JPH10114673A - 骨形成具 - Google Patents
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- JPH10114673A JPH10114673A JP9177440A JP17744097A JPH10114673A JP H10114673 A JPH10114673 A JP H10114673A JP 9177440 A JP9177440 A JP 9177440A JP 17744097 A JP17744097 A JP 17744097A JP H10114673 A JPH10114673 A JP H10114673A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 哺乳動物の体に移植したとき、移植部位にお
いて血管形成、無機質化、および骨の骨髄分化を含む軟
骨性骨形成の完全な発生のカスケードを誘導することが
できる、骨形成の蛋白質および骨形成具を提供するこ
と。 【解決手段】 活性な骨形成蛋白質を生産する方法であ
って、該骨形成蛋白質が、酸化状態で結合している一対
のポリペプチド鎖を含み、該一対のポリペプチド鎖は軟
骨性骨形成を誘導し得る構造のダイマー種を形成し、該
一対のポリペプチド鎖の少なくとも一方は、１１４また
はそれ以上のアミノ酸を有し、かつ、(i)以下のアミノ
酸配列： または(ii)該アミノ酸配列と少なくとも70％の配列相同
性を有するポリペプチドを含む、方法。
いて血管形成、無機質化、および骨の骨髄分化を含む軟
骨性骨形成の完全な発生のカスケードを誘導することが
できる、骨形成の蛋白質および骨形成具を提供するこ
と。 【解決手段】 活性な骨形成蛋白質を生産する方法であ
って、該骨形成蛋白質が、酸化状態で結合している一対
のポリペプチド鎖を含み、該一対のポリペプチド鎖は軟
骨性骨形成を誘導し得る構造のダイマー種を形成し、該
一対のポリペプチド鎖の少なくとも一方は、１１４また
はそれ以上のアミノ酸を有し、かつ、(i)以下のアミノ
酸配列： または(ii)該アミノ酸配列と少なくとも70％の配列相同
性を有するポリペプチドを含む、方法。
Description
【０００１】本出願は「骨形成具」という名称の米国特
許出願第422,699号（1989年10月17日出願）および「移
植のための骨コラーゲンマトリックス」という名称の米
国特許出願第483,913号（1990年２月22日出願）の一部
継続出願である。
許出願第422,699号（1989年10月17日出願）および「移
植のための骨コラーゲンマトリックス」という名称の米
国特許出願第483,913号（1990年２月22日出願）の一部
継続出願である。
【０００２】
【発明の属する技術分野】本発明は骨形成具、哺乳動物
において新しい骨の形成を誘導することができる蛋白質
をコードする遺伝子、および組み換えＤＮＡ技術を用い
た哺乳動物におけるこれらの蛋白質の生産のための方法
に関する。本発明はまた、同種移植あるいは異種の移植
に有用なマトリックス物質および新しい骨の形成を誘導
する骨形成蛋白質のキャリアーとして働くマトリックス
物質、および骨形成具を使用する骨および軟骨の修復方
法に関する。
において新しい骨の形成を誘導することができる蛋白質
をコードする遺伝子、および組み換えＤＮＡ技術を用い
た哺乳動物におけるこれらの蛋白質の生産のための方法
に関する。本発明はまた、同種移植あるいは異種の移植
に有用なマトリックス物質および新しい骨の形成を誘導
する骨形成蛋白質のキャリアーとして働くマトリックス
物質、および骨形成具を使用する骨および軟骨の修復方
法に関する。
【０００３】
【従来の技術】哺乳動物の骨組織はおそらく成長および
本来の骨の治療の間活性があり、軟骨性骨の形成を引き
起こす細胞の出来事の発生のカスケードを誘発しうる、
ひとつあるいは幾つかの蛋白様物質を含むことが知られ
ている。この活性因子は文献の中で骨形態形成あるいは
形態発生蛋白質、骨誘導蛋白質（bone inductive prote
in）、骨形成蛋白質、オステオジェニン、あるいは骨誘
導蛋白質（osteoinductive protein）とさまざまに呼ば
れている。
本来の骨の治療の間活性があり、軟骨性骨の形成を引き
起こす細胞の出来事の発生のカスケードを誘発しうる、
ひとつあるいは幾つかの蛋白様物質を含むことが知られ
ている。この活性因子は文献の中で骨形態形成あるいは
形態発生蛋白質、骨誘導蛋白質（bone inductive prote
in）、骨形成蛋白質、オステオジェニン、あるいは骨誘
導蛋白質（osteoinductive protein）とさまざまに呼ば
れている。
【０００４】骨分化の発生のカスケードは間葉細胞の漸
増、始原細胞の増殖、軟骨のカルシウム沈着、血管の侵
入、骨の形成、改造、および骨髄分化からなる（Reddi
(1981) Collagen Rel. Res. 1：209-226）。
増、始原細胞の増殖、軟骨のカルシウム沈着、血管の侵
入、骨の形成、改造、および骨髄分化からなる（Reddi
(1981) Collagen Rel. Res. 1：209-226）。
【０００５】これらの表現型形質転換の基礎となる詳細
な機構は明らかでないが、本来の骨マトリックスの軟骨
性骨への分化の活性が分離的に抽出され、そして不活性
な残存コラーゲン様マトリックスとともに再構成されて
十分な骨の誘導活性を回復させる（Sampath and Reddi
(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78：7599-760
3）。これはin vivoにおいて蛋白質抽出物の軟骨性骨を
誘導する活性を分析する実験方法を提供する。哺乳動物
の幾つかの種は種間の移植実験により証明されているよ
うな密接に関連した蛋白質を生産する（Sampath and Re
ddi (1981) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 80：6591-659
5）。
な機構は明らかでないが、本来の骨マトリックスの軟骨
性骨への分化の活性が分離的に抽出され、そして不活性
な残存コラーゲン様マトリックスとともに再構成されて
十分な骨の誘導活性を回復させる（Sampath and Reddi
(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78：7599-760
3）。これはin vivoにおいて蛋白質抽出物の軟骨性骨を
誘導する活性を分析する実験方法を提供する。哺乳動物
の幾つかの種は種間の移植実験により証明されているよ
うな密接に関連した蛋白質を生産する（Sampath and Re
ddi (1981) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 80：6591-659
5）。
【０００６】これらの蛋白質の潜在的な利用性は広く理
解されてきた。その蛋白質の有用性は整形法の薬、ある
種の形成外科、および歯根膜および脳顔面頭蓋の再生方
法に大変革をもたらすと予期されている。
解されてきた。その蛋白質の有用性は整形法の薬、ある
種の形成外科、および歯根膜および脳顔面頭蓋の再生方
法に大変革をもたらすと予期されている。
【０００７】これらの蛋白質画分の観察された特性は、
骨形成に必須な純粋の因子を単離し同定するために幾つ
かの研究室における精力的検索の努力を誘発してきた。
哺乳動物の骨からの骨形成蛋白質の精製技術の現在の状
況はサンパス(Sampath)ら（1987）Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 80により開示された。ウリスト(Urist)ら（198
4）Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 173：194-199は、塩化
カルシウム−尿素無機−有機溶液混合物により脱イオン
化された皮質性の骨から抽出され、そして塩酸グアニジ
ンでの分別沈澱および調製用ゲル電気泳動により回収さ
れたヒト骨形成蛋白質画分を開示している。著者はその
蛋白質画分が酸性ポリペプチドからなるアミノ酸組成お
よび17-18kDの範囲の分子量をもつことを報告してい
る。
骨形成に必須な純粋の因子を単離し同定するために幾つ
かの研究室における精力的検索の努力を誘発してきた。
哺乳動物の骨からの骨形成蛋白質の精製技術の現在の状
況はサンパス(Sampath)ら（1987）Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 80により開示された。ウリスト(Urist)ら（198
4）Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 173：194-199は、塩化
カルシウム−尿素無機−有機溶液混合物により脱イオン
化された皮質性の骨から抽出され、そして塩酸グアニジ
ンでの分別沈澱および調製用ゲル電気泳動により回収さ
れたヒト骨形成蛋白質画分を開示している。著者はその
蛋白質画分が酸性ポリペプチドからなるアミノ酸組成お
よび17-18kDの範囲の分子量をもつことを報告してい
る。
【０００８】ウリスト(Urist)ら（1984）Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 81:371-375は酸性ポリペプチドで約18kD
の分子量という特性をもつウシの骨形態形成蛋白質抽出
物を開示している。著者はその蛋白質がヒドロキシアパ
タイトクロマトグラフィーにより分離された画分に存在
し、マウス後部筋肉における骨の形成およびラットおよ
びイヌの頭蓋中の管錘欠損における骨の再生を誘導する
ことを報告した。骨からの抽出物を得るこれらの方法は
十分に限定されない不純な調製物を与える。
cad. Sci. USA 81:371-375は酸性ポリペプチドで約18kD
の分子量という特性をもつウシの骨形態形成蛋白質抽出
物を開示している。著者はその蛋白質がヒドロキシアパ
タイトクロマトグラフィーにより分離された画分に存在
し、マウス後部筋肉における骨の形成およびラットおよ
びイヌの頭蓋中の管錘欠損における骨の再生を誘導する
ことを報告した。骨からの抽出物を得るこれらの方法は
十分に限定されない不純な調製物を与える。
【０００９】ヨーロッパ特許出願第148,155号（1985年1
0月７日公開）はウシ、ブタおよびヒトの系統に由来す
る骨形成蛋白質を開示することを目的としている。発明
者によりP3蛋白質と命名された22-24kDの分子量の蛋白
質のうちの一つが本質的に均質な状態に精製された事が
示されている。この物質は哺乳動物に移植されたとき、
骨の形成を誘導すると報告されている。
0月７日公開）はウシ、ブタおよびヒトの系統に由来す
る骨形成蛋白質を開示することを目的としている。発明
者によりP3蛋白質と命名された22-24kDの分子量の蛋白
質のうちの一つが本質的に均質な状態に精製された事が
示されている。この物質は哺乳動物に移植されたとき、
骨の形成を誘導すると報告されている。
【００１０】ＰＣＴ出願第87/01537号（1988年１月14日
公開）（国際公開第WO88/00205）は骨の誘発の性質をも
つウシの骨からの不純な画分を開示している。その出願
人は組み換えＤＮＡ技術により生産された仮想上の「骨
誘発因子」もまた開示している。４つのＤＮＡ配列がヒ
トおよびウシのゲノミックあるいはｃＤＮＡライブラリ
ーから回収されそして組換え体宿主細胞内において発現
