JPH10174588A

JPH10174588A - レクチンのポリペプチド及びそれをコードするｄｎａ

Info

Publication number: JPH10174588A
Application number: JP9197628A
Authority: JP
Inventors: Yasushi Asano; 靖司浅野; Takeo Kamoashi; 建夫鴨脚
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1996-10-15
Filing date: 1997-07-23
Publication date: 1998-06-30

Abstract

(57)【要約】【課題】ムジナタケレクチンをコードするＤＮＡを提
供する。【解決手段】配列番号２に示すアミノ酸配列を有す
るポリペプチドをコードするＤＮＡ、例えば配列番号１
に示す塩基配列において４１位〜１２４６位の塩基配列
を有するＤＮＡをムジナタケから単離する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ムジナタケレクチ
ン（Psathyrella velutina lectin,ＰＶＬ)と同効のポ
リペプチド、および、ムジナタケレクチンまたはその同
効物をコードするＤＮＡに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ムジナタケレクチン（以下ＰＶＬと省略
する）の性質及びその製造方法に関しては、特開平１−
１３９５９９号公報に記載されている。また、ＰＶＬの
精製方法と性質に関して、Kochibe等の論文が発表され
ている（J. Biol. Chem.264, 173-177(1989)）。また、
ＰＶＬのガラクトース欠失IgG糖鎖への結合特性に関し
ては、Tsuchiya等の論文（J. Immunology 151, 1137-11
46(1993)）が発表されている。しかし、ＰＶＬをコード
するＤＮＡ及びＰＶＬのアミノ酸配列については、いま
だ知られていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ＰＶＬをコードするＤ
ＮＡが得られれば、組換え発現系によるレクチン生産及
びレクチン性状改変への利用が期待される。従って、本
発明が解決しようとする課題は、ＰＶＬをコードするＤ
ＮＡを提供することである。また、そのＤＮＡに基づい
て新規なレクチンのポリペプチドを提供することであ
る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＰＶＬを
コードするｃＤＮＡのクローニングに成功し、特定のア
ミノ酸配列を有するレクチンのポリペプチド及びその部
分ポリペプチド（以下、まとめて「本発明ポリペプチ
ド」ともいう）、それに結合する抗体、並びにＰＶＬを
含むレクチンのポリペプチド及びその部分ポリペプチド
をコードするＤＮＡ（以下、「本発明ＤＮＡ」ともい
う）を提供するに至った。

【０００５】本発明ポリペプチドは、下記式（１）で示
されるアミノ酸配列を少なくとも含むレクチンのポリペ
プチドを含む。

【０００６】

【化７】 Asp Xaa Xaa Gly Phe Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn (Xaa) (Gly) (Xaa) Xaa Xaa Xaa (Xaa) Xaa Xaa Xaa Xaa (Xaa) Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xa a (Xaa) Xaa Xaa Gly Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg・・・・式（１）（上記式中、Xaaは任意のアミノ酸を示す。また括弧内
に示されるアミノ酸は、存在しなくてもよいことを示
す）

【０００７】また、本発明ポリペプチドは、配列番号２
に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を有し、糖鎖（好
ましくはＮ−アセチルグルコサミン残基を有する糖鎖、
より好ましくは末端にＮ−アセチルグルコサミン残基を
有する糖鎖、特に好ましくは末端にＮ−アセチルグルコ
サミン残基を有する糖鎖の当該Ｎ−アセチルグルコサミ
ン残基、極めて好ましくは末端にＮ−アセチルグルコサ
ミン残基−マンノース残基(GlcNAc→Man)を有する糖鎖
の当該Ｎ−アセチルグルコサミン残基）への結合活性を
実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失
または挿入を有していてもよいレクチンのポリペプチド
を含む。好ましくは、配列番号２に示すアミノ酸配列の
少なくとも一部を有するポリペプチドである。

【０００８】さらに、本発明ポリペプチドは、上記のポ
リペプチドの一部分を含むポリペプチドを含む。さら
に、また、ポリペプチド鎖中に、上記のポリペプチドと
他のポリペプチドとを含む融合ポリペプチド、及び、本
発明ポリペプチドに結合する抗体が提供される。

【０００９】本発明ＤＮＡは、下記の性質を有するレク
チンをコードするＤＮＡを含む。 (1)糖鎖（好ましくはＮ−アセチルグルコサミン残基を
有する糖鎖、より好ましくは末端にＮ−アセチルグルコ
サミン残基を有する糖鎖、特に好ましくは末端にＮ−ア
セチルグルコサミン残基を有する糖鎖の当該Ｎ−アセチ
ルグルコサミン残基、極めて好ましくは末端にGlcNAc→
Manを有する糖鎖の当該Ｎ−アセチルグルコサミン残
基）に結合する。 (2)ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により推定される分子
量が約４０キロダルトンである。 (3)下記のアミノ酸組成を有する。

【００１０】

【表２】残基モル％ Asx 14.9 Thr 5.5 Ser 3.2 Glx 4.2 Pro 3.2 Gly 14.9 Ala 8.0 Cys 1.0 Val 10.4 Met 1.5 Ile 5.2 Leu 7.0 Tyr 2.5 Phe 5.5 His 1.7 Lys 3.7 Trp 2.2 Arg 5.2

【００１１】(4)ムジナタケ(Psathyrella velutina)の
子実体に存在する。

【００１２】また、本発明ＤＮＡは、上記本発明ポリペ
プチドの少なくとも一部をコードするＤＮＡを含む。好
ましくは、配列番号２においてアミノ酸番号１〜４０２
で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、
さらに好ましくは、配列番号１において塩基番号４１〜
１２４６で表される塩基配列の少なくとも一部またはす
べてを有する。

【００１３】さらに、本発明ＤＮＡを含む組換えＤＮ
Ａ、組換えベクター、および、該ベクターを宿主細胞に
導入することにより得られる形質転換細胞が提供され
る。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明を、本発明ポリペプ
チド、本発明ＤＮＡの順に詳細に説明する。＜１＞本発明ポリペプチド本発明ポリペプチドは、上記式（１）で示されるアミノ
酸配列を少なくとも含むレクチンのポリペプチドを含
む。

【００１５】この本発明ポリペプチドは、好ましくは、
下記式（２）で示されるアミノ酸環状配列の任意の位置
から開始される一周分の配列を少なくとも含む。

【００１６】

【化８】 Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Gly Phe Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn (Xaa) (Gly) (Xaa) Xaa Xaa Xaa (Xaa) Xaa Xaa Xaa Xaa (Xaa) Xaa Xaa Xaa Xa a Xaa Xaa Xaa (Xaa) Xaa Xaa Gly Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa (Xaa)・・・・式（２）（上記式の配列は、環状配列である。上記式中、Xaaは
任意のアミノ酸を示す。また括弧内に示されるアミノ酸
は、存在しなくてもよいことを示す）

【００１７】本明細書中における「アミノ酸」は、通常
には、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸（アラニ
ン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シス
テイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチ
ジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、
フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、ト
リプトファン、チロシン、バリン）であるが、その他の
アミノ酸が含まれていてもよい。またグリシン以外のア
ミノ酸は、Ｌ−アミノ酸であることが好ましい。

【００１８】なお、本明細書において「環状配列」と
は、上記式（２）における最初のアミノ酸（Xaa）−・
・・・・−最後のアミノ酸（(Xaa)）−最初のアミノ酸
−・・・・・−最後のアミノ酸−最初のアミノ酸−・・
・・・のように、上記式（２）の配列が連続して繰り返
しつながった配列を意味するものである。

【００１９】「環状配列の任意の位置から開始される一
周分の配列」とは、上記式（２）において例えば最初か
ら８番目のPheを開始位置とした場合を例とすると、「P
he-Gly-Xaa-Xaa-・・・・・・・・・-Asp-Xaa-Xaa-Gl
y」からなる配列である。なおこの配列はあくまで例示
であり、これに限定されるものではない。

【００２０】本発明ポリペプチドは、あるいは下記式
（３）で示されるアミノ酸配列を少なくとも含む。

【００２１】

【化９】 Asp Xaa1 Xaa1 Gly Phe Gly Xaa Xaa Xaa Xaa1 Xaa Xaa Xaa Xaa Asn (Xaa) (Gl y) (Xaa) Xaa Xaa Xaa1 (Xaa) Xaa Xaa1 Xaa1 Xaa (Xaa) Xaa1 Xaa1 Xaa Xaa Xa a1 Xaa Xaa (Xaa) Xaa Xaa Gly Trp Xaa Xaa1 Xaa Xaa Xaa Xaa1 Arg Xaa Xaa1 Xaa1・・・・式（３）（上記式中、Xaaは任意のアミノ酸を、Xaa1は疎水性ア
ミノ酸（本明細書中では、「Gly、Ala、Val、Leu、Il
e、Pro、Phe、Met、Trp、Cysおよびこれらと同等の疎水
性を有するアミノ酸」、より好ましくは「Gly、Ala、Va
l、Leu、Ile、Pro、Phe、Met、Trp、Cys」を意味する）
をそれぞれ示す。また括弧内に示されるアミノ酸は、存
在していなくてもよいことを示す）

【００２２】さらに、好ましくは、下記式（４）で示さ
れるアミノ酸配列を少なくとも含む。

【００２３】

【化１０】 Xaa Xaa Xaa Asp Xaa1 Xaa1 Gly Phe Gly Xaa Xaa Xaa Xaa1 Xaa Xaa Xaa Xaa A sn (Xaa) (Gly) (Xaa) Xaa Xaa Xaa1 (Xaa) Xaa Xaa1 Xaa1 Xaa (Xaa) Xaa1 Xaa 1 Xaa Xaa Xaa1 Xaa Xaa (Xaa) Xaa Xaa Gly Trp Xaa Xaa1 Xaa Xaa Xaa Xaa1 A rg Xaa Xaa1 Xaa1 Xaa Xaa Xaa Xaa (Xaa)・・・・式（４）（上記式中、Xaaは任意のアミノ酸を、Xaa1は疎水性ア
ミノ酸をそれぞれ示す。また括弧内に示されるアミノ酸
は、存在しなくてもよいことを示す）

【００２４】より好ましくは、下記式（５）で示される
アミノ酸配列を少なくとも含む。

【００２５】

【化１１】 Asp X11 X11 Gly Phe Gly Xaa Xaa Xaa X12 Xaa Xaa Xaa Xaa Asn (Xaa) (Gly) (Xaa) Xaa Xaa X13 (Xaa) Xaa X14 X15 Xaa (Xaa) X16 X11 Xaa Xaa X13 Xaa Xa a (Xaa) Xaa Xaa Gly Trp Xaa X11 Xaa Xaa Xaa X17 Arg Xaa X18 X19・・・・式（５）（上記式中、Xaaは任意のアミノ酸を、X11はIle、Valま
たはLeuを、X12はIleまたはValを、X13はPheまたはLeu
を、X14はPro、AlaまたはValを、X15はPro、Ala、Valま
たはMetを、X16はAla、ValまたはLeuを、X17はPro、Va
l、LeuまたはIleを、X18はAla、Val、Leu、IleまたはMe
tを、X19はAla、ValまたはGlyをそれぞれ示す。また括
弧内に示されるアミノ酸は、存在しなくてもよいことを
示す）

【００２６】さらに、より好ましくは、下記式（６）で
示されるアミノ酸配列を少なくとも含む。

【００２７】

【化１２】 Xaa Xaa Xaa Asp X11 X11 Gly Phe Gly Xaa Xaa Xaa X12 Xaa Xaa Xaa Xaa Asn (Xaa) (Gly) (Xaa) Xaa Xaa X13 (Xaa) Xaa X14 X15 Xaa (Xaa) X16 X11 Xaa Xa a X13 Xaa Xaa (Xaa) Xaa Xaa Gly Trp Xaa X11 Xaa Xaa Xaa X17 Arg Xaa X18 X19 Xaa Xaa Xaa Xaa (Xaa)・・・・式（６）（上記式中、Xaaは任意のアミノ酸を、X11はIle、Valま
たはLeuを、X12はIleまたはValを、X13はPheまたはLeu
を、X14はPro、AlaまたはValを、X15はPro、Ala、Valま
たはMetを、X16はAla、ValまたはLeuを、X17はPro、Va
l、LeuまたはIleを、X18はAla、Val、Leu、IleまたはMe
tを、X19はAla、ValまたはGlyをそれぞれ示す。また括
弧内に示されるアミノ酸は、存在しなくてもよいことを
示す）

