動でサ
イズの違いに従い分離する。次に、アルカリ及び塩によ
って DNAを変性させ、ニトロセルロース・フィルターに
移す。このフィルターを [32P]で標識したプローブとハ
イブリダイズさせ、フィルターをオートラジオグラフィ
ーにかける。その結果、ハイブリダイズした DNA断片が
検出される。この方法を用いることで、遺伝子数 (コピ
ー数）、ファミリーの存在等を知ることができる。プロ
ーブとしては、配列番号１又は３で示す完全長 cDNA 又
はその少なくとも一部を含む断片 (オリゴヌクレオチ
ド) が用いられる。具体的な詳細は〔実施例４〕に記
す。
【００４０】(2) ノーザンブロットによる解析 ノーザンブロットとは、RNA の混合物の中から特定の R
NAを検出するための手法であり、また、目的の RNAのサ
イズ及び量を検出することを目的として使用される手法
である。細胞又は組織からの RNAの抽出は、例えば高濃
度グアニジンチオシアネートを用いて行い、フェノール
／クロロフォルムで除蛋白したのち、アルコール沈殿で
RNAを精製する。アガロースゲル電気泳動により、RNA
をサイズの違いで分画し、アルカリ及び塩により変性さ
せる。次に、 RNAをニトロセルロース・フィルターに移
し、[32P] でラベルした cDNA プローブとハイブリダイ
ズさせる。そして、オートラジオグラフィーで感光さ
せ、プローブとハイブリダイズした目的の RNAを検出す
る。この方法により、プローブに用いた cDNA の配列に
対応する mRNA が検出され、かつ、目的の遺伝子の完全
長のサイズ及び相対的発現量を知ることができる。プロ
ーブとしては、例えば Marathon cDNA Kit を用いて得
られた完全長 cDNA の一部であるC 端側の ORF (open r
eading frame)のＣ端側を3'-UT を含む308bp の断片
（配列番号１又は３で表される塩基配列の第2475〜第27
82番の配列) が用いられる。具体的な詳細は〔実施例
５〕に記す。
NAを検出するための手法であり、また、目的の RNAのサ
イズ及び量を検出することを目的として使用される手法
である。細胞又は組織からの RNAの抽出は、例えば高濃
度グアニジンチオシアネートを用いて行い、フェノール
／クロロフォルムで除蛋白したのち、アルコール沈殿で
RNAを精製する。アガロースゲル電気泳動により、RNA
をサイズの違いで分画し、アルカリ及び塩により変性さ
せる。次に、 RNAをニトロセルロース・フィルターに移
し、[32P] でラベルした cDNA プローブとハイブリダイ
ズさせる。そして、オートラジオグラフィーで感光さ
せ、プローブとハイブリダイズした目的の RNAを検出す
る。この方法により、プローブに用いた cDNA の配列に
対応する mRNA が検出され、かつ、目的の遺伝子の完全
長のサイズ及び相対的発現量を知ることができる。プロ
ーブとしては、例えば Marathon cDNA Kit を用いて得
られた完全長 cDNA の一部であるC 端側の ORF (open r
eading frame)のＣ端側を3'-UT を含む308bp の断片
（配列番号１又は３で表される塩基配列の第2475〜第27
82番の配列) が用いられる。具体的な詳細は〔実施例
５〕に記す。
【００４１】V. 形質転換体の作製 本発明の形質転換体は、本発明の組換え体 DNAを、該組
換え体 DNAを作製する際に用いた発現ベクターに適合す
る宿主中に導入することにより得られる。
換え体 DNAを作製する際に用いた発現ベクターに適合す
る宿主中に導入することにより得られる。
【００４２】精製された遺伝子を、適当なベクター DNA
の制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入し
て組換え体 DNAを作製し、当該組換え体 DNAを用いて、
宿主細胞を形質転換する。
の制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入し
て組換え体 DNAを作製し、当該組換え体 DNAを用いて、
宿主細胞を形質転換する。
【００４３】DNA 断片を挿入するためのベクター DNA
は、宿主細胞で複製可能なものであれば特に限定され
ず、例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げら
れる。プラスミド DNAとしては、例えばプラスミドpUC1
18（宝酒造社製）、pUC119 (宝酒造社製）、pBluescrip
t SK+ (Stratagene 社製）、pGEM-T (Promega 社製) 等
が挙げられ、ファージ DNAとしては、例えば M13mp18、
M13mp19 等が挙げられる。
は、宿主細胞で複製可能なものであれば特に限定され
ず、例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げら
れる。プラスミド DNAとしては、例えばプラスミドpUC1
18（宝酒造社製）、pUC119 (宝酒造社製）、pBluescrip
t SK+ (Stratagene 社製）、pGEM-T (Promega 社製) 等
が挙げられ、ファージ DNAとしては、例えば M13mp18、
M13mp19 等が挙げられる。
【００４４】宿主としては、目的とする遺伝子を発現で
きるものであれば特に限定されず、真核細胞及び原核細
胞のいずれをも用いることができる。例えば、大腸菌
(Escherichia coli))、バチルス・ズブチリス (Bacillu
s subtilis)等の細菌、サッカロミセス・セレビシエ (S
accharomyces cerevisiae) 等の酵母、COS 細胞、ＣＨ
Ｏ細胞等の動物細胞などが挙げられる。
きるものであれば特に限定されず、真核細胞及び原核細
胞のいずれをも用いることができる。例えば、大腸菌
(Escherichia coli))、バチルス・ズブチリス (Bacillu
s subtilis)等の細菌、サッカロミセス・セレビシエ (S
accharomyces cerevisiae) 等の酵母、COS 細胞、ＣＨ
Ｏ細胞等の動物細胞などが挙げられる。
【００４５】大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合
は、本発明の組換え体 ＤＮＡが該宿主中で自立複製可
能であると同時に、プロモーター、本発明の DNA、転写
終結配列を含む構成であることが好ましい。例えば、大
腸菌としては XL1-Blue (Stratagene 社製）、JM109(宝
酒造社製) 等が挙げられ、発現ベクターとしては、例え
ば pBTrp2 等が挙げられる。プロモーターとしては、大
腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用い
てもよい。例えば、trp プロモーター、lac プロモータ
ー、PL プロロモーター、PR プロモーターなどの大腸菌
やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。
は、本発明の組換え体 ＤＮＡが該宿主中で自立複製可
能であると同時に、プロモーター、本発明の DNA、転写
終結配列を含む構成であることが好ましい。例えば、大
腸菌としては XL1-Blue (Stratagene 社製）、JM109(宝
酒造社製) 等が挙げられ、発現ベクターとしては、例え
ば pBTrp2 等が挙げられる。プロモーターとしては、大
腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用い
てもよい。例えば、trp プロモーター、lac プロモータ
ー、PL プロロモーター、PR プロモーターなどの大腸菌
やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。
【００４６】本発明では、形質転換は、例えばHanahan
の方法[Techniques for Transformation of E. coli In
DNA Cloning, vol.1, Glover,D.M. (ed.), pp109-136,
IRLPress (1985)]により行うことができる。
の方法[Techniques for Transformation of E. coli In
DNA Cloning, vol.1, Glover,D.M. (ed.), pp109-136,
IRLPress (1985)]により行うことができる。
【００４７】酵母を宿主として用いる場合は、発現ベク
ターとして、例えば YEp13、YCp50等が挙げられる。プ
ロモーターとしては、例えば gal 1プロモーター、gal
10プロモーター等が挙げられる。酵母への組換え体 DNA
の導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法
[Methods. Enzymol., 194, pp182-187 (1990)]、スフ
ェロプラスト法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, pp
1929-1933 (1978)]、酢酸リチウム法 [J. Bacteriol.,
153, 163-168 (1983)] 等が挙げられる。
ターとして、例えば YEp13、YCp50等が挙げられる。プ
ロモーターとしては、例えば gal 1プロモーター、gal
10プロモーター等が挙げられる。酵母への組換え体 DNA
の導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法
[Methods. Enzymol., 194, pp182-187 (1990)]、スフ
ェロプラスト法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, pp
1929-1933 (1978)]、酢酸リチウム法 [J. Bacteriol.,
153, 163-168 (1983)] 等が挙げられる。
【００４８】動物細胞を宿主として用いる場合は、発現
ベクターとして例えば pcDNAI、pcDNAI/Amp (インビト
ロジェン社) 等が用いられる。動物細胞への組換え体 D
NAの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション
法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。
ベクターとして例えば pcDNAI、pcDNAI/Amp (インビト
ロジェン社) 等が用いられる。動物細胞への組換え体 D
NAの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション
法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。
【００４９】ベクター DNAとしてプラスミド DNAを用い
る場合、例えば EcoRI DNA断片を挿入する際、プラスミ
ド DNAを制限酵素 EcoRI (NEB 社製) を用いて消化して
おく。次いで、DNA 断片と切断されたベクター DNAとを
混合し、これに、例えば T4DNA リガーゼ (宝酒造社製)
を作用させて組換え体 DNAを得る。
る場合、例えば EcoRI DNA断片を挿入する際、プラスミ
ド DNAを制限酵素 EcoRI (NEB 社製) を用いて消化して
おく。次いで、DNA 断片と切断されたベクター DNAとを
混合し、これに、例えば T4DNA リガーゼ (宝酒造社製)
を作用させて組換え体 DNAを得る。
【００５０】上記形質転換株のスクリーニングは、目的
遺伝子の一部を含む DNA断片をプローブとしたコロニー
ハイブリダイゼーション、あるいは、目的の遺伝子の塩
基配列に基づいた 5' プライマー (FP; forward prime
r) を合成し、次いで、相補鎖DNAの塩基配列に基づいた
3' プライマー (RP; reverse primer) を合成し、これ
らのプライマーを用いた PCR法により、目的とする遺伝
子を含むコロニーを選択することができる。
遺伝子の一部を含む DNA断片をプローブとしたコロニー
ハイブリダイゼーション、あるいは、目的の遺伝子の塩
基配列に基づいた 5' プライマー (FP; forward prime
r) を合成し、次いで、相補鎖DNAの塩基配列に基づいた
3' プライマー (RP; reverse primer) を合成し、これ
らのプライマーを用いた PCR法により、目的とする遺伝
子を含むコロニーを選択することができる。
【００５１】VI. ヒト CDC28-#46遺伝子がコードするポ
リペプチドの生産 前記のようにして得られた組換え体 DNAを保有する形質
転換体を培養すれば、本発明の遺伝子がコードするポリ
ペプチドを生産することができる。培養方法は、通常の
固体培養法でもよいが、液体培養法を採用することが好
ましい。
リペプチドの生産 前記のようにして得られた組換え体 DNAを保有する形質
転換体を培養すれば、本発明の遺伝子がコードするポリ
ペプチドを生産することができる。培養方法は、通常の
固体培養法でもよいが、液体培養法を採用することが好
ましい。
【００５２】形質転換体を培養する培地としては、例え
ば酵母エキス、ペプトン、肉エキス等から選ばれる１種
以上の窒素源に、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化第二鉄等の無機塩類の１種以上を添加し、更
に必要により糖質原料、抗生物質、ビタミン等を適宜添
加したものが用いられる。また、必要により培地に IPT
G 等を添加して、遺伝子の発現を誘導してもよい。培養
開始時の培地の pH は7.2〜7.4 に調節し、培養は通常3
6〜38℃、好ましくは37℃前後で14〜20時間、通気撹拌
培養、振盪培養等により行う。
ば酵母エキス、ペプトン、肉エキス等から選ばれる１種
以上の窒素源に、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化第二鉄等の無機塩類の１種以上を添加し、更
に必要により糖質原料、抗生物質、ビタミン等を適宜添
加したものが用いられる。また、必要により培地に IPT
G 等を添加して、遺伝子の発現を誘導してもよい。培養
開始時の培地の pH は7.2〜7.4 に調節し、培養は通常3
6〜38℃、好ましくは37℃前後で14〜20時間、通気撹拌
培養、振盪培養等により行う。
【００５３】培養終了後、培養物より本発明のポリペプ
チドを採取するには、通常のタンパク質精製手段を用い
ることができる。すなわち、リゾチーム等の酵素を用い
た溶菌処理、超音波破砕処理、磨砕処理等により菌体を
破壊し、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを菌
体外に排出させる。次いで、濾過又は遠心分離等を用い
て不溶物を除去し、粗ポリペプチド溶液を得る。
チドを採取するには、通常のタンパク質精製手段を用い
ることができる。すなわち、リゾチーム等の酵素を用い
た溶菌処理、超音波破砕処理、磨砕処理等により菌体を
破壊し、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを菌
体外に排出させる。次いで、濾過又は遠心分離等を用い
て不溶物を除去し、粗ポリペプチド溶液を得る。
【００５４】上記粗ポリペプチド溶液から該ポリペプチ
ドをさらに精製するには、通常のタンパク質精製法を使
用することができる。例えば、硫安塩析法、イオン交換
クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ
過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、電気泳動法等を、単独又は適宜組み合わせること
により行う。
ドをさらに精製するには、通常のタンパク質精製法を使
用することができる。例えば、硫安塩析法、イオン交換
クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ
過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、電気泳動法等を、単独又は適宜組み合わせること
により行う。
【００５５】VII. モノクローナル抗体の作製 本発明のヒト CDC28-#46遺伝子がコードするポリペプチ
ドに特異的なモノクローナル抗体は、以下のようにして
得ることができる。 (1) 抗原の調製 前記の方法 (VI) により得られたポリペプチドを緩衝液
に溶解し、次いでアジュバントを添加する。アジュバン
トとしては、市販のフロイント完全アジュバント、フロ
イントの不完全アジュバント等が挙げられ、これらの何
れのものを混合してもよい。
ドに特異的なモノクローナル抗体は、以下のようにして
得ることができる。 (1) 抗原の調製 前記の方法 (VI) により得られたポリペプチドを緩衝液
に溶解し、次いでアジュバントを添加する。アジュバン
トとしては、市販のフロイント完全アジュバント、フロ
イントの不完全アジュバント等が挙げられ、これらの何
れのものを混合してもよい。
【００５６】(2) 免疫及び抗体産生細胞の採取 上記のようにして得られた免疫原を哺乳動物、例えばラ
ット、マウスなどに投与する。抗原の免疫量は１回に動
物１匹当たり、10〜500μg 用いる。免疫部位は、主と
して静脈内、皮下、腹腔内に注入する。また、免疫の間
隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましく
は１〜３週間間隔で、２〜５回、好ましくは３〜４回免
疫する。最終の免疫日から２〜７日後、好ましくは４〜
５日後に、抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞とし
ては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げら
れるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
ット、マウスなどに投与する。抗原の免疫量は１回に動
物１匹当たり、10〜500μg 用いる。免疫部位は、主と
