JPH10243799A - 微生物の同定法 - Google Patents
微生物の同定法Info
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- JPH10243799A JPH10243799A JP6396997A JP6396997A JPH10243799A JP H10243799 A JPH10243799 A JP H10243799A JP 6396997 A JP6396997 A JP 6396997A JP 6396997 A JP6396997 A JP 6396997A JP H10243799 A JPH10243799 A JP H10243799A
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- Japan
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- pectinatus
- ribotyping
- kbp
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ビール混濁菌であるペクチネイタス属の菌、
特にペクチネイタス セレビシフィラス（Pectinatus
cerevisiiphilus）、ペクチネイタス フリシンジェン
シス（Pectinatus frisingensis）を同定するための方
法を提供する。 【解決手段】 制限断片長多形性を利用した遺伝子型の
決定法において、リボタイピングでハイブリダイズする
ＤＮＡ断片を比較してペクチネイタス属細菌の存在を同
定することを特徴とする微生物の同定法。
特にペクチネイタス セレビシフィラス（Pectinatus
cerevisiiphilus）、ペクチネイタス フリシンジェン
シス（Pectinatus frisingensis）を同定するための方
法を提供する。 【解決手段】 制限断片長多形性を利用した遺伝子型の
決定法において、リボタイピングでハイブリダイズする
ＤＮＡ断片を比較してペクチネイタス属細菌の存在を同
定することを特徴とする微生物の同定法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ビール混濁菌であ
るペクチネイタス属の菌、特にペクチネイタスセレビシ
フィラス（Pectinatus cerevisiiphilus）、ペクチネ
イタス フリシンジェンシス（Pectinatus frisingens
is）を同定するための方法に関する。
るペクチネイタス属の菌、特にペクチネイタスセレビシ
フィラス（Pectinatus cerevisiiphilus）、ペクチネ
イタス フリシンジェンシス（Pectinatus frisingens
is）を同定するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ペク
チネイタス属細菌は、Leeらによってビール混濁菌とし
て発見、同定、報告されているグラム陰性、偏性嫌気性
細菌である（Inter. J. System. Bacter.,Vol.28, p.58
2, 1978）。この後、この菌によるビール混濁の事例が
あり、検出方法の開発が進められてきた。例えば、サン
プル捕集の条件を検討し、アクリジンオレンジによって
ペクチネイタス属細菌を検出する方法（Haikara, A. J.
Amer. Soc. Brew. Chem., Vol.43, p.43, 1985）、抗
体を用いて選択的に検出する方法（Hakalehto, E. et a
l., FEMS Microbiol., Vol.67, p.307, 1990, Grares,
S. L, et al., J. Amer. Soc. Brew. Chem., Vol.51,
p.158, 1993）、ペクチネイタス属細菌を選択的に検出
できる培地の検討（Lee, S. Y. J. Amer. Soc. Brew. C
hem., Vol.52, p.115, 1994）などが報告されている。
しかし、これらの方法は全て種（species）を特定する
もので、株（strain）を特定できるものではない。
チネイタス属細菌は、Leeらによってビール混濁菌とし
て発見、同定、報告されているグラム陰性、偏性嫌気性
細菌である（Inter. J. System. Bacter.,Vol.28, p.58
2, 1978）。この後、この菌によるビール混濁の事例が
あり、検出方法の開発が進められてきた。例えば、サン
プル捕集の条件を検討し、アクリジンオレンジによって
ペクチネイタス属細菌を検出する方法（Haikara, A. J.