【００２８】特に好ましくは、下記式（７）〜（１３）
に示される配列番号３〜９のアミノ酸配列から選ばれる
１または２以上のアミノ酸配列を含む。

【００２９】

【化１３】 Gly Val Ala Asp Leu Val Gly Phe Gly Thr Gly Gly Val Tyr Ile Ile Arg Asn Ser Leu Leu Ile Gln Val Val Lys Val Ile Asn Asn Phe Gly Tyr Asp Ala Gly Gly Trp Arg Val Glu Lys His Val Arg Leu Leu Ala Asp Thr Thr Gly Asp・・・・式（７）［配列番号３］

【００３０】

【化１４】 Asn Gln Ser Asp Val Val Gly Phe Gly Glu Asn Gly Val Trp Ile Ser Thr Asn Asn Gly Asn Asn Thr Phe Thr Asp Pro Pro Lys Met Val Ile Ala Asn Phe Ala Tyr Asn Ala Gly Gly Trp Arg Val Glu Lys His Ile Arg Phe Met Ala Asp Leu Arg Lys Thr・・・・式（８）［配列番号４］

【００３１】

【化１５】 Gly Arg Ala Asp Ile Val Gly Phe Gly Glu Ala Gly Ile Leu Val Ser Leu Asn Asn Gly Gly Ser Gln Phe Ala Pro Ala Gln Leu Ala Leu Asn Asn Phe Gly Tyr Ala Gln Gly Trp Arg Leu Asp Arg His Leu Arg Phe Leu Gly Asp Ile Thr Gly Asp・・・・式（９）［配列番号５］

【００３２】

【化１６】 Gly Leu Leu Asp Val Val Gly Phe Gly Glu Asn His Val Tyr Ala Ala Arg Asn Asn Gly Asn Gly Thr Phe Gln Pro Ala Gln Ala Val Val Asn Asn Phe Cys Val Gly Ala Gly Gly Trp Thr Ile Ala Ser His Pro Arg Val Ile Ala Asp Leu Thr Gly Asp・・・・式（１０）［配列番号６］

【００３３】

【化１７】 Lys Arg Ala Asp Ile Leu Gly Phe Gly Gly Ala Gly Val Tyr Thr Ser Leu Asn Asn Gly Asn Gly Thr Phe Gly Ala Val Asn Leu Val Leu Lys Asp Phe Gly Thr Ala Ser Gly Trp Arg Val Glu Lys His Val Arg Cys Val Ala Pro Leu Thr Asn Lys・・・・式（１１）［配列番号７］

【００３４】

【化１８】 Lys Val Gly Asp Ile Ile Gly Phe Gly Asp Ala Gly Val Tyr Val Ala Leu Asn Asn Gly Asn Gly Thr Phe Gly Pro Val Lys Arg Val Ile Asp Asn Phe Gly Tyr Asn Gln Gly Trp Arg Val Asp Lys His Pro Arg Phe Val Val Asp Leu Thr Gly Asp・・・・式（１２）［配列番号８］

【００３５】

【化１９】 Gly Cys Ala Asp Ile Val Gly Phe Gly Glu Asn Ser Val Trp Ala Cys Met Asn Lys Gly Asp Gly Thr Phe Gly Pro Met Met Lys Leu Ile Asp Asp Leu Thr Val Ser Lys Gly Trp Thr Leu Gln Arg Thr Val Arg Tyr Ala Ala Asn Leu Tyr Leu ・・・・式（１３）［配列番号９］

【００３６】さらに特に好ましくは、前記式（７）〜
（１３）で示される配列番号３〜９のアミノ酸配列のそ
れぞれを１つづつ全て含む。なお、上記式の各々におい
て、同じ記号（Xaa1、X11〜X19等）が複数存在する場
合、各記号が示すアミノ酸は同一でも互いに異なってい
てもよい。

【００３７】上記の本発明ポリペプチドは、通常、糖鎖
（好ましくはＮ−アセチルグルコサミン残基を有する糖
鎖、より好ましくは末端にＮ−アセチルグルコサミン残
基を有する糖鎖、特に好ましくは末端にＮ−アセチルグ
ルコサミン残基を有する糖鎖の当該Ｎ−アセチルグルコ
サミン残基、極めて好ましくは末端にGlcNAc→Manを有
する糖鎖の当該Ｎ−アセチルグルコサミン残基）に結合
する活性を有するレクチンであり、さらに好ましくはＮ
−アセチルグルコサミン残基に特異的に結合する活性を
有するレクチンである。

【００３８】さらに、本発明ポリペプチドは、配列番号
２に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を有し、糖鎖
（好ましくはＮ−アセチルグルコサミン残基を有する糖
鎖、より好ましくは末端にＮ−アセチルグルコサミン残
基を有する糖鎖、特に好ましくは末端にＮ−アセチルグ
ルコサミン残基を有する糖鎖の当該Ｎ−アセチルグルコ
サミン残基、極めて好ましくは末端にGlcNAc→Manを有
する糖鎖の当該Ｎ−アセチルグルコサミン残基）に結合
する活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の
置換、欠失または挿入を有していてもよいレクチンのポ
リペプチドを含む。好ましくは、アミノ酸残基の置換、
欠失または挿入を含まない、配列番号２に示すアミノ酸
配列の少なくとも一部を有するレクチンのポリペプチド
である。

【００３９】このようなアミノ酸残基の置換、欠失また
は挿入は、配列番号２に示すアミノ酸配列の少なくとも
一部をコードするＤＮＡに１つ又は２以上のアミノ酸残
基の置換、欠失又は挿入を起こすようなヌクレオチドの
置換、欠失又は挿入を導入して得られるＤＮＡを発現さ
せることによって得ることができる。ＤＮＡ配列へのヌ
クレオチドの置換、欠失又は挿入は、両末端に制限酵素
切断末端を持ち、変異点の両側を含む配列を合成し、未
変異ＤＮＡ配列の相当する部分と入れ換える事により、
導入することができる。また、部位特異的変異法（Kram
er,W. and Frits,H.J.,Methods in Enzymol.,154,350
(1987); Kunkel,T.A. et al., Methods in Enzymol.,15
4,367(1987)）などの方法によっても、ＤＮＡ配列に置
換、挿入又は欠失を導入することができる。

【００４０】レクチンのポリペプチドの糖鎖結合活性
（レクチン活性）は、例えば、後述のレクチン活性測定
法によって測定することができ、当業者は糖鎖結合活性
を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠
失または挿入を容易に識別することができる。

【００４１】本明細書において、「配列番号２に示すア
ミノ酸配列の少なくとも一部を有する」とは、糖鎖結合
活性を有する必要かつ最小のポリペプチドのアミノ酸配
列を有することを意味するものである。

【００４２】さらにまた、本発明ポリペプチドは、上記
のポリペプチドの一部分を含むポリペプチドを含む。こ
こで、「一部分」とは、好ましくは、糖鎖結合活性を有
する、抗原性を有する等の何らかの活性ないし機能を有
する部分を意味する。このような部分を識別することは
当業者であれば容易である。

【００４３】なお、本発明ポリペプチドとしては、配列
番号２においてアミノ酸番号１８〜４０２で表されるア
ミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましく、配列番号
２においてアミノ酸番号１〜４０２で表されるアミノ酸
配列を有するポリペプチドが特に好ましい。

【００４４】なお、本発明ポリペプチドは必ずしも単独
のポリペプチドでなくてもよく、必要により、融合ポリ
ペプチド（融合タンパク質）の一部となっていてもよ
い。この融合ポリペプチドを構成する他のポリペプチド
としては、例えば、ビオチン化を受けるポリペプチド、
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼもしくはその一
部、Ｔ７ファージのgene10がコードするタンパク質（Ｔ
７ファージのgene10産物）もしくはその一部などが挙げ
られる。

【００４５】上記の本発明ポリペプチドは、アミノ酸配
列が本発明により明らかにされたので、その配列に基づ
いて合成することも可能であるが、後記の本発明ＤＮＡ
を用いて発現させて得ることが可能であり、かつ好まし
い。すなわち、本発明ＤＮＡを保持する細胞を、好適な
培地で培養し本発明ポリペプチドを培地中に生成蓄積さ
せ、その培地から本発明ポリペプチドを採取することに
よって、本発明ポリペプチドを製造することができる。
本発明ＤＮＡを保持する宿主細胞を用いた本発明ポリペ
プチドの発現には、通常タンパク質の製造に用いられる
宿主−ベクター系を使用することができるが、大腸菌Ｋ
１２株またはその変異株と発現ベクター（PinPointXa、
pGEMEX、pET-5(プロメガ(Promega)製)、pGEX-5X(ファル
マシア(Pharmacia)製)など）の使用が好ましい。

【００４６】また、例えば大腸菌・酵母シャトルベクタ
ーであるpPIC3K(Invitrogen社製)を用いることによっ
て、Pichia pastorisのような酵母を宿主として、本発
明ＤＮＡから本発明ポリペプチドを発現させることもで
きる。

【００４７】発現は、本発明ＤＮＡを用いて直接発現さ
せてもよいし、他のタンパク質との融合タンパク質とし
て発現させてもよい。また、本発明ＤＮＡは全長を発現
させてもよいし、一部を部分ペプチドとして発現させて
もよい。

【００４８】特記すべき事として、慢性関節リウマチ
（ＲＡ）の患者においては、IgGの糖鎖構造異常、すな
わちガラクトースを欠いた糖鎖の増加が知られている
が、ＰＶＬはこのガラクトース欠失IgG(アガラクトIgG)
において露出したＮ−アセチルグルコサミン残基(GlcNA
c)β1→2マンノース残基(Man)を特異的に認識する。従
って上記のようにして製造された本発明のＰＶＬと同様
の活性を有するポリペプチドもしくはその部分ポリペプ
チドまたはこれらと他のタンパク質との融合タンパク質
を用いて、ELISA法等によりアガラクトIgGを検出する体
外診断薬を作製することもできる。

【００４９】本発明の抗体は、本発明ポリペプチドに結
合する抗体であり、ポリクローナル、モノクローナルの
いずれでもよい。本発明の抗体は、上記のようにして製
造された本発明ポリペプチドもしくはその部分ポリペプ
チドまたはこれらと他のタンパク質との融合タンパク質
を抗原として、常法に従って例えば以下のように作製す
ることが可能である。

【００５０】ポリクローナルな本発明の抗体は、例えば
マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等
の被免疫動物を上記抗原で免疫し、これらの動物から血
清を採取することによって得ることができる。被免疫動
物を免疫する際に、補助剤（アジュバント）を併用する
ことは、抗体産生細胞を賦活するので望ましい。得られ
た抗血清から、常法によってイムノグロブリン分画を精
製してもよい。

【００５１】モノクローナルな本発明の抗体は、例えば
次のようにして得られる。すなわち、上記抗原をマウ
ス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の被
免疫動物の腹腔内、皮下、足蹠(footpad)に投与した後
に脾臓又は膝窩リンパ節を摘出し、これらから採取した
細胞と腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合さ
せてハイブリドーマを樹立し、得られたハイブリドーマ
を連続増殖させ、さらに得られたハイブリドーマから本
発明ポリペプチドに対する特異抗体を継続的に産生する
細胞株を選別する。こうして選別された株を好適な培地
で培養することによって、培地中にモノクローナルな本
発明の抗体が得られる。あるいは、マウスの腹腔などの
生体内にて前記ハイブリドーマを培養することによっ
て、モノクローナルな本発明の抗体を大量に製造するこ
とができる。細胞融合に用いる細胞としては、脾細胞以
外にリンパ節細胞および末梢血中のリンパ細胞等を用い
ることができる。また、ミエローマ細胞株は、異種細胞
種由来のものに比べ同種細胞種由来のものが望ましく、
安定な抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。

【００５２】得られたポリクローナル抗体およびモノク
ローナル抗体の精製法としては、硫酸ナトリウム、硫酸
アンモニウム等による塩析、低温アルコール沈殿および
ポリエチレングリコールまたは等電点による選択的沈殿
分別法、電気泳動法、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチ
ル）−誘導体、ＣＭ（カルボキシメチル）−誘導体等の
イオン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィー、
プロテインＡまたはプロテインＧを用いたアフィニティ
ークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマ
トグラフィー、抗原を固定化した免疫吸着クロマトグラ
フィー、ゲル濾過法および超遠心法等を挙げることがで
きる。なお本発明の抗体を、抗原結合部位（Ｆａｂ）を
分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシ
ン、パパイン等）で処理して得られるＦａｂを含むフラ
グメントとしても良い。また本発明の抗体をコードする
遺伝子の塩基配列もしくは抗体のアミノ酸配列が決定さ
れれば、遺伝子工学的に本発明の抗体のＦａｂを含むフ
ラグメントやキメラ抗体（例えば本発明の抗体のＦａｂ
部分を含むキメラ抗体等）を作製することができ、この
ようなフラグメントやキメラ抗体も、本発明の抗体に包
含される。