して静脈内、皮下、腹腔内に注入する。また、免疫の間
隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましく
は１〜３週間間隔で、２〜５回、好ましくは３〜４回免
疫する。最終の免疫日から２〜７日後、好ましくは４〜
５日後に、抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞とし
ては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げら
れるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
【００５７】(3) 細胞融合 抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウ
スなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用する。
使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の
状態では選択培地 (HAT 培地：ヒポキサンチン、アミノ
プテリン、チミンを含む) で生存できず、抗体産生細胞
と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好
ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、P3U-1(大日
本製薬社製）、P3x63Ag8.653などのマウスミエローマ細
胞株が挙げられる。次に、上記ミエローマ細胞と抗体産
生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まな
いDMEM、RPMI-1640 培地などの動物細胞培養用培地中
で、108 細胞/ml の抗体産生細胞と２×105 細胞/ml の
ミエローマ細胞とを等容量混合し、融合促進剤存在のも
とで融合反応を行う。細胞融合を促進させるためには、
平均分子量 1,500ダルトンのポリエチレングリコール等
を使用することができる。また、電気刺激 (例えばエレ
クトロポレーション) を利用した市販の細胞融合装置を
用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させるこ
ともできる。
スなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用する。
使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の
状態では選択培地 (HAT 培地：ヒポキサンチン、アミノ
プテリン、チミンを含む) で生存できず、抗体産生細胞
と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好
ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、P3U-1(大日
本製薬社製）、P3x63Ag8.653などのマウスミエローマ細
胞株が挙げられる。次に、上記ミエローマ細胞と抗体産
生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まな
いDMEM、RPMI-1640 培地などの動物細胞培養用培地中
で、108 細胞/ml の抗体産生細胞と２×105 細胞/ml の
ミエローマ細胞とを等容量混合し、融合促進剤存在のも
とで融合反応を行う。細胞融合を促進させるためには、
平均分子量 1,500ダルトンのポリエチレングリコール等
を使用することができる。また、電気刺激 (例えばエレ
クトロポレーション) を利用した市販の細胞融合装置を
用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させるこ
ともできる。
【００５８】(4) ハイブリドーマの選択及びクローニン
グ 細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを
選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎
児血清含有 RPMI-1640培地などで適当に希釈後、マイク
ロタイタープレート上に５〜10細胞／ウェル程度まき、
各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換
して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、約
14日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして
得ることができる。
グ 細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを
選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎
児血清含有 RPMI-1640培地などで適当に希釈後、マイク
ロタイタープレート上に５〜10細胞／ウェル程度まき、
各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換
して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、約
14日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして
得ることができる。
【００５９】増殖してきたハイブリドーマの培養上清中
に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニング
する。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法
に従えばよく、特に限定されない。例えば、ハイブリド
ーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を
採集し、酵素免疫測定法 (EIA; enzyme immuno assa
y）、RIA (radio immuno assay) 等によって行うことが
できる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等によ
り行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハ
イブリドーマを樹立する。
に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニング
する。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法
に従えばよく、特に限定されない。例えば、ハイブリド
ーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を
採集し、酵素免疫測定法 (EIA; enzyme immuno assa
y）、RIA (radio immuno assay) 等によって行うことが
できる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等によ
り行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハ
イブリドーマを樹立する。
【００６０】(5) モノクローナル抗体の採取 樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取
する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等が
採用できる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを
10％ウシ胎児血清含有 RPMI-1640培地、MEM 培地又は無
血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件
(例えば37℃，５％CO2 濃度) で10〜14日間培養し、そ
の培養上清から抗体を取得することができる。腹水形成
法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動
物の腹腔内にハイブリドーマを約５×106 個投与し、ハ
イブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間
後に腹水または血清を採集する。上記抗体の採取方法に
おいて、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析
法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーなどの公知
の方法を適宜に選択して、又はこれらを組み合わせるこ
とにより精製することができる。
する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等が
採用できる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを
10％ウシ胎児血清含有 RPMI-1640培地、MEM 培地又は無
血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件
(例えば37℃，５％CO2 濃度) で10〜14日間培養し、そ
の培養上清から抗体を取得することができる。腹水形成
法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動
物の腹腔内にハイブリドーマを約５×106 個投与し、ハ
イブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間
後に腹水または血清を採集する。上記抗体の採取方法に
おいて、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析
法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーなどの公知
の方法を適宜に選択して、又はこれらを組み合わせるこ
とにより精製することができる。
【００６１】VIII. ポリクローナル抗体の作製 (1) 抗原の調製 前記の方法 (VI) により得られたポリペプチドを緩衝液
に溶解し、次いでアジュバントを添加する。アジュバン
トとしては市販のフロイント完全アジュバント、フロイ
ント不完全アジュバントを用いる。
に溶解し、次いでアジュバントを添加する。アジュバン
トとしては市販のフロイント完全アジュバント、フロイ
ント不完全アジュバントを用いる。
【００６２】(2) 免疫 免疫のために使用される動物には、通常、ウサギ、モル
モット、ヤギ、ヒツジなどが用いられる。ウサギを例に
とると、ウサギの足蹠に、通常 100μg から 500μg の
ポリペプチドをフロイント完全アジュバントとともに皮
下注射する。二週間後に同量の抗原をフロイント不完全
アジュバントと混合して筋肉内注射をする。さらに二週
間後に筋肉内注射を繰り返し、最終免疫の一週間後に耳
より部分採血して EIA法等により抗体価を測定する。抗
体価が目的の値に達していれば全採血し、抗体価が低け
れば筋肉内注射を繰り返し、抗体価が目的の値に達する
まで免疫を繰り返す。血清から硫安分画による抗体の精
製は、モノクローナル抗体の項 (VII)で述べた方法を採
用できる。
モット、ヤギ、ヒツジなどが用いられる。ウサギを例に
とると、ウサギの足蹠に、通常 100μg から 500μg の
ポリペプチドをフロイント完全アジュバントとともに皮
下注射する。二週間後に同量の抗原をフロイント不完全
アジュバントと混合して筋肉内注射をする。さらに二週
間後に筋肉内注射を繰り返し、最終免疫の一週間後に耳
より部分採血して EIA法等により抗体価を測定する。抗
体価が目的の値に達していれば全採血し、抗体価が低け
れば筋肉内注射を繰り返し、抗体価が目的の値に達する
まで免疫を繰り返す。血清から硫安分画による抗体の精
製は、モノクローナル抗体の項 (VII)で述べた方法を採
用できる。
【００６３】IX. ヒト CDC28-#46遺伝子及びその遺伝子
がコードするポリペプチドの検出用試薬 本発明のヒト CDC28-#46遺伝子は、種を越えて比較的良
く保存され (図４）、かつ、ヒトのさまざまな組織にお
いて高い発現が認められたことから (図５）、生体の基
本的な恒常性の維持に関わる RNAヘリカーゼをコードし
ている遺伝子の一つであり、この遺伝子の発現制御の解
明は、生体の恒常性維持を司るメカニズムを解明するう
えで有用である。また、本発明の遺伝子は、生体の基本
的な恒常性を維持するための新規医薬品の創製にも有用
であると共に、老化との関連を解明するための研究にも
有用である。
がコードするポリペプチドの検出用試薬 本発明のヒト CDC28-#46遺伝子は、種を越えて比較的良
く保存され (図４）、かつ、ヒトのさまざまな組織にお
いて高い発現が認められたことから (図５）、生体の基
本的な恒常性の維持に関わる RNAヘリカーゼをコードし
ている遺伝子の一つであり、この遺伝子の発現制御の解
明は、生体の恒常性維持を司るメカニズムを解明するう
えで有用である。また、本発明の遺伝子は、生体の基本
的な恒常性を維持するための新規医薬品の創製にも有用
であると共に、老化との関連を解明するための研究にも
有用である。
【００６４】本発明の遺伝子を検出用試薬として使用す
る場合は、クローニングされたヒトCDC28-#46遺伝子の
少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドをプローブ
としてハイブリダイセーションを行い、サザン又はノー
ザンブロット法により検出が行われる。なお、オリゴヌ
クレオチドプローブとしては、DNA プローブ、RNA プロ
ーブ等が挙げられる。
る場合は、クローニングされたヒトCDC28-#46遺伝子の
少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドをプローブ
としてハイブリダイセーションを行い、サザン又はノー
ザンブロット法により検出が行われる。なお、オリゴヌ
クレオチドプローブとしては、DNA プローブ、RNA プロ
ーブ等が挙げられる。
【００６５】また、本発明の遺伝子がコードするポリペ
プチドに対するポリクローナル抗体又はモノクローナル
抗体を検出用試薬として使用する場合は、EIA、RIA 又
はウエスタンブロット解析により検出が行われる。
プチドに対するポリクローナル抗体又はモノクローナル
抗体を検出用試薬として使用する場合は、EIA、RIA 又
はウエスタンブロット解析により検出が行われる。
【００６６】X. 遺伝子の発現レベルを上昇又は下降す
るように修飾された遺伝子が導入されたトランスジェニ
ック動物 本発明においては、遺伝子の発現を正常に調節している
いくつかの重要な部位(エンハンサー、プロモーター、
イントロン等) の一部に欠失、置換、挿入等の変異を起
こさせることにより、本来の遺伝子の発現レベルと比較
して人工的に上昇又は下降するように修飾することがで
きる。
るように修飾された遺伝子が導入されたトランスジェニ
ック動物 本発明においては、遺伝子の発現を正常に調節している
いくつかの重要な部位(エンハンサー、プロモーター、
イントロン等) の一部に欠失、置換、挿入等の変異を起
こさせることにより、本来の遺伝子の発現レベルと比較
して人工的に上昇又は下降するように修飾することがで
きる。
【００６７】上記変異の導入は、公知のいずれかの手法
により行うことができ、例えば、点突然変異導入キット
(例えば宝酒造社の TAKARA LA PCR in vitro Mutagene
siskit)等を用いることができる。トランスジェニック
動物としては、例えばトランスジェニックマウス、トラ
ンスジェニックラット等が挙げられる。
により行うことができ、例えば、点突然変異導入キット
(例えば宝酒造社の TAKARA LA PCR in vitro Mutagene
siskit)等を用いることができる。トランスジェニック
動物としては、例えばトランスジェニックマウス、トラ
ンスジェニックラット等が挙げられる。
【００６８】前記変異を導入した遺伝子を保有するベク
ターとしては、ヒト CDC28-#46遺伝子を過剰発現させる
ようなベクター、逆にその発現を抑制するようなアンチ
センスのベクターの二つが考えられる。いずれの場合に
も、遺伝子の選択のためのポジティブ選別用の薬剤 (例
えば、ネオマイシンなど) 耐性遺伝子を連結させてお
く。
ターとしては、ヒト CDC28-#46遺伝子を過剰発現させる
ようなベクター、逆にその発現を抑制するようなアンチ
センスのベクターの二つが考えられる。いずれの場合に
も、遺伝子の選択のためのポジティブ選別用の薬剤 (例
えば、ネオマイシンなど) 耐性遺伝子を連結させてお
く。
【００６９】細胞への遺伝子の挿入は、受精卵に直接 D
NAを注入する方法も使用し得るが、ES細胞（胚性幹細
胞:embrionic stem cell) は、培養が可能でしかもこの
細胞からマウス等を発生させることができるという利点
を有しているため、各種ES細胞を用いる方法がより効率
的で好ましい。ES細胞としては、例えば TT2細胞が挙げ
られる (相沢慎一，ジーンターゲッティング，1995年，
羊土社)。ヒト CDC28-#46遺伝子を含む上記ベクター DN
AをエレクトロポレーションによりES細胞へ導入し、ネ
オマイシンでポジティブ選別し、目的の変異ES細胞を得
る。
NAを注入する方法も使用し得るが、ES細胞（胚性幹細
胞:embrionic stem cell) は、培養が可能でしかもこの
細胞からマウス等を発生させることができるという利点
を有しているため、各種ES細胞を用いる方法がより効率
的で好ましい。ES細胞としては、例えば TT2細胞が挙げ
られる (相沢慎一，ジーンターゲッティング，1995年，
羊土社)。ヒト CDC28-#46遺伝子を含む上記ベクター DN
AをエレクトロポレーションによりES細胞へ導入し、ネ
オマイシンでポジティブ選別し、目的の変異ES細胞を得
る。
【００７０】上記ES細胞を、胚胎盤胞又は８細胞期胚に