された。出願人は、発現された蛋白質が骨形態発生蛋白
質であろうと陳述しているが、骨の誘発は証明されてお
らず、組換え体蛋白質が骨形成蛋白質でないことを示唆
している。同じグループが引き続いて（Science, 242：
1528, Dec. 1988）４つの因子のうちの３つが軟骨の形
成を誘導し、そして骨の形成活性が「制御分子の混合物
による」ことおよび「骨の形成はこれらの分子との相互
関係により制御されている可能性が強い」と仮定すると
報告している。再び、骨の誘導はｃＤＮＡの発現の生産
物によるものでなくなった。骨形態発生剤という名称の
ウリスト(Urist)らのヨーロッパ特許出願第212,474号も
また参照せよ。
公開）（国際公開第WO88/00205）は骨の誘発の性質をも
つウシの骨からの不純な画分を開示している。その出願
人は組み換えＤＮＡ技術により生産された仮想上の「骨
誘発因子」もまた開示している。４つのＤＮＡ配列がヒ
トおよびウシのゲノミックあるいはｃＤＮＡライブラリ
ーから回収されそして組換え体宿主細胞内において発現
された。出願人は、発現された蛋白質が骨形態発生蛋白
質であろうと陳述しているが、骨の誘発は証明されてお
らず、組換え体蛋白質が骨形成蛋白質でないことを示唆
している。同じグループが引き続いて（Science, 242：
1528, Dec. 1988）４つの因子のうちの３つが軟骨の形
成を誘導し、そして骨の形成活性が「制御分子の混合物
による」ことおよび「骨の形成はこれらの分子との相互
関係により制御されている可能性が強い」と仮定すると
報告している。再び、骨の誘導はｃＤＮＡの発現の生産
物によるものでなくなった。骨形態発生剤という名称の
ウリスト(Urist)らのヨーロッパ特許出願第212,474号も
また参照せよ。
【００１１】ワング(Wang)ら（1988）Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 85：9484-9488は軟骨および骨の形成活性
をもつ脱イオン化された骨のグアニジン抽出物からウシ
の骨形態形成蛋白質を、ゲル抽出により決定された30kD
の分子量に等しい塩基性蛋白質として精製したことを開
示している。その蛋白質の精製は分離されると不活性な
30，18，および16kDの蛋白質を生じた。この結果から見
て、著者は活性のある物質の厳密な同定はまだ決定され
ていない事を認めている。
d. Sci. USA 85：9484-9488は軟骨および骨の形成活性
をもつ脱イオン化された骨のグアニジン抽出物からウシ
の骨形態形成蛋白質を、ゲル抽出により決定された30kD
の分子量に等しい塩基性蛋白質として精製したことを開
示している。その蛋白質の精製は分離されると不活性な
30，18，および16kDの蛋白質を生じた。この結果から見
て、著者は活性のある物質の厳密な同定はまだ決定され
ていない事を認めている。
【００１２】ワング(Wang)ら（1990）Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 87：2220-2227はＰＣＴ出願第87/01537号
に記述されているｃＤＮＡ配列のうちの一つの発現およ
び部分精製を記述している。これらの蛋白質を用いる場
合の確実な軟骨および／または骨の形成は最小限600ng
の50％純粋な材料を必要とする。
d. Sci. USA 87：2220-2227はＰＣＴ出願第87/01537号
に記述されているｃＤＮＡ配列のうちの一つの発現およ
び部分精製を記述している。これらの蛋白質を用いる場
合の確実な軟骨および／または骨の形成は最小限600ng
の50％純粋な材料を必要とする。
【００１３】ＰＣＴ出願第89/04458号（1990年４月19日
公関）（国際公開第WO90/003733号）はP30F 31-34と呼
ばれる骨形成因子ファミリーの精製および分析を記述し
ている。その蛋白質ファミリーはペプチド断片の配列に
より特徴づけられた少なくとも４つの蛋白質を含む。不
純な混合物P3 OF 31-34の骨形成活性も分析された。し
かしながら個別の蛋白質の活性は評価も議論もされなか
った。
公関）（国際公開第WO90/003733号）はP30F 31-34と呼
ばれる骨形成因子ファミリーの精製および分析を記述し
ている。その蛋白質ファミリーはペプチド断片の配列に
より特徴づけられた少なくとも４つの蛋白質を含む。不
純な混合物P3 OF 31-34の骨形成活性も分析された。し
かしながら個別の蛋白質の活性は評価も議論もされなか
った。
【００１４】骨形成の因子の移植の成功には使用される
in vivoの領域において蛋白質を維持することができる
有用なキャリアー材料と蛋白質との結合を必要とする。
キャリアーは生物的に適合性があり、生物的に分解され
そして細胞浸潤に十分な多孔性であることが望まれる。
粉末化された骨のグアニジン抽出および脱脂後に残る不
溶性のコラーゲン粒子は幾つかの種の異質遺伝子型の移
植において通常は効果的であった。しかしながら、骨誘
導蛋白質(osteoinductive protein)は種を通じて有効で
あるが、通常軟骨性骨形成を誘導するのに使用されるコ
ラーゲン様骨マトリックスは種特異的であることが研究
により示された（Sampath and Reddi (1983) Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 80：6591-6594）。in vivoにおいて
移植された脱イオン化され、脱脂され、抽出された外因
牲の骨マトリックスキャリアーは、おそらく骨マトリッ
クス中における阻害性あるいは免疫原性成分のために骨
形成を誘導することができない。多くの種においては、
骨形成用具において同種の骨マトリックスを使用しても
骨誘導の骨形成(osteoinductive bone formation)には
不十分であろう。例えば、脱イオン化され、脱脂された
サルの骨のマトリックスの皮下へ同種の移植物はサルに
おいて骨の形成を誘導しないと報告されている。（Aspe
rberg et al. (1988) J. Bone Joint Surg. (Br) 70-
B：625-627）。
in vivoの領域において蛋白質を維持することができる
有用なキャリアー材料と蛋白質との結合を必要とする。
キャリアーは生物的に適合性があり、生物的に分解され
そして細胞浸潤に十分な多孔性であることが望まれる。
粉末化された骨のグアニジン抽出および脱脂後に残る不
溶性のコラーゲン粒子は幾つかの種の異質遺伝子型の移
植において通常は効果的であった。しかしながら、骨誘
導蛋白質(osteoinductive protein)は種を通じて有効で
あるが、通常軟骨性骨形成を誘導するのに使用されるコ
ラーゲン様骨マトリックスは種特異的であることが研究
により示された（Sampath and Reddi (1983) Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 80：6591-6594）。in vivoにおいて
移植された脱イオン化され、脱脂され、抽出された外因
牲の骨マトリックスキャリアーは、おそらく骨マトリッ
クス中における阻害性あるいは免疫原性成分のために骨
形成を誘導することができない。多くの種においては、
骨形成用具において同種の骨マトリックスを使用しても
骨誘導の骨形成(osteoinductive bone formation)には
不十分であろう。例えば、脱イオン化され、脱脂された
サルの骨のマトリックスの皮下へ同種の移植物はサルに
おいて骨の形成を誘導しないと報告されている。（Aspe
rberg et al. (1988) J. Bone Joint Surg. (Br) 70-
B：625-627）。
【００１５】米国特許出願第4,563,350号（1986年１月
７日発行）は、トリプシン処理されたウシの骨のマトリ
ックスが、抽出され、部分精製された骨−誘導蛋白質の
調製物を用いた移植のときに骨形成活性に影響する異種
のマトリックスとして使用されることを開示している。
骨の形成は少なくとも５％、好ましくは少なくとも10％
の非繊維状コラーゲンの存在を必要とすることが示され
ている。著者らは、コラーゲンの調製物の免疫原性に一
部関係するテロペプチドの除去が異種性の移植におい
て、より有効であると主張している。
７日発行）は、トリプシン処理されたウシの骨のマトリ
ックスが、抽出され、部分精製された骨−誘導蛋白質の
調製物を用いた移植のときに骨形成活性に影響する異種
のマトリックスとして使用されることを開示している。
骨の形成は少なくとも５％、好ましくは少なくとも10％
の非繊維状コラーゲンの存在を必要とすることが示され
ている。著者らは、コラーゲンの調製物の免疫原性に一
部関係するテロペプチドの除去が異種性の移植におい
て、より有効であると主張している。
【００１６】ヨーロッパ特許出願第309,241号（1989年
３月29日公開）は、骨形成蛋白質調製物、および無機成
分あるいは骨コラーゲン粉末60−98％からなるマトリッ
クスキャリアーおよび２−40％のアテロペプチド低免疫
原性コラーゲンからなる軟骨性骨の形成の誘導具を開示
している。
３月29日公開）は、骨形成蛋白質調製物、および無機成
分あるいは骨コラーゲン粉末60−98％からなるマトリッ
クスキャリアーおよび２−40％のアテロペプチド低免疫
原性コラーゲンからなる軟骨性骨の形成の誘導具を開示
している。
【００１７】デセラージ(Detherage)ら（1987）Collage
n Rel. Res. 7：2225-2231は、一回のイオン交換カラム
により最小限に精製されたウシの骨のマトリックス抽出
物および再構成され、高度に精製されたヒトType-I胎盤
コラーゲンからなる明白な外因性移植具を開示すると主
張している。
n Rel. Res. 7：2225-2231は、一回のイオン交換カラム
により最小限に精製されたウシの骨のマトリックス抽出
物および再構成され、高度に精製されたヒトType-I胎盤
コラーゲンからなる明白な外因性移植具を開示すると主
張している。
【００１８】米国特許出願第3,394,370号（1983年７月1
9日発行）は、異種性の移植において有用であると紹介
されている再構成されたコラーゲンのマトリックスを記
述している。コラーゲン繊維は免疫原性をもつ可能性が
あるテロペプチド（繊維内部の交差結合の主な原因でも
ある）を除去するために酵素により処理されそして付随
している非コラーゲン組成物を除去するために溶解され
た。再構成されたコラーゲンを酢酸中で分散させること
により基本コラーゲン分子の無秩序なマトリックスを形
成し、これを次に骨形成因子と混合し、そして凍結乾燥
して、好ましくは交差結合している「半硬性のフォーム
あるいはスポンジ」を形成することによりマトリックス
を組み立てた。組み立てられたマトリックスはin vivo
において試験されない。
9日発行）は、異種性の移植において有用であると紹介
されている再構成されたコラーゲンのマトリックスを記
述している。コラーゲン繊維は免疫原性をもつ可能性が
あるテロペプチド（繊維内部の交差結合の主な原因でも
ある）を除去するために酵素により処理されそして付随
している非コラーゲン組成物を除去するために溶解され
た。再構成されたコラーゲンを酢酸中で分散させること
により基本コラーゲン分子の無秩序なマトリックスを形
成し、これを次に骨形成因子と混合し、そして凍結乾燥
して、好ましくは交差結合している「半硬性のフォーム
あるいはスポンジ」を形成することによりマトリックス