【００５３】＜２＞本発明ＤＮＡ本発明ＤＮＡは、下記の性質を有するレクチンをコード
するＤＮＡを含む。 (1)糖鎖（好ましくはＮ−アセチルグルコサミン残基を
有する糖鎖、より好ましくは末端にＮ−アセチルグルコ
サミン残基を有する糖鎖、特に好ましくは末端にＮ−ア
セチルグルコサミン残基を有する糖鎖の当該Ｎ−アセチ
ルグルコサミン残基、極めて好ましくは末端にGlcNAc→
Manを有する糖鎖の当該Ｎ−アセチルグルコサミン残
基）に結合する。 (2)ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により推
定される分子量が約４０キロダルトンである。 (3)前記の特定のアミノ酸組成を有する。 (4)ムジナタケ(Psathyrella velutina)の子実体に存在
する。

【００５４】また、本発明ＤＮＡは、上記の本発明ポリ
ペプチドの少なくとも一部をコードするＤＮＡを含む。
上記レクチンは、上記の性質に加え、さらにアミノ酸残
基が４０２残基であるものが好ましい。

【００５５】本発明ＤＮＡの塩基配列は、上記性質を有
するレクチンまたはその同効物のポリペプチドの少なく
とも一部をコードしていれば、その塩基配列は特に限定
されない。

【００５６】また本発明ＤＮＡは、少なくとも前記した
本発明ポリペプチドをコードしているＤＮＡを全て包含
している。例えば配列番号２に示すアミノ酸配列の少な
くとも一部を有し、糖鎖（好ましくはＮ−アセチルグル
コサミン残基を有する糖鎖、より好ましくは末端にＮ−
アセチルグルコサミン残基を有する糖鎖、特に好ましく
は末端にＮ−アセチルグルコサミン残基を有する糖鎖の
当該Ｎ−アセチルグルコサミン残基、極めて好ましくは
末端にGlcNAc→Manを有する糖鎖の当該Ｎ−アセチルグ
ルコサミン残基）に結合する活性を実質的に害さない１
つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を有して
いてもよいレクチンのポリペプチド、配列番号２に示す
アミノ酸配列の少なくとも一部を有するレクチンのポリ
ペプチド、およびこれらのポリペプチドの一部分を含む
ポリペプチドのそれぞれをコードするＤＮＡ等は、全て
本発明ＤＮＡに包含されるものである。

【００５７】本発明ＤＮＡとして具体的には、配列番号
２においてアミノ酸番号１８〜４０２または１〜４０２
で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する
ＤＮＡが挙げられ、かつ好ましい。また本発明ＤＮＡと
してより具体的には、配列番号１に示す塩基配列（塩基
番号９２〜１２４６または４１〜１２４６）の少なくと
も一部あるいはすべてを有するＤＮＡが挙げられ、かつ
特に好ましい。

【００５８】なお、遺伝暗号の縮重による異なった塩基
配列のＤＮＡも本発明ＤＮＡに包含されることは、当業
者であれば容易に理解されるところである。これらのＤ
ＮＡのいずれもが本発明ＤＮＡに包含される。

【００５９】なお、染色体由来のＰＶＬ遺伝子は、コー
ド領域にイントロンを含むことが予想されるが、そのよ
うなイントロンで分断されているＤＮＡ断片であって
も、ＰＶＬのポリペプチドの少なくとも一部をコードす
る限り、本発明ＤＮＡに含まれる。すなわち、本明細書
において「コードする」とは、転写時にプロッセッシン
グ等を受けて最終的に目的のポリペプチドを生じ得る塩
基配列を有することも包含する。

【００６０】また、本明細書において「ポリペプチドの
少なくとも一部をコードする」とは、好ましくは、糖鎖
（好ましくはＮ−アセチルグルコサミン残基を有する糖
鎖、より好ましくは末端にＮ−アセチルグルコサミン残
基を有する糖鎖、特に好ましくは末端にＮ−アセチルグ
ルコサミン残基を有する糖鎖の当該Ｎ−アセチルグルコ
サミン残基、極めて好ましくは末端にGlcNAc→Manを有
する糖鎖の当該Ｎ−アセチルグルコサミン残基）への結
合活性を有する、抗原性を有する等の何らかの活性ない
し機能を有する部分、あるいは、その部分に相当する塩
基配列がＰＶＬ遺伝子に特異的であってプライマーやプ
ローブとして使用できる部分をコードすることを意味す
る。

【００６１】なお、本発明には、本発明ＤＮＡに相補的
なＤＮＡまたはＲＮＡが包含される。さらに本発明ＤＮ
Ａは、レクチンをコードするコード鎖のみの一本鎖であ
ってもよいし、この一本鎖及びこれと相補的な配列を有
するＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖とからなる二本鎖であって
もよい。

【００６２】また、本発明ＤＮＡは、ＰＶＬ全体をコー
ドするコード領域全長を有していてもよいし、ＰＶＬの
一部のペプチドをコードするものであってもよい。本発
明ＤＮＡは、その塩基配列が本発明により明らかにされ
たので、その配列に基づいて合成し、あるいはその配列
に基づいて作成したオリゴヌクレオチドプライマーを用
いるＰＣＲ法（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション
法）によって、ムジナタケ染色体ＤＮＡ、あるいはｍ
ＲＮＡから本発明ＤＮＡを増幅することによって、取得
することも可能である。なお、本発明ＤＮＡは、後記実
施例に示すように、以下に示す各工程からなるｃＤＮＡ
クローニングによって、初めて得られたものである。

【００６３】（１）ムジナタケのＰＶＬのポリペプチド
をコードするｃＤＮＡのクローニングムジナタケの採取とムジナタケ子実体からの全細胞ｍ
ＲＮＡの抽出ムジナタケ子実体からのＰＶＬの精製と抗ＰＶＬポリ
クローナル抗体の作成精製したＰＶＬの部分アミノ酸
配列の決定ムジナタケ細胞からのポリ(A)+RNAの調製とムジナタ
ケｃＤＮＡライブラリーの作成抗体によるムジナタケｃＤＮＡライブラリーのスクリ
ーニングとＰＶＬ完全長ｃＤＮＡの選択全塩基配列の決定と塩基配列から推定されるＰＶＬア
ミノ酸配列とＰＶＬ部分アミノ酸配列との比較ＰＶＬ発現プラスミドの作成と発現させたポリペプチ
ドのレクチン活性の確認

【００６４】しかし本発明ＤＮＡの製造方法はこれに限
定されるものではなく、部分アミノ酸配列に基づき合成
されたＤＮＡプローブによるｃＤＮＡライブラリーのス
クリーニング法や、レクチン活性を指標とした発現クロ
ーニング法、その他公知のｃＤＮＡクローニングの手法
によっても本発明ＤＮＡを製造することができる。

【００６５】以下に、本発明ＤＮＡを得る方法を具体的
に説明する。（１）ＰＶＬのムジナタケ子実体からの精製と抗ＰＶＬ
ポリクローナル抗体の作製ＰＶＬの精製ＰＶＬは、ムジナタケ子実体から通常の蛋白質の精製方
法を組み合わせることによって精製することができる。
具体的には、J. Biol. Chem.264, 173-177(1989)に記載
された方法に従って行うことが好ましい。

【００６６】ＰＶＬの糖鎖結合活性（レクチン活性）
は、Kochibe等のビオチン化したＰＶＬによるＥＬＩＳ
Ａ法（J. Biol. Chem.264, 173-177(1989)）や、Tsuchi
yaらによる、アガラクトＩｇＧへの結合法（J. Immunol
ogy 151, 1137-1146(1993)）によって測定できる。ま
た、後述の実施例に記載した赤血球凝集法や赤血球凝集
阻害法によってもレクチンの糖鎖結合活性を測定するこ
とができる。

【００６７】天然ＰＶＬ及び組換え体ＰＶＬポリペプチ
ドの存在は、後述の抗ＰＶＬ抗体を利用したウエスタン
ブロットにより検出できる。ウサギ抗ＰＶＬポリクローナル抗体の作製抗ＰＶＬ抗体は、ウサギをＰＶＬで免疫することによ
り、公知の方法で調製出来る。免疫法、検出法全般に関
しては、たとえばEd Harlow and David Lane(Antibodie
s, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborat
ory, 1988)により詳述されている。

【００６８】（２）ムジナタケｃＤＮＡの調製全ＲＮＡの調製全RNAは、公知の方法(Kingston, R. E., (1991) in Cur
rent Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Un
it 4.2, Greene Publishing Associates and Wiley Int
erscience, New York 等)で得ることができる。材料
は、ＰＶＬのｍＲＮＡを発現している材料であれば限定
されないが、全長ｍＲＮＡを得るには、新鮮なムジナタ
ケ子実体が好ましい。地域的変異体や亜種の存在する可
能性もあるので、ムジナタケの中でも特に、群馬県の榛
名山及び赤城山の標高５００ｍ〜６００ｍの地上に生息
しているものが好ましい。

【００６９】全ＲＮＡは、前述のようにムジナタケ子実
体から、通常用いられる全ＲＮＡの調製方法により得る
ことができるが、グアニジンチオシアネート／CsCl法(K
ingston, R. E., (1991) in Current Protocols in Mol
ecular Biology, Suppl. 14,Unit 4.2, Greene Publish
ing Associates and Wiley Interscience, New York)で
調製するのが好ましい。

【００７０】poly(A)+RNAの調製 poly(A)+RNAは、上記のようにして得られた全RNAから、
公知の方法、例えばオリゴdT（oligo-(dT)）セルロース
カラムクロマトグラフィーなどによって精製することが
できるが、磁気によるmRNA分離システム、例えばPolyAT
tract mRNA isolation system(プロメガ(Promega)製)の
使用が好ましい。

【００７１】ムジナタケｃＤＮＡの合成と発現ライブ
ラリーの作製 cDNAは、poly(A)+RNAを鋳型とした逆転写酵素反応によ
り合成することができる。市販のcDNA合成用キットを用
いるのが便利である。例えばRiboClone cDNA synthesis
systems(プロメガ(Promega)製)を用いると、cDNAを合
成し、およびcDNAをクローニングベクター（例えばEcoR
I消化したλｇｔ１１）に連結させることができる。本
発明においてはEcoRI消化したλｇｔ１１を用いること
が好ましい。なお逆転写酵素反応のプライマーとして
は、oligo(dT)nを用いる事も出来るが、ランダムオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いることが好ましい。

【００７２】λｇｔ１１のようなλファージ発現ベクタ
ーの場合、組換えＤＮＡを直接塩化カルシウム処理した
大腸菌に導入できるが、あらかじめ試験管中でファージ
外殻に入れて（in vitroパッケージングという）、大腸
菌に効率よく感染させる方法が一般に使用されており、
そのためのキットも市販されている（Gigapack II pack
aging extract、ストラタジーン(Stratagene) 製等)。
本発明でもこの方法を用いることが好ましい。この方法
により、ムジナタケｃＤＮＡライブラリーが作成でき
る。

【００７３】in vitroパッケージングした組換えＤＮＡ
は、大腸菌に感染するが、用いるクローニングベクター
によって用いる大腸菌株を選択する必要がある。例え
ば、クローニングベクターにλｇｔ１１を用いる場合、
大腸菌(Escherichia coli) Y1088等のβ−ガラクトシダ
ーゼ活性を発現しない、ファージ宿主として適合した大
腸菌株を選択すればよい。ベクターにλｇｔ１１を用い
た場合は、指示菌とともに軟寒天培地に懸濁し、寒天培
地上に重層してプラークを形成させればよい。

【００７４】ＰＶＬｃＤＮＡのクローニング上述のλｇｔ１１においては、ムジナタケｃＤＮＡがβ
−ガラクトシダーゼの遺伝子の下流の制限酵素EcoRI切
断部位に挿入されるため、ムジナタケの遺伝子断片が、
β−ガラクトシダーゼの遺伝子と融合し、ムジナタケ由
来蛋白質が発現される。

【００７５】次に、上記のようにして得られたｃＤＮＡ
ライブラリーから、ＰＶＬのｃＤＮＡを有するファージ
クローンを、抗ＰＶＬ抗体への反応性を指標として選択
することができる。抗ＰＶＬ抗体と反応するファージク
ローンの調製と選択は、通常の方法、例えばSambrook等
の記載（Sambrook, J. et al, Molecular cloning,Cold
Spring Harbor lab. Press. 1989）に従って行えばよ
い。ファージクローンの検出には、たとえば、ProtBlot
II AP system(プロメガ(Promega)製)の使用が好まし
い。

【００７６】選択された陽性クローンから、ファージＤ
ＮＡを調製し、適当な制限酵素で切断することによっ
て、候補ｃＤＮＡを切り出すことができる。得られたｃ
ＤＮＡは、そのまま、あるいは適当なプラスミドにサブ
クローニングして、塩基配列を決定する。