毛細管等を用いて注入する。その後、胚胎盤胞又は８細
胞期胚を直接仮親の卵管に移植するか、一日培養して胚
盤胞まで発生したものを仮親の子宮に移植する。仮親か
ら生まれた子のうちキメラ動物を選ぶ。キメラの寄与率
が高い動物は、生殖系列の可能性が高いが、キメラ動物
を正常動物と交配することにより、生殖系列のキメラ動
物であることの確認が可能である。生殖系列のキメラ動
物と正常動物との交配により、ヘテロ接合体動物が得ら
れ、ヘテロ接合体同士の交配によりホモ接合体動物を得
ることができる。
毛細管等を用いて注入する。その後、胚胎盤胞又は８細
胞期胚を直接仮親の卵管に移植するか、一日培養して胚
盤胞まで発生したものを仮親の子宮に移植する。仮親か
ら生まれた子のうちキメラ動物を選ぶ。キメラの寄与率
が高い動物は、生殖系列の可能性が高いが、キメラ動物
を正常動物と交配することにより、生殖系列のキメラ動
物であることの確認が可能である。生殖系列のキメラ動
物と正常動物との交配により、ヘテロ接合体動物が得ら
れ、ヘテロ接合体同士の交配によりホモ接合体動物を得
ることができる。
【００７１】XI. ノックアウトマウス 本発明のノックアウトマウスは、ヒト CDC28-#46遺伝子
の機能が失われるように処理されたものである。その処
理方法について説明する。
の機能が失われるように処理されたものである。その処
理方法について説明する。
【００７２】ヒト CDC28-#46遺伝子を含むゲノム DNAを
PCR又はゲノムライブラリーより得、そのいずれかのエ
クソンの中に neo耐性遺伝子を挿入したベクターを構築
する。この操作により、このエクソンの機能は破壊され
る。これと同時に、このベクターの中にネガティブ選別
用のチミジンキナーゼ (tk) 遺伝子又はジフテリア(DT)
毒素遺伝子を繋げておく。エレクトロポレーションによ
り該ベクター DNAをES細胞に導入する。次に、この細胞
をポジティブ選別用のネオマイシン及びネガティブ選別
用の核酸類似体 FIAU (fluoroiodoadenosyluracil)、又
はジフテリア毒素の存在下で培養する。この操作により
非相同組換えを起こしたジフテリア毒素感受性細胞、及
び組換えを全く起こさないG418感受性細胞が除去され、
相同組換えを起こした細胞のみが残る。この細胞では、
破壊されたエクソンを含む遺伝子がノックアウトされ
る。
PCR又はゲノムライブラリーより得、そのいずれかのエ
クソンの中に neo耐性遺伝子を挿入したベクターを構築
する。この操作により、このエクソンの機能は破壊され
る。これと同時に、このベクターの中にネガティブ選別
用のチミジンキナーゼ (tk) 遺伝子又はジフテリア(DT)
毒素遺伝子を繋げておく。エレクトロポレーションによ
り該ベクター DNAをES細胞に導入する。次に、この細胞
をポジティブ選別用のネオマイシン及びネガティブ選別
用の核酸類似体 FIAU (fluoroiodoadenosyluracil)、又
はジフテリア毒素の存在下で培養する。この操作により
非相同組換えを起こしたジフテリア毒素感受性細胞、及
び組換えを全く起こさないG418感受性細胞が除去され、
相同組換えを起こした細胞のみが残る。この細胞では、
破壊されたエクソンを含む遺伝子がノックアウトされ
る。
【００７３】得られた細胞をマウスの胚胎盤胞又は８細
胞期胚に注入する。その後は、トランスジェニック動物
の作製と同様の手法により、ノックアウトマウスを作製
することができる。
胞期胚に注入する。その後は、トランスジェニック動物
の作製と同様の手法により、ノックアウトマウスを作製
することができる。
【００７４】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲を限定するものではない。
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲を限定するものではない。
【００７５】〔実施例１〕MarathonTM cDNA Amplificat
ion Kit を用いたヒト CDC28-#46cDNA のクローニング (1) RT-PCRによるヒト CDC28-#46遺伝子の部分 cDNA 断
片の調製 (1-i) 逆転写による cDNA の調製及び増幅 ヒトの精巣由来の Poly(A)+ RNA (CLONETECH社) 約１μ
g、ジチオスレイトール、dNTP (dATP, dCTP, dGTP及び
dTTP)、逆転写酵素用バッファー及び逆転写酵素 Super
Sucript II を含む反応液を、42℃で30分反応させ、そ
の後 RNase処理をして cDNA を調製した。この cDNA を
テンプレートとし、B233 (配列番号８)及び B241 ( 配
列番号９) をプライマーとして、Taq DNA ポリメラーゼ
を用い、RT-PCR反応を行った。RT-PCRは、1.5 mM MgC
l2、20 mM dNTP、1x Perkin-ElmerCetus buffer、各プ
ライマー 0.3 mM、及び 0.25 unit Taqポリメラーゼを
含む10 μl の混合反応液中で行った。
ion Kit を用いたヒト CDC28-#46cDNA のクローニング (1) RT-PCRによるヒト CDC28-#46遺伝子の部分 cDNA 断
片の調製 (1-i) 逆転写による cDNA の調製及び増幅 ヒトの精巣由来の Poly(A)+ RNA (CLONETECH社) 約１μ
g、ジチオスレイトール、dNTP (dATP, dCTP, dGTP及び
dTTP)、逆転写酵素用バッファー及び逆転写酵素 Super
Sucript II を含む反応液を、42℃で30分反応させ、そ
の後 RNase処理をして cDNA を調製した。この cDNA を
テンプレートとし、B233 (配列番号８)及び B241 ( 配
列番号９) をプライマーとして、Taq DNA ポリメラーゼ
を用い、RT-PCR反応を行った。RT-PCRは、1.5 mM MgC
l2、20 mM dNTP、1x Perkin-ElmerCetus buffer、各プ
ライマー 0.3 mM、及び 0.25 unit Taqポリメラーゼを
含む10 μl の混合反応液中で行った。
【００７６】まず、上記反応液を94℃で５分反応させ、
次に、94℃で30秒、50℃で30秒及び72℃で１分の反応を
１サイクルとしてこれを35サイクル行った。得られた反
応液をさらに72℃で５分反応させた。
次に、94℃で30秒、50℃で30秒及び72℃で１分の反応を
１サイクルとしてこれを35サイクル行った。得られた反
応液をさらに72℃で５分反応させた。
【００７７】(1-ii) 塩基配列決定のための RT-PCR 産
物の調製 上記 DNA溶液、T4 DNAリガーゼ (宝酒造社製)、バッフ
ァー (宝酒造社製)、及び pGEM-T ベクター (Promega
社製) を含む溶液を15℃で３時間反応させて、RT-PCR産
物の断片を pGEM-T ベクターに組み込んだ。このベクタ
ーで大腸菌 JM109をトランスフォームさせ、この大腸菌
を、X-gal、IPTG及びアンピシリン (最終濃度 50μg/m
l) を含む LB バクトアガープレートに播いた白色の大
腸菌コロニーについて、アンピシリン (最終濃度 50μg
/ml) を含む LB 培地で、37℃で16時間以上振盪培養
し、Kurabo社製のロボット (PI-100Σ) を用いてプラス
ミド DNAを回収・精製した。RNase 処理により RNAを分
解した後、20％ポリエチレングリコール/2.5M NaCl溶液
で小分子化合物を除き、エタノール沈殿を行い、DNA シ
ークエンス用の試料とした。通常、7 μl を 1.5％アガ
ロースゲルにより解析し、特異的な増幅が認められた場
合、5 μl を直接塩基配列の解析に用いた。
物の調製 上記 DNA溶液、T4 DNAリガーゼ (宝酒造社製)、バッフ
ァー (宝酒造社製)、及び pGEM-T ベクター (Promega
社製) を含む溶液を15℃で３時間反応させて、RT-PCR産
物の断片を pGEM-T ベクターに組み込んだ。このベクタ
ーで大腸菌 JM109をトランスフォームさせ、この大腸菌
を、X-gal、IPTG及びアンピシリン (最終濃度 50μg/m
l) を含む LB バクトアガープレートに播いた白色の大
腸菌コロニーについて、アンピシリン (最終濃度 50μg
/ml) を含む LB 培地で、37℃で16時間以上振盪培養
し、Kurabo社製のロボット (PI-100Σ) を用いてプラス
ミド DNAを回収・精製した。RNase 処理により RNAを分
解した後、20％ポリエチレングリコール/2.5M NaCl溶液
で小分子化合物を除き、エタノール沈殿を行い、DNA シ
ークエンス用の試料とした。通常、7 μl を 1.5％アガ
ロースゲルにより解析し、特異的な増幅が認められた場
合、5 μl を直接塩基配列の解析に用いた。
【００７８】(1-iii) 塩基配列の決定 目的とする DNA断片を pGEM-T ベクター (Promega 社
製) に挿入し、大腸菌で増殖させた後、プラスミドをロ
ボット (Kurabo社製 PI-100Σ) を用いたアルカリ法に
より精製した。得られた精製プラスミドを RNaseで処理
した後、ポリエチレングリコール／食塩水の溶液で処理
して小分子を除き、DNA を精製した。精製された DNAを
鋳型 DNAとして、非標識プライマー、４種類の蛍光標識
ヌクレオチド-5'-トリフォスフェイト、及び Taqポリメ
ラーゼを加えた反応系でPCRを行った。反応混合液は以
下の通りである。
製) に挿入し、大腸菌で増殖させた後、プラスミドをロ
ボット (Kurabo社製 PI-100Σ) を用いたアルカリ法に
より精製した。得られた精製プラスミドを RNaseで処理
した後、ポリエチレングリコール／食塩水の溶液で処理
して小分子を除き、DNA を精製した。精製された DNAを
鋳型 DNAとして、非標識プライマー、４種類の蛍光標識
ヌクレオチド-5'-トリフォスフェイト、及び Taqポリメ
ラーゼを加えた反応系でPCRを行った。反応混合液は以
下の通りである。
【００７９】 Thermal Ready Reaction Mix 8.0 μl 鋳型 DNA 2.0 μl プライマー 2.0 pmol/μl dH2O 8.5 μl
【００８０】PCR は、96℃で10秒 (変性)、55℃で５秒
(アニーリング) 及び60℃で４分 (伸長) の反応を１サ
イクルとしてこれを25サイクル行った。この反応では、
無作為に蛍光色素の入った DNA断片が合成され、それを
シークエンサーで解析することで、最終的には連続した
塩基配列を決定することができる。得られた cDNA クロ
ーンは、下記のプライマーを用いて、Applied Biosyste
m 社製の自動 DNAシークエンサー (model ABI 373)によ
り行った。
(アニーリング) 及び60℃で４分 (伸長) の反応を１サ
イクルとしてこれを25サイクル行った。この反応では、
無作為に蛍光色素の入った DNA断片が合成され、それを
シークエンサーで解析することで、最終的には連続した
塩基配列を決定することができる。得られた cDNA クロ
ーンは、下記のプライマーを用いて、Applied Biosyste
m 社製の自動 DNAシークエンサー (model ABI 373)によ
り行った。
【００８１】 M13F側 配列番号４ M13R側 配列番号５ SP6 側 配列番号６ T7 側 配列番号７
【００８２】その結果、配列番号19で表される504bp の
cDNA が得られた。次に、RT-PCR法により得られたヒト
CDC28-#46遺伝子の部分 DNA断片配列 (配列番号19) を
基に、各プライマー、すなわち cDNA の相補鎖上に 5'G
SP1（配列番号10）及び 5'GSP2 (配列番号11)、そして
cDNA 鎖上に 3'GSP1 (配列番号15)及び 3'GSP2 (配列番
号16) を作製した。
cDNA が得られた。次に、RT-PCR法により得られたヒト
CDC28-#46遺伝子の部分 DNA断片配列 (配列番号19) を
基に、各プライマー、すなわち cDNA の相補鎖上に 5'G
SP1（配列番号10）及び 5'GSP2 (配列番号11)、そして
cDNA 鎖上に 3'GSP1 (配列番号15)及び 3'GSP2 (配列番
号16) を作製した。
【００８３】(2) 5'-, 3'-両端を含む未知配列の cDNA
断片の増幅 ヒト心臓又は胎盤由来の cDNA ReadyTM(CLONETECH社)
を起源にして、(i) 5'-RACE-1 、(ii) 5'-RACE-2、及び
(iii) 3'-RACE を行った。以下、各 RACE について順に
説明する。
断片の増幅 ヒト心臓又は胎盤由来の cDNA ReadyTM(CLONETECH社)
を起源にして、(i) 5'-RACE-1 、(ii) 5'-RACE-2、及び
(iii) 3'-RACE を行った。以下、各 RACE について順に
説明する。
【００８４】(2-i) 5'-RACE-1 産物の増幅 (2-i-a) 1st LD PCR ヒト心臓又は胎盤由来の cDNA ReadyTMをテンプレート
にして、AP1 (配列番号17) 及び 5'GSP1 (配列番号10)
を用いて、以下の組成及びサイクルプログラム(表１及
び２) により PCR反応を行った。
にして、AP1 (配列番号17) 及び 5'GSP1 (配列番号10)
を用いて、以下の組成及びサイクルプログラム(表１及
び２) により PCR反応を行った。
【００８５】
【表１】 表１．PCR 反応溶液 組 成 5 μl ヒト心臓又は胎盤 cDNA ReadyTM 1 μl AP1 （配列番号17）（10μM) 1 μl 5'GSP1（配列番号10）（10μM) 43 μl マスターミックス 36μl dH2O 5 μl 10×KlenTaq PCR buffer 1 μl 10mM dNTP 1 μl 50×KlenTaq DNA polymerase 50μl (全量)
【００８６】
【表２】 表２．PCR サイクルプログラム (1) （94℃で２分）×１サイクル (2) （94℃で30秒、 68℃で４分）×30サイクル (3) 4 ℃で静置
【００８７】(2-i-b) 2nd LD PCR 1st PCR 産物を 1xTE (pH8.0) で50倍希釈したものの 5
μl をテンプレートにして、nestedプライマー [AP2(配
列番号18) 及び GSP2(配列番号11)]を用いて PCR反応を
行った (表３及び４)。
μl をテンプレートにして、nestedプライマー [AP2(配
列番号18) 及び GSP2(配列番号11)]を用いて PCR反応を
行った (表３及び４)。
【００８８】
【表３】 表３．PCR 反応溶液 組 成 5 μl １st PCR産物（50倍希釈） 1 μl AP2 (配列番号18）（10μM) 1 μl 5'GSP2（配列番号11）（10μM) 43 μl マスターミックス（組成は表１と同様） 50 μl (全量)
【００８９】
【表４】 表４．PCR サイクルプログラム (1) （94℃で２分）×１サイクル (2) （94℃で30秒，68℃で４分）×20サイクル (3) ４℃で静置
【００９０】2nd PCR 産物10μlを 1.2％アガロースゲ
ル電気泳動後、EtBr染色して、アダプターを含まないヒ
ト CDC28-#46 cDNA の 5'端部分である1303bpの断片
(配列番号20) の増幅を確認した。
ル電気泳動後、EtBr染色して、アダプターを含まないヒ
ト CDC28-#46 cDNA の 5'端部分である1303bpの断片
(配列番号20) の増幅を確認した。
【００９１】(2-ii) 5'-RACE-2産物の増幅 (2-ii-a) 1st LD PCR ヒト心臓又は胎盤由来の cDNA ReadyTMをテンプレート
にして、AP1(配列番号17）及び 5'GSP3 (配列番号12)
を用いて、以下の組成及びサイクルプログラム（表５及
び６）により PCR反応を行った。
にして、AP1(配列番号17）及び 5'GSP3 (配列番号12)
を用いて、以下の組成及びサイクルプログラム（表５及
び６）により PCR反応を行った。
【００９２】
【表５】 表５．PCR 反応溶液 組 成 5 μl ヒト心臓又は胎盤 cDNA ReadyTM 1 μl AP1 （配列番号17）（10μM) 1 μl 5'GSP3（配列番号12）（10μM) 43 μl マスターミックス（組成は表１と同様） 50 μl (全量）
【００９３】
【表６】 表６．ＰＣＲ サイクルプログラム (1) （94℃で２分）×１サイクル (2) （94℃で30秒，68℃で４分）×30サイクル (3) ４℃で静置
【００９４】(2-ii-b) 2nd LD PCR 1st PCR 産物を、1xTE (pH8.0)で50倍希釈したものの 5
μlをテンプレートにして、nestedプライマー [AP2(配
列番号18) 及び 5'GSP4 (配列番号13)]を用いてPCR 反
応を行った (表７及び８)。なお、5'GSP4 (配列番号13)
は、前記 5'-RACE-1産物の配列を基に設計し合成した
ものである。
μlをテンプレートにして、nestedプライマー [AP2(配
列番号18) 及び 5'GSP4 (配列番号13)]を用いてPCR 反
応を行った (表７及び８)。なお、5'GSP4 (配列番号13)
は、前記 5'-RACE-1産物の配列を基に設計し合成した
ものである。
【００９５】
【表７】 表７．PCR 反応溶液 組 成 5 μl １st PCR産物（50倍希釈） 1 μl AP2 （配列番号18）（10μM) 1 μl 5'GSP4（配列番号13）（10μM) 43 μl マスターミックス（組成は表１と同様） 50 μl (全量）
【００９６】
【表８】 表８．ＰＣＲ サイクルプログラム (1) （94℃で２分）×１サイクル (2) （94℃で30秒，68℃で４分）×20サイクル (3) ４℃で静置
【００９７】(2-ii-c) 3rd LD PCR 2nd PCR 産物を、1xTE (pH8.0)で50倍希釈したものの 5
μlをテンプレートにして、nestedプライマー [AP2(配
列番号18) 及び 5'GSP5 (配列番号14)]を用いてPCR 反
応を行った (表９及び１０)。なお、5'GSP5 (配列番号1