Amer. Soc. Brew. Chem., Vol.43, p.43, 1985）、抗
体を用いて選択的に検出する方法（Hakalehto, E. et a
l., FEMS Microbiol., Vol.67, p.307, 1990, Grares,
S. L, et al., J. Amer. Soc. Brew. Chem., Vol.51,
p.158, 1993）、ペクチネイタス属細菌を選択的に検出
できる培地の検討（Lee, S. Y. J. Amer. Soc. Brew. C
hem., Vol.52, p.115, 1994）などが報告されている。
しかし、これらの方法は全て種（species）を特定する
もので、株（strain）を特定できるものではない。
【０００３】前記のような課題に対応できる技術とし
て、本発明では、制限断片長多形性（ＲＦＬＰ、restri
ction fragment length polymorphism）について検討を
加えた。この制限断片長多形性とは、制限酵素によって
切断された断片のパターンの解析であり、バンドパター
ンを電気泳動により検出して比較検討するものである。
この制限断片長多形性を利用した遺伝子型の決定法とし
ては、特開昭６２−１１１６９９、特表平６−５１１３
８０、特開平７−５９５６８、特開平７−５９５７７な
どがあり、すでに医薬、植物、飲食品の分野で利用され
ている。このうち、リボソームRNA遺伝子の多型性に着
目したものを、リボタイピングと称している。この方法
によれば、試験に供する菌株の種（species）、亜種（s
ubspeices）、株（strain）のレベルでの同定が可能と
なることが報告されている。
て、本発明では、制限断片長多形性（ＲＦＬＰ、restri
ction fragment length polymorphism）について検討を
加えた。この制限断片長多形性とは、制限酵素によって
切断された断片のパターンの解析であり、バンドパター
ンを電気泳動により検出して比較検討するものである。
この制限断片長多形性を利用した遺伝子型の決定法とし
ては、特開昭６２−１１１６９９、特表平６−５１１３
８０、特開平７−５９５６８、特開平７−５９５７７な
どがあり、すでに医薬、植物、飲食品の分野で利用され
ている。このうち、リボソームRNA遺伝子の多型性に着
目したものを、リボタイピングと称している。この方法
によれば、試験に供する菌株の種（species）、亜種（s
ubspeices）、株（strain）のレベルでの同定が可能と
なることが報告されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、このリボタイ
ピングを利用した判定法を利用して、ビール混濁菌であ
るペクチネイタス属の菌、特に、ペクチネイタス セレ
ビシフィラス（Pectinatus cerevisiiphilus）、ペクチ
ネイタス フリシンジェンシス（Pectinatus frisingen
sis）を同定、さらには株の特定をするための方法を提
供するものである。
ピングを利用した判定法を利用して、ビール混濁菌であ
るペクチネイタス属の菌、特に、ペクチネイタス セレ
ビシフィラス（Pectinatus cerevisiiphilus）、ペクチ
ネイタス フリシンジェンシス（Pectinatus frisingen
sis）を同定、さらには株の特定をするための方法を提
供するものである。
【０００５】即ち、本発明は制限断片長多形性を利用し
た遺伝子型の決定法において、リボタイピングでハイブ
リダイズするＤＮＡ断片を比較してペクチネイタス属細
菌の存在を同定することを特徴とする微生物の同定法で
ある。リボタイピングによる同定方法はすでに公知の方
法（Proc. Natl. Acad. Sci.USA, Vol.92, pp5229, 199
5、J. CLIN. MICROBIOL., VOL.34, NO.9, 2294-2296, 1
996）に基づき実施することができる。基本となる操作
方法は次のとおりである。すなわち、細菌から全ＤＮＡ