【００７７】上記のようにして決定されたＰＶＬをコー
ドするｃＤＮＡの塩基配列のオープンリーディングフレ
ーム部分を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に
示す。最初のATGコドンで始まる単一のオープンリーデ
ィングフレームからは、402アミノ酸残基からなり、分
子量43キロダルトン(kDa)のタンパク質が予想される。

【００７８】上記のようにして得られるＤＮＡは、この
ＤＮＡによってコードされるポリペプチドが、糖鎖（好
ましくはＮ−アセチルグルコサミン残基を有する糖鎖、
より好ましくは末端にＮ−アセチルグルコサミン残基を
有する糖鎖、特に好ましくは末端にＮ−アセチルグルコ
サミン残基を有する糖鎖の当該Ｎ−アセチルグルコサミ
ン残基、極めて好ましくは末端にGlcNAc→Manを有する
糖鎖の当該Ｎ−アセチルグルコサミン残基）に結合する
活性を実質的に害されない限り、１つ又は２以上のアミ
ノ酸残基の置換、欠失又は挿入を起こすようなヌクレオ
チドの置換、欠失又は挿入を有していてもよい。ＤＮＡ
配列へのヌクレオチドの置換、欠失又は挿入は、両末端
に制限酵素切断末端を持ち、変異点の両側を含む配列を
合成し、未変異ＤＮＡ配列の相当する部分と入れ換える
事により、導入することができる。また、部位特異的変
異法（Kramer,W. and Frits,H.J.,Methods in Enzymo
l.,154,350 (1987); Kunkel,T.A. et.al.,Methods in E
nzymol.,154,367(1987)）などの方法によっても、ＤＮ
Ａ配列に置換、挿入又は欠失を導入することができる。

【００７９】ポリペプチドの糖鎖に結合する活性は、例
えば、前述のレクチン活性測定法等によって測定するこ
とができ、当業者は活性を実質的に害さない１つ以上の
アミノ酸残基の置換、欠失または挿入を容易に識別する
ことができる。

【００８０】（３）ＰＶＬクローンの配列の確認ＰＶＬの部分アミノ酸配列の決定精製ＰＶＬ断片化の方法は特に限定されないが、リジル
エンドペプチダーゼ(Lysyl Endopeptidase；和光純薬工
業株式会社製)等の配列分析用タンパク質分解酵素を用
いることが好ましい。また、切り出したゲルをタンパク
質分解酵素に接触させ、その後SDS-PAGE等で分離しても
よいしゲル濾過等で分離してもよい。簡便な操作として
は、Cleveland, D. W., Fischer, S. G., Kirshner, M.
W., andLaemmli, U. K.(1977) J. Biol. Chem. 252, 1
102-1106 の方法がある。すなわち、タンパク質バンド
を切り出して別のゲルのウェルに挿入し、タンパク質分
解酵素を含む緩衝液を、挿入したゲルにのせてSDS-PAGE
を行い、色素の先端が分離ゲルに入る前に電源を切るこ
とによって泳動を一時中止し、約30分間酵素消化を行
い、その後電気泳動を再開するという方法である。この
方法によれば酵素消化と消化後のペプチド断片の分離が
ワンステップでできるので便利である。プロテアーゼ消
化により形成したペプチドはPVDF膜やニトロセルロース
膜等に転写する。この膜をクマシー・ブリリアント・ブ
ルーやアミドブラック等のタンパク質を染色する色素で
染色した後、ペプチドバンドを切り出す。タンパク質分
解酵素消化後に生じたペプチドを含むPVDF膜やニトロセ
ルロース膜等は、公知の方法でペプチドのアミノ末端配
列決定を行うことができる。ペプチドの部分アミノ酸配
列を知ることで、塩基配列との整合性を確認できる。

【００８１】ＰＶＬ遺伝子の発現ＰＶＬ遺伝子は通常使用されている、または市販されて
いる大腸菌や酵母を宿主とする発現ベクターにより、周
知の方法で発現させることができる。発現ベクターは、
本ＰＶＬＤＮＡを開始コドンから直接発現させるもので
も、融合タンパク質として発現させるものでもよい。発
現ベクターとしては、PinPointXa、pGEMEX、pET-5(プロ
メガ(Promega)製)、pGEX-5X(ファルマシア(Pharmacia)
製)、大腸菌・酵母シャトルベクターであるpPIC3K(イン
ビトロジェン(Invitrogen)製)などの使用が好ましい。

【００８２】本発明の組換えＤＮＡは、本発明ＤＮＡ
に、他の任意のポリペプチドをコードするＤＮＡを常法
により組込むことによって得ることができる。他の任意
のポリペプチドをコードするＤＮＡは、ビオチン化を受
けるペプチドをコードする塩基配列を有することが好ま
しい。

【００８３】本発明ＤＮＡを含む組換えベクターは、常
法により任意のベクターに本発明ＤＮＡを組込むことに
よって得ることができる。好ましくは、ベクターは発現
ベクターである。発現ベクターは、遺伝子工学分野で通
常用いることができるベクターであれば特に限定されな
いが、ビオチン化を受けるペプチドをコードする塩基配
列や、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをコード
する塩基配列や、Ｔ７ファージのgene10産物等をコード
する塩基配列等を有することが好ましい。

【００８４】このような発現ベクターを用いて、例え
ば、ビオチン化を受けるペプチドとの融合ポリペプチド
を形成するように本発明ＤＮＡを組込めば、宿主細胞で
生成したポリペプチドがアビジン結合樹脂等を使用する
ことにより容易に精製できるようになる。また、例えば
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合ポリペ
プチドを形成するように本発明ＤＮＡを組込めば、宿主
細胞で生成したポリペプチドがグルタチオン結合樹脂等
を使用することにより容易に精製できるようになる。

【００８５】上記の組換えベクターを常法により宿主細
胞に導入することにより形質転換細胞が得られる。好ま
しくは、宿主細胞は大腸菌又は酵母である。組換えベク
ターおよび宿主細胞の組み合わせは当業者であれば適宜
選択することができる。

【００８６】

【実施例】次に、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、この実施例は本発明の一例を示すものであ
り、これに限定されるものではない。はじめに、実施例
中で共通して用いる方法に関して説明する。なお、特記
しない限り「％」は重量％である。

【００８７】１．レクチン活性測定法ＰＶＬのレクチン活性測定、及び結合特異性の測定はKo
chibe等の方法（Kochibe,A. and Matta,K.(1989),J.Bio
l.Chem.,264,173-177）に従った。具体的には、次の方
法で実施した。赤血球凝集法：９６穴のマイクロタイタープレートを
使用し、ＰＢＳで段階希釈したタンパク質液２５μｌと
２％Ｏ型ヒト赤血球ＰＢＳ懸濁液２５μｌを混合する。
20分室温放置後、凝集を引き起こす最小量を、ＰＶＬの
１凝集単位と規定する。赤血球凝集阻害法：段階希釈した既知濃度の阻害物質
液２５μｌと８凝集単位のＰＶＬ（２５μｌ）を混合
し、２時間４℃に放置後２％Ｏ型ヒト赤血球ＰＢＳ懸濁
液５０μｌを加える。20分室温放置後、凝集を完全に阻
害する、阻害物質の濃度（ｍＭ）を阻害濃度と規定す
る。

【００８８】

【実施例１】ＰＶＬのムジナタケ子実体からの精製と抗ＰＶＬポリク
ローナル抗体の作製１．抗ＰＶＬ抗体の調製ムジナタケ子実体は群馬県において、赤城山の標高５０
０ｍ〜６００ｍの地上に生息しているものを採取し、J.
Biol. Chem.,264, 173-177(1989)に記載された方法に
より、３００ｇのムジナタケ子実体から、電気泳動的に
ほぼ均一なバンドを示す約４０ｍｇのＰＶＬを得た。

【００８９】抗ＰＶＬ抗体を作成するために、１５週齢
のウサギを３羽免疫した。一回目の免疫は約２ｍｇのＰ
ＶＬをFreund Complete Adjuvantと混合したエマルジョ
ンをウサギ背部皮下に注射した。その後同量のＰＶＬと
Freund Incomplete Adjuvantを混合したエマルジョンを
筋肉内に毎週一回、３週連続して注射し、一週間後全採
血した。得られたウサギ血液は、4℃に一晩静置し、血
餅を沈澱させた後、2000×g、4℃で15分遠心して血清を
得た。得られた血清についてはオクタロニー拡散法を用
いてＰＶＬとの反応を確認した後、抗血清からプロテイ
ンＡアフィニティーカラム（アマシャム・ライフ・サイ
エンス(Amersham LIFE SCIENCE)製）を用いてＩｇＧを
精製した。

【００９０】２．ＥＬＩＳＡによる抗ＰＶＬポリクロー
ナル抗体の検定 96穴プレート（ヌンク(Nunc)製）の各ウェルに17μg/ml
のＰＶＬ溶液(25mM NaHCO3/NaOH緩衝液(pH9.4))を100μ
lづつ分注し、37℃で95分おいた後、145mM NaCl, 5mM
リン酸緩衝液(pH7.5)（ＰＢＳ）で一回洗浄した。１％
ウシ胎仔血清アルブミン（BSA-フラクションV；生化学
工業株式会社販売）を150μlづつ各ウェルに加え、３７
℃に1時間おいてブロッキングを行った。ＰＢＳで１回
各ウェルを洗浄した後、希釈した抗ＰＶＬ抗体を100μl
づつ加え、３７℃で１．５時間インキュベートを行っ
た。0.1％ Tween-20を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で3回洗
浄した後、アルカリフォスファターゼ結合抗ウサギＩｇ
Ｇ＋ＩｇＭヤギ抗体（コスモバイオ社(Cosmo Bio Co.L
td)製）を100μlづつ加え、３７℃で１時間インキュベ
ートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、基質溶液（1mg/
ml SIGMA 104 PHOSPHATASE SUBSTRATE, シグマ(Sigma)
社製)を100μlづつ加えて、室温に５分おいた後、着色
液の波長４０５nmでの吸光度（対照波長６３０nm）（Ａ
４０５／６３０）をウェルリーダーSK601（生化学工業
株式会社販売）にて測定した。

【００９１】３．抗ＰＶＬ抗体を用いたウエスタンブロ
ットドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動(SDS-PAGE)はLaemmliらの方法(Laemmli, U
K.,(1970), Nature 227, 680-685)を一部改変して行っ
た。サンプル緩衝液(50mM Tris-HCl, ２％ SDS, 20％グ
リセロール, 0.002％ブロモフェノールブルー(BPB), 5
％ β-メルカプトエタノール)と試料とを等量混合した
各サンプルを12.5％ポリアクリルアミドゲルを用いて2
0mAで約2時間、電気泳動にかけた。泳動後のゲルからPV
DFメンブラン（イモビロン；ミリポア(Millipore)社
製）への転写は、Nielsen PJ.とTowbin Hの方法(Nielse
n PJ.and Towbin H.,(1982),J.Biol.Chem.,257,12316-1
2321)を一部改変して行った。PVDFメンブランは100％
メタノールに20秒浸した後、蒸留水で数秒洗い25mMトリ
ス−192mM グリシン, 20％メタノール(ブロット緩衝液)
に５分間浸した。ブロット緩衝液に浸した濾紙（3MM ch
romatography paper；ワットマン(Whatman)製）を重ね
てメンブラン及びゲルをはさみ、180mAで1時間室温で通
電した。転写後、PVDFメンブランを5分間、3回、ＴＢＳ
Ｔ(10mM Tris-HCl(pH7.5), 150mM NaCl, 0.1％ Tween 2
0)で洗浄した。3％ BSAを含むＴＢＳＴ中にメンブラン
を移し1時間ブロッキングを行った。再びＴＢＳＴで５
分間、３回洗浄した後、抗ＰＶＬ抗体を含むＴＢＳＴ中
に移し1時間振とうしながら室温においた。ＴＢＳＴで
同様に洗浄した後、アルカリフォスファターゼ結合抗ウ
サギＩｇＧ(Fc)抗体（プロメガ(Promega)社製）を含む
ＴＢＳＴ中に移して1時間、振とうしながら室温におい
た。ＴＢＳＴで５分間洗浄後、ＴＢＳ(ＴＢＳＴのTween
20を含まないもの）で５分間、２回洗浄した後、Weste
rn Blue substrate（プロメガ(Promega)社製）中に移し
て発色反応を行った。適当な発色を確認した後、メンブ
ランを蒸留水で洗い発色を止めた。