4) は、前記 5'-RACE-1産物の配列を基に設計し合成し
たものである。
μlをテンプレートにして、nestedプライマー [AP2(配
列番号18) 及び 5'GSP5 (配列番号14)]を用いてPCR 反
応を行った (表９及び１０)。なお、5'GSP5 (配列番号1
4) は、前記 5'-RACE-1産物の配列を基に設計し合成し
たものである。
【００９８】
【表９】 表９．PCR 反応溶液 組 成 5 μl １st PCR産物（50倍希釈） 1 μl AP2 （配列番号18）（10μM) 1 μl 5'GSP5（配列番号14）（10μM) 43 μl マスターミックス（組成は表１と同様） 50 μl (全量）
【００９９】
【表１０】 表１０．ＰＣＲ サイクルプログラム (1) （94℃で２分）×１サイクル (2) （94℃で30秒，68℃で４分）×20サイクル (3) ４℃で静置
【０１００】3rd PCR 産物10μl を 1.2％アガロースゲ
ル電気泳動後、EtBr染色して、アダプターを含まないヒ
ト CDC28-#46 cDNAの 5' 端部分である117bp の断片
(配列番号21) の増幅を確認した。
ル電気泳動後、EtBr染色して、アダプターを含まないヒ
ト CDC28-#46 cDNAの 5' 端部分である117bp の断片
(配列番号21) の増幅を確認した。
【０１０１】(2-iii) 3'-RACE 産物の増幅 (2-iii-a) 1st LD PCR 5'-RACE 同様、ヒト心臓又は胎盤由来の cDNA ReadyTM
をテンプレートにして、AP1(配列番号17) 及び 3'GSP1
(配列番号15) を用いて PCR反応を行った (表１１及び
１２)。
をテンプレートにして、AP1(配列番号17) 及び 3'GSP1
(配列番号15) を用いて PCR反応を行った (表１１及び
１２)。
【０１０２】
【表１１】 表１１．ＰＣＲ反応溶液 組 成 5 μl ヒト心臓又は胎盤 cDNA ReadyTM 1 μl AP1 （配列番号17）（10μM) 1 μl 3'GSP1（配列番号15）（10μM) 43 μl マスターミックス（組成は表１と同様） 50 μl (全量)
【０１０３】
【表１２】 表１２．PCR サイクルプログラム (1) （94℃で２分）×１サイクル (2) （94℃で30秒，68℃で４分）×30サイクル (3) ４℃で静置
【０１０４】(2-iii-b) 2nd LD PCR 1st PCR 産物を、1x TE (pH8.0) で50倍希釈したものの
5μlをテンプレートにして、nestedプライマー [AP2
(配列番号18) 及び 3'GSP2 (配列番号16)]を用いて PCR
反応を行った。
5μlをテンプレートにして、nestedプライマー [AP2
(配列番号18) 及び 3'GSP2 (配列番号16)]を用いて PCR
反応を行った。
【０１０５】なお、プライマーとして 3'GSP2 を使う以
外は、表３及び４に記載の条件と同様である。2nd PCR
産物 15μlを 1.0％アガロースゲル電気泳動にかけた
後、EtBr染色した結果、アダプターを含まない1684bpの
ヒト CDC28-#46 cDNA 3'-端部分断片 (配列番号22) の
特異的増幅を確認した。
外は、表３及び４に記載の条件と同様である。2nd PCR
産物 15μlを 1.0％アガロースゲル電気泳動にかけた
後、EtBr染色した結果、アダプターを含まない1684bpの
ヒト CDC28-#46 cDNA 3'-端部分断片 (配列番号22) の
特異的増幅を確認した。
【０１０６】〔実施例２〕λgt11ヒト膵臓cDNAライブラ
リーのスクリーニング ヒト膵臓由来のλgt 11 cDNAライブラリーを、RT-PCR法
により得られたCDC28-#46 cDNAの部分断片(437bp: 配列
番号１又は３で表される塩基配列の第284 〜第720 番の
配列）をプローブとしてスクリーニングし、少しずつ長
さが異なるがそれぞれ完全長を含む３種類の cDNA クロ
ーンを得た。
リーのスクリーニング ヒト膵臓由来のλgt 11 cDNAライブラリーを、RT-PCR法
により得られたCDC28-#46 cDNAの部分断片(437bp: 配列
番号１又は３で表される塩基配列の第284 〜第720 番の
配列）をプローブとしてスクリーニングし、少しずつ長
さが異なるがそれぞれ完全長を含む３種類の cDNA クロ
ーンを得た。
【０１０７】(1) 感染宿主細胞の調整 大腸菌 Y1090を100.0μg/mlのアンピシリンを含む LB
プレートで37℃で一晩培養し、単一コロニーを得た。こ
の単一コロニーを 0.2％マルトースと 10mM MgSO4 を含
む 75mlの LB 培養液中に懸濁し、37℃で一晩振盪培養
し、翌日、冷却遠心分離 (3,500rpm×15分) により大
腸菌を回収した。最終的に、あらかじめ４℃に冷却した
0.2％マルトースと 10mM MgSO4 を含む 150 ml の滅菌
Milli-Q水に懸濁しなおし、感染宿主細胞として用い
た。
プレートで37℃で一晩培養し、単一コロニーを得た。こ
の単一コロニーを 0.2％マルトースと 10mM MgSO4 を含
む 75mlの LB 培養液中に懸濁し、37℃で一晩振盪培養
し、翌日、冷却遠心分離 (3,500rpm×15分) により大
腸菌を回収した。最終的に、あらかじめ４℃に冷却した
0.2％マルトースと 10mM MgSO4 を含む 150 ml の滅菌
Milli-Q水に懸濁しなおし、感染宿主細胞として用い
た。
【０１０８】(2) 感染とプレーティング SM溶液 [下記「(7) 試薬・溶液」の項を参照] で1.5-3
×104pfuに希釈したλgt 11 cDNAライブラリーファージ
溶液と、前記の方法で調整された600μl の Y1090とを
よく混合し、37℃、20分間インキュべートした。次に、
９mlの0.7％トップアガロース-NZYM (あらかじめ50℃
に温めておく) を加え、1.5％ボトムアガー-NZYM プレ
ート (直径15cmのディッシュ) 上に均一になるようにま
き、37℃で6-8時間インキュべートした。
×104pfuに希釈したλgt 11 cDNAライブラリーファージ
溶液と、前記の方法で調整された600μl の Y1090とを
よく混合し、37℃、20分間インキュべートした。次に、
９mlの0.7％トップアガロース-NZYM (あらかじめ50℃
に温めておく) を加え、1.5％ボトムアガー-NZYM プレ
ート (直径15cmのディッシュ) 上に均一になるようにま
き、37℃で6-8時間インキュべートした。
【０１０９】(3) ニトロセルロースフィルターへのファ
ージ DNAの固定化 プラークのできたプレートを４℃で冷やした後 (30分以
上)、あらかじめボールペンなどでプレートと同じ番号
をつけたニトロセルロースフィルター (Schleicher & S
chuell社製、ミリポア社製など）をプレートとニトロセ
ルロースフィルターとの間に空気が入らないように静か
に置いた。約３分間静置し（プレートが暖かいうちにフ
ィルターを載せ、剥がすとアガロースがフィルターにつ
く）、その間ニトロセルロースフィルターとプレートと
を注射針で刺し、印をつけた。フィルターを剥がし、フ
ァージのついた面を上にして、以下の溶液(I〜III)を染
み込ませたろ紙上にフィルターを順次置いた。
ージ DNAの固定化 プラークのできたプレートを４℃で冷やした後 (30分以
上)、あらかじめボールペンなどでプレートと同じ番号
をつけたニトロセルロースフィルター (Schleicher & S
chuell社製、ミリポア社製など）をプレートとニトロセ
ルロースフィルターとの間に空気が入らないように静か
に置いた。約３分間静置し（プレートが暖かいうちにフ
ィルターを載せ、剥がすとアガロースがフィルターにつ
く）、その間ニトロセルロースフィルターとプレートと
を注射針で刺し、印をつけた。フィルターを剥がし、フ
ァージのついた面を上にして、以下の溶液(I〜III)を染
み込ませたろ紙上にフィルターを順次置いた。
【０１１０】 I. 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl １分 30 秒 II. 0.5 M Tris-HCl (pH 7.5), 1.5 M NaCl ５分 III. 3 x SSC ３分
【０１１１】得られたニトロセルロースフィルターを自
然乾燥の後、312 nmの UV 光で 15秒間暴露し、ファー
ジDNAをフィルターに固定した。 (4) プローブの標識 プローブ DNAとしては、RT-PCR法により得られた437bp
の断片（配列番号１又は３で表される塩基配列の第284
〜第720 番の配列）であって、5' Marathon Ready Ampl
ification 法で伸長した CDC28-#46 cDNA の部分断片を
用いた。テンプレートとして CDC28-#46 cDNA 断片 50
ng、プライマーとしてランダムヘキサマー 50 pmolを用
い、 [32P]ラベルした。
然乾燥の後、312 nmの UV 光で 15秒間暴露し、ファー
ジDNAをフィルターに固定した。 (4) プローブの標識 プローブ DNAとしては、RT-PCR法により得られた437bp
の断片（配列番号１又は３で表される塩基配列の第284
〜第720 番の配列）であって、5' Marathon Ready Ampl
ification 法で伸長した CDC28-#46 cDNA の部分断片を
用いた。テンプレートとして CDC28-#46 cDNA 断片 50
ng、プライマーとしてランダムヘキサマー 50 pmolを用
い、 [32P]ラベルした。
【０１１２】(5) ハイブリダイゼーション フィルターをポリ容器の中で、100 mlのハイブリダイゼ
ーションバッファー（50％ホルムアミド、５×SSPE、10
×Denhardt's溶液、２％ SDS、100μg/ml変性サケ精子D
NA断片）に浸して42℃で４時間以上インキュベーション
した。ハイブリダイゼーションバッファーを除去し、新
たに50mlのハイブリダイゼーションバッファーを加え、
気泡がフィルターの下に入りこまないように穏やかに振
盪した。これに [32P]でラベルした DNAプローブを加
え、42℃で 16 時間以上ハイブリダイズした。
ーションバッファー（50％ホルムアミド、５×SSPE、10
×Denhardt's溶液、２％ SDS、100μg/ml変性サケ精子D
NA断片）に浸して42℃で４時間以上インキュベーション
した。ハイブリダイゼーションバッファーを除去し、新
たに50mlのハイブリダイゼーションバッファーを加え、
気泡がフィルターの下に入りこまないように穏やかに振
盪した。これに [32P]でラベルした DNAプローブを加
え、42℃で 16 時間以上ハイブリダイズした。
【０１１３】(6) 洗浄・オートラジオグラフィー ハイブリダイゼーションの後、フィルターは、 100 ml
の２× SSC、0.1% SDS溶液で室温、10分のリンスを３回
繰り返し、次に 100 ml の 0.1× SSC、0.1% SDS溶液で
室温、10分のリンスを４回行った。フィルターがやや湿
った状態を保持するように過剰の水分を除き、サランラ
ップ（旭化成社製）にはさんで、コダック社製又は富士
フィルム社製によるオートラジオグラフィー解析を行っ
た。
の２× SSC、0.1% SDS溶液で室温、10分のリンスを３回
繰り返し、次に 100 ml の 0.1× SSC、0.1% SDS溶液で
室温、10分のリンスを４回行った。フィルターがやや湿
った状態を保持するように過剰の水分を除き、サランラ
ップ（旭化成社製）にはさんで、コダック社製又は富士
フィルム社製によるオートラジオグラフィー解析を行っ
た。
【０１１４】(7) 試薬・溶液 (i) : SM溶液; A) : 5.8 (g) NaCl B) : 2.0 (g) MgSO4・7H2O C) : 25.0 (ml) 2M Tris-HCl (pH 7.5) D) : 5.0 (ml) 2% Gelatin Milli-Q 水で 1,000mlに調整後、オートクレーブ滅菌す
る。
る。
【０１１５】(ii) :溶液 I; 変性溶液(1,000ml) ; A) : 100.00 (ml) 5N NaOH (最終濃度 0.5M) B) : 300.00 (ml) 5M NaCl (最終濃度 1.5M) Milli-Q 水で 1,000mlに調整後、オートクレーブ滅菌す
る。
る。
【０１１６】 (iii) : 溶液 II;中和溶液(1,000ml) ; A) : 250.00 (ml) 2M Tris-HCl(pH 7.4) (最終濃度 0.5M) B) : 300.00 (ml) 5M NaCl (最終濃度 1.5M) Milli-Q 水で 1,000mlに調整後、オートクレーブ滅菌する。
【０１１７】 (iv) : 溶液 III; 20 x SSC (1,000ml) ; A) : 175.32 (g) NaCl (最終濃度 3.0M) B) : 88.23 (g) Na citrate (最終濃度 0.3M) 6N塩酸で pH 7.0 に調整後、Milli-Q 水で 1,000mlとし、オートクレーブ滅菌 する。
【０１１８】(v) : ハイブリダイゼーション溶液 A) : 50%ホルムアミド B) : 5×SSPE C) : 5× Denhardt's 溶液 D) : 0.1% SDS E) : 100μg/mlサケ精子DNA
【０１１９】(vi) :保存溶液 a) : 20 x SSPE 1) : 175.32 (g) NaCl 2) : 27.60 (g) NaH2PO4 3) : 7.49 (g) EDTA・2Na 4) : 750.00 (ml) Milli-Q 水 10N NaOHで pH 7.4 に調整後、Milli-Q 水で 1,000mlと
し、オートクレーブ滅菌する。
し、オートクレーブ滅菌する。
【０１２０】b) : 50×Denhardt's溶液 1) : 10.00 (g) Ficoll 400 2) : 10.00 (g) BSA 画分V 3) : 10.00 (g) ポリビニルピロリドン Mill-iQ 水を加えて 1000ml とした後、濾過し -20℃に
保存する。
保存する。
【０１２１】c) : 100mg/20ml サケ精子DNA 1) :サケ精子 DNAを 100(mg)秤量し、50mlチューブに入
れる。 2) : Milli-Q水を 20ml 加え、10分間インキュベートす
る。 3) : 上記溶液を 100回以上注射針を通過させ、あるい
は、ソニケーションにより短い DNA断片にする。 4) : 10 分間煮沸後、直ちに氷冷し、10分間放置する。
れる。 2) : Milli-Q水を 20ml 加え、10分間インキュベートす
る。 3) : 上記溶液を 100回以上注射針を通過させ、あるい
は、ソニケーションにより短い DNA断片にする。 4) : 10 分間煮沸後、直ちに氷冷し、10分間放置する。
【０１２２】得られた３種類の全長クローンの内の一つ
を pBluescript KS(+) (Strategene社製) にサブクロー
ニングし、配列決定を行った。その結果、配列番号１で
表される全長3028bpの完全長のヒト CDC28-#46 cDNAを
得ることができた。また、配列番号１で表される塩基配
列がコードする本発明のポリペプチドのアミノ酸配列を
配列番号２に、該アミノ酸配列をコードする DNAの塩基
配列を配列番号３に示す。
を pBluescript KS(+) (Strategene社製) にサブクロー
ニングし、配列決定を行った。その結果、配列番号１で
表される全長3028bpの完全長のヒト CDC28-#46 cDNAを
得ることができた。また、配列番号１で表される塩基配
列がコードする本発明のポリペプチドのアミノ酸配列を
配列番号２に、該アミノ酸配列をコードする DNAの塩基
配列を配列番号３に示す。
【０１２３】〔実施例３〕P1 DNAの精製及び FISH 純度の高い P1 DNA は、塩化セシウム (CsCl) 密度勾配
遠心法で分離精製し、FISHによる解析に用いた。
遠心法で分離精製し、FISHによる解析に用いた。
【０１２４】(1) P1クローンの培養法 P1クローンからの DNAの回収・精製は、Smoller ら [Ch
romosoma, 100, pp487-494 (1991) ] によって報告され
た方法に変更を加えて行った。すなわち、単一P1ファー
ジクローンを含む大腸菌コロニーを最終濃度 25.0 μg/
mlのカナマイシンを含む１L の LB 培養液中へ懸濁し、
37℃で一晩振盪培養した。
romosoma, 100, pp487-494 (1991) ] によって報告され
た方法に変更を加えて行った。すなわち、単一P1ファー
ジクローンを含む大腸菌コロニーを最終濃度 25.0 μg/
mlのカナマイシンを含む１L の LB 培養液中へ懸濁し、
37℃で一晩振盪培養した。
【０１２５】(2) CsCl密度勾配遠心法による P1 DNA の
精製 P1 DNAは、上記(1) に記載した方法により得られた菌体
から、通常のアルカリ-SDS法〔Birnboim and Doly, Nuc
leic Acids Res. 7, pp1513-1523 (1979)〕により調製
し、CsCl密度勾配遠心法により精製した。
精製 P1 DNAは、上記(1) に記載した方法により得られた菌体
から、通常のアルカリ-SDS法〔Birnboim and Doly, Nuc
leic Acids Res. 7, pp1513-1523 (1979)〕により調製
し、CsCl密度勾配遠心法により精製した。
【０１２６】冷却遠心分離 (3,500rpm×15分) により回
収した菌体に、50mlの 50mM Sucrose-10mM EDTA-25mM T
ris-HCl (pH 8.0)と、50 mg/mlのリゾチーム溶液を 1.5
ml加え、穏やかに室温で５分インキュベートした。引
き続き、100ml の 0.2M NaOH-1％SDS 溶液を加え、穏や
かに氷上で５分インキュベートした。さらに、75mlの3
M KAc-11.5％氷酢酸を加え、穏やかに氷上で５分インキ
ュベートした。
収した菌体に、50mlの 50mM Sucrose-10mM EDTA-25mM T