を抽出し、制限酵素を用いて切断する。その後、アガロ
ースゲル電気泳動を行い、切断されたＤＮＡ断片は大き
さによって分離される。膜に転写されたＤＮＡを１本鎖
化して適当なプローブを用いてサザンブロッテイング法
によってハイブリダイゼーションを行い、洗浄後、標識
をし、標識に基づきプローブがついた部分が確認され
る。
た遺伝子型の決定法において、リボタイピングでハイブ
リダイズするＤＮＡ断片を比較してペクチネイタス属細
菌の存在を同定することを特徴とする微生物の同定法で
ある。リボタイピングによる同定方法はすでに公知の方
法（Proc. Natl. Acad. Sci.USA, Vol.92, pp5229, 199
5、J. CLIN. MICROBIOL., VOL.34, NO.9, 2294-2296, 1
996）に基づき実施することができる。基本となる操作
方法は次のとおりである。すなわち、細菌から全ＤＮＡ
を抽出し、制限酵素を用いて切断する。その後、アガロ
ースゲル電気泳動を行い、切断されたＤＮＡ断片は大き
さによって分離される。膜に転写されたＤＮＡを１本鎖
化して適当なプローブを用いてサザンブロッテイング法
によってハイブリダイゼーションを行い、洗浄後、標識
をし、標識に基づきプローブがついた部分が確認され
る。
【０００６】この基本操作方法をもとに、本発明ではビ
ール混濁菌であるペクチネイタス属菌の同定方法を完成
した。本方法についてさらに詳しく説明する。ペクチネ
イタス属菌は全ＤＮＡを抽出するにあたって、チオグリ
コール酸培地II（ニッスイ社製）で３０℃、３日間嫌気
条件下で増殖させた後、菌体を滅菌蒸留水にて洗浄し、
遠心回収した。ＤＮＡ抽出は、リゾチーム、N-アセチル
ムラミダーゼにて細胞壁を溶解後、プロテイナーゼＫで
蛋白質の分解を行った。その後、クロロホルム／イソペ
ンタノール抽出後、RNaseによるＲＮＡ分解、再びクロ
ロホルム／イソペンタノール抽出を経て、冷エタノール
により、ＤＮＡを沈殿させ、回収した。最終精製として
CHROMA SPIN （登録商標）カラム（CLONTECH社製）を用
いた。制限酵素による処理方法、アガロースゲル電気泳
動は、サザンブロッテイング法により、Molecular Clon
ing （second edition, J. Sambrook, E.F. Fritsch,
T. Maniatis (ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess）に記載されている通常の方法を用いておこなっ
た。プローブは、大腸菌のリボソームRNA遺伝子を用い
ておこなった。
ール混濁菌であるペクチネイタス属菌の同定方法を完成
した。本方法についてさらに詳しく説明する。ペクチネ
イタス属菌は全ＤＮＡを抽出するにあたって、チオグリ
コール酸培地II（ニッスイ社製）で３０℃、３日間嫌気
条件下で増殖させた後、菌体を滅菌蒸留水にて洗浄し、
遠心回収した。ＤＮＡ抽出は、リゾチーム、N-アセチル
ムラミダーゼにて細胞壁を溶解後、プロテイナーゼＫで
蛋白質の分解を行った。その後、クロロホルム／イソペ
ンタノール抽出後、RNaseによるＲＮＡ分解、再びクロ
ロホルム／イソペンタノール抽出を経て、冷エタノール
により、ＤＮＡを沈殿させ、回収した。最終精製として
CHROMA SPIN （登録商標）カラム（CLONTECH社製）を用
いた。制限酵素による処理方法、アガロースゲル電気泳
動は、サザンブロッテイング法により、Molecular Clon
ing （second edition, J. Sambrook, E.F. Fritsch,
T. Maniatis (ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess）に記載されている通常の方法を用いておこなっ
た。プローブは、大腸菌のリボソームRNA遺伝子を用い
ておこなった。
【０００７】なお、最近では菌の培養以降の工程をすべ
て機械で自動的に行うことが可能である。例えば、機械
としてはクオリコン社製のRiboPrinter(登録商標) Micr