【００９２】４．抗ＰＶＬ抗体の検定精製された抗ＰＶＬ抗体の検定のためにＥＬＩＳＡ及び
ウエスタンブロットを行った(図１)。ＥＬＩＳＡでは10
000倍の希釈での使用が可能であった。また、ウエスタ
ンブロットでの検定ではムジナタケの抽出物中には40kD
aのＰＶＬ以外のバンドは確認されなかった。また、K12
株由来の大腸菌の抽出液を用いたウエスタンブロットに
おいてもバンドは確認されず交差反応をする蛋白質はな
いと考えられた。

【００９３】５．ＰＶＬ部分アミノ酸配列の決定精製ＰＶＬはリジルエンドペプチダーゼ(Lysyl Endopep
tidase, 和光純薬工業株式会社製)を用い断片化した。
ゲル濾過により断片化したポリペプチドを分離した。４
個のペプチド断片の部分アミノ酸配列が決定された。こ
れらは後述するように、塩基配列から予測されるアミノ
酸配列と合致した（図３）。

【００９４】

【実施例２】ムジナタケｃＤＮＡの調製＜１＞ムジナタケ子実体λgt11cDNAライブラリーの調製ムジナタケ子実体は群馬県において、赤城山の標高５０
０ｍ〜６００ｍの地上に生息しているものを採取し、新
鮮なムジナタケ子実体をタンパク質変性剤存在下でポリ
トロンホモジナイザーで破砕し、細胞全ＲＮＡを抽出し
た。エタノール沈澱後細胞全ＲＮＡを−８０℃で保存し
た。

【００９５】全RNAからのmRNAの精製はPoLyATract mRNA
単離システム(プロメガ(Promega)社製)を用い、方法は
添付のプロトコールに従った。精製したmRNAからのcDNA
の合成はRiboClone cDNA Synthesis Systems AMV RT
（プロメガ(Promega)製のキット）を用い、当該キット
に添付の試薬を使用した。50mM Tris-HCl(pH8.5), 50mM
KCl, 10mM MgCl2, 500μM スペルミジン(spermidine),
10mM ジチオトレイトール(DTT), 1mM dNTPsに加え、1
μg ランダムプライマーを加えた後、25ユニット(U)RNa
sin、4mM リン酸ナトリウム、30U AMV RT(Avian Myelob
lastosis Virus Reverse Transcriptase)を加えて、1時
間37℃でインキュベートした。その後、反応液に最終濃
度で40mM Tris-HCl(pH7.2), 90mM KCl, 3mM MgCl2, 3mM
DTT, 50μg/ml BSAを加え、0.8U RNase H、23U DNAポ
リメラーゼIを加えて、14℃で２時間インキュベートし
た。その後、反応液を10分間、70℃においてcDNAを変性
させ、2UT4DNAポリメラーゼを加えて10分間、37℃でイ
ンキュベートした後、反応液に最終濃度で20mM エチレ
ンジアミン四酢酸(EDTA)を加えて反応を停止させた。フ
ェノール抽出、エタノール沈澱を行った後、10mM Tris-
HCl(pH8.0),1mM EDTA(TE緩衝液)に溶解した。cDNAにEco
RIアダプター(プロメガ(Promega)製)を結合し、λgt11
ベクターアーム(プロメガ(Promega)製)と結合した。得
られたDNAをGigapackIII Gold Packaging Extract(スト
ラタジーン(Stratagene)社製)を用いてパッケージング
し、大腸菌Y1090に感染させた後ファージを回収し、λg
t11ライブラリーを調製した。

【００９６】＜２＞ＰＶＬｃＤＮＡの分離１．抗ＰＶＬ抗体を用いたcDNAライブラリーのスクリー
ニングＬＢ(Luria Broth)培地中で一晩培養したY1090にλgt11
cDNAライブラリーの1.5×104を感染させ15mmプレートに
まいた後、42℃で3.5時間インキュベートした。10mM イ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド(Isoprop
yl-β-D-thiogalactopyranoside；以下IPTGともいう)溶
液に30分間浸しておいたニトロセルロース膜（ミリポア
(Millipore)社製）を静かにプレートにのせ、さらに37
℃で3.5時間インキュベートした。ニトロセルロース膜
を静かにプレートからはがした後、ＴＢＳＴで２回洗浄
した。１％ BSAを含むＴＢＳＴ中に移し、室温で1時間
ブロッキングした。ＴＢＳＴで１回洗浄した後、抗ＰＶ
Ｌ抗体と室温で30分間反応させた。ＴＢＳＴで３回洗浄
した後、アルカリフォスファターゼ結合抗ウサギIgG抗
体(プロメガ(Promega)製)を含む溶液中で30分間室温で
インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄した後、さらに
ＴＢＳで１回洗浄した。ニトロブルーテトラゾリウム(N
itro blue Tetrazolium；NBT)及びブロモクロロインド
イルフォスフェート(Bromochloroindoyl phosphate；BC
IP)を含むアルカリフォスファターゼ(alkaline phospha
tase；AP)溶液(100mM Tris-HCl(pH9.5), 100mM NaCl 5m
M MgCl2)で発色反応を行った。適当な発色が得られたと
ころで20mM Tris-HCl(pH8.0), 5mM EDTA溶液中にニトロ
セルロース膜を移して発色反応を停止させた。得られた
陽性プラークからファージを抽出してY1090に感染させ
上記と同様の操作を繰り返して陽性クローンの精製を行
った。

【００９７】２．ＰＶＬcDNAクローンの単離調製したムジナタケcDNAライブラリーをスクリーニング
し、1.4x105 プラーク形成単位(pfu)のプラークから６
つの陽性プラークを検出精製した。各々のクローンから
cDNAを単離し、EcoRIを用いて切断した後、アガロース
電気泳動にてインサートの分子量を確認した。最長のイ
ンサートをもつクローンはλPVL231とλPVL2111でイン
サートの長さはどちらもほぼ同じでおよそ1300bpであっ
た。λPVL511,λPVL3121,λPVL2221のインサートの長さ
は各々概算で700bp,300bp,250bpであった。λPVL611に
ついては電気泳動ではインサートと思われるバンドは確
認できず、100bp以下の長さであると考えられた。ＰＶ
Ｌの分子量は40kDaであることから(Kochibe,A. and Mat
ta,K.(1989),J.Biol.Chem.,264,173-177)、予想される
ＰＶＬのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の長
さは1200bp程度と考えらるのでλPVL231とλPVL2111は
目的とするＰＶＬをコードする塩基配列の全長か、もし
くはそれに近い長さを含むものであると推測された。

【００９８】＜３＞ＰＶＬクローンの配列の確認１．ＰＶＬcDNAの塩基配列の決定 λPVL231とλPVL2111からインサートをEcoRI処理によっ
て取り出し、pBluescript SK(+)（ストラタジーン(Stra
tagene)製）の EcoRIサイトに挿入し、各々SKPVL231とS
KPVL2111を作成した。これらを種々の制限酵素で切断し
電気泳動で確認した結果この２つのクローンのインサー
トは同じパターンを示した(データは示していない)。そ
こでSKPVL231を中心に解析を行うことにした。塩基配列
の決定はABI Prism Primer Cycle Sequencing reaction
Kit(パーキン・エルマー社(Perkin-Elmer Co.)製)を用
いて行った。また、サーマルサイクラーはGeneamp PCRs
ystem 9600(パーキン・エルマー社(Perkin-Elmer Co.)
製)を用いた。シークエンサーは、model 373A(パーキン
・エルマー社(Perkin-Elmer Co.)製)を用いた。決定さ
れた塩基配列の解析は、Wisconsin DNA analysis progr
am(The WisconsinSequence Analysis PackageTM)を用い
て行った。図２に示すようにインサートをRsaI,HindII
I,SalIで消化することによって得られた7つのフラグメ
ントをpBluescript SK(+)に挿入して7つのサブクローン
を作成し、その7つのサブクローンについてM13-20プラ
イマー(プロメガ(Promega)製)、及びM13リバースプライ
マー(プロメガ(Promega)製)を用いて双方向から各々に
ついて数回づつシークエンシングし、各々のサブクロー
ンのインサートの塩基配列を決定した。さらにSKPVL231
のインサートの全塩基配列を確定するために、得られた
情報から図２に示す13のプライマーを作成し、それらを
用いてインサート全長の塩基配列を決定した。

【００９９】２．ＰＶＬcDNAの塩基配列の解析塩基配列解析の結果を図３に示す。インサートDNAの全
長は1256bpで、ポリＡテール及びそれに関するシグナル
は含まれなかった。これはライブラリー調製の際にラン
ダムプライマーを使用したためと考えられる。得られた
インサートDNAの塩基配列についてＯＲＦを検索した結
果、900bp以上のＯＲＦは一つしか確認されず、6つのフ
レームの内4つのフレームについては500bp以下のＯＲＦ
しか確認されなかった。また残りの1つのフレームには
開始コドンも終始コドンも確認されず、より大きなＯＲ
Ｆの一部部分とも考えられたが、アミノ酸配列の解析で
得られた配列がこの中には全く含まれないことと、1256
bpだけでアミノ酸に換算すると43kDa以上の分子量とな
り、アミノ酸配列解析で得られたアミノ酸配列を含むよ
り長いＯＲＦは考え難く、目的の物質をコードしている
とは考えにくい。ＰＶＬをコードしていると考えられる
ＯＲＦは塩基数にして1206bpでアミノ酸に換算すると40
2残基であった。塩基配列から予想されるアミノ酸配列
はＰＶＬの酵素消化によるフラグメントのアミノ酸配列
解析から得られた4つのペプチドの部分アミノ酸配列が
全て含まれていた(図３の太下線)。また、このＯＲＦの
中には先頭のATG配列の他に5つのATG配列が存在する
が、これらを開始コドンとするとその内のもっとも長い
ＯＲＦでも、アミノ酸配列解析で得られた配列を含まな
い配列が存在し、この結果と一致しない。ＰＶＬをコー
ドしていると思われるＯＲＦの塩基配列から予想される
分子量は43006.88であり、SDS-PAGEやゲルフィルトレー
ションで推定されている分子量(40kDa)よりも大きかっ
た。また、このＯＲＦの塩基配列から予想されるアミノ
酸組成と以前にN. Kochibeら（J. Biol. Chem. 264, 17
3-177(1989)）によって報告されたＰＶＬのアミノ酸組
成分析の結果を比較するとその割合は全体によく一致し
ていた(第１表)。第１表中、数字はアミノ酸の残基数で
あり、括弧内の数字はアミノ酸比率（％）である。

【０１００】

【表３】第１表アミノ酸組成の比較 ────────────────────────── ｃＤＮＡ塩基配列 N. Kochibeらがから予測される報告したＰＶＬのアミノ酸アミノ酸組成アミノ酸組成（４３ｋＤａ）（４０ｋＤａ）Ａｓｘ 60 (14.9) 49.8 (13.7) Ｔｈｒ 22 ( 5.5) 27.7 ( 7.6) Ｓｅｒ 13 ( 3.2) 17.7 ( 4.9) Ｇｌｘ 17 ( 4.2) 24.5 ( 6.7) Ｐｒｏ 13 ( 3.2) 15.6 ( 4.3) Ｇｌｙ 60 (14.9) 42.3 (11.6) Ａｌａ 32 ( 8.0) 27.7 ( 7.6) Ｃｙｓ 4 ( 1.0) 2.5 ( 0.7) Ｖａｌ 42 (10.4) 23.1 ( 6.3) Ｍｅｔ 6 ( 1.5) 3.5 ( 1.0) Ｉｌｅ 21 ( 5.2) 18.5 ( 5.1) Ｌｅｕ 28 ( 7.0) 27.0 ( 7.4) Ｔｙｒ 10 ( 2.5) 10.7 ( 2.9) Ｐｈｅ 22 ( 5.5) 23.5 ( 6.5) Ｈｉｓ 7 ( 1.7) 7.8 ( 2.1) Ｌｙｓ 15 ( 3.7) 16.4 ( 4.5) Ｔｒｐ 9 ( 2.2) 1.5 ( 0.4) Ａｒｇ 21 ( 5.2) 24.5 ( 6.7) 計 402 364.3 ──────────────────────────

【０１０１】N. Kochibeらが報告したＰＶＬのアミノ酸
組成解析の数値は分子量を40kDaとして各アミノ酸比率
からアミノ酸残基数に換算したものである。そのため、
組成の割合が大きなアミノ酸ではcDNAの塩基配列から得
られた残基数との開きが一見大きく見えるが比率におい
てはほぼ一致している。また、トリプトファンに関して
はその数値に両者の間の開きが大きいように感じられる
が、アミノ酸組成分析の際のペプチドの酸による加水分
解処理によってトリプトファン自体が破壊されたためと
考えられる。図３に細下線で示したように５つのＮ−グ
リコシレーション可能な部位が存在した。興味深いこと
に、図４に示すように蛋白質全体にわたって７回の繰り
返し配列が確認された。アミノ酸配列における繰り返し
構造は他の植物レクチンでも確認されているが部分的な
繰り返しにすぎず蛋白質の90％以上が繰り返し配列に含
まれるものは極めて珍しい。