ris-HCl (pH 8.0)と、50 mg/mlのリゾチーム溶液を 1.5
ml加え、穏やかに室温で５分インキュベートした。引
き続き、100ml の 0.2M NaOH-1％SDS 溶液を加え、穏や
かに氷上で５分インキュベートした。さらに、75mlの3
M KAc-11.5％氷酢酸を加え、穏やかに氷上で５分インキ
ュベートした。
【０１２７】冷却遠心分離 (4,000 rpm×15分）により
上清を回収し、そこに最終濃度 50μg/mlとなるように
RNase溶液を加え、37℃で１時間インキュベート後、同
量の2-プロパノールを加え -20℃で１時間放置した。冷
却遠心分離 (6,000rpm×15分)後、デカンテーションに
より上清を除去し、P1/PAC DNAを含む沈殿を 70％EtOH
で洗浄後、完全に風乾させた。６mlの 10mM Tris-HCl-1
mM EDTA (pH 8.0)を加えて沈殿を溶解させ、そこに６g
の CsCl を加えて十分に溶解させ、さらに 10mg/mlエチ
ジウムブロミドを 100μl 加え、-20 ℃で 20分放置し
た。
上清を回収し、そこに最終濃度 50μg/mlとなるように
RNase溶液を加え、37℃で１時間インキュベート後、同
量の2-プロパノールを加え -20℃で１時間放置した。冷
却遠心分離 (6,000rpm×15分)後、デカンテーションに
より上清を除去し、P1/PAC DNAを含む沈殿を 70％EtOH
で洗浄後、完全に風乾させた。６mlの 10mM Tris-HCl-1
mM EDTA (pH 8.0)を加えて沈殿を溶解させ、そこに６g
の CsCl を加えて十分に溶解させ、さらに 10mg/mlエチ
ジウムブロミドを 100μl 加え、-20 ℃で 20分放置し
た。
【０１２８】冷却遠心分離 (6,000rpm×10分) 後上清を
回収し、22℃で 100,000rpm ×６時間以上の超高速遠心
により、P1 DNAをバクテリアゲノムと分離した。UV照射
下でP1 DNA を含むバンドを回収後、イソアミルアルコ
ールでエチジウムブロミドを除き、また、２度の透析に
より CsCl を除き、 P1 DNA を精製した。透析バッファ
ーとして 10mM Tris-HCl-1.25mM EDTA (pH 8.0) を用い
た。この P1 DNA は、FISHによる解析に用いた。
回収し、22℃で 100,000rpm ×６時間以上の超高速遠心
により、P1 DNAをバクテリアゲノムと分離した。UV照射
下でP1 DNA を含むバンドを回収後、イソアミルアルコ
ールでエチジウムブロミドを除き、また、２度の透析に
より CsCl を除き、 P1 DNA を精製した。透析バッファ
ーとして 10mM Tris-HCl-1.25mM EDTA (pH 8.0) を用い
た。この P1 DNA は、FISHによる解析に用いた。
【０１２９】(3) FISH ヒト末梢血細胞を PHAで刺激して細胞分裂を促進し、コ
ルセミドを用いて分裂中期で分裂を停止させた。細胞は
酢酸／メタノール溶液で固定した後に、スライドグラス
の上に広げた。スライドグラス上の標本はホルムアミド
と SSC [Standard Saline Citrate; 0.15M NaCl, 0.015
M Sodium Citrate (pH 7.0)]により変性させた。次に、
ジゴキシゲニンで標識したヒト CDC28-#46遺伝子を含む
P1 DNA(P1-#13939 DNA) プローブを反応させて標本と
ハイブリダイズさせた。そして、FITC- 標識した抗ジゴ
キシゲニン抗体で処理して標本を蛍光標識した。
ルセミドを用いて分裂中期で分裂を停止させた。細胞は
酢酸／メタノール溶液で固定した後に、スライドグラス
の上に広げた。スライドグラス上の標本はホルムアミド
と SSC [Standard Saline Citrate; 0.15M NaCl, 0.015
M Sodium Citrate (pH 7.0)]により変性させた。次に、
ジゴキシゲニンで標識したヒト CDC28-#46遺伝子を含む
P1 DNA(P1-#13939 DNA) プローブを反応させて標本と
ハイブリダイズさせた。そして、FITC- 標識した抗ジゴ
キシゲニン抗体で処理して標本を蛍光標識した。
【０１３０】その結果、図３に示すように、FITCのシグ
ナルは、第４染色体のセントロメアを特異的に染める標
準 DNAプローブの近傍の短腕部分に存在した。従って、
ヒトCDC28-#46遺伝子を含む P1-#13939 DNAは、第４染
色体短腕, 4p15.3領域に存在することが分かった。
ナルは、第４染色体のセントロメアを特異的に染める標
準 DNAプローブの近傍の短腕部分に存在した。従って、
ヒトCDC28-#46遺伝子を含む P1-#13939 DNAは、第４染
色体短腕, 4p15.3領域に存在することが分かった。
【０１３１】〔実施例４〕ヒト CDC28-#46遺伝子のサザ
ンブロットによる解析 標識された核酸プローブと相補的な塩基配列を持つヒト
CDC28-#46遺伝子 DNAの領域を同定するために、次のよ
うにサザンハイブリダイゼーション(Zoo Blot)を行っ
た。
ンブロットによる解析 標識された核酸プローブと相補的な塩基配列を持つヒト
CDC28-#46遺伝子 DNAの領域を同定するために、次のよ
うにサザンハイブリダイゼーション(Zoo Blot)を行っ
た。
【０１３２】９種類の動物由来のゲノム DNA各４μgを
アガロース電気泳動して、ナイロン膜にブロットしたプ
リメイドフィルター (Clontech社製) を使用した (図４
B ）。ヒト CDC28-#46遺伝子の検出プローブは[32P] 標
識の完全長ヒト CDC28-#46 cDNA を使用し、ハイブリダ
イゼーション及び洗浄条件はClontechのプロトコールに
従った。
アガロース電気泳動して、ナイロン膜にブロットしたプ
リメイドフィルター (Clontech社製) を使用した (図４
B ）。ヒト CDC28-#46遺伝子の検出プローブは[32P] 標
識の完全長ヒト CDC28-#46 cDNA を使用し、ハイブリダ
イゼーション及び洗浄条件はClontechのプロトコールに
従った。
【０１３３】図４より、ヒト CDC28-#46遺伝子は、種を
越えて良く保存されていることがわかった。なお、ゲノ
ム DNAの由来は以下の通りである。a,ヒト; b,サル; c,
ラット; d,マウス; e,イヌ; f,ウシ; g,ウサギ; h,ニワ
トリ; i,酵母。
越えて良く保存されていることがわかった。なお、ゲノ
ム DNAの由来は以下の通りである。a,ヒト; b,サル; c,
ラット; d,マウス; e,イヌ; f,ウシ; g,ウサギ; h,ニワ
トリ; i,酵母。
【０１３４】〔実施例５〕ヒト CDC28-#46遺伝子のノー
ザンブロットによる解析 (1) ヒト CDC28-#46遺伝子のノーザンブロット解析 (1-i) ヒト多組織ノーザン (Multiple Tissue Norther
n; MTN-1 and -II)ブロット １６種類のヒトの組織・臓器より抽出した poly(A)+ RN
A 各 2μg をアガロース電気泳動し、ナイロン膜にブロ
ットしたプリメイドフィルター (Clontech社製) を使用
してノーザンブロットを行った (図５）。
ザンブロットによる解析 (1) ヒト CDC28-#46遺伝子のノーザンブロット解析 (1-i) ヒト多組織ノーザン (Multiple Tissue Norther
n; MTN-1 and -II)ブロット １６種類のヒトの組織・臓器より抽出した poly(A)+ RN
A 各 2μg をアガロース電気泳動し、ナイロン膜にブロ
ットしたプリメイドフィルター (Clontech社製) を使用
してノーザンブロットを行った (図５）。
【０１３５】(1-ii) ヒト CDC28-#46 cDNA プローブ ヒト CDC28-#46 cDNA の一部である ORFの C端側と 3'-
UTを含む (308 bp) を後述の方法に従い放射性ラベル
し、これをヒト CDC28-#46遺伝子の検出プローブとして
用いた。
UTを含む (308 bp) を後述の方法に従い放射性ラベル
し、これをヒト CDC28-#46遺伝子の検出プローブとして
用いた。
【０１３６】(2) ハイブリダイゼーション (2-i) プレハイブリダイゼーション フィルターを弁当箱型ポリ容器の中で、100 mlのプレハ
イブリダイゼーションバッファーに浸し、42℃で４時間
インキュベーションした。プレハイブリダイゼーション
バッファーには、50％ホルムアミド、５×SSPE、10×De
nhardt's溶液、２％ SDS及び 100μg/ml変性サケ精子 D
NA断片を含むものを用いた。
イブリダイゼーションバッファーに浸し、42℃で４時間
インキュベーションした。プレハイブリダイゼーション
バッファーには、50％ホルムアミド、５×SSPE、10×De
nhardt's溶液、２％ SDS及び 100μg/ml変性サケ精子 D
NA断片を含むものを用いた。
【０１３７】(2-ii) ヒト CDC28-#46 cDNA プローブの
放射性ラベリング テンプレートとして前述のヒト CDC28-#46 cDNA 断片 5
0 ng、プライマーとしてランダムヘキサマー 50 pmolを
用い、ランダムプライマー DNAラベリングキット Ver.2
(宝酒造社製）により [α-32P]-dCTP (NEN 社製、第一
化学薬品社製)で放射性ラベルした。
放射性ラベリング テンプレートとして前述のヒト CDC28-#46 cDNA 断片 5
0 ng、プライマーとしてランダムヘキサマー 50 pmolを
用い、ランダムプライマー DNAラベリングキット Ver.2
(宝酒造社製）により [α-32P]-dCTP (NEN 社製、第一
化学薬品社製)で放射性ラベルした。
【０１３８】(2-iii) ハイブリダイゼーション プレハイブリダイゼーションバッファーを棄て、新たに
50ml のプレハイブリダイゼーションバッファーを加
え、気泡がフィルターの下に入りこまないように穏やか
に振盪した。これに [32P]-dCTP で放射性ラベルしたプ
ローブを比活性が約１×106 cpm/mlとなるように加え、
42℃で16時間ハイブリダイズした。
50ml のプレハイブリダイゼーションバッファーを加
え、気泡がフィルターの下に入りこまないように穏やか
に振盪した。これに [32P]-dCTP で放射性ラベルしたプ
ローブを比活性が約１×106 cpm/mlとなるように加え、
42℃で16時間ハイブリダイズした。
【０１３９】ハイブリダイゼーションの後、フィルター
に対し、100 mlの２×SSC、0.1 ％SDS溶液を用いて室温
で 15分のリンスを２回繰り返し、次に100 mlの0.2×SS
C、0.1 ％ SDS溶液を用いて室温で15分のリンスを２回
行った。フィルターがやや湿った状態になるまで水分を
除き、サランラップ（旭化成社製）にはさんでBAS 1500
システム (富士フィルム社製) によるオートラジオグラ
フィー解析を行った。
に対し、100 mlの２×SSC、0.1 ％SDS溶液を用いて室温
で 15分のリンスを２回繰り返し、次に100 mlの0.2×SS
C、0.1 ％ SDS溶液を用いて室温で15分のリンスを２回
行った。フィルターがやや湿った状態になるまで水分を
除き、サランラップ（旭化成社製）にはさんでBAS 1500
システム (富士フィルム社製) によるオートラジオグラ
フィー解析を行った。
【０１４０】(3) Fuji BAS 1500 システムによる解析 輝尽性蛍光体を用いた放射線エネルギーメモリ型２次元
センサー（イメージングプレート；IP）に、Ｘ線フィル
ムと同様にサンプルを密着露光させ、この IPを He-Ne
レーザー光で励起させ、露光量に応じて放出される蛍光
をPSL (Photo Stimulated Luminescence）というデジタ
ル量に変換して定量した。定量は BAS 1500 システムを
用いた。このシステムによる定量値の直線性は良好であ
り、バックグラウンドの減算、指定領域内の放射線強度
の計測、比較が行える。
センサー（イメージングプレート；IP）に、Ｘ線フィル
ムと同様にサンプルを密着露光させ、この IPを He-Ne
レーザー光で励起させ、露光量に応じて放出される蛍光
をPSL (Photo Stimulated Luminescence）というデジタ
ル量に変換して定量した。定量は BAS 1500 システムを
用いた。このシステムによる定量値の直線性は良好であ
り、バックグラウンドの減算、指定領域内の放射線強度
の計測、比較が行える。
【０１４１】(4) ヒト CDC28-#46 mRNA の組織特異的発
現結果 ヒト各組織・臓器由来の２μg poly(A)+ RNA を含む MT
Nブロット(CLONTECH社製）に、 [32P]標識したヒト CDC
28-#46 cDNA の一部である ORFの C端側及び3'-UTを含
む 308 bp の断片（配列番号１又は３で表される塩基配
列の第2475〜第2782番の配列）をプローブとしてハイブ
リダイズさせた。
現結果 ヒト各組織・臓器由来の２μg poly(A)+ RNA を含む MT
Nブロット(CLONTECH社製）に、 [32P]標識したヒト CDC
28-#46 cDNA の一部である ORFの C端側及び3'-UTを含
む 308 bp の断片（配列番号１又は３で表される塩基配
列の第2475〜第2782番の配列）をプローブとしてハイブ
リダイズさせた。
【０１４２】その結果、ヒト CDC28-#46 mRNA の発現
は、各種の臓器で幅広く認められ、図５のようなパター
ンを示した。すなわち、ヒト CDC28-#46遺伝子は、膵臓
及び骨格筋において強く発現し、心臓、脳、胎盤、脾
臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸において中程度に
発現し、肺、肝臓、腎臓、大腸、及び末梢血リンパ球に
おいては、僅かしか発現していないことがわかった。Po
ly (A)+ RNA の起源は以下の通りである。
は、各種の臓器で幅広く認められ、図５のようなパター
ンを示した。すなわち、ヒト CDC28-#46遺伝子は、膵臓
及び骨格筋において強く発現し、心臓、脳、胎盤、脾
臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸において中程度に
発現し、肺、肝臓、腎臓、大腸、及び末梢血リンパ球に
おいては、僅かしか発現していないことがわかった。Po
ly (A)+ RNA の起源は以下の通りである。
【０１４３】a,心臓； b,脳 ; c,胎盤; d, 肺; e,
肝臓 ; f,骨格筋 ; g,腎臓; h,膵臓; i,脾臓; j,胸腺; k,前立腺; l,精巣;
m, 卵巣 ; n,小腸 o,大腸 ; p,末梢血リンパ球
肝臓 ; f,骨格筋 ; g,腎臓; h,膵臓; i,脾臓; j,胸腺; k,前立腺; l,精巣;
m, 卵巣 ; n,小腸 o,大腸 ; p,末梢血リンパ球
【０１４４】
【発明の効果】本発明により、ヒト CDC28-#46遺伝子が
提供される。本発明のヒト CDC28-#46遺伝子は、ヒトの
恒常性維持及び細胞老化との関連を解明するための研究
に有用であると共に、発育及び老化に伴って発症する疾
患の病因解明、症状の改善・緩和を目指す治療薬とし
て、また、老化に伴う他の疾病との関連性のある病気の
検査・予防のための診断プローブとして、あるいは、ヒ
ト個体の発生に関する医科学的、細胞生物学的、免疫学
的、生化学的及び分子生物学的研究のための試薬として
有用である。
提供される。本発明のヒト CDC28-#46遺伝子は、ヒトの
恒常性維持及び細胞老化との関連を解明するための研究
に有用であると共に、発育及び老化に伴って発症する疾
患の病因解明、症状の改善・緩和を目指す治療薬とし
て、また、老化に伴う他の疾病との関連性のある病気の
検査・予防のための診断プローブとして、あるいは、ヒ
ト個体の発生に関する医科学的、細胞生物学的、免疫学
的、生化学的及び分子生物学的研究のための試薬として
有用である。
【０１４５】