を組み立てた。組み立てられたマトリックスはin vivo
において試験されない。
【００１９】米国特許出願第4,172,128号（1979年10月2
3日発行）は、骨様材料を分解しそして低い免疫原性を
もつように再生する方法を記述し、その方法が種を越え
て有用であるとしている。脱イオン化された骨の粒子は
付随している全てのムコ多糖(グリコサミノグリカン)を
溶解するために膨張剤で処理され、そして引き続いてコ
ラーゲン繊維を均質なコロイド溶液を形成するために溶
解される。次に、生理学的に活性のないムコ多糖および
繊維形成の促進のための電解質を使用して再構成された
繊維のゲルを形成することができる。
3日発行）は、骨様材料を分解しそして低い免疫原性を
もつように再生する方法を記述し、その方法が種を越え
て有用であるとしている。脱イオン化された骨の粒子は
付随している全てのムコ多糖(グリコサミノグリカン)を
溶解するために膨張剤で処理され、そして引き続いてコ
ラーゲン繊維を均質なコロイド溶液を形成するために溶
解される。次に、生理学的に活性のないムコ多糖および
繊維形成の促進のための電解質を使用して再構成された
繊維のゲルを形成することができる。
【００２０】本発明の目的は、組換え体ＤＮＡから生産
され、そして同種および異種性の移植において骨を誘導
することができる、分散された骨形成蛋白質を含むマト
リックスからなる骨形成具を提供することである。もう
一つの目的は、哺乳動物細胞から発現され、そして軟骨
性骨の形成を誘導することができる、組換え体骨形成蛋
白質を提供することである。さらにもう一つの目的は、
骨形成蛋白質をコードする遺伝子および組み換えＤＮＡ
技術を使用したそれらの生産方法を提供することであ
る。なおさらにもう一つの目的は、骨誘導蛋白質(osteo
inductive protein)と組み合わせて、軟骨性骨の形成を
することができる、生物的に適合性があり、in vivoに
おいて生物的に分解されうるマトリックスを提供するこ
とである。
され、そして同種および異種性の移植において骨を誘導
することができる、分散された骨形成蛋白質を含むマト
リックスからなる骨形成具を提供することである。もう
一つの目的は、哺乳動物細胞から発現され、そして軟骨
性骨の形成を誘導することができる、組換え体骨形成蛋
白質を提供することである。さらにもう一つの目的は、
骨形成蛋白質をコードする遺伝子および組み換えＤＮＡ
技術を使用したそれらの生産方法を提供することであ
る。なおさらにもう一つの目的は、骨誘導蛋白質(osteo
inductive protein)と組み合わせて、軟骨性骨の形成を
することができる、生物的に適合性があり、in vivoに
おいて生物的に分解されうるマトリックスを提供するこ
とである。
【００２１】本発明の、これらのおよび他の目的および
特徴は以下の説明、図面、および請求の範囲から明らか
にされる。
特徴は以下の説明、図面、および請求の範囲から明らか
にされる。
【００２２】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、哺乳動物の
体に移植したとき、移植部位において血管形成、無機質
化、および骨の骨髄分化を含む軟骨性骨形成の完全な発
生のカスケードを誘導することができる、骨形成の蛋白
質および骨形成具を提供する。この骨形成具は、ここで
はマトリックスと呼ばれ、以下に開示された特徴をも
ち、そして組み換えＤＮＡ技術を使用して生産されそし
て真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞から発現され
た骨形成蛋白質を分散して含んだキャリアー材料からな
る。
体に移植したとき、移植部位において血管形成、無機質
化、および骨の骨髄分化を含む軟骨性骨形成の完全な発
生のカスケードを誘導することができる、骨形成の蛋白
質および骨形成具を提供する。この骨形成具は、ここで
はマトリックスと呼ばれ、以下に開示された特徴をも
ち、そして組み換えＤＮＡ技術を使用して生産されそし
て真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞から発現され
た骨形成蛋白質を分散して含んだキャリアー材料からな
る。
【００２３】
【課題を解決するための手段】ここに開示されたマトリ
ックス中に分散した組換え体蛋白質の好ましい態様は、
天然の材料から抽出されそして同種の脱イオン化された
骨粉のマトリックス材料中で再構成された天然の形の蛋
白質の生理学的な活性と密接に類似している。好ましい
蛋白質は、従来報告された生合成されたどのような材料
よりもはるかに高い比活性を有し、すなわち活性分析法
の精度の限度内において米国特許出願第179,406号（198
8年４月８日発行）（PCT US/89 01453）において述べら
れたようにして生産された実質的に純粋な材料と本質的
に同一と認められる活性をもつ。したがって、本出願は
天然の骨の治療において起こるのと本質的に同様な軟骨
性骨の完全な発生のカスケードを誘導する骨形成具の製
造方法および使用方法を開示する。
ックス中に分散した組換え体蛋白質の好ましい態様は、
天然の材料から抽出されそして同種の脱イオン化された
骨粉のマトリックス材料中で再構成された天然の形の蛋
白質の生理学的な活性と密接に類似している。好ましい
蛋白質は、従来報告された生合成されたどのような材料
よりもはるかに高い比活性を有し、すなわち活性分析法
の精度の限度内において米国特許出願第179,406号（198
8年４月８日発行）（PCT US/89 01453）において述べら
れたようにして生産された実質的に純粋な材料と本質的
に同一と認められる活性をもつ。したがって、本出願は
天然の骨の治療において起こるのと本質的に同様な軟骨
性骨の完全な発生のカスケードを誘導する骨形成具の製
造方法および使用方法を開示する。
【００２４】これらの開発の鍵は、アミノ酸配列の推定
および天然の骨形成蛋白質の構造データである。一つの
プロトコルを作成し、それにしたがって、骨形成活性の
半最大活性値が移植片１mgあたり約0.8から1.0ngの哺乳
動物の骨からの実質的に純粋な骨形成蛋白質を回収し
た。その材料を入手できたことにより、本発明者らは骨
形成を達成するために必要な蛋白質の詳細な全構造を推
定することができた。蛋白質のアミノ酸配列および他の
構造的な特徴の知識により天然の遺伝子を同定およびク
ローニングすることができた。
および天然の骨形成蛋白質の構造データである。一つの
プロトコルを作成し、それにしたがって、骨形成活性の
半最大活性値が移植片１mgあたり約0.8から1.0ngの哺乳
動物の骨からの実質的に純粋な骨形成蛋白質を回収し
た。その材料を入手できたことにより、本発明者らは骨
形成を達成するために必要な蛋白質の詳細な全構造を推
定することができた。蛋白質のアミノ酸配列および他の
構造的な特徴の知識により天然の遺伝子を同定およびク
ローニングすることができた。
【００２５】部分的な配列データおよび引例において開
示された制御蛋白質との間の観察された相同性に基づい
たコンセンサスＤＮＡ配列をゲノミックおよびｃＤＮＡ
ライブラリーから骨形成蛋白質をコードする遺伝子を抽
出するためのプローブとして使用した。コンセンサス配
列のプローブの内の一つが、これまでに未同定のＤＮＡ
配列を単離した；その一部分を連結したときコードする
タンパク質は、正確に修飾され、適切なマトリックスに
取り込まれそしてここに開示されたように移植されると
きに、軟骨性骨の形成を誘導することができる領域を有
していた。ここでＯＰ１と呼ばれている蛋白質並びにさ
まざまに欠失させた型および融合物を完全長のｃＤＮＡ
配列およびさまざまに欠失させた合成ＤＮＡから大腸菌
およびさまざまな哺乳動物において発現させ、そしてホ
モダイマーとしてあるいはＢＭＰ２、すなわちコンセン
サス配列のプローブによるヒトＤＮＡライブラリーから
抽出された他の骨形成蛋白質とのヘテロダイマーとして
骨形成活性を示すことを見い出した。
示された制御蛋白質との間の観察された相同性に基づい
たコンセンサスＤＮＡ配列をゲノミックおよびｃＤＮＡ
ライブラリーから骨形成蛋白質をコードする遺伝子を抽
出するためのプローブとして使用した。コンセンサス配
列のプローブの内の一つが、これまでに未同定のＤＮＡ
配列を単離した；その一部分を連結したときコードする
タンパク質は、正確に修飾され、適切なマトリックスに
取り込まれそしてここに開示されたように移植されると
きに、軟骨性骨の形成を誘導することができる領域を有
していた。ここでＯＰ１と呼ばれている蛋白質並びにさ
まざまに欠失させた型および融合物を完全長のｃＤＮＡ
配列およびさまざまに欠失させた合成ＤＮＡから大腸菌
およびさまざまな哺乳動物において発現させ、そしてホ
モダイマーとしてあるいはＢＭＰ２、すなわちコンセン
サス配列のプローブによるヒトＤＮＡライブラリーから
抽出された他の骨形成蛋白質とのヘテロダイマーとして
骨形成活性を示すことを見い出した。
【００２６】ＯＰ１遺伝子の特徴決定および活性に必要
なＤＮＡおよびアミノ酸配列の同定により哺乳動物細胞
においてその遺伝子を発現させることができた。哺乳動
物の蛋白質の哺乳動物細胞における発現、特に治療のた
めの使用を意図とした組換え体蛋白質の発現は通常天然
の材料構造によく似た構造をもった蛋白質を生じると考
えられている。このことは、原核細胞生物系において行
われることがないグリコシル化のような特定の後翻訳修
飾を必要とする分泌蛋白質においては特に真実である。
大腸菌内におけるＯＰ１遺伝子の発現により、グリコシ
ル化されていない型の蛋白質は骨形成活性をもつことが
示されたが、例えば、蛋白質の安定性、溶解性、あるい
は免疫原性に関連したまだ決定されていないオリゴサッ
カロイドの機能のような他のものがあるかも知れない。
さらに、培養液中に分泌された蛋白質の精製は、原核生
物細胞の封入体(inclusion bodies)から誘導された蛋白
質を抽出する方法に代替する方法を提供する。
なＤＮＡおよびアミノ酸配列の同定により哺乳動物細胞
においてその遺伝子を発現させることができた。哺乳動
物の蛋白質の哺乳動物細胞における発現、特に治療のた
めの使用を意図とした組換え体蛋白質の発現は通常天然
の材料構造によく似た構造をもった蛋白質を生じると考
えられている。このことは、原核細胞生物系において行
われることがないグリコシル化のような特定の後翻訳修
飾を必要とする分泌蛋白質においては特に真実である。
大腸菌内におけるＯＰ１遺伝子の発現により、グリコシ
ル化されていない型の蛋白質は骨形成活性をもつことが
示されたが、例えば、蛋白質の安定性、溶解性、あるい
は免疫原性に関連したまだ決定されていないオリゴサッ
カロイドの機能のような他のものがあるかも知れない。
さらに、培養液中に分泌された蛋白質の精製は、原核生
物細胞の封入体(inclusion bodies)から誘導された蛋白
質を抽出する方法に代替する方法を提供する。
【００２７】遺伝子の哺乳動物細胞における発現は、成
熟蛋白質のＮ末端の決定もまた可能にした。ＯＰ１の成
熟型であると信じられるもののアミノ酸配列は次のとお
りである（Seq. ID No.１）：
熟蛋白質のＮ末端の決定もまた可能にした。ＯＰ１の成
熟型であると信じられるもののアミノ酸配列は次のとお
りである（Seq. ID No.１）：
【００２８】組み替えにより生産されたＯＰ１は蛋白質
のＮ末端を欠失させた幾つかの型においても活性をもっ
ている。欠失させたＯＰ１の内の主要な一種は次のもの
である（Seq. ID No.２）：
のＮ末端を欠失させた幾つかの型においても活性をもっ