【０１０２】GenBank、EMBL及び蛋白質データベース（P
IR、SWISS-PROT）を用いて菌類だけでなく、全ての種に
おいて検索を行ったが、有意な相同性をもつものは確認
されなかった。

【０１０３】３．ＰＶＬcDNAの発現３−１．宿主細胞として大腸菌を用いる発現３−１−１．発現ベクターPinPointXaを用いた発現 SKPVL231からHindIIIで切断して得られたフラグメント
を発現ベクターPinpoint Xa-1(プロメガ(Promega)製)の
HindIIIサイトに挿入してpPPVL231を作成した。このプ
ラスミドで大腸菌JM109を形質転換した。この形質転換
した大腸菌を50μg/ml アンピシリンを含むＬＢ(LBamp)
で一晩前培養し、100mlのLBampに1mlの前培養液を添加
し、37℃で１時間振とう培養後、最終濃度が100μMとな
るように IPTGを加えて、さらに４時間振とう培養し
た。培養液の100μlを取り、室温、10,000×gで５分遠
心後、上清を捨てた。ペレットに、50mM Tris-HCl, ２
％ SDS, 20％グリセロール, 5％ β-メルカプトエタノ
ール, 0.002％ BPBを含む緩衝液(サンプル緩衝液)を加
えて攪拌し、95℃で5分間煮沸した。この後、SDS-PAGE
及びウエスタンブロットで解析を行った。

【０１０４】発現ベクターpPPVL231の構造を図５に示
す。発現ベクターPinpoint Xa-1は大腸菌内でビオチン
化を受けるペプチドの融合蛋白質を発現する。このベク
ターのビオチン化ペプチドの下流のHindIIIサイトに挿
入されたインサートはＰＶＬcDNAのＯＲＦの最初から23
bp、アミノ酸にして８アミノ酸残基を欠いている。SDS-
PAGEによる解析(図６.A)では、pPPVL231で形質転換した
大腸菌の抽出物ではベクター(Pinpoint Xa-1)のみで形
質転換した大腸菌の抽出物では認められない53kDaのバ
ンドを確認した。また、ウエスタンブロットによる解析
(図６.B)では同じ53kDaのバンドが特異的に抗ＰＶＬ抗
体と反応し、ベクター(Pinpoint Xa-1)のみを導入した
大腸菌の抽出物には抗ＰＶＬ抗体と反応するバンドは確
認されなかった。

【０１０５】なおデータは省略するが、ＰＶＬのＯＲＦ
を融合蛋白質でない形で発現したものではSDS-PAGEで確
認される分子量は天然ＰＶＬと同一の40kDaであった。
また本組換え融合タンパク質を、PinPoint protein pur
ification system(プロメガ(Promega)社製のキット)に
含まれるアビジン樹脂（Softlink SoftReleaseAvidin R
esin；プロメガ(Promega)社製）を使用し、当該キット
に添付の公知のプロトコールに従い精製したものは、上
述の方法でレクチン活性及びアガラクトＩｇＧ結合性を
示した。

【０１０６】これらの結果から、クローン化したcDNAは
ＰＶＬをコードしていることが明かとなった。

【０１０７】３−１−２．発現ベクターpGEMEXを用いた
発現 pPPVL231の、PVL遺伝子を含む制限酵素 SacI、EcoRI切
断DNA断片を、プラスミドpGEMEX-1（プロメガ(Promega)
社製）の対応するSacI、EcoRI部位に挿入することで、
プラスミド pGEMEXPVL231を作成した。

【０１０８】このpGEMEXPVL231で大腸菌BL21(DE3)pLysS
を形質転換した。各プラスミドで形質転換した大腸菌を
LB-アンピシリンプレート(50μg/ml)で一晩培養し、得
られた単一コロニーをLB-アンピシリン(50μg/ml)液体
培地に接種し、37℃で一晩前培養した。LB培地に1/100
量の前培養液を接種し、37℃で１時間振とう培養後、最
終濃度100μMとなるようにIPTGを加えた。さらに4時
間、37℃で振とう培養後、菌体を遠心分離により回収し
た。菌体ペレットに、湿重量の10倍の溶液Ａ(50mM Tris
-HCl(pH8.0)、145mM NaCl、5mM EDTA、0.5mM PMSF(フェ
ニルメタンスルホニルフルオリド)、10％グリセロー
ル)を加えて超音波処理した。この菌体破砕液を4℃、2
0,000×gで30分間遠心し、上清を菌体粗抽出液とした。

【０１０９】この抽出液について、SDS-PAGE及びウエス
タンブロットで解析した結果、抗PVL抗体と特異的に反
応するそれぞれ40kDaと56kDaのバンドを検出した。この
結果から、pGEMEXPVL231からの組換え体PVLの発現が確
認された。

【０１１０】なお、pGEMEXPVL231からの産物は、PVLと
Ｔ７ファージのgene10産物との融合蛋白質であり、この
分子量は配列から予想された分子量とよく一致した。

【０１１１】３−１−３．発現ベクターpET-5を用いた
発現 pSKPVL231の、PVL遺伝子を含む制限酵素 HindIII、EcoR
I切断DNA断片を、プラスミド pET-5c（プロメガ(Promeg
a)社製）の対応するHindIII、EcoRI部位に挿入すること
で、プラスミド pETPVL231を作成した。

【０１１２】このpETPVL231で大腸菌BL21(DE3)pLysSを
形質転換し、上記３−１−２．と同様の操作を行い、菌
体粗抽出液を得た。

【０１１３】この抽出液について、SDS-PAGE及びウエス
タンブロットで解析した結果、抗PVL抗体と特異的に反
応するそれぞれ40kDaと56kDaのバンドを検出した。この
結果から、pETPVL231からの組換え体PVLの発現が確認さ
れた。

【０１１４】なお、pETPVL231の産物はアミノ末端にＴ
７ファージのgene10産物と同一の配列を含むが、その分
子量は配列から予測されるように天然のPVLの分子量に
近かった。

【０１１５】３−１−４．発現ベクターpGEX-5Xを用い
た発現上記３−１−２．で作成したpETPVL231の、PVL遺伝子を
含む制限酵素 BamH1、EcoRI切断DNA断片を、プラスミド
pGEX-5X-1(ファルマシア(Pharmachia)社製）の対応す
るBamHI、EcoRI部位に挿入することで、プラスミド pGS
TPVL231を作成した。

【０１１６】このpGSTPVL231で大腸菌 ABLE Kを形質転
換し、上記３−１−２．と同様の操作を行い、菌体粗抽
出液を得た。

【０１１７】この抽出液についてSDS-PAGE及びウエスタ
ンブロットで解析した結果、特異的な68kDaのバンドが
確認された。このバンドはウエスタンブロットによって
抗PVL抗体と特異的に反応した。

【０１１８】この結果から、ｐＥＴＰＶＬ２３１からの
組換え体ＰＶＬの発現が確認された。なお、pGSTPVL2
31からの産物はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラー
ゼとPVLとの融合蛋白質であり、この分子量は配列から
予想された分子量とよく一致した。

【０１１９】３−２．宿主細胞として酵母を用いる発現３−２−１．酵母発現プラスミドの作成プラスミド pSKPVL231を制限酵素DdeIで切断後、DNAポ
リメラーゼクレノウ断片(DNA polymerase Klenow frag
ment)の反応により末端平滑化し、EcoRI-linkerを連結
させた。この反応物を制限酵素EcoRIで切断後、アガロ
ース電気泳動でPVL遺伝子を含むDNA断片を分離・精製
し、酵母発現プラスミド pPIC3K(Invitrogen社製)のEco
RI切断部位にPVL遺伝子配列が、AOX1(alcohol oxidase)
遺伝子プロモーターの下流で転写される方向に挿入した
プラスミド、pPICPVL231を作成した。発現プラスミドpP
ICPVL231の構造を図７に示す。本プラスミドは、PVL遺
伝子cDNAの蛋白質をコードする部分の全配列を含むもの
である。

【０１２０】３−２−２．発現プラスミドの導入及びク
ローンの選択 pPICPVL231のプラスミドDNAを制限酵素BspEIで切断し、
酵母 Pichia pastoris、SMD1168(his4 pep4)にエレクト
ロポレーションで導入した。ヒスチジン無しで生育出来
る遺伝子導入体をMD寒天培地(ミニマル・デキストロー
ス培地(MinimalDextrose Medium)；1.35％ Yeast Nitro
gen Base、4×10^-5％ビオチン、2％グルコース、 2％
アガロース)で選択した。これら導入体はPichia pasto
risのhis4遺伝子領域に、pPICPVL231DNAが酵母染色体の
一部として組み込まれたものである。これらの導入体中
で遺伝子重複による発現量増加を期待しG418耐性の高い
クローン(#20と名付けた)を選択した。

【０１２１】３−２−３．PVLの発現前記クローン#20の単コロニーを10mlのＭＧ(ミニマル・
グリセロール培地(Minimal glycerol medium)；1.34％
Yeast Nitrogen Base、4×10^-5％ビオチン、1％グリ
セロール)で30℃一晩培養し、集菌後、30mlのＭＭ(ミニ
マル・メタノール培地(Minimal methanol medium);1.34
％ Yeast Nitrogen Base、4×10^-5％ビオチン、1.5％
メタノール)で37℃で培養し、24時間毎に、培地の0.5％
に相当する量のメタノールを添加した。

【０１２２】サンプルは、24時間毎に1mlずつ回収し、
遠心後ペレットを-80℃で保存した。各サンプルは100μ
ｌのBB(破砕緩衝液(Breaking Buffer)；50mM 燐酸ナト
リウムpH7.4、1mM EDTA、5％グリセロール)に懸濁し、
ガラスビーズで細胞壁を破砕後、12,000rpm、10分間遠
心した。遠心上清にSDSサンプル緩衝液を加え、SDS-PAG
Eの後、ウェスタンブロットを行った。その結果、いず
れのサンプルでも、天然物のPVLとほぼ等分子量の抗PVL
抗体と反応性のある蛋白質の発現が認められた。

【０１２３】本発現プラスミド(pPICPVL231)は、大腸菌
内での複製開始領域（ori;pMB1 replication origin)、
アンピシリン耐性遺伝子(bla)を持ち大腸菌内で増殖出
来る。5'AOX1はalcohol oxidase遺伝子AOX1のpromoter
領域であり、その下流にPVL遺伝子のORF(open reading
frame)が挿入されている。本プラスミドには酵母での複
製開始領域(ARS)が含まれないが、染色体に挿入される
ことで、染色体の一部として複製される。

【０１２４】例えばこのプラスミドをBspE1で切断し、
酵母にエレクトロポレーションなどの手段で導入する
と、HIS4領域に組み込まれる。同様にSacIで切断すれば
AOX1遺伝子に組み込まれる。BglIIで切断したものを導
入すれば、AOX1遺伝子との遺伝子置換(gene replacemen
t)も可能である。

【０１２５】本発現プラスミドで、酵母におけるPVL遺
伝子の発現が確認された事から、類似のAOX1遺伝子プロ
モーターを利用したPichia pastoris発現ベクター、例
えばpPIC9K、pAO815、pHIL-D2等によるPVLの発現が可能
であろうことは、当業者であれば容易に予測できる。ま
たPichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae及びSch
izosaccharomyces pombeを含む各種酵母類の発現系によ
り、PVL遺伝子の発現が可能である事が予測される。ま
たpPICPVL231を含む、これら発現プラスミドの改良、導
入体の選択・改良、培養・誘導条件の改良により、組換
え体PVLの大量発現、供給が期待できる。

【０１２６】

【発明の効果】本発明により、ＰＶＬまたはその同効物
をコードするＤＮＡ、および該ＤＮＡまたは該ＤＮＡ由
来のＤＮＡ断片から発現されるポリペプチドが得られ
る。

【０１２７】本発明により、ＰＶＬまたはその同効物を
コードするＤＮＡが得られたので、ＰＶＬまたはその同
効物を工業的に使用可能な程度まで大量生産できること
が期待される。従来ＰＶＬが用いられていた用途および
ＰＶＬの結合特異性等を利用した用途への利用が期待さ
れる。