obial Characterization System (Qualicon L.L.C., US
A) がある。しかし、もちろん手動でこれらの試験を行
っても差し支えないが、効率的、精度的あるいは再現性
に注意を要する。
て機械で自動的に行うことが可能である。例えば、機械
としてはクオリコン社製のRiboPrinter(登録商標) Micr
obial Characterization System (Qualicon L.L.C., US
A) がある。しかし、もちろん手動でこれらの試験を行
っても差し支えないが、効率的、精度的あるいは再現性
に注意を要する。
【０００８】これらの手法により多数のペクチネイタス
属菌を分析した結果、株毎に特異なパターンを示すと同
時にペクチネイタス セレビシフィラス（Pectinatus c
erevisiiphilus）、ペクチネイタス フリシンジェンシ
ス（Pectinatus frisingensis）を同定することが可能
なバンドが確認された。従って、これらの種特異的な共
通バンドに注目することにより、試験菌をペクチネイタ
ス セレビシフィラス（Pectinatus cerevisiiphilu
s）、ペクチネイタス フリシンジェンシス（Pectinatu
s frisingensis）かどうかの種の同定ができる。ペクチ
ネイタス セレビシフィラス（Pectinatus cerevisiiph
ilus）で確認される共通のバンドとして、２〜３Ｋｂ
ｐ、５〜６Ｋｂｐかつ２０〜３０Ｋｂｐにバンドがあ
る。また、ペクチネイタス フリシンジェンシス（Pect
inatus frisingensis）に特徴的な共通パターンは、
２．５〜３Ｋｂｐ、７〜８Ｋｂｐかつ１０〜２０Ｋｂｐ
にバンドがある。
属菌を分析した結果、株毎に特異なパターンを示すと同
時にペクチネイタス セレビシフィラス（Pectinatus c
erevisiiphilus）、ペクチネイタス フリシンジェンシ
ス（Pectinatus frisingensis）を同定することが可能
なバンドが確認された。従って、これらの種特異的な共
通バンドに注目することにより、試験菌をペクチネイタ
ス セレビシフィラス（Pectinatus cerevisiiphilu
s）、ペクチネイタス フリシンジェンシス（Pectinatu
s frisingensis）かどうかの種の同定ができる。ペクチ
ネイタス セレビシフィラス（Pectinatus cerevisiiph
ilus）で確認される共通のバンドとして、２〜３Ｋｂ
ｐ、５〜６Ｋｂｐかつ２０〜３０Ｋｂｐにバンドがあ
る。また、ペクチネイタス フリシンジェンシス（Pect
inatus frisingensis）に特徴的な共通パターンは、
２．５〜３Ｋｂｐ、７〜８Ｋｂｐかつ１０〜２０Ｋｂｐ
にバンドがある。
【０００９】
【実施例】以下、具体的な実施例をもって本発明を説明
する。実施例１ ペクチネータス セレビシフィラス及びペク
チネイタス フリシンゲンシスのリボタイピングでの共
通バンドの確認 10mlの液体培地で増殖させたペクチネイタス セレビシ
フィラスを4℃、3500rpm、10分間で遠心した後、10mlの
滅菌蒸留水に懸濁し、再度4℃、3500rpm、10分間遠心し
菌体を回収した。次に1mlの懸濁緩衝液 (10mM Tris-HC
l, 1mM EDTA,0.35M sucrose pH8.0) に懸濁し、リゾチ
ームを1mg/ml、N-アセチルムラミダーゼを50μg/mlにな
るように添加し、37℃、１時間インキュベートを行っ
た。2mlの2×CTAB (0.1M Tris-Hcl, 1.5M NaCl, 20mM E
DTA, 2% CTAB, 2% 2-メルカプトエタノール pH8.0) を
加え、プロテイナーゼＫを80μg/mlとなるように添加
し、50℃、2時間インキュベートした。2mlのクロロホル
ム−イソペンタノール（97:3) を加え、20分間懸濁振と
うした後、室温で3500rpm、10分間遠心した。上部の水
層を別のチューブに移し、これに2mlのクロロホルム−