ている。欠失させたＯＰ１の内の主要な一種は次のもの
である（Seq. ID No.２）：
【００２９】４つの他の活性のある短いＯＰ１配列は：
【００３０】
【００３１】
【００３２】
【００３３】これらの６種のＯＰ１のin vivoにおける
骨形成活性を調べそしてすべてが可溶性マトリックスと
一緒に哺乳動物において移植したときに薬剤量に依存し
た様式で軟骨性骨形成を誘導することが示された。これ
らの種の比活性は実質的に純粋な、天然物を源とする骨
形成蛋白質の比活性に近い。さらに、これらの蛋白質は
従来報告された他の骨形成蛋白質調製物よりも天然物を
源とする材料の活性とより密接に似ている。
骨形成活性を調べそしてすべてが可溶性マトリックスと
一緒に哺乳動物において移植したときに薬剤量に依存し
た様式で軟骨性骨形成を誘導することが示された。これ
らの種の比活性は実質的に純粋な、天然物を源とする骨
形成蛋白質の比活性に近い。さらに、これらの蛋白質は
従来報告された他の骨形成蛋白質調製物よりも天然物を
源とする材料の活性とより密接に似ている。
【００３４】組換え体により生産されたＯＰ１は哺乳動
物内においてグリコシル化されたホモダイマーとして発
現される。ＯＰ１−１８のホモダイマーはSDS-PAGEによ
り決定すると、酸化された時には約36kD、還元された時
には約18kDの見かけ分子量である。OP1-16S，OP1-16V，
OP1-16M，OP1-16AおよびOP1-16LはSDS-PAGEにより決定
すると還元された時には約16kDであり、そしてこれらの
蛋白質のホモダイマー並びにOP1-18とのヘテロダイマー
は酸化された時に約30-36kDの範囲内の見かけ分子量で
ある。還元された状態においては、これらの蛋白質は検
出できるような骨の形成活性を示さない。
物内においてグリコシル化されたホモダイマーとして発
現される。ＯＰ１−１８のホモダイマーはSDS-PAGEによ
り決定すると、酸化された時には約36kD、還元された時
には約18kDの見かけ分子量である。OP1-16S，OP1-16V，
OP1-16M，OP1-16AおよびOP1-16LはSDS-PAGEにより決定
すると還元された時には約16kDであり、そしてこれらの
蛋白質のホモダイマー並びにOP1-18とのヘテロダイマー
は酸化された時に約30-36kDの範囲内の見かけ分子量で
ある。還元された状態においては、これらの蛋白質は検
出できるような骨の形成活性を示さない。
【００３５】ＯＰ１は今日迄に多くのさまざまな哺乳動
物において発現され、それらすべての細胞は翻訳後に蛋
白質をグリコシル化しそしてプロセスする。オリゴサッ
カロイドの側鎖の詳細な構造はセルラインの種類により
異なるであろうが、すべての場合において発現された配
列は特異的なそして薬剤依存性の様式において骨形成の
活性をもつ。
物において発現され、それらすべての細胞は翻訳後に蛋
白質をグリコシル化しそしてプロセスする。オリゴサッ
カロイドの側鎖の詳細な構造はセルラインの種類により
異なるであろうが、すべての場合において発現された配
列は特異的なそして薬剤依存性の様式において骨形成の
活性をもつ。
【００３６】本発明はそれらの特異的な構成物に限定さ
れない。したがって、本発明の骨形成蛋白質は宿主の真
核生物細胞において組換え体ＤＮＡの発現により生産さ
れたさまざまなグリコシル化のパターン、Ｎ末端の変
化、アミノ酸相同性領域をもった関連する蛋白質のファ
ミリー、および天然のアミノ酸配列を欠失させたり変異
を起こさせたものを含む。本発明の骨形成具において有
用な活性配列は、OP1-16Vとの間に少なくとも70％、好
ましくは少なくとも80％、の配列相同性をもった骨形成
蛋白質を含む。これは長い型の蛋白質や対立遺伝子の変
異物および変異蛋白質をも含む。
れない。したがって、本発明の骨形成蛋白質は宿主の真
核生物細胞において組換え体ＤＮＡの発現により生産さ
れたさまざまなグリコシル化のパターン、Ｎ末端の変
化、アミノ酸相同性領域をもった関連する蛋白質のファ
ミリー、および天然のアミノ酸配列を欠失させたり変異
を起こさせたものを含む。本発明の骨形成具において有
用な活性配列は、OP1-16Vとの間に少なくとも70％、好
ましくは少なくとも80％、の配列相同性をもった骨形成
蛋白質を含む。これは長い型の蛋白質や対立遺伝子の変
異物および変異蛋白質をも含む。
【００３７】したがって、本開示からみて、遺伝子工学
の当業者は適切なアミノ酸をコードするｃＤＮＡあるい
はゲノミックライブラリーから遺伝子を単離、あるいは
オリゴヌクレオチドからＤＮＡをつくることができる。
そして骨の形成を誘導することができる活性型蛋白質を
大量に生産するために、さまざまなタイプの宿主真核生
物細胞においてそれらを発現することができる。
の当業者は適切なアミノ酸をコードするｃＤＮＡあるい
はゲノミックライブラリーから遺伝子を単離、あるいは
オリゴヌクレオチドからＤＮＡをつくることができる。
そして骨の形成を誘導することができる活性型蛋白質を
大量に生産するために、さまざまなタイプの宿主真核生
物細胞においてそれらを発現することができる。
【００３８】骨形成蛋白質は適切な送達剤あるいは支持
系（マトリックス）とともに、臨床の応用において有用
である。マトリックスは、生物的に適応でき、蛋白質を
抽出され、無機塩類を含まず、脱脂された不溶性のType
-I骨コラーゲン粒子からなり、これは宿主にとって同種
あるいは異種であり得る。粒子は好ましくは、粒子の形
態を変えるために、すなわち粒子内部の多孔性および粒
子の表面の領域を増加させるために、お湯あるいは他の
繊維修飾溶剤のような繊維修飾剤で処理される。粒子は
共にマトリックスを形成させるために詰め込まれる。粒
子間の空間は先祖細胞の移動そして引き続く細胞の分化
および増殖のための範囲でなければならない。粒子の大
きさは70−850μm、好ましくは150μm−420μmの範囲内
がよい。マトリックスは骨の欠損にまたがる形に粒子を
ぴったりと詰め込むことにより、あるいは粒子を望まれ
る形に他の方法で詰め込んでかたちづくることにより作
り上げる。マトリックスはin vivoにおいて生物的に適
応し（炎症性のない）、そして生物的に分解され得る、
そして「一時的骨格」および移動性の先祖細胞を呼び集
める土台として、およびそれらの引き続く固着および増
殖のための基礎として用いられる。ここに開示されたよ
うに、マトリックスは哺乳動物体内において確実にそし
て再現性よく軟骨性骨の形成を誘導する骨形成蛋白質と
組み合わせることができる。
系（マトリックス）とともに、臨床の応用において有用
である。マトリックスは、生物的に適応でき、蛋白質を
抽出され、無機塩類を含まず、脱脂された不溶性のType
-I骨コラーゲン粒子からなり、これは宿主にとって同種
あるいは異種であり得る。粒子は好ましくは、粒子の形
態を変えるために、すなわち粒子内部の多孔性および粒
子の表面の領域を増加させるために、お湯あるいは他の
繊維修飾溶剤のような繊維修飾剤で処理される。粒子は
共にマトリックスを形成させるために詰め込まれる。粒
子間の空間は先祖細胞の移動そして引き続く細胞の分化
および増殖のための範囲でなければならない。粒子の大
きさは70−850μm、好ましくは150μm−420μmの範囲内
がよい。マトリックスは骨の欠損にまたがる形に粒子を
ぴったりと詰め込むことにより、あるいは粒子を望まれ
る形に他の方法で詰め込んでかたちづくることにより作
り上げる。マトリックスはin vivoにおいて生物的に適
応し（炎症性のない）、そして生物的に分解され得る、
そして「一時的骨格」および移動性の先祖細胞を呼び集
める土台として、およびそれらの引き続く固着および増
殖のための基礎として用いられる。ここに開示されたよ
うに、マトリックスは哺乳動物体内において確実にそし
て再現性よく軟骨性骨の形成を誘導する骨形成蛋白質と
組み合わせることができる。
【００３９】このマトリックスの材料の開発は異種性の
骨のマトリックスおよび骨形成蛋白質の移植の成功のた
めに必要な鍵となる特徴の発見の結果として開発され
た。実質的に純粋な骨形成蛋白質および同種の脱イオン
化され、脱脂された蛋白質−抽出骨マトリックスからな
る骨形成具は、移動する先祖細胞の流入、増殖および分
化のための寸法の間隙をもつ必要があるということを研
究が示唆した。異種性の骨マトリックスからなる骨形成
具がin vivoにおいてほとんどあるいは全く軟骨性骨形
成を誘導しないということもまた観察された。異種性の
マトリックスによる骨の形成がないことは、一般的にマ
トリックス中にまだ存在している成分（例えば、コラー
ゲンテロペプチドあるいは付随する非コラーゲン性糖蛋
白質）に対する免疫原性あるいは阻害的な応答によると
考えられてきた。
骨のマトリックスおよび骨形成蛋白質の移植の成功のた
めに必要な鍵となる特徴の発見の結果として開発され
た。実質的に純粋な骨形成蛋白質および同種の脱イオン
化され、脱脂された蛋白質−抽出骨マトリックスからな
る骨形成具は、移動する先祖細胞の流入、増殖および分
化のための寸法の間隙をもつ必要があるということを研
究が示唆した。異種性の骨マトリックスからなる骨形成
具がin vivoにおいてほとんどあるいは全く軟骨性骨形
成を誘導しないということもまた観察された。異種性の
マトリックスによる骨の形成がないことは、一般的にマ
トリックス中にまだ存在している成分（例えば、コラー
ゲンテロペプチドあるいは付随する非コラーゲン性糖蛋
白質）に対する免疫原性あるいは阻害的な応答によると
考えられてきた。
【００４０】粒子の総合的比表面積（表面領域／単位物
質量）、多孔性および微小なくぼみの程度、およびマト
リックス粒子のくぼみおよび穴の大きさが異種性移植、
および特定の種においては同種移植にさえも重要である
ことが今日発見されている。
質量）、多孔性および微小なくぼみの程度、およびマト
リックス粒子のくぼみおよび穴の大きさが異種性移植、
および特定の種においては同種移植にさえも重要である
ことが今日発見されている。
【００４１】図１のパネルＡおよびＢはそれぞれラット
および子ウシからの脱イオン化され、グアニジン抽出さ
れた骨マトリックスの粒子構造を示す走査電子顕微鏡写
真である。これらの写真から観察され得るように、子ウ
シの骨マトリックスにおいてよりもラットの骨マトリッ
クスにおいて顕著なより大きい生来の多孔性、あるいは
表面積がある。骨マトリックスの多孔性および粒子内部
の表面の領域を増加させることは、ラットのコラーゲン
性骨マトリックスの移植により明らかにされたように、
骨形成の誘導を促進することができる。このことは、そ
の形態を変えるために一定の溶剤又は加熱によりコラー
ゲン性骨マトリックスを処理することにより達成され
る。この目的に適する薬剤はここで開示されそしてコラ
ーゲン繊維−修飾剤と呼ばれる。
および子ウシからの脱イオン化され、グアニジン抽出さ
れた骨マトリックスの粒子構造を示す走査電子顕微鏡写
真である。これらの写真から観察され得るように、子ウ
シの骨マトリックスにおいてよりもラットの骨マトリッ
クスにおいて顕著なより大きい生来の多孔性、あるいは
表面積がある。骨マトリックスの多孔性および粒子内部
の表面の領域を増加させることは、ラットのコラーゲン
性骨マトリックスの移植により明らかにされたように、
骨形成の誘導を促進することができる。このことは、そ
の形態を変えるために一定の溶剤又は加熱によりコラー
ゲン性骨マトリックスを処理することにより達成され
る。この目的に適する薬剤はここで開示されそしてコラ
ーゲン繊維−修飾剤と呼ばれる。
【００４２】したがって、本発明の一つの局面は表面積