【０１２８】また、本発明によって得られる組換え体Ｐ
ＶＬは診断薬への応用が期待される。すなわち、慢性関
節リウマチ(RA)の患者では正常人と異なり、血清中にお
いて異常なIgG、すなわち297番目のアスパラギン残基に
結合した糖鎖のガラクトース(Gal)以下が欠落し、Ｎ結
合型糖鎖の基本構造となるAsn←GlcNAc←GlcNAc←Man←
GlcNAcが剥きだしとなったIgG(アガラクトIgG)が異常に
増加していることが報告されている(Mullinax,F.(197
5),Arthritis Rheum.,18,417；Parekh,B. et al.(198
5), Nature, 316,452)。一方、ＰＶＬは単量体の蛋白質
であり、βGlcNAc1→6Man及び1→3Man等の末端にGlcNAc
を有する糖鎖に結合する（Kochibe,A. andMatta,K.(198
9),J.Biol.Chem.,264,173-177）。ＰＶＬがアガラクトI
gGを特異的に認識することによりRAの診断への応用の可
能性が報告されている（Tsuchiya,N. and Kobata,A.(19
93),J. Immunol,151,1137-1146）。また、アガラクトIg
Gの特異的な増加は一部の他の疾病でも報告されてい
る。従って、組換え体ＰＶＬのこうした疾病に対する診
断薬への応用が大いに期待される。また、本発明ＤＮＡ
を用いた遺伝子工学的手法により、新規な活性を有する
レクチンの創製も期待される。

【０１２９】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：1256 配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 起源生物名：ムジナタケ（Psathyrella velutina）組織の種類：子実体配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：41..1246 配列 ACCTCCTACG ATCTTCACCG CCTAAGAGAT ACAATACCCA ATG TCG ATC CCA GTC 55 Met Ser Ile Pro Val 1 5 ATC AGT CAA GCT TCG CCC GTC CCC ACC CGC ATT CCA GGT GTC GCA GAC 103 Ile Ser Gln Ala Ser Pro Val Pro Thr Arg Ile Pro Gly Val Ala Asp 10 15 20 CTG GTC GGG TTC GGA ACT GGA GGA GTC TAC ATA ATC CGT AAC TCC CTC 151 Leu Val Gly Phe Gly Thr Gly Gly Val Tyr Ile Ile Arg Asn Ser Leu 25 30 35 CTC ATC CAG GTC GTC AAA GTC ATC AAC AAC TTC GGC TAC GAC GCC GGA 199 Leu Ile Gln Val Val Lys Val Ile Asn Asn Phe Gly Tyr Asp Ala Gly 40 45 50 GGA TGG CGC GTC GAA AAG CAC GTC CGC CTC CTC GCA GAC ACC ACA GGC 247 Gly Trp Arg Val Glu Lys His Val Arg Leu Leu Ala Asp Thr Thr Gly 55 60 65 GAC AAC CAA TCT GAT GTG GTC GGC TTC GGC GAG AAC GGC GTC TGG ATC 295 Asp Asn Gln Ser Asp Val Val Gly Phe Gly Glu Asn Gly Val Trp Ile 70 75 80 85 TCG ACC AAC AAC GGC AAC AAC ACG TTC ACC GAC CCC CCC AAG ATG GTG 343 Ser Thr Asn Asn Gly Asn Asn Thr Phe Thr Asp Pro Pro Lys Met Val 90 95 100 ATT GCC AAC TTC GCA TAC AAC GCG GGC GGC TGG CGT GTC GAA AAG CAC 391 Ile Ala Asn Phe Ala Tyr Asn Ala Gly Gly Trp Arg Val Glu Lys His 105 110 115 ATC CGT TTC ATG GCG GAC CTG CGC AAG ACC GGC CGT GCT GAC ATC GTC 439 Ile Arg Phe Met Ala Asp Leu Arg Lys Thr Gly Arg Ala Asp Ile Val 120 125 130 GGG TTC GGA GAG GCC GGC ATC CTC GTC TCG CTC AAC AAC GGC GGC AGC 487 Gly Phe Gly Glu Ala Gly Ile Leu Val Ser Leu Asn Asn Gly Gly Ser 135 140 145 CAG TTC GCG CCC GCC CAG CTC GCC TTG AAC AAC TTT GGG TAC GCC CAA 535 Gln Phe Ala Pro Ala Gln Leu Ala Leu Asn Asn Phe Gly Tyr Ala Gln 150 155 160 165 GGA TGG AGG TTG GAC CGC CAC CTC CGT TTC CTC GGT GAC ATC ACC GGC 583 Gly Trp Arg Leu Asp Arg His Leu Arg Phe Leu Gly Asp Ile Thr Gly 170 175 180 GAC GGC CTC CTC GAC GTT GTC GGT TTC GGC GAG AAC CAC GTC TAC GCC 631 Asp Gly Leu Leu Asp Val Val Gly Phe Gly Glu Asn His Val Tyr Ala 185 190 195 GCA CGC AAC AAC GGC AAC GGC ACC TTC CAG CCT GCC CAG GCC GTC GTC 679 Ala Arg Asn Asn Gly Asn Gly Thr Phe Gln Pro Ala Gln Ala Val Val 200 205 210 AAC AAC TTC TGC GTC GGC GCA GGA GGA TGG ACT ATC GCC TCC CAC CCT 727 Asn Asn Phe Cys Val Gly Ala Gly Gly Trp Thr Ile Ala Ser His Pro 215 220 225 CGT GTC ATC GCC GAC CTC ACT GGA GAC AAG AGG GCC GAC ATC CTT GGC 775 Arg Val Ile Ala Asp Leu Thr Gly Asp Lys Arg Ala Asp Ile Leu Gly 230 235 240 245 TTC GGC GGA GCA GGA GTG TAC ACC TCC CTC AAC AAC GGC AAC GGC ACT 823 Phe Gly Gly Ala Gly Val Tyr Thr Ser Leu Asn Asn Gly Asn Gly Thr 250 255 260 TTC GGC GCC GTC AAC CTC GTC TTG AAG GAC TTT GGC ACC GCC AGC GGA 871 Phe Gly Ala Val Asn Leu Val Leu Lys Asp Phe Gly Thr Ala Ser Gly 265 270 275 TGG CGT GTC GAG AAA CAC GTC CGC TGC GTC GCC CCC CTC ACC AAC AAG 919 Trp Arg Val Glu Lys His Val Arg Cys Val Ala Pro Leu Thr Asn Lys 280 285 290 AAG GTC GGA GAC ATC ATC GGG TTC GGC GAC GCG GGC GTG TAC GTC GCG 967 Lys Val Gly Asp Ile Ile Gly Phe Gly Asp Ala Gly Val Tyr Val Ala 295 300 305 CTC AAC AAT GGC AAC GGA ACG TTC GGC CCC GTC AAG CGC GTC ATC GAT 1015 Leu Asn Asn Gly Asn Gly Thr Phe Gly Pro Val Lys Arg Val Ile Asp 310 315 320 325 AAC TTT GGG TAC AAC CAG GGA TGG CGA GTG GAC AAG CAC CCG AGG TTC 1063 Asn Phe Gly Tyr Asn Gln Gly Trp Arg Val Asp Lys His Pro Arg Phe 330 335 340 GTC GTC GAC TTG ACC GGC GAC GGC TGC GCC GAT ATC GTC GGA TTT GGA 1111 Val Val Asp Leu Thr Gly Asp Gly Cys Ala Asp Ile Val Gly Phe Gly 345 350 355 GAG AAC TCG GTT TGG GCG TGC ATG AAC AAG GGC GAC GGA ACC TTT GGA 1159 Glu Asn Ser Val Trp Ala Cys Met Asn Lys Gly Asp Gly Thr Phe Gly 360 365 370 CCG ATG ATG AAG CTG ATT GAC GAC TTG ACG GTC TCC AAG GGC TGG ACC 1207 Pro Met Met Lys Leu Ile Asp Asp Leu Thr Val Ser Lys Gly Trp Thr 375 380 385 CTC CAG AGG ACC GTC CGA TAC GCC GCG AAC CTC TAC CTC TGAACGCGAC 1256 Leu Gln Arg Thr Val Arg Tyr Ala Ala Asn Leu Tyr Leu 390 395 400

【０１３０】配列番号：２配列の長さ：402 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Ser Ile Pro Val Ile Ser Gln Ala Ser Pro Val Pro Thr Arg Ile 1 5 10 15 Pro Gly Val Ala Asp Leu Val Gly Phe Gly Thr Gly Gly Val Tyr Ile 20 25 30 Ile Arg Asn Ser Leu Leu Ile Gln Val Val Lys Val Ile Asn Asn Phe 35 40 45 Gly Tyr Asp Ala Gly Gly Trp Arg Val Glu Lys His Val Arg Leu Leu 50 55 60 Ala Asp Thr Thr Gly Asp Asn Gln Ser Asp Val Val Gly Phe Gly Glu 65 70 75 80 Asn Gly Val Trp Ile Ser Thr Asn Asn Gly Asn Asn Thr Phe Thr Asp 85 90 95 Pro Pro Lys Met Val Ile Ala Asn Phe Ala Tyr Asn Ala Gly Gly Trp 100 105 110 Arg Val Glu Lys His Ile Arg Phe Met Ala Asp Leu Arg Lys Thr Gly 115 120 125 Arg Ala Asp Ile Val Gly Phe Gly Glu Ala Gly Ile Leu Val Ser Leu 130 135 140 Asn Asn Gly Gly Ser Gln Phe Ala Pro Ala Gln Leu Ala Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Gly Tyr Ala Gln Gly Trp Arg Leu Asp Arg His Leu Arg Phe Leu 165 170 175 Gly Asp Ile Thr Gly Asp Gly Leu Leu Asp Val Val Gly Phe Gly Glu 180 185 190 Asn His Val Tyr Ala Ala Arg Asn Asn Gly Asn Gly Thr Phe Gln Pro 195 200 205 Ala Gln Ala Val Val Asn Asn Phe Cys Val Gly Ala Gly Gly Trp Thr 210 215 220 Ile Ala Ser His Pro Arg Val Ile Ala Asp Leu Thr Gly Asp Lys Arg 225 230 235 240 Ala Asp Ile Leu Gly Phe Gly Gly Ala Gly Val Tyr Thr Ser Leu Asn 245 250 255 Asn Gly Asn Gly Thr Phe Gly Ala Val Asn Leu Val Leu Lys Asp Phe 260 265 270 Gly Thr Ala Ser Gly Trp Arg Val Glu Lys His Val Arg Cys Val Ala 275 280 285 Pro Leu Thr Asn Lys Lys Val Gly Asp Ile Ile Gly Phe Gly Asp Ala 290 295 300 Gly Val Tyr Val Ala Leu Asn Asn Gly Asn Gly Thr Phe Gly Pro Val 305 310 315 320 Lys Arg Val Ile Asp Asn Phe Gly Tyr Asn Gln Gly Trp Arg Val Asp 325 330 335 Lys His Pro Arg Phe Val Val Asp Leu Thr Gly Asp Gly Cys Ala Asp 340 345 350 Ile Val Gly Phe Gly Glu Asn Ser Val Trp Ala Cys Met Asn Lys Gly 355 360 365 Asp Gly Thr Phe Gly Pro Met Met Lys Leu Ile Asp Asp Leu Thr Val 370 375 380 Ser Lys Gly Trp Thr Leu Gln Arg Thr Val Arg Tyr Ala Ala Asn Leu 385 390 395 400 Tyr Leu

【０１３１】配列番号：３配列の長さ：53 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Val Ala Asp Leu Val Gly Phe Gly Thr Gly Gly Val Tyr Ile Ile 1 5 10 15 Arg Asn Ser Leu Leu Ile Gln Val Val Lys Val Ile Asn Asn Phe Gly 20 25 30 Tyr Asp Ala Gly Gly Trp Arg Val Glu Lys His Val Arg Leu Leu Ala 35 40 45 Asp Thr Thr Gly Asp 50

【０１３２】配列番号：４配列の長さ：57 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Asn Gln Ser Asp Val Val Gly Phe Gly Glu Asn Gly Val Trp Ile Ser 1 5 10 15 Thr Asn Asn Gly Asn Asn Thr Phe Thr Asp Pro Pro Lys Met Val Ile 20 25 30 Ala Asn Phe Ala Tyr Asn Ala Gly Gly Trp Arg Val Glu Lys His Ile 35 40 45 Arg Phe Met Ala Asp Leu Arg Lys Thr 50 55

【０１３３】配列番号：５配列の長さ：55 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Arg Ala Asp Ile Val Gly Phe Gly Glu Ala Gly Ile Leu Val Ser 1 5 10 15 Leu Asn Asn Gly Gly Ser Gln Phe Ala Pro Ala Gln Leu Ala Leu Asn 20 25 30 Asn Phe Gly Tyr Ala Gln Gly Trp Arg Leu Asp Arg His Leu Arg Phe 35 40 45 Leu Gly Asp Ile Thr Gly Asp 50 55