イソペンタノール（97:3)を加え、20分間懸濁振とうし
た後、室温で3500rpm、10分間遠心した。この操作を計
２回行った。上部の水層に、等量の2-プロパノールを添
加し、氷上で１時間以上静置した。4℃で3500rpm、10分
間遠心して上清を捨てた後、沈殿物に2mlの70%エタノー
ルを添加し、4℃で3500rpm、10分間遠心して上清を捨て
た。沈殿したDNAを３０分間減圧乾燥を行った後、0.5ml
TE (10mM Tris-HCl,1mM EDTA, pH8.0)に溶解し、RNase
Aを500μg/mlとなるように添加して、37℃１時間インキ
ュベートを行った。次に0.5mlのクロロホルム−イソペ
ンタノール (97:3) を加え、５分間懸濁振とうした後、
室温で3500rpm、10分間遠心した。上部の水層に0.5mlの
クロロホルム−イソペンタノール (97:3) を加え、５分
間懸濁振とうした後、室温で3500rpm、10分間遠心し
た。この操作を計２回行った。上清に50μlの3M酢酸ナ
トリウム (pH5.2) を添加し、1mlの冷却エタノール（9
9.5%)を添加し、-20℃で１時間以上静置した。14000rp
m、５分間遠心した後、上清を捨て、沈殿したDNAに1ml
の冷却エタノール (70%) を添加し、14000rpm、５分間
遠心した後、上清を捨て、１５分間減圧乾燥を行った。
100μlのTE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0) に溶解
し、CHROMA SPIN カラム (CLONTECH, TOYOBO社製) を用
い、最終精製を行った。得られたDNAをEcoRI処理し、そ
の300ngを1%アガロースゲル (Nusieve 3.1, TBE) にて5
0V、１時間、室温で電気泳動を行った。エチジウムブロ
マイド染色により、泳動バンドを確認した後、そのゲル
を脱プリン溶液 (250mM HCl) に浸し15分間穏やかに振
とうした後、蒸留水を３回交換して洗浄した。つぎに変
性溶液 (1.5M NaCl, 0.5M NaOH) にゲルを浸し、15分間
穏やかに振とうした後、蒸留水を３回交換して洗浄し
た。つぎに中和溶液 (1.5M NaCl, 0.5M Tris-Hcl, pH7.
5)にゲルを浸し、20分間穏やかに振とうした。さらに中
和溶液を交換し、同様の操作を行った。このゲルにナイ
ロンメンブラン（Hybond-N+, Amersham社製) を重ね合
わせ、アルカリブロッティングを行った。このメンブラ
ンをハイブリッド形成溶液 (5 ×SSC; 1%(w/v)ブロッキ
ング試薬、0.1%(w/v) N-ラウロイルサルコシン、0.2%(w
/v) SDS) の入ったプラスチックバッグに入れてシール
し、68℃で１時間以上振とうしながらインキュベートし
た。
する。実施例１ ペクチネータス セレビシフィラス及びペク
チネイタス フリシンゲンシスのリボタイピングでの共
通バンドの確認 10mlの液体培地で増殖させたペクチネイタス セレビシ
フィラスを4℃、3500rpm、10分間で遠心した後、10mlの
滅菌蒸留水に懸濁し、再度4℃、3500rpm、10分間遠心し
菌体を回収した。次に1mlの懸濁緩衝液 (10mM Tris-HC
l, 1mM EDTA,0.35M sucrose pH8.0) に懸濁し、リゾチ
ームを1mg/ml、N-アセチルムラミダーゼを50μg/mlにな
るように添加し、37℃、１時間インキュベートを行っ
た。2mlの2×CTAB (0.1M Tris-Hcl, 1.5M NaCl, 20mM E
DTA, 2% CTAB, 2% 2-メルカプトエタノール pH8.0) を
加え、プロテイナーゼＫを80μg/mlとなるように添加
し、50℃、2時間インキュベートした。2mlのクロロホル
ム−イソペンタノール（97:3) を加え、20分間懸濁振と
うした後、室温で3500rpm、10分間遠心した。上部の水
層を別のチューブに移し、これに2mlのクロロホルム−
イソペンタノール（97:3)を加え、20分間懸濁振とうし
た後、室温で3500rpm、10分間遠心した。この操作を計