およびマトリックスのコラーゲン粒子の多孔性を実質的
に増加させるために処理されたマトリックスからなる骨
形成具を含む。
およびマトリックスのコラーゲン粒子の多孔性を実質的
に増加させるために処理されたマトリックスからなる骨
形成具を含む。
【００４３】本発明の骨形成具において有用な、現時点
で好ましい繊維−修飾剤は熱せられた水性溶媒で、最も
好ましくは水である。脱イオン化され脱脂されグアニジ
ン抽出された骨のコラーゲンを水中で高温にて（37°−
65°、好ましくは45°−60℃）約１時間熱することは、
望まれた表面の形態を得るのに通常は十分である。機構
は明らかでないが、熱処理はコラーゲン繊維を変化さ
せ、その結果粒子の表面積を増加させると仮定される。
したがって、骨のマトリックスは水中（１g/30ml）で撹
拌しながらさまざまに高めた温度で処理し、そして濾過
することができる。水中で温度を上昇させることにより
不溶性のコラーゲンを処理することにより、らせん構造
から非らせん構造への完全な遷移の1/4から3/4に達する
のに必要な温度である溶解遷移（Tm）に最初に到達す
る。その後繊維は収縮温度（Ts）と呼ばれるいくらか高
い温度において突然に何分の一かに収縮する。Tsは通常
より高く、分子の詰め込みにより更に安定性が高まるこ
とを反映する。約５以下のpHにおいては、熱せられたコ
ラーゲンのTmおよびTsの両値は減少する。
で好ましい繊維−修飾剤は熱せられた水性溶媒で、最も
好ましくは水である。脱イオン化され脱脂されグアニジ
ン抽出された骨のコラーゲンを水中で高温にて（37°−
65°、好ましくは45°−60℃）約１時間熱することは、
望まれた表面の形態を得るのに通常は十分である。機構
は明らかでないが、熱処理はコラーゲン繊維を変化さ
せ、その結果粒子の表面積を増加させると仮定される。
したがって、骨のマトリックスは水中（１g/30ml）で撹
拌しながらさまざまに高めた温度で処理し、そして濾過
することができる。水中で温度を上昇させることにより
不溶性のコラーゲンを処理することにより、らせん構造
から非らせん構造への完全な遷移の1/4から3/4に達する
のに必要な温度である溶解遷移（Tm）に最初に到達す
る。その後繊維は収縮温度（Ts）と呼ばれるいくらか高
い温度において突然に何分の一かに収縮する。Tsは通常
より高く、分子の詰め込みにより更に安定性が高まるこ
とを反映する。約５以下のpHにおいては、熱せられたコ
ラーゲンのTmおよびTsの両値は減少する。
【００４４】溶剤で処理された骨のコラーゲン性マトリ
ックスの実験は、脱イオン化されグアニジン−抽出され
た異種性の子ウシの骨はさらに別の物質の混合物も含む
ことを示し、そしてこれらの物質を抽出するとマトリッ
クスの特性を改良できることを示している。抽出物中の
成分をクロマトグラフィーにより分離し、続いてクロマ
トグラフィーのピークに対応するさまざまな抽出画分を
活性マトリックスに加え戻すことにより、骨形成の誘導
効果(osteoinductine effect)を阻害できる活性がある
ことが示唆された。この阻害画分内の物質の正体はまだ
決定されていない。本発明の一つの局面において、上述
されたタイプのType-I骨コラーゲン粒子からなりさらに
該コラーゲン粒子が阻害作用を示す成分を除去されてい
る点において特徴づけられるマトリックスが提供され
る。
ックスの実験は、脱イオン化されグアニジン−抽出され
た異種性の子ウシの骨はさらに別の物質の混合物も含む
ことを示し、そしてこれらの物質を抽出するとマトリッ
クスの特性を改良できることを示している。抽出物中の
成分をクロマトグラフィーにより分離し、続いてクロマ
トグラフィーのピークに対応するさまざまな抽出画分を
活性マトリックスに加え戻すことにより、骨形成の誘導
効果(osteoinductine effect)を阻害できる活性がある
ことが示唆された。この阻害画分内の物質の正体はまだ
決定されていない。本発明の一つの局面において、上述
されたタイプのType-I骨コラーゲン粒子からなりさらに
該コラーゲン粒子が阻害作用を示す成分を除去されてい
る点において特徴づけられるマトリックスが提供され
る。
【００４５】本明細書の開示から見て、当業者は骨形成
具を確立するのに有用な、そして例えば骨の誘導を促進
するためのパッキンとして、あるいは生物的に分解され
る徐放性の耐えられる放出移植片として他の移植可能な
材料として有用な望まれた多孔性および表面の微小構造
をもつ、生物的に適応できる特別上質のマトリックスを
創ることができる。
具を確立するのに有用な、そして例えば骨の誘導を促進
するためのパッキンとして、あるいは生物的に分解され
る徐放性の耐えられる放出移植片として他の移植可能な
材料として有用な望まれた多孔性および表面の微小構造
をもつ、生物的に適応できる特別上質のマトリックスを
創ることができる。
【００４６】ここに開示された骨形成蛋白質および移植
可能な骨形成具により、医師は例えば、後天性および先
天性の脳顔面頭蓋のおよび他の骨格あるいは歯の奇形を
矯正するために最善の予測できる骨の形成をすることが
できる（Glowacki et al. (1981) Lancet 1：959-96
3）。この骨形成具は動物実験において証明されたよう
な癒着不良骨折において、および骨の形成が必要な歯周
の適用を含む他の治療の適用において、局部の軟骨性骨
の形成を誘導するのに使用される。他の潜在的な治療の
適用は例えば、骨関節炎の処理における軟骨の修復にお
いてである。
可能な骨形成具により、医師は例えば、後天性および先
天性の脳顔面頭蓋のおよび他の骨格あるいは歯の奇形を
矯正するために最善の予測できる骨の形成をすることが
できる（Glowacki et al. (1981) Lancet 1：959-96
3）。この骨形成具は動物実験において証明されたよう
な癒着不良骨折において、および骨の形成が必要な歯周
の適用を含む他の治療の適用において、局部の軟骨性骨
の形成を誘導するのに使用される。他の潜在的な治療の
適用は例えば、骨関節炎の処理における軟骨の修復にお
いてである。
【００４７】
【発明の実施の形態】哺乳動物の骨からの蛋白質の粗抽
出物に存在する骨形成の蛋白質の単離を可能にした精製
のプロトコルが最初に開発された。（PCT第US89/01453
号、および米国特許出願第179,406号（1988年４月８日
出願）を参照）。新鮮な子ウシの骨を入手できたこと
と、上記方法が開発されたことにより、実質的に純粋な
ウシの骨形成蛋白質（ＢＯＰ）を単離できた。ＢＯＰは
有意に同定された；ネコ、うさぎ、およびラットにおけ
る軟骨および最後の軟骨性骨を誘導するその能力は証明
され、そして研究された；従来は不均質な骨の抽出物内
の未知の蛋白質によると見なされていた骨の形成の発生
カスケードを誘導することが可能であることが示され
た。この薬剤量依存性および高い特異活性は、蛋白質が
グリコシル化されていてもいなくても存在した（米国特
許出願第232,630号（1988年８月15日出願）およびSampa
th et al.,(1990) J. Biol. Chem. 265：pp. 13198-132
05を参照せよ）。ウシの材料から得られた配列データは
プローブの構想を与え、ヒトの遺伝子を単離するために
使用された。ヒトのＯＰに相当する蛋白質は今日発現さ
れそして十分に同定されている。
出物に存在する骨形成の蛋白質の単離を可能にした精製
のプロトコルが最初に開発された。（PCT第US89/01453
号、および米国特許出願第179,406号（1988年４月８日
出願）を参照）。新鮮な子ウシの骨を入手できたこと
と、上記方法が開発されたことにより、実質的に純粋な
ウシの骨形成蛋白質（ＢＯＰ）を単離できた。ＢＯＰは
有意に同定された；ネコ、うさぎ、およびラットにおけ
る軟骨および最後の軟骨性骨を誘導するその能力は証明
され、そして研究された；従来は不均質な骨の抽出物内
の未知の蛋白質によると見なされていた骨の形成の発生
カスケードを誘導することが可能であることが示され
た。この薬剤量依存性および高い特異活性は、蛋白質が
グリコシル化されていてもいなくても存在した（米国特
許出願第232,630号（1988年８月15日出願）およびSampa
th et al.,(1990) J. Biol. Chem. 265：pp. 13198-132
05を参照せよ）。ウシの材料から得られた配列データは
プローブの構想を与え、ヒトの遺伝子を単離するために
使用された。ヒトのＯＰに相当する蛋白質は今日発現さ
れそして十分に同定されている。
【００４８】ホモダイマーとして個々にそしてヘテロダ
イマーとして別の種と結合した全体的に新規な、非天然
蛋白質構成物をコードするＤＮＡを調製することを可能
にしたこれらの発見は、真の軟骨性骨を生産することが
可能である（PCT出願第89/01469号（1989年４月７日出
願）および米国特許出願第315,342号（1989年２月23日
出願）を参照せよ）。それらは、ここに開示された技術
を使用してそして自動化され市販されている装置を使用
することにより生産された合成ＤＮＡからあるいは天然
源から回収されたｃＤＮＡおよびゲノミックＤＮＡか
ら、天然の材料、欠失させた型、変異蛋白質、アナロ
グ、融合蛋白質、そしてさまざまな他の由来物および構
成物を発現させることもまた可能にした。ＤＮＡは原核
生物細胞および真核生物生物細胞においてよく確立され
た分子生物学および組み替えＤＮＡ技術を使用して発現
され、そして必要ならば、生物学的に活性のある蛋白質
を生産するためにin vitroにおいて酸化されそして再び
おりたたまれる。
イマーとして別の種と結合した全体的に新規な、非天然
蛋白質構成物をコードするＤＮＡを調製することを可能
にしたこれらの発見は、真の軟骨性骨を生産することが
可能である（PCT出願第89/01469号（1989年４月７日出
願）および米国特許出願第315,342号（1989年２月23日
出願）を参照せよ）。それらは、ここに開示された技術
を使用してそして自動化され市販されている装置を使用
することにより生産された合成ＤＮＡからあるいは天然
源から回収されたｃＤＮＡおよびゲノミックＤＮＡか
ら、天然の材料、欠失させた型、変異蛋白質、アナロ
グ、融合蛋白質、そしてさまざまな他の由来物および構
成物を発現させることもまた可能にした。ＤＮＡは原核
生物細胞および真核生物生物細胞においてよく確立され
た分子生物学および組み替えＤＮＡ技術を使用して発現
され、そして必要ならば、生物学的に活性のある蛋白質
を生産するためにin vitroにおいて酸化されそして再び
おりたたまれる。
【００４９】ゲノミックおよびｃＤＮＡライブラリーか
ら単離されたＤＮＡ配列のうちの一つはここでＯＰ１と
呼ばれる、これまで未同定の遺伝子をコードしていた。
単離されたＤＮＡによりコードされている蛋白質はＴＧ
Ｆ−βファミリー内の蛋白質とのアミノ酸相同性から最
初に同定された。コンセンサスなスプライスシグナルは
エクソンとイントロンの境界と呼ばれているアミノ酸相
同性が終わるところで見いだされた。７つのシステイン
を含む機能的なＴＧＦ−β様ドメインを得るために、３
つのエクソンを結合させた。（例えば、米国特許出願第
315,342号（1980年２月23日出願）、あるいはOzkaynak,
E. et al.,(1990) EMBO. J. 9：pp. 2085-2093）。
ら単離されたＤＮＡ配列のうちの一つはここでＯＰ１と
呼ばれる、これまで未同定の遺伝子をコードしていた。
単離されたＤＮＡによりコードされている蛋白質はＴＧ
Ｆ−βファミリー内の蛋白質とのアミノ酸相同性から最