配列番号：１ 配列の長さ：３０２８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ホモ・サピエンス 配列の特徴 他の情報：human CDC28-#46 RNA helicase 配列： CTCGTCGCCG CCGCCATTTT AGCTGTTGGT TCCGGCCGCA CCGTGTGGGC TGTAGTAGCG 60 GGAGGGGTGG GGGTCCTCCA GAGTTAAGTG GCTGTCCTCG ACTGTGCCCA TACAGCAGCC 120 AGCTTTCTTC CTTAATAACT GCCCGTTCGA AGAGTGCGAG G ATG TCC AAG CGG 173 Met Ser Lys Arg 1 CAC CGG TTG GAC CTA GGG GAG GAT TAC CCC TCT GGC AAG AAG CGT GCG 221 His Arg Leu Asp Leu Gly Glu Asp Tyr Pro Ser Gly Lys Lys Arg Ala 5 10 15 20 GGG ACC GAT GGG AAG GAT CGA GAT CGA GAC CGG GAT CGT GAA GAT CGG 269 Gly Thr Asp Gly Lys Asp Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Glu Asp Arg 25 30 35 TCT AAA GAT CGA GAC CGA GAA CGT GAT AGA GGA GAT AGA GAG CGA GAG 317 Ser Lys Asp Arg Asp Arg Glu Arg Asp Arg Gly Asp Arg Glu Arg Glu 40 45 50 AGG GAG AAA GAA AAG GAG AAG GAG TTG CGA GCT TCA ACA AAT GCT ATG 365 Arg Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Leu Arg Ala Ser Thr Asn Ala Met 55 60 65 CTT ATC AGT GCT GGA TTA CCA CCC CTG AAA GCT TCC CAT TCA GCT CAC 413 Leu Ile Ser Ala Gly Leu Pro Pro Leu Lys Ala Ser His Ser Ala His 70 75 80 TCA ACC CAC TCA GCA CAT TCA ACG CAT TCT ACA CAT TCT GCT CAT TCA 461 Ser Thr His Ser Ala His Ser Thr His Ser Thr His Ser Ala His Ser 85 90 95 100 ACG CAT GCC GGA CAT GCA GGT CAC ACG TCA CTT CCA CAG TGC ATT AAT 509 Thr His Ala Gly His Ala Gly His Thr Ser Leu Pro Gln Cys Ile Asn 105 110 115 CCG TTC ACC AAC TTA CCC CAT ACT CCT CGA TAC TAT GAT ATT CTA AAG 557 Pro Phe Thr Asn Leu Pro His Thr Pro Arg Tyr Tyr Asp Ile Leu Lys 120 125 130 AAA CGT CTT CAG CTC CCT GTT TGG GAA TAC AAG GAT AGG TTT ACA GAT 605 Lys Arg Leu Gln Leu Pro Val Trp Glu Tyr Lys Asp Arg Phe Thr Asp 135 140 145 ATT CTG GGT AGA CAT CAG TCC TTT GTA CTG GTT GGT GAG ACT GGG TCT 653 Ile Leu Gly Arg His Gln Ser Phe Val Leu Val Gly Glu Thr Gly Ser 150 155 160 GGT AAA ACA ACA CAA ATT CCA CAC CGG TGT GTG GAG TAC ATG CGA TCA 701 Gly Lys Thr Thr Gln Ile Pro His Arg Cys Val Glu Tyr Met Arg Ser 165 170 175 180 TTA CCA GGA CCC AAG AGA GGA GTT GCC TGT ACC CAA CCC AGG AGA GTG 749 Leu Pro Gly Pro Lys Arg Gly Val Ala Cys Thr Gln Pro Arg Arg Val 185 190 195 GCT GCA ATG AGT GTG GCT CAG AGA GTT GCT GAT GAG ATG GAT GTG ATG 797 Ala Ala Met Ser Val Ala Gln Arg Val Ala Asp Glu Met Asp Val Met 200 205 210 TTG GGC CAG GAA GTT GGT TAC TCC ATT CGA TTT GAA GAC TGC AGT AGT 845 Leu Gly Gln Glu Val Gly Tyr Ser Ile Arg Phe Glu Asp Cys Ser Ser 215 220 225 GCA AAA ACA TTT TTT ATG TAT ATG ACT GAT GGG ATG TTA CTT CGT GAA 893 Ala Lys Thr Phe Phe Met Tyr Met Thr Asp Gly Met Leu Leu Arg Glu 230 235 240 GCT ATG AAT GAT CCC CTC CTG GAG CGT TAT GGT GTA ATA ATT CTT GAT 941 Ala Met Asn Asp Pro Leu Leu Glu Arg Tyr Gly Val Ile Ile Leu Asp 245 250 255 260 GAG GCT CAT GAG AGG ACA CTG GCT ACA GAT ATT CTA ATG GGT GTT CTG 989 Glu Ala His Glu Arg Thr Leu Ala Thr Asp Ile Leu Met Gly Val Leu 265 270 275 AAG GAA GTT GTA AGA CAG AGA TCA GAT TTA AAG GTT ATA GTT ATG AGC 1037 Lys Glu Val Val Arg Gln Arg Ser Asp Leu Lys Val Ile Val Met Ser 280 285 290 GCT ACT CTA GAT GCA GGA AAA TTC CAG ATT TAC TTT GAT AAC TGT CCT 1085 Ala Thr Leu Asp Ala Gly Lys Phe Gln Ile Tyr Phe Asp Asn Cys Pro 295 300 305 CTC CTA ACT ATT CCT GGG CGT ACA CAT CCT GTT GAG ATC TTC TAT ACT 1133 Leu Leu Thr Ile Pro Gly Arg Thr His Pro Val Glu Ile Phe Tyr Thr 310 315 320 CCA GAA CCA GAG AGA GAT TAT CTT GAA GCA GCA ATT CGA ACA GTT ATC 1181 Pro Glu Pro Glu Arg Asp Tyr Leu Glu Ala Ala Ile Arg Thr Val Ile 325 330 335 340 CAG ATT CAT ATG TGT GAA GAG GAA GAG GGA GAT CTT CTT CTT TTC TTA 1229 Gln Ile His Met Cys Glu Glu Glu Glu Gly Asp Leu Leu Leu Phe Leu 345 350 355 ACT GGT CAA GAG GAA ATT GAT GAA GCC TGT AAG AGA ATA AAG CGT GAA 1277 Thr Gly Gln Glu Glu Ile Asp Glu Ala Cys Lys Arg Ile Lys Arg Glu 360 365 370 GTT GAT GAT TTG GGC CCT GAA GTT GGT GAC ATT AAA ATC ATT CCA TTG 1325 Val Asp Asp Leu Gly Pro Glu Val Gly Asp Ile Lys Ile Ile Pro Leu 375 380 385 TAT TCT ACA CTT CCA CCT CAG CAG CAG CAA CGC ATT TTT GAG CCT CCA 1373 Tyr Ser Thr Leu Pro Pro Gln Gln Gln Gln Arg Ile Phe Glu Pro Pro 390 395 400 CCT CCC AAA AAA CAG AAT GGA GCA ATT GGA AGA AAG GTA GTT GTG TCA 1421 Pro Pro Lys Lys Gln Asn Gly Ala Ile Gly Arg Lys Val Val Val Ser 405 410 415 420 ACT AAC ATA GCA GAG ACG TCT TTG ACA ATA GAT GGT GTG GTG TTT GTG 1469 Thr Asn Ile Ala Glu Thr Ser Leu Thr Ile Asp Gly Val Val Phe Val 425 430 435 ATT GAT CCT GGA TTT GCG AAA CAG AAG GTC TAC AAT CCT CGA ATC AGA 1517 Ile Asp Pro Gly Phe Ala Lys Gln Lys Val Tyr Asn Pro Arg Ile Arg 440 445 450 GTT GAG TCC CTT TTG GTG ACA GCT ATT AGT AAA GCT TCA GCT CAG CAA 1565 Val Glu Ser Leu Leu Val Thr Ala Ile Ser Lys Ala Ser Ala Gln Gln 455 460 465 AGG GCT GGT CGA GCT GGA CGT ACC AGA CCT GGA AAA TGC TTC AGA CTT 1613 Arg Ala Gly Arg Ala Gly Arg Thr Arg Pro Gly Lys Cys Phe Arg Leu 470 475 480 TAC ACA GAG AAA GCT TAT AAA ACA GAA ATG CAG GAT AAC ACC TAT CCT 1661 Tyr Thr Glu Lys Ala Tyr Lys Thr Glu Met Gln Asp Asn Thr Tyr Pro 485 490 495 500 GAG ATT TTG CGT TCT AAT TTA GGA TCA GTT GTG TTA CAA TTG AAG AAA 1709 Glu Ile Leu Arg Ser Asn Leu Gly Ser Val Val Leu Gln Leu Lys Lys 505 510 515 CTT GGT ATT GAT GAC TTG GTA CAT TTT GAT TTT ATG GAT CCA CCA GCT 1757 Leu Gly Ile Asp Asp Leu Val His Phe Asp Phe Met Asp Pro Pro Ala 520 525 530 CCT GAA ACT CTG ATG AGA GCC CTG GAA CTT TTG AAT TAC CTG GCT GCT 1805 Pro Glu Thr Leu Met Arg Ala Leu Glu Leu Leu Asn Tyr Leu Ala Ala 535 540 545 TTA AAT GAT GAT GGA GAT CTG ACT GAA TTG GGA TCC ATG ATG GCA GAG 1853 Leu Asn Asp Asp Gly Asp Leu Thr Glu Leu Gly Ser Met Met Ala Glu 550 555 560 TTT CCT CTA GAT CCA CAG CTC GCA AAA ATG GTT ATT GCA AGT TGT GAC 1901 Phe Pro Leu Asp Pro Gln Leu Ala Lys Met Val Ile Ala Ser Cys Asp 565 570 575 580 TAC AAC TGT TCT AAT GAG GTC CTA TCT ATT ACT GCT ATG TTG TCA GTC 1949 Tyr Asn Cys Ser Asn Glu Val Leu Ser Ile Thr Ala Met Leu Ser Val 585 590 595 CCA CAG TGT TTT GTT CGC CCC ACG GAG GCC AAG AAA GCC GCA GAT GAG 1997 Pro Gln Cys Phe Val Arg Pro Thr Glu Ala Lys Lys Ala Ala Asp Glu 600 605 610 GCC AAG ATG AGA TTT GCC CAC ATA GAT GGA GAT CAT CTG ACA CTG CTG 2045 Ala Lys Met Arg Phe Ala His Ile Asp Gly Asp His Leu Thr Leu Leu 615 620 625 AAC GTC TAC CAT GCT TTT AAA CAA AAT CAT GAA TCG GTT CAG TGG TGT 2093 Asn Val Tyr His Ala Phe Lys Gln Asn His Glu Ser Val Gln Trp Cys 630 635 640 TAT GAC AAC TTC ATT AAC TAC AGG TCC CTG ATG TCC GCG GAC AAT GTA 2141 Tyr Asp Asn Phe Ile Asn Tyr Arg Ser Leu Met Ser Ala Asp Asn Val 645 650 655 660 CGC CAG CAG CTA TCT CGA ATT ATG GAC AGA TTT AAT TTG CCT CGT CGA 2189 Arg Gln Gln Leu Ser Arg Ile Met Asp Arg Phe Asn Leu Pro Arg Arg 665 670 675 AGT ACT GAC TTT ACA AGC AGG GAC TAT TAT ATT AAT ATA AGA AAA GCT 2237 Ser Thr Asp Phe Thr Ser Arg Asp Tyr Tyr Ile Asn Ile Arg Lys Ala 680 685 690 TTG GTT ACT GGG TAT TTT ATG CAG GTG GCA CAT TTA GAA CGA ACA GGG 2285 Leu Val Thr Gly Tyr Phe Met Gln Val Ala His Leu Glu Arg Thr Gly 695 700 705 CAT TAC TTA ACT GTG AAA GAT AAC CAG GTG GTT CAG TTG CAT CCC TCT 2333 His Tyr Leu Thr Val Lys Asp Asn Gln Val Val Gln Leu His Pro Ser 710 715 720 ACT GTT CTT GAC CAC AAA CCT GAA TGG GTG CTT TAT AAT GAG TTT GTT 2381 Thr Val Leu Asp His Lys Pro Glu Trp Val Leu Tyr Asn Glu Phe Val 725 730 735 740 CTA ACA ACA AAG AAT TAC ATC CGG ACA TGT ACA GAC ATC AAG CCA GAA 2429 Leu Thr Thr Lys Asn Tyr Ile Arg Thr Cys Thr Asp Ile Lys Pro Glu 745 750 755 TGG TTG GTG AAA ATT GCC CCT CAA TAT TAT GAC ATG AGC AAT TTC CCA 2477 Trp Leu Val Lys Ile Ala Pro Gln Tyr Tyr Asp Met Ser Asn Phe Pro 760 765 770 CAG TGT GAA GCA AAG AGA CAG TTG GAC CGC ATC ATT GCC CAA ACT TCA 2525 Gln Cys Glu Ala Lys Arg Gln Leu Asp Arg Ile Ile Ala Gln Thr Ser 775 780 785 ATC CAA GGA ATA TTC ACA GTA CTG AAT TCA GTG CTT AGA ACT GAA GTT 2573 Ile Gln Gly Ile Phe Thr Val Leu Asn Ser Val Leu Arg Thr Glu Val 790 795 800 ATT GAG AGG ACA GCT TTA AAA GAT GAA TGAACTCAAA AGTTCGAGTT 2620 Ile Glu Arg Thr Ala Leu Lys Asp Glu 805 810 GTGCTCTTCA CGTTGGTTCG ATAATGGCCT TTATTTGAAA GCTTTTTAAT TTTTCTTTAC 2680 AGTAAATATT CCATTCTGAT TTCATAAATT AAACATTTAT GCCTCCCTTT TGTGTTGACA 2740 CTGTAGCTCA TACTGGAAAA GTCGATCAAT GTTTTGCAGT TTATTGAAAG TAGTTCTATA 2800 TATAACAATG TTATAAGCAT TTCTTTAGAA ATGGTTGAAA ATGCTTCTAA AATGTGATTA 2860 TCGACCATGG TATGCATGAT CGTTGTAATT GTTGACATTC CTTTTAGAAG TTGTGAAATG 2920 TTACAACTTG TGCTTATGTA GACACAATTT TTTGTTTCAG TACCAGAGGC ACTGACTTCA 2980 ATAAAGTTTA TTTATACGGA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA 3028