２回行った。上部の水層に、等量の2-プロパノールを添
加し、氷上で１時間以上静置した。4℃で3500rpm、10分
間遠心して上清を捨てた後、沈殿物に2mlの70%エタノー
ルを添加し、4℃で3500rpm、10分間遠心して上清を捨て
た。沈殿したDNAを３０分間減圧乾燥を行った後、0.5ml
TE (10mM Tris-HCl,1mM EDTA, pH8.0)に溶解し、RNase
Aを500μg/mlとなるように添加して、37℃１時間インキ
ュベートを行った。次に0.5mlのクロロホルム−イソペ
ンタノール (97:3) を加え、５分間懸濁振とうした後、
室温で3500rpm、10分間遠心した。上部の水層に0.5mlの
クロロホルム−イソペンタノール (97:3) を加え、５分
間懸濁振とうした後、室温で3500rpm、10分間遠心し
た。この操作を計２回行った。上清に50μlの3M酢酸ナ
トリウム (pH5.2) を添加し、1mlの冷却エタノール（9
9.5%)を添加し、-20℃で１時間以上静置した。14000rp
m、５分間遠心した後、上清を捨て、沈殿したDNAに1ml
の冷却エタノール (70%) を添加し、14000rpm、５分間
遠心した後、上清を捨て、１５分間減圧乾燥を行った。
100μlのTE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0) に溶解
し、CHROMA SPIN カラム (CLONTECH, TOYOBO社製) を用
い、最終精製を行った。得られたDNAをEcoRI処理し、そ
の300ngを1%アガロースゲル (Nusieve 3.1, TBE) にて5
0V、１時間、室温で電気泳動を行った。エチジウムブロ
マイド染色により、泳動バンドを確認した後、そのゲル
を脱プリン溶液 (250mM HCl) に浸し15分間穏やかに振
とうした後、蒸留水を３回交換して洗浄した。つぎに変
性溶液 (1.5M NaCl, 0.5M NaOH) にゲルを浸し、15分間
穏やかに振とうした後、蒸留水を３回交換して洗浄し
た。つぎに中和溶液 (1.5M NaCl, 0.5M Tris-Hcl, pH7.
5)にゲルを浸し、20分間穏やかに振とうした。さらに中
和溶液を交換し、同様の操作を行った。このゲルにナイ
ロンメンブラン（Hybond-N+, Amersham社製) を重ね合
わせ、アルカリブロッティングを行った。このメンブラ
ンをハイブリッド形成溶液 (5 ×SSC; 1%(w/v)ブロッキ
ング試薬、0.1%(w/v) N-ラウロイルサルコシン、0.2%(w
/v) SDS) の入ったプラスチックバッグに入れてシール
し、68℃で１時間以上振とうしながらインキュベートし
た。
【００１０】次に、ジゴキシゲニン標識した大腸菌のrR
NA遺伝子を熱変性し、ハイブリッド形成溶液に10ng/ml
となるように加え、68℃、16時間ハイブリダイゼーショ
ンを行った。洗浄溶液Ｉ (0.1%(w/v)SDS、2×SSC) にて
室温で5分間メンブランを洗浄した後、予め68℃に加温
した洗浄溶液II (0.1%(w/v)SDS、0.1×SSC) で15分間洗
浄し、さらに新しい洗浄溶液IIに交換して15分間洗浄し
た。次に、0.3%(w/v)Tween20を含むマレイン酸緩衝液
(0.1M マレイン酸、0.15M NaCl、pH7.5) で1分間穏やか
に洗浄した後、ブロッキング溶液 (1%(w/v) ブロッキン
グ試薬（ベーリングマンハイム社製）を含むマレイン酸
溶液）で30分間室温でインキュベートした後、抗ジゴキ
シゲニン−アルカリフォスファターゼ複合体を150mU/ml
となるように加え、30分間室温で反応させた。次にマレ
イン酸緩衝液で15分間の洗浄を2回行い、トリス緩衝液
(0.1M Tris-HCl、0.1M NaCl、50mM MgCl2、pH9.5) に2
分間浸し、発光基質 (CSPD、ベーリンガーマンハイム社
製）をトリス緩衝液で100倍希釈したものをメンブラン
のDNA面に添加し、X線フィルムに感光した。
NA遺伝子を熱変性し、ハイブリッド形成溶液に10ng/ml