【０１３４】配列番号：６配列の長さ：56 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Leu Leu Asp Val Val Gly Phe Gly Glu Asn His Val Tyr Ala Ala 1 5 10 15 Arg Asn Asn Gly Asn Gly Thr Phe Gln Pro Ala Gln Ala Val Val Asn 20 25 30 Asn Phe Cys Val Gly Ala Gly Gly Trp Thr Ile Ala Ser His Pro Arg 35 40 45 Val Ile Ala Asp Leu Thr Gly Asp 50 55

【０１３５】配列番号：７配列の長さ：55 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Lys Arg Ala Asp Ile Leu Gly Phe Gly Gly Ala Gly Val Tyr Thr Ser 1 5 10 15 Leu Asn Asn Gly Asn Gly Thr Phe Gly Ala Val Asn Leu Val Leu Lys 20 25 30 Asp Phe Gly Thr Ala Ser Gly Trp Arg Val Glu Lys His Val Arg Cys 35 40 45 Val Ala Pro Leu Thr Asn Lys 50 55

【０１３６】配列番号：８配列の長さ：55 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Lys Val Gly Asp Ile Ile Gly Phe Gly Asp Ala Gly Val Tyr Val Ala 1 5 10 15 Leu Asn Asn Gly Asn Gly Thr Phe Gly Pro Val Lys Arg Val Ile Asp 20 25 30 Asn Phe Gly Tyr Asn Gln Gly Trp Arg Val Asp Lys His Pro Arg Phe 35 40 45 Val Val Asp Leu Thr Gly Asp 50 55

【０１３７】配列番号：９配列の長さ：54 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Cys Ala Asp Ile Val Gly Phe Gly Glu Asn Ser Val Trp Ala Cys 1 5 10 15 Met Asn Lys Gly Asp Gly Thr Phe Gly Pro Met Met Lys Leu Ile Asp 20 25 30 Asp Leu Thr Val Ser Lys Gly Trp Thr Leu Gln Arg Thr Val Arg Tyr 35 40 45 Ala Ala Asn Leu Tyr Leu 50

【図面の簡単な説明】

【図１】Ａ．作成した抗ＰＶＬ抗体のＰＶＬとの反応性
をＥＬＩＳＡ法により示す。Ｂ．作成した抗ＰＶＬ抗体の反応性特異性をウエスタン
ブロット法により示す（電気泳動写真）。

【図２】ＰＶＬｃＤＮＡクローン、SKPVL231の塩基配列
決定の基本戦略（シークエンシング・ストラテジー）を
示す。

【図３】ＰＶＬｃＤＮＡクローンの塩基配列とアミノ酸
配列、及びＰＶＬ部分アミノ酸配列との対応を示す。

【図４】ＰＶＬアミノ酸配列における繰り返しを示す。

【図５】ＰＶＬ発現プラスミド(pPPVL231)の構造模式図
を示す。

【図６】大腸菌における組換え体ＰＶＬの発現例を示す
（電気泳動写真）。

【図７】ＰＶＬ発現プラスミド(pPICPVL231)の構造模式
図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＧ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記式（１）で示されるアミノ酸配列を
少なくとも含むレクチンのポリペプチド。【化１】 Asp Xaa Xaa Gly Phe Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn (Xaa) (Gly) (Xaa) Xaa Xaa Xaa (Xaa) Xaa Xaa Xaa Xaa (Xaa) Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xa a (Xaa) Xaa Xaa Gly Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg・・・・式（１）（上記式中、Xaaは任意のアミノ酸を示す。また括弧内
に示されるアミノ酸は、存在しなくてもよいことを示
す）
【請求項２】下記式（２）で示されるアミノ酸環状配
列の任意の位置から開始される一周分の配列を少なくと
も含むレクチンのポリペプチド。【化２】 Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Gly Phe Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn (Xaa) (Gly) (Xaa) Xaa Xaa Xaa (Xaa) Xaa Xaa Xaa Xaa (Xaa) Xaa Xaa Xaa Xa a Xaa Xaa Xaa (Xaa) Xaa Xaa Gly Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa (Xaa)・・・・式（２）（上記式の配列は、環状配列である。上記式中、Xaaは
任意のアミノ酸を示す。また括弧内に示されるアミノ酸
は、存在しなくてもよいことを示す）
【請求項３】下記式（３）で示されるアミノ酸配列を
少なくとも含む請求項１記載のレクチンのポリペプチ
ド。【化３】 Asp Xaa1 Xaa1 Gly Phe Gly Xaa Xaa Xaa Xaa1 Xaa Xaa Xaa Xaa Asn (Xaa) (Gl y) (Xaa) Xaa Xaa Xaa1 (Xaa) Xaa Xaa1 Xaa1 Xaa (Xaa) Xaa1 Xaa1 Xaa Xaa Xa a1 Xaa Xaa (Xaa) Xaa Xaa Gly Trp Xaa Xaa1 Xaa Xaa Xaa Xaa1 Arg Xaa Xaa1 Xaa1・・・・式（３）（上記式中、Xaaは任意のアミノ酸を、Xaa1は疎水性ア
ミノ酸をそれぞれ示す。また括弧内に示されるアミノ酸
は、存在していなくてもよいことを示す）
【請求項４】下記式（４）で示されるアミノ酸配列を
少なくとも含む請求項１〜３のいずれか１項に記載のレ
クチンのポリペプチド。【化４】 Xaa Xaa Xaa Asp Xaa1 Xaa1 Gly Phe Gly Xaa Xaa Xaa Xaa1 Xaa Xaa Xaa Xaa A sn (Xaa) (Gly) (Xaa) Xaa Xaa Xaa1 (Xaa) Xaa Xaa1 Xaa1 Xaa (Xaa) Xaa1 Xaa 1 Xaa Xaa Xaa1 Xaa Xaa (Xaa) Xaa Xaa Gly Trp Xaa Xaa1 Xaa Xaa Xaa Xaa1 A rg Xaa Xaa1 Xaa1 Xaa Xaa Xaa Xaa (Xaa)・・・・式（４）（上記式中、Xaaは任意のアミノ酸を、Xaa1は疎水性ア
ミノ酸をそれぞれ示す。また括弧内に示されるアミノ酸
は、存在しなくてもよいことを示す）
【請求項５】下記式（５）で示されるアミノ酸配列を
少なくとも含む請求項１〜４のいずれか１項に記載のレ
クチンのポリペプチド。【化５】 Asp X11 X11 Gly Phe Gly Xaa Xaa Xaa X12 Xaa Xaa Xaa Xaa Asn (Xaa) (Gly) (Xaa) Xaa Xaa X13 (Xaa) Xaa X14 X15 Xaa (Xaa) X16 X11 Xaa Xaa X13 Xaa Xa a (Xaa) Xaa Xaa Gly Trp Xaa X11 Xaa Xaa Xaa X17 Arg Xaa X18 X19・・・・式（５）（上記式中、Xaaは任意のアミノ酸を、X11はIle、Valま
たはLeuを、X12はIleまたはValを、X13はPheまたはLeu
を、X14はPro、AlaまたはValを、X15はPro、Ala、Valま
たはMetを、X16はAla、ValまたはLeuを、X17はPro、Va
l、LeuまたはIleを、X18はAla、Val、Leu、IleまたはMe
tを、X19はAla、ValまたはGlyをそれぞれ示す。また括
弧内に示されるアミノ酸は、存在しなくてもよいことを
示す）
【請求項６】下記式（６）で示されるアミノ酸配列を
少なくとも含む請求項５に記載のレクチンのポリペプチ
ド。【化６】 Xaa Xaa Xaa Asp X11 X11 Gly Phe Gly Xaa Xaa Xaa X12 Xaa Xaa Xaa Xaa Asn (Xaa) (Gly) (Xaa) Xaa Xaa X13 (Xaa) Xaa X14 X15 Xaa (Xaa) X16 X11 Xaa Xa a X13 Xaa Xaa (Xaa) Xaa Xaa Gly Trp Xaa X11 Xaa Xaa Xaa X17 Arg Xaa X18 X19 Xaa Xaa Xaa Xaa (Xaa)・・・・式（６）（上記式中、Xaaは任意のアミノ酸を、X11はIle、Valま
たはLeuを、X12はIleまたはValを、X13はPheまたはLeu
を、X14はPro、AlaまたはValを、X15はPro、Ala、Valま
たはMetを、X16はAla、ValまたはLeuを、X17はPro、Va
l、LeuまたはIleを、X18はAla、Val、Leu、IleまたはMe
tを、X19はAla、ValまたはGlyをそれぞれ示す。また括
弧内に示されるアミノ酸は、存在しなくてもよいことを
示す）
【請求項７】配列番号３〜９に示すアミノ酸配列から
選ばれる１または２以上のアミノ酸配列を含む請求項１
〜６のいずれか１項に記載のレクチンのポリペプチド。
【請求項８】配列番号３〜９に示すアミノ酸配列のそ
れぞれを１つづつ全て含む請求項７に記載のレクチンの
ポリペプチド。
【請求項９】配列番号２に示すアミノ酸配列の少なく
とも一部を有し、糖鎖に結合する活性を実質的に害さな
い１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を有
していてもよいレクチンのポリペプチド。
【請求項１０】配列番号２に示すアミノ酸配列の少な
くとも一部を有するレクチンのポリペプチド。
【請求項１１】請求項９または１０に記載のレクチン
のポリペプチドの一部分を含むポリペプチド。
【請求項１２】配列番号２において、アミノ酸番号１
８〜４０２で表されるアミノ酸配列を有する請求項１〜
１１のいずれか１項に記載のレクチンのポリペプチド。
【請求項１３】配列番号２において、アミノ酸番号１
〜４０２で表されるアミノ酸配列を有する請求項１〜１
１のいずれか１項に記載のレクチンのポリペプチド。
【請求項１４】ポリペプチド鎖中に、請求項１〜１３
のいずれか１項に記載のポリペプチドと、他のポリペプ
チドとを含む融合ポリペプチド。
【請求項１５】他のポリペプチドが、ビオチン化を受
けるペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
又はＴ７ファージのgene10産物である請求項１４記載の
融合ポリペプチド。
【請求項１６】上記請求項１〜１５のいずれか１項に
記載のポリペプチドに結合する抗体。
【請求項１７】下記の性質を有するレクチンをコード
するＤＮＡ。 (1)Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する糖鎖に結合
する。 (2)ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により推定される分子量が約４０キロダルトン
である。 (3)下記のアミノ酸組成を有する。【表１】残基モル％ Asx 14.9 Thr 5.5 Ser 3.2 Glx 4.2 Pro 3.2 Gly 14.9 Ala 8.0 Cys 1.0 Val 10.4 Met 1.5 Ile 5.2 Leu 7.0 Tyr 2.5 Phe 5.5 His 1.7 Lys 3.7 Trp 2.2 Arg 5.2 (4)ムジナタケ(Psathyrella velutina)の子実体に存在
する。
【請求項１８】請求項１〜８のいずれか１項に記載の
ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１９】請求項９に記載のポリペプチドの少な
くとも一部をコードするＤＮＡ。
【請求項２０】配列番号２に示すアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列の少なくとも一部を有する、レクチンの
ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項２１】請求項１１に記載のポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ。
【請求項２２】配列番号２において、アミノ酸番号１
８〜４０２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配
列を有するＤＮＡ。
【請求項２３】配列番号２において、アミノ酸番号１
〜４０２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列
を有するＤＮＡ。
【請求項２４】配列番号１において塩基番号９２〜１
２４６で表される塩基配列の少なくとも一部または全て
を有するＤＮＡ。
【請求項２５】配列番号１において塩基番号４１〜１
２４６で表される塩基配列の少なくとも一部または全て
を有するＤＮＡ。
【請求項２６】請求項１７〜２５のいずれか１項に記
載のＤＮＡに、他のポリペプチドをコードするＤＮＡを
結合させた組換えＤＮＡ。
【請求項２７】他のポリペプチドが、ビオチン化を受
けるペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
又はＴ７ファージのgene10産物である請求項２６記載の
組換えＤＮＡ。
【請求項２８】上記請求項１７〜２７のいずれか１項
に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項２９】発現ベクターである請求項２８記載の
組換えベクター。
【請求項３０】発現ベクターが、ビオチン化を受ける
ペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ又は
Ｔ７ファージのgene10産物をコードする塩基配列を含む
ことを特徴とする請求項２９記載の組換えベクター。
【請求項３１】請求項２８〜３０のいずれか１項に記
載の組換えベクターを宿主細胞に導入することにより得
られる形質転換細胞。
【請求項３２】宿主細胞が、大腸菌(Escherichia col
i)又は酵母である請求項３１記載の形質転換細胞。