初に同定された。コンセンサスなスプライスシグナルは
エクソンとイントロンの境界と呼ばれているアミノ酸相
同性が終わるところで見いだされた。７つのシステイン
を含む機能的なＴＧＦ−β様ドメインを得るために、３
つのエクソンを結合させた。（例えば、米国特許出願第
315,342号（1980年２月23日出願）、あるいはOzkaynak,
E. et al.,(1990) EMBO. J. 9：pp. 2085-2093）。
【００５０】ＯＰ１の完全長のｃＤＮＡ配列はそれがコ
ードするアミノ酸配列を含めて図２に示されている。Ｏ
Ｐ１の完全長のｃＤＮＡ配列、さらにこの遺伝子をさま
ざまに欠失させた型、および融合させた遺伝子を大腸菌
において発現させ、そしてマトリックスと結合させて哺
乳動物において移植したときに骨の形成活性をもつこと
が示された。
ードするアミノ酸配列を含めて図２に示されている。Ｏ
Ｐ１の完全長のｃＤＮＡ配列、さらにこの遺伝子をさま
ざまに欠失させた型、および融合させた遺伝子を大腸菌
において発現させ、そしてマトリックスと結合させて哺
乳動物において移植したときに骨の形成活性をもつこと
が示された。
【００５１】天然の型の蛋白質は蛋白質の適切な分泌の
ためのシグナルペプチド配列を含む「プレプロ」型とし
て最初に発現される。シグナルペプチドが切断される部
位は図２において下線が引かれている。シグナルペプチ
ドの除去により蛋白質の「プロ」型を生じ、これが分泌
時にプロセスされて成熟蛋白質を生じる。成熟配列を生
じる切断部位は図２において矢印で示されている。成熟
型であると信じられているアミノ酸配列は次のとおりで
ある（Seq. ID No.１）：
ためのシグナルペプチド配列を含む「プレプロ」型とし
て最初に発現される。シグナルペプチドが切断される部
位は図２において下線が引かれている。シグナルペプチ
ドの除去により蛋白質の「プロ」型を生じ、これが分泌
時にプロセスされて成熟蛋白質を生じる。成熟配列を生
じる切断部位は図２において矢印で示されている。成熟
型であると信じられているアミノ酸配列は次のとおりで
ある（Seq. ID No.１）：
【００５２】正しくダイマーにされ、おりたたまれ、マ
トリックスに吸収され、そして移植された時に、プロ型
およびプレプロ型の両者は骨形成活性を示すが、これは
おそらく分割および成熟型の蛋白質あるいは活性のある
欠失されたアナログ蛋白質を生じるような分解酵素によ
る分解のためである。
トリックスに吸収され、そして移植された時に、プロ型
およびプレプロ型の両者は骨形成活性を示すが、これは
おそらく分割および成熟型の蛋白質あるいは活性のある
欠失されたアナログ蛋白質を生じるような分解酵素によ
る分解のためである。
【００５３】活性型のＯＰ１はまた蛋白質のＮ末端部分
がない、欠失された型で精製されうる。ＯＰ１の活性を
もつ欠失された型の一つは次のものである（Seq. ID N
o.２）：
がない、欠失された型で精製されうる。ＯＰ１の活性を
もつ欠失された型の一つは次のものである（Seq. ID N
o.２）：
【００５４】ＯＰ１の活性のある欠失された型の他の４
つは次のものである：
つは次のものである：
【００５５】
【００５６】
【００５７】
【００５８】前述のアミノ酸およびＤＮＡ配列の情報に
より、さまざまなＤＮＡが融合蛋白質、成熟蛋白質の他
の欠失型、および類似の構成物に加えて、ＯＰ１の少な
くとも最小限の活性ドメイン、および、それらのさまざ
まなアナログをコードするよに構成されうる。これらの
ＤＮＡは、ゲノミックＤＮＡおよびｃＤＮＡの単離、合
成されたオリゴヌクレオチドからの合成ＤＮＡの構成、
およびカセット変異導入技術を含む、よく知られたＤＮ
Ａ操作を使用して当業者により製造されうる。15−100m
erのオリゴヌクレオチドはバイオサーチDNAモデル8600
合成機により合成され、そしてTris-ほう酸-EDTA緩衝液
においてポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＰＡＧＥ)に
より精製される。そしてＤＮＡをゲルから電気的に溶出
する。オーバーラップするオリゴマーをＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼによりリン酸化しそしてＰＡＧＥによっ
ても精製されるより大きなブロックに連結する。
より、さまざまなＤＮＡが融合蛋白質、成熟蛋白質の他
の欠失型、および類似の構成物に加えて、ＯＰ１の少な
くとも最小限の活性ドメイン、および、それらのさまざ
まなアナログをコードするよに構成されうる。これらの
ＤＮＡは、ゲノミックＤＮＡおよびｃＤＮＡの単離、合
成されたオリゴヌクレオチドからの合成ＤＮＡの構成、
およびカセット変異導入技術を含む、よく知られたＤＮ
Ａ操作を使用して当業者により製造されうる。15−100m
erのオリゴヌクレオチドはバイオサーチDNAモデル8600
合成機により合成され、そしてTris-ほう酸-EDTA緩衝液
においてポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＰＡＧＥ)に
より精製される。そしてＤＮＡをゲルから電気的に溶出
する。オーバーラップするオリゴマーをＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼによりリン酸化しそしてＰＡＧＥによっ
ても精製されるより大きなブロックに連結する。
【００５９】そしてｃＤＮＡあるいは合成ＤＮＡを蛋白
質の発現のために発現ベクターに挿入しそして適切な宿
主細胞内にトランスフェクトする。原核細胞生物は蛋白
質をグリコシル化できないが蛋白質の骨形成活性は壊さ
ないから、宿主は原核細胞生物あるいは真核細胞生物を
使用する。有効な宿主細胞には大腸菌、酵母、昆虫／バ
キュロウイルス細胞系、ミエローマ細胞、およびさまざ
まな哺乳動物細胞が含まれる。本発明の蛋白質はここに
開示されたように、好ましくは哺乳動物において発現さ
れる。ベクターは付加的に複写プロモーターおよび終結
配列、エンハンサー配列、好ましいリボソーム結合部位
配列、好ましいｍＲＮＡリーダー配列、蛋白質の分泌の
ための好ましいシグナル配列、および類似物を含む組換
え体蛋白質の正確な発現を促進するさまざまな配列をコ
ードしていてもよい。興味のある遺伝子をコードするＤ
ＮＡ配列はまた、潜在的に阻害をする配列を除去するた
めにあるいは望まれない二次構造の形成を最小限にする
ために操作される。組換え体骨形成蛋白質はまた、融合
蛋白質としても発現されうる。翻訳された後に、蛋白質
は細胞自身から精製あるいは培養液から回収されうる。
すべての生物学的に活性のある蛋白質の型は、個々のサ
ブユニットの発現後に適切な真核生物細胞内あるいはin
vitroにおいて、さまざまな組換え体蛋白質のひとつあ
るいはいくつかが酸化およびおりたたまれることによ
り、ジスルフィド結合により連結されるか他の方法で結
合されて生産されるダイマー種からなる。
質の発現のために発現ベクターに挿入しそして適切な宿
主細胞内にトランスフェクトする。原核細胞生物は蛋白
質をグリコシル化できないが蛋白質の骨形成活性は壊さ
ないから、宿主は原核細胞生物あるいは真核細胞生物を
使用する。有効な宿主細胞には大腸菌、酵母、昆虫／バ
キュロウイルス細胞系、ミエローマ細胞、およびさまざ
まな哺乳動物細胞が含まれる。本発明の蛋白質はここに
開示されたように、好ましくは哺乳動物において発現さ
れる。ベクターは付加的に複写プロモーターおよび終結
配列、エンハンサー配列、好ましいリボソーム結合部位
配列、好ましいｍＲＮＡリーダー配列、蛋白質の分泌の
ための好ましいシグナル配列、および類似物を含む組換
え体蛋白質の正確な発現を促進するさまざまな配列をコ
ードしていてもよい。興味のある遺伝子をコードするＤ
ＮＡ配列はまた、潜在的に阻害をする配列を除去するた
めにあるいは望まれない二次構造の形成を最小限にする
ために操作される。組換え体骨形成蛋白質はまた、融合
蛋白質としても発現されうる。翻訳された後に、蛋白質
は細胞自身から精製あるいは培養液から回収されうる。
すべての生物学的に活性のある蛋白質の型は、個々のサ
ブユニットの発現後に適切な真核生物細胞内あるいはin
vitroにおいて、さまざまな組換え体蛋白質のひとつあ
るいはいくつかが酸化およびおりたたまれることによ
り、ジスルフィド結合により連結されるか他の方法で結
合されて生産されるダイマー種からなる。
【００６０】前述したように、治療における使用のため
の哺乳動物の組換え体蛋白質の生産は、その構造が天然
の物質に最も近い蛋白質を生産するために、好ましくは
哺乳動物細胞培養系において発現されるということが通
常は考えられている。哺乳動物細胞内における組換え体
蛋白質の生産は、トランスフェクトが簡単で、外来のＤ
ＮＡを並び方が変化していない配列で安定に維持し、そ
して転写、翻訳、後翻訳修飾、および蛋白質の分泌に十
分な必要な細胞の成分をもった適切な細胞および細胞ラ
インの確立を必要とする。さらに、興味のある遺伝子を
運ぶ適用なベクターもまた必要である。哺乳動物細胞へ
のトランスフェクションのためのＤＮＡベクターの構成
はコザックコンセンサス配列のような翻訳効率を高める
配列に加えて、適切な転写の開始、終結、およびエンハ
ンサー配列を含む上述されたような興味ある遺伝子の発
現を促進する適切な配列を含むべきである。好ましいＤ
ＮＡはまたマーカー遺伝子および興味ある遺伝子のコピ
ー数を増幅する手段を含む。
の哺乳動物の組換え体蛋白質の生産は、その構造が天然
の物質に最も近い蛋白質を生産するために、好ましくは
哺乳動物細胞培養系において発現されるということが通
常は考えられている。哺乳動物細胞内における組換え体
蛋白質の生産は、トランスフェクトが簡単で、外来のＤ
ＮＡを並び方が変化していない配列で安定に維持し、そ
して転写、翻訳、後翻訳修飾、および蛋白質の分泌に十
分な必要な細胞の成分をもった適切な細胞および細胞ラ
インの確立を必要とする。さらに、興味のある遺伝子を
運ぶ適用なベクターもまた必要である。哺乳動物細胞へ
のトランスフェクションのためのＤＮＡベクターの構成
はコザックコンセンサス配列のような翻訳効率を高める
配列に加えて、適切な転写の開始、終結、およびエンハ
ンサー配列を含む上述されたような興味ある遺伝子の発
現を促進する適切な配列を含むべきである。好ましいＤ
ＮＡはまたマーカー遺伝子および興味ある遺伝子のコピ
ー数を増幅する手段を含む。
【００６１】哺乳動物細胞の発現系の発展における実質
的な進歩はこの十年間につくられそしてこの系の多くの
局面は十分に特徴づけられた。有用な細胞、蛋白質発現
−プロモーター配列、マーカー遺伝子、および遺伝子増
幅法を含む、哺乳動物における外来蛋白質の生産の技術
の状況の詳細な論評は、ベンディグ(Bendig)、マリー(M
ary) M.,（1988）Genetic Engineering, 7：91-127に開
示されている。
的な進歩はこの十年間につくられそしてこの系の多くの
局面は十分に特徴づけられた。有用な細胞、蛋白質発現
−プロモーター配列、マーカー遺伝子、および遺伝子増
幅法を含む、哺乳動物における外来蛋白質の生産の技術
の状況の詳細な論評は、ベンディグ(Bendig)、マリー(M
ary) M.,（1988）Genetic Engineering, 7：91-127に開
示されている。
【００６２】簡潔に言えば、特定の哺乳動物内において
外来の遺伝子を発現するのに有用な最もよく特微づけら
れた転写プロモーターはSV40前期プロモーター、アデノ
ウイルスプロモーター(AdMLP)、マウスメタロチオネイ