となるように加え、68℃、16時間ハイブリダイゼーショ
ンを行った。洗浄溶液Ｉ (0.1%(w/v)SDS、2×SSC) にて
室温で5分間メンブランを洗浄した後、予め68℃に加温
した洗浄溶液II (0.1%(w/v)SDS、0.1×SSC) で15分間洗
浄し、さらに新しい洗浄溶液IIに交換して15分間洗浄し
た。次に、0.3%(w/v)Tween20を含むマレイン酸緩衝液
(0.1M マレイン酸、0.15M NaCl、pH7.5) で1分間穏やか
に洗浄した後、ブロッキング溶液 (1%(w/v) ブロッキン
グ試薬（ベーリングマンハイム社製）を含むマレイン酸
溶液）で30分間室温でインキュベートした後、抗ジゴキ
シゲニン−アルカリフォスファターゼ複合体を150mU/ml
となるように加え、30分間室温で反応させた。次にマレ
イン酸緩衝液で15分間の洗浄を2回行い、トリス緩衝液
(0.1M Tris-HCl、0.1M NaCl、50mM MgCl2、pH9.5) に2
分間浸し、発光基質 (CSPD、ベーリンガーマンハイム社
製）をトリス緩衝液で100倍希釈したものをメンブラン
のDNA面に添加し、X線フィルムに感光した。
【００１１】その結果を図１に示した。図から明らかな
ようにペクチネイタス セレビシフィラス（Pectinatus
cerevisiiphilus）で確認される共通のバンドとし
て、２〜３Ｋｂｐ、５〜６Ｋｂｐ、２０〜３０Ｋｂｐに
バンドを確認した。次に、10mlの液体培地で増殖させた
ペクチネイタス フリシンジェンシスを前記と同様の方
法で処理し、その結果を図１に示した。ペクチネイタス
フリシンジェンシス（Pectinatus frisingensis）に
特徴的な共通パターン、２．５〜３Ｋｂｐ、７〜８Ｋｂ
ｐ、１０〜２０Ｋｂｐにバンドが確認された。従って、
これらの共通のバンドパターンを利用すると、ペクチネ
イタス セレビシフィラス、ペクチネイタス フリシン
ジェンシスを同定することが可能である。
ようにペクチネイタス セレビシフィラス（Pectinatus
cerevisiiphilus）で確認される共通のバンドとし
て、２〜３Ｋｂｐ、５〜６Ｋｂｐ、２０〜３０Ｋｂｐに
バンドを確認した。次に、10mlの液体培地で増殖させた
ペクチネイタス フリシンジェンシスを前記と同様の方
法で処理し、その結果を図１に示した。ペクチネイタス
フリシンジェンシス（Pectinatus frisingensis）に
特徴的な共通パターン、２．５〜３Ｋｂｐ、７〜８Ｋｂ
ｐ、１０〜２０Ｋｂｐにバンドが確認された。従って、
これらの共通のバンドパターンを利用すると、ペクチネ
イタス セレビシフィラス、ペクチネイタス フリシン
ジェンシスを同定することが可能である。
【００１２】実施例２ 1.5%(W/V) 寒天を含む平板培地上にペクチネイタス属菌
のコロニーを形成させた後、そのコロニーを釣菌して、
試料緩衝液（RiboPrinterTM専用試薬) に108cells/ml
となるように懸濁した後、熱処理ステーション（RiboPr
interTM付属装置) で加熱冷却後、その菌懸濁液30μlに
Lysing Agent A, B (いずれも (RiboPrinterTM専用試
薬) を各々５μl添加し、RiboPrinterTM Microbial Cha
racterization System (Qualicon L.L.C.,USA）にて分
析を行った。その結果を図２および図３に示した。
のコロニーを形成させた後、そのコロニーを釣菌して、
試料緩衝液（RiboPrinterTM専用試薬) に108cells/ml
となるように懸濁した後、熱処理ステーション（RiboPr
interTM付属装置) で加熱冷却後、その菌懸濁液30μlに
Lysing Agent A, B (いずれも (RiboPrinterTM専用試
薬) を各々５μl添加し、RiboPrinterTM Microbial Cha
racterization System (Qualicon L.L.C.,USA）にて分
析を行った。その結果を図２および図３に示した。