【０１４６】配列番号：２ 配列の長さ：８１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ホモ・サピエンス 配列の特徴 他の情報：human CDC28-#46 RNA helicase 配列： Met Ser Lys Arg His Arg Leu Asp Leu Gly Glu Asp Tyr Pro Ser Gly 1 5 10 15 Lys Lys Arg Ala Gly Thr Asp Gly Lys Asp Arg Asp Arg Asp Arg Asp 20 25 30 Arg Glu Asp Arg Ser Lys Asp Arg Asp Arg Glu Arg Asp Arg Gly Asp 35 40 45 Arg Glu Arg Glu Arg Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Leu Arg Ala Ser 50 55 60 Thr Asn Ala Met Leu Ile Ser Ala Gly Leu Pro Pro Leu Lys Ala Ser 65 70 75 80 His Ser Ala His Ser Thr His Ser Ala His Ser Thr His Ser Thr His 85 90 95 Ser Ala His Ser Thr His Ala Gly His Ala Gly His Thr Ser Leu Pro 100 105 110 Gln Cys Ile Asn Pro Phe Thr Asn Leu Pro His Thr Pro Arg Tyr Tyr 115 120 125 Asp Ile Leu Lys Lys Arg Leu Gln Leu Pro Val Trp Glu Tyr Lys Asp 130 135 140 Arg Phe Thr Asp Ile Leu Gly Arg His Gln Ser Phe Val Leu Val Gly 145 150 155 160 Glu Thr Gly Ser Gly Lys Thr Thr Gln Ile Pro His Arg Cys Val Glu 165 170 175 Tyr Met Arg Ser Leu Pro Gly Pro Lys Arg Gly Val Ala Cys Thr Gln 180 185 190 Pro Arg Arg Val Ala Ala Met Ser Val Ala Gln Arg Val Ala Asp Glu 195 200 205 Met Asp Val Met Leu Gly Gln Glu Val Gly Tyr Ser Ile Arg Phe Glu 210 215 220 Asp Cys Ser Ser Ala Lys Thr Phe Phe Met Tyr Met Thr Asp Gly Met 225 230 235 240 Leu Leu Arg Glu Ala Met Asn Asp Pro Leu Leu Glu Arg Tyr Gly Val 245 250 255 Ile Ile Leu Asp Glu Ala His Glu Arg Thr Leu Ala Thr Asp Ile Leu 260 265 270 Met Gly Val Leu Lys Glu Val Val Arg Gln Arg Ser Asp Leu Lys Val 275 280 285 Ile Val Met Ser Ala Thr Leu Asp Ala Gly Lys Phe Gln Ile Tyr Phe 290 295 300 Asp Asn Cys Pro Leu Leu Thr Ile Pro Gly Arg Thr His Pro Val Glu 305 310 315 320 Ile Phe Tyr Thr Pro Glu Pro Glu Arg Asp Tyr Leu Glu Ala Ala Ile 325 330 335 Arg Thr Val Ile Gln Ile His Met Cys Glu Glu Glu Glu Gly Asp Leu 340 345 350 Leu Leu Phe Leu Thr Gly Gln Glu Glu Ile Asp Glu Ala Cys Lys Arg 355 360 365 Ile Lys Arg Glu Val Asp Asp Leu Gly Pro Glu Val Gly Asp Ile Lys 370 375 380 Ile Ile Pro Leu Tyr Ser Thr Leu Pro Pro Gln Gln Gln Gln Arg Ile 385 390 395 400 Phe Glu Pro Pro Pro Pro Lys Lys Gln Asn Gly Ala Ile Gly Arg Lys 405 410 415 Val Val Val Ser Thr Asn Ile Ala Glu Thr Ser Leu Thr Ile Asp Gly 420 425 430 Val Val Phe Val Ile Asp Pro Gly Phe Ala Lys Gln Lys Val Tyr Asn 435 440 445 Pro Arg Ile Arg Val Glu Ser Leu Leu Val Thr Ala Ile Ser Lys Ala 450 455 460 Ser Ala Gln Gln Arg Ala Gly Arg Ala Gly Arg Thr Arg Pro Gly Lys 465 470 475 480 Cys Phe Arg Leu Tyr Thr Glu Lys Ala Tyr Lys Thr Glu Met Gln Asp 485 490 495 Asn Thr Tyr Pro Glu Ile Leu Arg Ser Asn Leu Gly Ser Val Val Leu 500 505 510 Gln Leu Lys Lys Leu Gly Ile Asp Asp Leu Val His Phe Asp Phe Met 515 520 525 Asp Pro Pro Ala Pro Glu Thr Leu Met Arg Ala Leu Glu Leu Leu Asn 530 535 540 Tyr Leu Ala Ala Leu Asn Asp Asp Gly Asp Leu Thr Glu Leu Gly Ser 545 550 555 560 Met Met Ala Glu Phe Pro Leu Asp Pro Gln Leu Ala Lys Met Val Ile 565 570 575 Ala Ser Cys Asp Tyr Asn Cys Ser Asn Glu Val Leu Ser Ile Thr Ala 580 585 590 Met Leu Ser Val Pro Gln Cys Phe Val Arg Pro Thr Glu Ala Lys Lys 595 600 605 Ala Ala Asp Glu Ala Lys Met Arg Phe Ala His Ile Asp Gly Asp His 610 615 620 Leu Thr Leu Leu Asn Val Tyr His Ala Phe Lys Gln Asn His Glu Ser 625 630 635 640 Val Gln Trp Cys Tyr Asp Asn Phe Ile Asn Tyr Arg Ser Leu Met Ser 645 650 655 Ala Asp Asn Val Arg Gln Gln Leu Ser Arg Ile Met Asp Arg Phe Asn 660 665 670 Leu Pro Arg Arg Ser Thr Asp Phe Thr Ser Arg Asp Tyr Tyr Ile Asn 675 680 685 Ile Arg Lys Ala Leu Val Thr Gly Tyr Phe Met Gln Val Ala His Leu 690 695 700 Glu Arg Thr Gly His Tyr Leu Thr Val Lys Asp Asn Gln Val Val Gln 705 710 715 720 Leu His Pro Ser Thr Val Leu Asp His Lys Pro Glu Trp Val Leu Tyr 725 730 735 Asn Glu Phe Val Leu Thr Thr Lys Asn Tyr Ile Arg Thr Cys Thr Asp 740 745 750 Ile Lys Pro Glu Trp Leu Val Lys Ile Ala Pro Gln Tyr Tyr Asp Met 755 760 765 Ser Asn Phe Pro Gln Cys Glu Ala Lys Arg Gln Leu Asp Arg Ile Ile 770 775 780 Ala Gln Thr Ser Ile Gln Gly Ile Phe Thr Val Leu Asn Ser Val Leu 785 790 795 800 Arg Thr Glu Val Ile Glu Arg Thr Ala Leu Lys Asp Glu 805 810
【０１４７】配列番号：３ 配列の長さ：３０２８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ホモ・サピエンス 配列の特徴 他の情報：human CDC28-#46 RNA helicase 配列： CTCGTCGCCG CCGCCATTTT AGCTGTTGGT TCCGGCCGCA CCGTGTGGGC TGTAGTAGCG 60 GGAGGGGTGG GGGTCCTCCA GAGTTAAGTG GCTGTCCTCG ACTGTGCCCA TACAGCAGCC 120 AGCTTTCTTC CTTAATAACT GCCCGTTCGA AGAGTGCGAG GATGTCCAAG CGGCACCGGT 180 TGGACCTAGG GGAGGATTAC CCCTCTGGCA AGAAGCGTGC GGGGACCGAT GGGAAGGATC 240 GAGATCGAGA CCGGGATCGT GAAGATCGGT CTAAAGATCG AGACCGAGAA CGTGATAGAG 300 GAGATAGAGA GCGAGAGAGG GAGAAAGAAA AGGAGAAGGA GTTGCGAGCT TCAACAAATG 360 CTATGCTTAT CAGTGCTGGA TTACCACCCC TGAAAGCTTC CCATTCAGCT CACTCAACCC 420 ACTCAGCACA TTCAACGCAT TCTACACATT CTGCTCATTC AACGCATGCC GGACATGCAG 480 GTCACACGTC ACTTCCACAG TGCATTAATC CGTTCACCAA CTTACCCCAT ACTCCTCGAT 540 ACTATGATAT TCTAAAGAAA CGTCTTCAGC TCCCTGTTTG GGAATACAAG GATAGGTTTA 600 CAGATATTCT GGGTAGACAT CAGTCCTTTG TACTGGTTGG TGAGACTGGG TCTGGTAAAA 660 CAACACAAAT TCCACACCGG TGTGTGGAGT ACATGCGATC ATTACCAGGA CCCAAGAGAG 720 GAGTTGCCTG TACCCAACCC AGGAGAGTGG CTGCAATGAG TGTGGCTCAG AGAGTTGCTG 780 ATGAGATGGA TGTGATGTTG GGCCAGGAAG TTGGTTACTC CATTCGATTT GAAGACTGCA 840 GTAGTGCAAA AACATTTTTT ATGTATATGA CTGATGGGAT GTTACTTCGT GAAGCTATGA 900 ATGATCCCCT CCTGGAGCGT TATGGTGTAA TAATTCTTGA TGAGGCTCAT GAGAGGACAC 960 TGGCTACAGA TATTCTAATG GGTGTTCTGA AGGAAGTTGT AAGACAGAGA TCAGATTTAA 1020 AGGTTATAGT TATGAGCGCT ACTCTAGATG CAGGAAAATT CCAGATTTAC TTTGATAACT 1080 GTCCTCTCCT AACTATTCCT GGGCGTACAC ATCCTGTTGA GATCTTCTAT ACTCCAGAAC 1140 CAGAGAGAGA TTATCTTGAA GCAGCAATTC GAACAGTTAT CCAGATTCAT ATGTGTGAAG 1200 AGGAAGAGGG AGATCTTCTT CTTTTCTTAA CTGGTCAAGA GGAAATTGAT GAAGCCTGTA 1260 AGAGAATAAA GCGTGAAGTT GATGATTTGG GCCCTGAAGT TGGTGACATT AAAATCATTC 1320 CATTGTATTC TACACTTCCA CCTCAGCAGC AGCAACGCAT TTTTGAGCCT CCACCTCCCA 1380 AAAAACAGAA TGGAGCAATT GGAAGAAAGG TAGTTGTGTC AACTAACATA GCAGAGACGT 1440 CTTTGACAAT AGATGGTGTG GTGTTTGTGA TTGATCCTGG ATTTGCGAAA CAGAAGGTCT 1500 ACAATCCTCG AATCAGAGTT GAGTCCCTTT TGGTGACAGC TATTAGTAAA GCTTCAGCTC 1560 AGCAAAGGGC TGGTCGAGCT GGACGTACCA GACCTGGAAA ATGCTTCAGA CTTTACACAG 1620 AGAAAGCTTA TAAAACAGAA ATGCAGGATA ACACCTATCC TGAGATTTTG CGTTCTAATT 1680 TAGGATCAGT TGTGTTACAA TTGAAGAAAC TTGGTATTGA TGACTTGGTA CATTTTGATT 1740 TTATGGATCC ACCAGCTCCT GAAACTCTGA TGAGAGCCCT GGAACTTTTG AATTACCTGG 1800 CTGCTTTAAA TGATGATGGA GATCTGACTG AATTGGGATC CATGATGGCA GAGTTTCCTC 1860 TAGATCCACA GCTCGCAAAA ATGGTTATTG CAAGTTGTGA CTACAACTGT TCTAATGAGG 1920 TCCTATCTAT TACTGCTATG TTGTCAGTCC CACAGTGTTT TGTTCGCCCC ACGGAGGCCA 1980 AGAAAGCCGC AGATGAGGCC AAGATGAGAT TTGCCCACAT AGATGGAGAT CATCTGACAC 2040 TGCTGAACGT CTACCATGCT TTTAAACAAA ATCATGAATC GGTTCAGTGG TGTTATGACA 2100 ACTTCATTAA CTACAGGTCC CTGATGTCCG CGGACAATGT ACGCCAGCAG CTATCTCGAA 2160 TTATGGACAG ATTTAATTTG CCTCGTCGAA GTACTGACTT TACAAGCAGG GACTATTATA 2220 TTAATATAAG AAAAGCTTTG GTTACTGGGT ATTTTATGCA GGTGGCACAT TTAGAACGAA 2280 CAGGGCATTA CTTAACTGTG AAAGATAACC AGGTGGTTCA GTTGCATCCC TCTACTGTTC 2340 TTGACCACAA ACCTGAATGG GTGCTTTATA ATGAGTTTGT TCTAACAACA AAGAATTACA 2400 TCCGGACATG TACAGACATC AAGCCAGAAT GGTTGGTGAA AATTGCCCCT CAATATTATG 2460 ACATGAGCAA TTTCCCACAG TGTGAAGCAA AGAGACAGTT GGACCGCATC ATTGCCCAAA 2520 CTTCAATCCA AGGAATATTC ACAGTACTGA ATTCAGTGCT TAGAACTGAA GTTATTGAGA 2580 GGACAGCTTT AAAAGATGAA TGAACTCAAA AGTTCGAGTT GTGCTCTTCA CGTTGGTTCG 2640 ATAATGGCCT TTATTTGAAA GCTTTTTAAT TTTTCTTTAC AGTAAATATT CCATTCTGAT 2700 TTCATAAATT AAACATTTAT GCCTCCCTTT TGTGTTGACA CTGTAGCTCA TACTGGAAAA 2760 GTCGATCAAT GTTTTGCAGT TTATTGAAAG TAGTTCTATA TATAACAATG TTATAAGCAT 2820 TTCTTTAGAA ATGGTTGAAA ATGCTTCTAA AATGTGATTA TCGACCATGG TATGCATGAT 2880 CGTTGTAATT GTTGACATTC CTTTTAGAAG TTGTGAAATG TTACAACTTG TGCTTATGTA 2940 GACACAATTT TTTGTTTCAG TACCAGAGGC ACTGACTTCA ATAAAGTTTA TTTATACGGA 3000 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA 3028
【０１４８】配列番号：４ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC 24
【０１４９】配列番号：５ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TCACACAGGA AACAGCTATG AC 22
【０１５０】配列番号：６ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GATTTAGGTG ACACTATAG 19
【０１５１】配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TAATACGACT CACTATAGGG 20
【０１５２】配列番号：８ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GAYGARGCNC AYGARAGRAC RCT 23
【０１５３】配列番号：９ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：9 他の情報：N ＝inosine 特徴を表す記号：modified base 存在位置：11 他の情報：N ＝inosine 配列： ＧＡＮＧＴＹＴＣＮＧ ＣＮＡＴＲＴＴＮＧＴ ＴＧ
２２
２２
【０１５４】配列番号：１０ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧ ＧＣＴＣＡＡＡＡＡＴ ＧＣＧＴＴＧＣ
２７
２７
【０１５５】配列番号：１１ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGCTCAAAAA TGCGTTGCTG CTGCTGA 27
【０１５６】配列番号：１２ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AAGCTGGCTG CTGTATGGGC ACAGTCGA 28
【０１５７】配列番号：１３ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGCTGCTGTA TGGGCACAGT CGAGGACA 28
【０１５８】配列番号：１４ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGCTGTATGG GCACAGTCGA GGACAGCC 28
【０１５９】配列番号：１５ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TACACTTCCA CCTCAGCAGC AGCAACGC 28