ン-Iプロモーター(mMT-I)、ニワトリ肉腫ウイルス(RSV)
長末端重複(LTR)、マウス乳癌ウイルス長末端重複(MMTV
-LTR)、およびヒトサイトメガロウイルス主要中間−前
期プロモーター(hCMV)である。すべてのそれらプロモー
ターのＤＮＡ配列はその分野においてわかっており市販
されている。
外来の遺伝子を発現するのに有用な最もよく特微づけら
れた転写プロモーターはSV40前期プロモーター、アデノ
ウイルスプロモーター(AdMLP)、マウスメタロチオネイ
ン-Iプロモーター(mMT-I)、ニワトリ肉腫ウイルス(RSV)
長末端重複(LTR)、マウス乳癌ウイルス長末端重複(MMTV
-LTR)、およびヒトサイトメガロウイルス主要中間−前
期プロモーター(hCMV)である。すべてのそれらプロモー
ターのＤＮＡ配列はその分野においてわかっており市販
されている。
【００６３】哺乳動物系においてよりよく特徴づけられ
た遺伝子増幅の方法の一つはdhfr-セルラインにおける
誘導可能なDHFR遺伝子の使用である。通常、DHFR遺伝子
は興味ある遺伝子を運ぶベクター中に供給され、そして
細胞毒性薬剤メトトレキセートの付加による誘導によ
り、関連した興味ある遺伝子のコピー数に加えてDHFR遺
伝子のコピー数も増幅される。トランスフェクトされた
チャイニーズハムスター卵巣セルライン(CHO細胞)にお
ける誘導可能な、増幅マーカー遺伝子としてのDHFRはそ
の分野において特によく特徴づけられている。誘導可能
な遺伝子増幅器として有用な他の遺伝子は、アデノシン
脱アミノ酵素(ADA)およびグルタミン合成酵素(GS)遺伝
子である。
た遺伝子増幅の方法の一つはdhfr-セルラインにおける
誘導可能なDHFR遺伝子の使用である。通常、DHFR遺伝子
は興味ある遺伝子を運ぶベクター中に供給され、そして
細胞毒性薬剤メトトレキセートの付加による誘導によ
り、関連した興味ある遺伝子のコピー数に加えてDHFR遺
伝子のコピー数も増幅される。トランスフェクトされた
チャイニーズハムスター卵巣セルライン(CHO細胞)にお
ける誘導可能な、増幅マーカー遺伝子としてのDHFRはそ
の分野において特によく特徴づけられている。誘導可能
な遺伝子増幅器として有用な他の遺伝子は、アデノシン
脱アミノ酵素(ADA)およびグルタミン合成酵素(GS)遺伝
子である。
【００６４】細胞あるいはセルラインの選択もまた重要
であり実験者の必要に依存している。サル腎細胞(COS)
は高いレベルの一過性の遺伝子発現を提供し、ベクター
構成物およびクローン化された遺伝子の発現の迅速な試
験に有用な手段を提供する。COS細胞は興味ある遺伝子
を運ぶシミアンウイルス40(SV40)ベクターでトランスフ
ェクトされる。トランスフェクトされたCOS細胞はやが
て死滅し、そのため望まれた蛋白質の長期間の生産は妨
げられる。しかしながら、一過性の発現は安定なセルラ
インの開発に必要な時間を消費する過程（しばしば数週
間）を必要としない。
であり実験者の必要に依存している。サル腎細胞(COS)
は高いレベルの一過性の遺伝子発現を提供し、ベクター
構成物およびクローン化された遺伝子の発現の迅速な試
験に有用な手段を提供する。COS細胞は興味ある遺伝子
を運ぶシミアンウイルス40(SV40)ベクターでトランスフ
ェクトされる。トランスフェクトされたCOS細胞はやが
て死滅し、そのため望まれた蛋白質の長期間の生産は妨
げられる。しかしながら、一過性の発現は安定なセルラ
インの開発に必要な時間を消費する過程（しばしば数週
間）を必要としない。
【００６５】確立されたセルラインの間で、CHO細胞は
今日まで最も特徴がよくわかっている。それらはまた広
い範囲の細胞型由来の蛋白質を発現させることが可能で
ある。CHO細胞の一般的応用可能性および関係のない細
胞型由来の各種のヒト蛋白質の生産が成功している事実
は、すべての哺乳動物細胞における根源的な類似性を強
調する。そして、哺乳動物発現系において生産された組
換え体蛋白質のグリコシル化パターンは天然の蛋白質と
同一でないかも知れないが、オリゴサッカライドの側鎖
のちがいは発現された蛋白質の生物活性に本質的でない
ことがしばしばある。
今日まで最も特徴がよくわかっている。それらはまた広
い範囲の細胞型由来の蛋白質を発現させることが可能で
ある。CHO細胞の一般的応用可能性および関係のない細
胞型由来の各種のヒト蛋白質の生産が成功している事実
は、すべての哺乳動物細胞における根源的な類似性を強
調する。そして、哺乳動物発現系において生産された組
換え体蛋白質のグリコシル化パターンは天然の蛋白質と
同一でないかも知れないが、オリゴサッカライドの側鎖
のちがいは発現された蛋白質の生物活性に本質的でない
ことがしばしばある。
【００６６】さまざまな哺乳動物細胞から組換え体ＯＰ
１を発現させそして精製する方法、天然の異種性マトリ
ックス、および請求された主題の性格、有用性およびそ
れぞいかに作りそして使用するかということに関する他
の観点は、本発明の実施のために現在最良であると知ら
れた方法を構成する以下の記載からさらに理解されるで
あろう。
１を発現させそして精製する方法、天然の異種性マトリ
ックス、および請求された主題の性格、有用性およびそ
れぞいかに作りそして使用するかということに関する他
の観点は、本発明の実施のために現在最良であると知ら
れた方法を構成する以下の記載からさらに理解されるで
あろう。
【００６７】Ｉ．哺乳動物細胞における組換え体蛋白質
の発現 いくつかの違った哺乳動物細胞の発現系が、本発明の組
換え体ＯＰ１蛋白質の発現に使用された。特に、COS細
胞はCOS細胞中にＤＮＡ配列をトランスフェクトするた
めにSV40ベクターを使用して、ベクターの構築および遺
伝子の発現の迅速な評価のために使用される。安定なセ
ルラインはＯＰ１蛋白質の長期間の生産のためにCHO細
胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）およびBSC細胞
の高温感受性株（サルの腎細胞、BSC40-tsA58、（198
8）Biotechnology 6：1197-1196）を使用して開発され
る。２つの違ったプロモーターをＯＰ１の転写に使用す
る：ラウス肉腫ウイルスLTRからのエンハンサーにより
増幅されたCMVプロモーター、およびmMTプロモーター
(マウスメタロチオネインプロモーター)。いくつかの選
択マーカー遺伝子、例えば、neo(ネオマイシン)およびD
HFR、もまた使用される。DHFR遺伝子はまたCHO細胞の遺
伝子増幅計画の一部として使用されうる。他の遺伝子増
幅計画はSV40ベクターでトランスフェクトされたBSC40-
tsA58の温度感受性(ts)を利用する。33℃への温度の低
下は、ts SV40 T抗原を安定化し、それによって挿入さ
れた、トランスフェクトされたベクターＤＮＡの切り出
しおよび増幅が生じ、したがって結合された興味ある遺
伝子もまた増幅する。
の発現 いくつかの違った哺乳動物細胞の発現系が、本発明の組
換え体ＯＰ１蛋白質の発現に使用された。特に、COS細
胞はCOS細胞中にＤＮＡ配列をトランスフェクトするた
めにSV40ベクターを使用して、ベクターの構築および遺
伝子の発現の迅速な評価のために使用される。安定なセ
ルラインはＯＰ１蛋白質の長期間の生産のためにCHO細
胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）およびBSC細胞
の高温感受性株（サルの腎細胞、BSC40-tsA58、（198
8）Biotechnology 6：1197-1196）を使用して開発され
る。２つの違ったプロモーターをＯＰ１の転写に使用す
る：ラウス肉腫ウイルスLTRからのエンハンサーにより
増幅されたCMVプロモーター、およびmMTプロモーター
(マウスメタロチオネインプロモーター)。いくつかの選
択マーカー遺伝子、例えば、neo(ネオマイシン)およびD
HFR、もまた使用される。DHFR遺伝子はまたCHO細胞の遺
伝子増幅計画の一部として使用されうる。他の遺伝子増
幅計画はSV40ベクターでトランスフェクトされたBSC40-
tsA58の温度感受性(ts)を利用する。33℃への温度の低
下は、ts SV40 T抗原を安定化し、それによって挿入さ
れた、トランスフェクトされたベクターＤＮＡの切り出
しおよび増幅が生じ、したがって結合された興味ある遺
伝子もまた増幅する。
【００６８】安定なセルラインはBSC40-tsA58細胞（以
下「BSC細胞」と呼ぶ）に加えてCHO細胞でも確立され
た。本発明のＯＰ１蛋白質の哺乳動物細胞の発現のため
に選択されたさまざまなセルラインおよびＤＮＡ配列は
遺伝子工学の分野においてよく特徴づけられており容易
に入手できる。他のプロモーター、選択可能なマーカ
ー、遺伝子増幅法および細胞も本発明のＯＰ１蛋白質並
びに他の骨形成蛋白質の発現に利用されうる。トランス
フェクション、発現、および組換え体蛋白質の精製の特
別な詳細はその分野においてよく書物に記載されそして
当業者によって理解されている。哺乳動物発現系におけ
る外来遺伝子の組み換え体の生産において使用されたそ
れぞれの段階のさまざまな技術的な側面のさらなる詳細
は、例えば、Current Protocols in Molecular Biolog
y, F.M. Ausubel et al., ed., John Wiley & Sons, Ne
w York 1987のようなその分野における多くのテキスト
および実験マニュアルに見出されうる。
下「BSC細胞」と呼ぶ）に加えてCHO細胞でも確立され
た。本発明のＯＰ１蛋白質の哺乳動物細胞の発現のため
に選択されたさまざまなセルラインおよびＤＮＡ配列は
遺伝子工学の分野においてよく特徴づけられており容易
に入手できる。他のプロモーター、選択可能なマーカ
ー、遺伝子増幅法および細胞も本発明のＯＰ１蛋白質並
びに他の骨形成蛋白質の発現に利用されうる。トランス
フェクション、発現、および組換え体蛋白質の精製の特
別な詳細はその分野においてよく書物に記載されそして
当業者によって理解されている。哺乳動物発現系におけ
る外来遺伝子の組み換え体の生産において使用されたそ
れぞれの段階のさまざまな技術的な側面のさらなる詳細
は、例えば、Current Protocols in Molecular Biolog
y, F.M. Ausubel et al., ed., John Wiley & Sons, Ne
w York 1987のようなその分野における多くのテキスト
および実験マニュアルに見出されうる。
【００６９】１．発現ベクターの例 図３は哺乳動物におけるＯＰ１蛋白質の発現のために考
案されたさまざまな発現ベクターの例の制限地図を開示
している。これらのベクター構成物のそれぞれは最初に
ヒトｃＤＮＡライブラリー（ヒト胎盤）から単離され、
そして引き続いて挿入部位においてpUCポリリンカー配
列を使用して慣用的なpUCベクター(pUC-18）にクローン
化された完全長のｃＤＮＡ配列を使用している。これら
の構成物のそれぞれにクローン化されたＯＰ１ ｃＤＮ
Ａ断片は図２に描かれた完全なSmaI-BamHI ＯＰ１ ｃＤ
ＮＡ断片（Seq. ID No.７）、あるいはこの断片から標
準的な分子生物学方法論を使用して、周辺のコードして
いない５’および／または３’配列を再度切り取った修
飾断片である。それぞれのベクターはまた霊長類細胞
（例えば、COSおよびBSC細胞）においてプラスミドの複
製を伝達するのに有用なSV40の複製起点(ori)も使用し
ている。さらに、前期SV40プロモーターをベクター上の