【００１３】図２は、ペクチネイタス セレビシフィラ
スの実施例２の分析結果である。図３は、ペクチネイタ
ス フリシンジェンシスの実施例２の分析結果である。
これらの図から明らかなように、ペクチネイタス セレ
ビシフィラスのいずれの菌株においても、ＤＮＡ断片の
２〜３Ｋｂｐ、５〜６Ｋｂｐ、２０〜３０Ｋｂｐに共通
してバンドが存在することが認められた。また、ペクチ
ネイタス フリシンジェンシスのいずれの菌株において
も、ＤＮＡ断片の２．５〜３Ｋｂｐ、７〜８Ｋｂｐ、１
０〜２０Ｋｂｐに共通してバンドが存在することが認め
られた。
スの実施例２の分析結果である。図３は、ペクチネイタ
ス フリシンジェンシスの実施例２の分析結果である。
これらの図から明らかなように、ペクチネイタス セレ
ビシフィラスのいずれの菌株においても、ＤＮＡ断片の
２〜３Ｋｂｐ、５〜６Ｋｂｐ、２０〜３０Ｋｂｐに共通
してバンドが存在することが認められた。また、ペクチ
ネイタス フリシンジェンシスのいずれの菌株において
も、ＤＮＡ断片の２．５〜３Ｋｂｐ、７〜８Ｋｂｐ、１
０〜２０Ｋｂｐに共通してバンドが存在することが認め
られた。
【図１】 ペクチネイタス属細菌のリボタイピングの結
果を示す電気泳動図である。
果を示す電気泳動図である。
【図２】 ペクチネイタス セレビシフィラスの実施例
２によるRiboPrinterTMパターン図である。
２によるRiboPrinterTMパターン図である。
【図３】 ペクチネイタス フリシンジェンシスの実施
例２によるRiboPrinterTMパターン図である。
例２によるRiboPrinterTMパターン図である。
Claims (3)
- 【請求項１】 制限断片長多形性を利用した遺伝子型の
決定法において、リボタイピングでハイブリダイズする
ＤＮＡ断片を比較してペクチネイタス属細菌の存在を同
定することを特徴とする微生物の同定法。 - 【請求項２】 ペクチネイタス属細菌がペクチネイタス
セレビシフィラス（Pectinatus cerevisiiphilus）
であり、リボタイピングでハイブリダイズするＤＮＡ断
片が２〜３Ｋｂｐ、５〜６Ｋｂｐかつ２０〜３０Ｋｂｐ
に存在することを確認して同定することを特徴とする請
求項１記載の同定法。 - 【請求項３】 ペクチネイタス属細菌がペクチネイタス
フリシンジェンシス（Pectinatus frisingensis）で
あり、リボタイピングでハイブリダイズするＤＮＡ断片
が２．５〜３Ｋｂｐ、７〜８Ｋｂｐかつ１０〜２０Ｋｂ
ｐに存在することを確認して同定することを特徴とする
請求項１記載の同定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6396997A JPH10243799A (ja) | 1997-03-04 | 1997-03-04 | 微生物の同定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6396997A JPH10243799A (ja) | 1997-03-04 | 1997-03-04 | 微生物の同定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10243799A true JPH10243799A (ja) | 1998-09-14 |
Family
ID=13244643
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6396997A Pending JPH10243799A (ja) | 1997-03-04 | 1997-03-04 | 微生物の同定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10243799A (ja) |
-
1997
- 1997-03-04 JP JP6396997A patent/JPH10243799A/ja active Pending
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