【０１６０】配列番号：１６ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AGCAGCAGCA ACGCATTTTT GAGCCTCC 28
【０１６１】配列番号：１７ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC 27
【０１６２】配列番号：１８ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ACTCACTATA GGGCTCGAGC GGC 23
【０１６３】配列番号：１９ 配列の長さ：５０４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ホモ・サピエンス 配列の特徴 他の情報：human CDC28-#46 RNA helicase 配列： GATGAGGCTC ATGAGAGGAC ACTGGCTACA GATATTCTAA TGGGTGTTCT GAAGGAAGTT 60 GTAAGACAGA GATCAGATTT AAAGGTTATA GTTATGAGCG CTACTCTAGA TGCAGGAAAA 120 TTCCAGATTT ACTTTGATAA CTGTCCTCTC CTAACTATTC CTGGGCGTAC ACATCCTGTT 180 GAGATCTTCT ATACTCCAGA ACCAGAGAGA GATTATCTTG AAGCAGCAAT TCGAACAGTT 240 ATCCAGATTC ATATGTGTGA AGAGGAAGAG GGAGATCTTC TTCTTTTCTT AACTGGTCAA 300 GAGGAAATTG ATGAAGCCTG TAAGAGAATA AAGCGTGAAG TTGATGATTT GGGCCCTGAA 360 GTTGGTGACA TTAAAATCAT TCCATTGTAT TCTACACTTC CACCTCAGCA GCAGCAACGC 420 ATTTTTGAGC CTCCACCTCC CAAAAAACAG AATGGAGCAA TTGGAAGAAA GGTAGTTGTG 480 TCAACTAACA TAGCAGAGAC GTCT 504
【０１６４】配列番号：２０ 配列の長さ：１３０３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ホモ・サピエンス 配列の特徴 他の情報：human CDC28-#46 RNA helicase 配列： GTGGGGGTCC TCCAGAGTTA AGTGGCTGTC CTCGACTGTG CCCATACAGC AGCCAGCTTT 60 CTTCCTTAAT AACTGCCCGT TCGAAGAGTG CGAGGATGTC CAAGCGGCAC CGGTTGGACC 120 TAGGGGAGGA TTACCCCTCT GGCAAGAAGC GTGCGGGGAC CGATGGGAAG GATCGAGATC 180 GAGACCGGGA TCGTGAAGAT CGGTCTAAAG ATCGAGACCG AGAACGTGAT AGAGGAGATA 240 GAGAGCGAGA GAGGGAGAAA GAAAAGGAGA AGGAGTTGCG AGCTTCAACA AATGCTATGC 300 TTATCAGTGC TGGATTACCA CCCCTGAAAG CTTCCCATTC AGCTCACTCA ACCCACTCAG 360 CACATTCAAC GCATTCTACA CATTCTGCTC ATTCAACGCA TGCCGGACAT GCAGGTCACA 420 CGTCACTTCC ACAGTGCATT AATCCGTTCA CCAACTTACC CCATACTCCT CGATACTATG 480 ATATTCTAAA GAAACGTCTT CAGCTCCCTG TTTGGGAATA CAAGGATAGG TTTACAGATA 540 TTCTGGGTAG ACATCAGTCC TTTGTACTGG TTGGTGAGAC TGGGTCTGGT AAAACAACAC 600 AAATTCCACA CCGGTGTGTG GAGTACATGC GATCATTACC AGGACCCAAG AGAGGAGTTG 660 CCTGTACCCA ACCCAGGAGA GTGGCTGCAA TGAGTGTGGC TCAGAGAGTT GCTGATGAGA 720 TGGATGTGAT GTTGGGCCAG GAAGTTGGTT ACTCCATTCG ATTTGAAGAC TGCAGTAGTG 780 CAAAAACATT TTTTATGTAT ATGACTGATG GGATGTTACT TCGTGAAGCT ATGAATGATC 840 CCCTCCTGGA GCGTTATGGT GTAATAATTC TTGATGAGGC TCATGAGAGG ACACTGGCTA 900 CAGATATTCT AATGGGTGTT CTGAAGGAAG TTGTAAGACA GAGATCAGAT TTAAAGGTTA 960 TAGTTATGAG CGCTACTCTA GATGCAGGAA AATTCCAGAT TTACTTTGAT AACTGTCCTC 1020 TCCTAACTAT TCCTGGGCGT ACACATCCTG TTGAGATCTT CTATACTCCA GAACCAGAGA 1080 GAGATTATCT TGAAGCAGCA ATTCGAACAG TTATCCAGAT TCATATGTGT GAAGAGGAAG 1140 AGGGAGATCT TCTTCTTTTC TTAACTGGTC AAGAGGAAAT TGATGAAGCC TGTAAGAGAA 1200 TAAAGCGTGA AGTTGATGAT TTGGGCCCTG AAGTTGGTGA CATTAAAATC ATTCCATTGT 1260 ATTCTACACT TCCACCTCAG CAGCAGCAAC GCATTTTTGA GCC 1303
【０１６５】配列番号：２１ 配列の長さ：１１７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ホモ・サピエンス 配列の特徴 他の情報：human CDC28-#46 RNA helicase 配列： CTCGTCGCCG CCGCCATTTT AGCTGTTGGT TCCGGCCGCA CCGTGTGGGC TGTAGTAGCG 60 GGAGGGGTGG GGGTCCTCCA GAGTTAAGTG GCTGTCCTCG ACTGTGCCCA TACAGCA 117
【０１６６】配列番号：２２ 配列の長さ：１６８４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ホモ・サピエンス 配列の特徴 他の情報：human CDC28-#46 RNA helicase 配列： AGCAGCAGCA ACGCATTTTT GAGCCTCCAC CTCCCAAAAA ACAGAATGGA GCAATTGGAA 60 GAAAGGTAGT TGTGTCAACT AACATAGCAG AGACGTCTTT GACAATAGAT GGTGTGGTGT 120 TTGTGATTGA TCCTGGATTT GCGAAACAGA AGGTCTACAA TCCTCGAATC AGAGTTGAGT 180 CCCTTTTGGT GACAGCTATT AGTAAAGCTT CAGCTCAGCA AAGGGCTGGT CGAGCTGGAC 240 GTACCAGACC TGGAAAATGC TTCAGACTTT ACACAGAGAA AGCTTATAAA ACAGAAATGC 300 AGGATAACAC CTATCCTGAG ATTTTGCGTT CTAATTTAGG ATCAGTTGTG TTACAATTGA 360 AGAAACTTGG TATTGATGAC TTGGTACATT TTGATTTTAT GGATCCACCA GCTCCTGAAA 420 CTCTGATGAG AGCCCTGGAA CTTTTGAATT ACCTGGCTGC TTTAAATGAT GATGGAGATC 480 TGACTGAATT GGGATCCATG ATGGCAGAGT TTCCTCTAGA TCCACAGCTC GCAAAAATGG 540 TTATTGCAAG TTGTGACTAC AACTGTTCTA ATGAGGTCCT ATCTATTACT GCTATGTTGT 600 CAGTCCCACA GTGTTTTGTT CGCCCCACGG AGGCCAAGAA AGCCGCAGAT GAGGCCAAGA 660 TGAGATTTGC CCACATAGAT GGAGATCATC TGACACTGCT GAACGTCTAC CATGCTTTTA 720 AACAAAATCA TGAATCGGTT CAGTGGTGTT ATGACAACTT CATTAACTAC AGGTCCCTGA 780 TGTCCGCGGA CAATGTACGC CAGCAGCTAT CTCGAATTAT GGACAGATTT AATTTGCCTC 840 GTCGAAGTAC TGACTTTACA AGCAGGGACT ATTATATTAA TATAAGAAAA GCTTTGGTTA 900 CTGGGTATTT TATGCAGGTG GCACATTTAG AACGAACAGG GCATTACTTA ACTGTGAAAG 960 ATAACCAGGT GGTTCAGTTG CATCCCTCTA CTGTTCTTGA CCACAAACCT GAATGGGTGC 1020 TTTATAATGA GTTTGTTCTA ACAACAAAGA ATTACATCCG GACATGTACA GACATCAAGC 1080 CAGAATGGTT GGTGAAAATT GCCCCTCAAT ATTATGACAT GAGCAATTTC CCACAGTGTG 1140 AAGCAAAGAG ACAGTTGGAC CGCATCATTG CCCAAACTTC AATCCAAGGA ATATTCACAG 1200 TACTGAATTC AGTGCTTAGA ACTGAAGTTA TTGAGAGGAC AGCTTTAAAA GATGAATGAA 1260 CTCAAAAGTT CGAGTTGTGC TCTTCACGTT GGTTCGATAA TGGCCTTTAT TTGAAAGCTT 1320 TTTAATTTTT CTTTACAGTA AATATTCCAT TCTGATTTCA TAAATTAAAC ATTTATGCCT 1380 CCCTTTTGTG TTGACACTGT AGCTCATACT GGAAAAGTCG ATCAATGTTT TGCAGTTTAT 1440 TGAAAGTAGT TCTATATATA ACAATGTTAT AAGCATTTCT TTAGAAATGG TTGAAAATGC 1500 TTCTAAAATG TGATTATCGA CCATGGTATG CATGATCGTT GTAATTGTTG ACATTCCTTT 1560 TAGAAGTTGT GAAATGTTAC AACTTGTGCT TATGTAGACA CAATTTTTTG TTTCAGTACC 1620 AGAGGCACTG ACTTCAATAA AGTTTATTTA TACGGAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1680 AAAA 1684
【図１】本発明のヒト CDC28-#46遺伝子のクローニング
手法の概要を示す図である。
手法の概要を示す図である。
【図２】ヒト CDC28-#46遺伝子がコードするタンパク質
を示す模式図である。
を示す模式図である。
【図３】ヒト CDC28-#46遺伝子を含む P1 DNA を用いた
FISH による解析結果を示す写真である (生物の形
態)。
FISH による解析結果を示す写真である (生物の形
態)。
【図４】ヒト CDC28-#46遺伝子のサザンブロットによる
解析結果を示す電気泳動写真である。
解析結果を示す電気泳動写真である。
【図５】ヒト CDC28-#46遺伝子のノーザンブロットによ
る解析結果を示す電気泳動写真である。
る解析結果を示す電気泳動写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (15)
- 【請求項１】 配列番号２で表されるアミノ酸配列又は
該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加された配列を含み、ヘリカーゼ活
性をもたらすタンパク質をコードする遺伝子。 - 【請求項２】 遺伝子が、配列番号１又は３で表される
塩基配列を含むものである請求項１記載の遺伝子。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載の遺伝子の少なくと
も一部とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレ
オチドプローブ。 - 【請求項４】 請求項１又は２記載の遺伝子を含む組換
え体ＤＮＡ。 - 【請求項５】 請求項４記載の組換え体ＤＮＡによって
形質転換された形質転換体。 - 【請求項６】 請求項５記載の形質転換体を培養し、得
られる培養物からヘリカーゼ活性をもたらすタンパク質
を採取することを特徴とする該タンパク質の製造方法。 - 【請求項７】 配列番号２で表されるアミノ酸配列又は
該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加された配列を含み、ヘリカーゼ活
性をもたらすタンパク質。 - 【請求項８】 請求項７記載のタンパク質と特異的に反
応するモノクローナル抗体。 - 【請求項９】 請求項７記載のタンパク質と特異的に反
応するポリクローナル抗体。 - 【請求項１０】 請求項７記載のタンパク質で免疫され
た抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることに
より得られる、請求項８記載のモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ。 - 【請求項１１】 請求項３記載のオリゴヌクレオチドプ
ローブを含む、ヘリカーゼ活性をもたらすタンパク質を
コードする遺伝子の検出用試薬。 - 【請求項１２】 遺伝子が、配列番号１又は３で表され
る塩基配列を含むものである請求項１１記載の試薬。 - 【請求項１３】 請求項７記載のタンパク質、及び請求
項９記載のモノクローナル抗体又は請求項１０記載のポ
リクローナル抗体を含む、老化に伴う疾患の検出用試
薬。 - 【請求項１４】 請求項１又は２記載の遺伝子の機能が
失われるように処理されたノックアウトマウス。 - 【請求項１５】 請求項１又は２記載の遺伝子の発現レ
ベルを上昇又は下降するように修飾された遺伝子が導入
されたトランスジェニック動物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9149101A JPH10337183A (ja) | 1997-06-06 | 1997-06-06 | ヘリカーゼをコードするヒトの遺伝子，ｃｄｃ２８−＃４６ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9149101A JPH10337183A (ja) | 1997-06-06 | 1997-06-06 | ヘリカーゼをコードするヒトの遺伝子，ｃｄｃ２８−＃４６ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10337183A true JPH10337183A (ja) | 1998-12-22 |
Family
ID=15467727
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9149101A Pending JPH10337183A (ja) | 1997-06-06 | 1997-06-06 | ヘリカーゼをコードするヒトの遺伝子，ｃｄｃ２８−＃４６ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10337183A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001087951A1 (fr) * | 2000-05-09 | 2001-11-22 | Shanghai Biowindow Gene Development Inc. | Nouveau polypeptide, helicase humaine 11, et polynucleotide codant pour ce polypeptide |
| WO2002024908A1 (fr) * | 2000-09-22 | 2002-03-28 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Nouveau polypeptide secretoire specifique d'un tissu et adn correspondant |
-
1997
- 1997-06-06 JP JP9149101A patent/JPH10337183A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001087951A1 (fr) * | 2000-05-09 | 2001-11-22 | Shanghai Biowindow Gene Development Inc. | Nouveau polypeptide, helicase humaine 11, et polynucleotide codant pour ce polypeptide |
| WO2002024908A1 (fr) * | 2000-09-22 | 2002-03-28 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Nouveau polypeptide secretoire specifique d'un tissu et adn correspondant |
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