マーカー遺伝子（例えば、neoおよびDHFR）の転写の制
御に使用している。
案されたさまざまな発現ベクターの例の制限地図を開示
している。これらのベクター構成物のそれぞれは最初に
ヒトｃＤＮＡライブラリー（ヒト胎盤）から単離され、
そして引き続いて挿入部位においてpUCポリリンカー配
列を使用して慣用的なpUCベクター(pUC-18）にクローン
化された完全長のｃＤＮＡ配列を使用している。これら
の構成物のそれぞれにクローン化されたＯＰ１ ｃＤＮ
Ａ断片は図２に描かれた完全なSmaI-BamHI ＯＰ１ ｃＤ
ＮＡ断片（Seq. ID No.７）、あるいはこの断片から標
準的な分子生物学方法論を使用して、周辺のコードして
いない５’および／または３’配列を再度切り取った修
飾断片である。それぞれのベクターはまた霊長類細胞
（例えば、COSおよびBSC細胞）においてプラスミドの複
製を伝達するのに有用なSV40の複製起点(ori)も使用し
ている。さらに、前期SV40プロモーターをベクター上の
マーカー遺伝子（例えば、neoおよびDHFR）の転写の制
御に使用している。
【００７０】pH717発現ベクター（図３Ａ）は、誘導可
能な選択マーカーとしてネオマイシン(neo)遺伝子を含
む。このマーカー遺伝子は遺伝子工学の分野においてよ
く特徴づけられており市販されている。一方、他の選択
可能なマーカーも使用可能である。pH717のためのneo遺
伝子ＤＮＡ断片の提供に使用される特定のベクター（pM
AM-neo-blue）は、Clontech, Inc., Palo Alto, CAから
入手できる。pH717において、ＯＰ１ ＤＮＡの転写はRS
V-LTRおよびMMTV-LTR（マウス乳癌ウイルス）エンハン
サー配列により増幅されるCMVプロモーターにより制御
されている。これらの配列はその分野においてよく知ら
れており、そして市販されている。例えば、このプロモ
ーター／エンハンサー配列を含むベクター（例えば、pC
DM8）はInvitrogen Inc., San Diego, CA, からえられ
る。
能な選択マーカーとしてネオマイシン(neo)遺伝子を含
む。このマーカー遺伝子は遺伝子工学の分野においてよ
く特徴づけられており市販されている。一方、他の選択
可能なマーカーも使用可能である。pH717のためのneo遺
伝子ＤＮＡ断片の提供に使用される特定のベクター（pM
AM-neo-blue）は、Clontech, Inc., Palo Alto, CAから
入手できる。pH717において、ＯＰ１ ＤＮＡの転写はRS
V-LTRおよびMMTV-LTR（マウス乳癌ウイルス）エンハン
サー配列により増幅されるCMVプロモーターにより制御
されている。これらの配列はその分野においてよく知ら
れており、そして市販されている。例えば、このプロモ
ーター／エンハンサー配列を含むベクター（例えば、pC
DM8）はInvitrogen Inc., San Diego, CA, からえられ
る。
【００７１】発現ベクターpH731（図３Ｂ）はＯＰ１の
転写を制御するためにSV40後期プロモーターを利用して
いる。上で述べられたように、このプロモーターの配列
および特徴はまたその分野においてよく知られている。
一方、pH731はpEUK-Cl（Clontech, Inc., Palo Alto, C
A）にＯＰ１のSmaI-BamHI断片を挿入することにより生
産される。
転写を制御するためにSV40後期プロモーターを利用して
いる。上で述べられたように、このプロモーターの配列
および特徴はまたその分野においてよく知られている。
一方、pH731はpEUK-Cl（Clontech, Inc., Palo Alto, C
A）にＯＰ１のSmaI-BamHI断片を挿入することにより生
産される。
【００７２】pH754発現ベクター（図３Ｃ）は，選択マ
ーカーとしておよび誘導可能な遺伝子増幅器としてDHFR
配列を含む。ＯＰ１はCMV制御下にある、DHFRのＤＮＡ
配列は遺伝子工学の分野においてよく特徴づけられてお
り、市販されている。一方、pH754はneo遺伝子（BamHI
分解物）をDHFR遺伝子を含むBamHI断片（例えば、pSV5-
dhfr（ATCC #37148）から得られる）に置き換えること
により、pMAM-neo（Clontech, Inc., Palo Alto, CA）
から生産できる。そしてＯＰ１ ＤＮＡはMMTVLTR配列
(マウス乳癌ウイルスLTR)の下流のポリリンカー部位に
挿入され得、pH752を生じる（図３Ｄ）。そしてCMVプロ
モーター配列を、ClaI-XbaI断片（例えば、pMAM-neo bl
ue, Clontech, Inc.から）としてpH752（ClaI-NheIにお
いて開かれた）に挿入できる。
ーカーとしておよび誘導可能な遺伝子増幅器としてDHFR
配列を含む。ＯＰ１はCMV制御下にある、DHFRのＤＮＡ
配列は遺伝子工学の分野においてよく特徴づけられてお
り、市販されている。一方、pH754はneo遺伝子（BamHI
分解物）をDHFR遺伝子を含むBamHI断片（例えば、pSV5-
dhfr（ATCC #37148）から得られる）に置き換えること
により、pMAM-neo（Clontech, Inc., Palo Alto, CA）
から生産できる。そしてＯＰ１ ＤＮＡはMMTVLTR配列
(マウス乳癌ウイルスLTR)の下流のポリリンカー部位に
挿入され得、pH752を生じる（図３Ｄ）。そしてCMVプロ
モーター配列を、ClaI-XbaI断片（例えば、pMAM-neo bl
ue, Clontech, Inc.から）としてpH752（ClaI-NheIにお
いて開かれた）に挿入できる。
【００７３】pW24ベクター（図３Ｅ）はneoがDHFRの代
わりにマーカー遺伝子（pH717を参照）として使用され
ていることを除いてp754の配列と本質的に同一である。
わりにマーカー遺伝子（pH717を参照）として使用され
ていることを除いてp754の配列と本質的に同一である。
【００７４】同様にして、pH783（図３Ｆ）は増幅可能
なマーカーDHFRを含むが、ここではＯＰ１はmMT(マウス
メタロチオネインプロモーター)制御下にある。mMTプロ
モーターは遺伝子工学の分野においてよく特徴づけられ
ており市販されている。一方、mMTプロモーター配列（A
llegro Nichols Institute Diagnostics, San Juan Cap
istrano, CAから手に入る）を含むClaI-NheI断片はpH78
3を生産するためにpH752に挿入され得る。
なマーカーDHFRを含むが、ここではＯＰ１はmMT(マウス
メタロチオネインプロモーター)制御下にある。mMTプロ
モーターは遺伝子工学の分野においてよく特徴づけられ
ており市販されている。一方、mMTプロモーター配列（A
llegro Nichols Institute Diagnostics, San Juan Cap
istrano, CAから手に入る）を含むClaI-NheI断片はpH78
3を生産するためにpH752に挿入され得る。
【００７５】試験されたすべてのベクターはＯＰ１を発
現するために使用されたさまざまな細胞において安定で
あり、そしてある範囲内のＯＰ１発現レベルを提供す
る。
現するために使用されたさまざまな細胞において安定で
あり、そしてある範囲内のＯＰ１発現レベルを提供す
る。
【００７６】２．哺乳動物細胞の例 組換え体ＯＰ１は３つの違った細胞発現系において発現
された： さまざまな発現ベクター構成物の機能性を迅
速にスクリーニングするためのCOS細胞、安定なセルラ
インの確立のためのCHO細胞、およびＯＰ１蛋白質を生
産する他の手段としてのBSC40-tsA58細胞。
された： さまざまな発現ベクター構成物の機能性を迅
速にスクリーニングするためのCOS細胞、安定なセルラ
インの確立のためのCHO細胞、およびＯＰ１蛋白質を生
産する他の手段としてのBSC40-tsA58細胞。
【００７７】Ａ．ＣＯＳ細胞 COS細胞（サルの腎細胞）はベクター構成物の迅速なス
クリーニングおよびＯＰ１蛋白質の迅速かつ小スケール
の生産に使用される。COS細胞はその分野においてよく
特徴づけられており市販されている。ここに記述された
特定のセルライン（ATCC #COS-1, CRL-1650）はAmerica
n Type Culture Collectionを通じて得られる。
クリーニングおよびＯＰ１蛋白質の迅速かつ小スケール
の生産に使用される。COS細胞はその分野においてよく
特徴づけられており市販されている。ここに記述された
特定のセルライン（ATCC #COS-1, CRL-1650）はAmerica
n Type Culture Collectionを通じて得られる。
【００７８】ノーザンおよびウエスタンブロットにより
分析された種々のベクターからのＯＰ１発現レベルは以
下の表１に比較されている。
分析された種々のベクターからのＯＰ１発現レベルは以
下の表１に比較されている。
【００７９】
【表１】
【００８０】pH754でトランスフェクトされたCOS細胞は
今日最も高い収率でＯＰ１を生産することが明らかにな
っている。しかしながら、トランスフェクトされたCOS
細胞は分裂せずにトランスフェクション後に数日で死ぬ
ので、個々のスケールアップされた形質転換には大量の
プラスミドＤＮＡが必要となる。
今日最も高い収率でＯＰ１を生産することが明らかにな
っている。しかしながら、トランスフェクトされたCOS
細胞は分裂せずにトランスフェクション後に数日で死ぬ
ので、個々のスケールアップされた形質転換には大量の
プラスミドＤＮＡが必要となる。
【００８１】トランスフェクトされたCOS細胞からのＯ
Ｐ１の大スケールでの調製は慣用的なローラーボトル技
術を使用して生産される。簡潔に言えば、14×106の細
胞がそれぞれのボトルに接種するのに使用される。２４
時間の成育後に、DEAE-デキストラン法を使用して、106
細胞あたり10μgのベクターＤＮＡ（例えば、pH717）で
細胞をトランスフェクトする。そして、蛋白質の分析の
ために培地を採取する前に120時間血清を含まない培地
で処理する。このプロトコルに従うと、ＯＰ１の収率は
約２−６ng/mlになる。
Ｐ１の大スケールでの調製は慣用的なローラーボトル技
術を使用して生産される。簡潔に言えば、14×106の細
胞がそれぞれのボトルに接種するのに使用される。２４
時間の成育後に、DEAE-デキストラン法を使用して、106
細胞あたり10μgのベクターＤＮＡ（例えば、pH717）で
細胞をトランスフェクトする。そして、蛋白質の分析の
ために培地を採取する前に120時間血清を含まない培地
で処理する。このプロトコルに従うと、ＯＰ１の収率は
約２−６ng/mlになる。
【００８２】Ｂ．ＣＨＯ細胞 CHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞)は長期間の
ＯＰ１の生産に使用される。CHOセルラインは外来遺伝
子の小および大スケールの生産のためによく特徴づけら
れておりそして市販されている。ここに記述された特定
のセルラインはCHO-DXBll、（Laurence Chasin, Columb
ia University, NY）である。以下の表２はさまざまな
発現ベクターで得られるＯＰ１の収率例を表す。
ＯＰ１の生産に使用される。CHOセルラインは外来遺伝
子の小および大スケールの生産のためによく特徴づけら
れておりそして市販されている。ここに記述された特定
のセルラインはCHO-DXBll、（Laurence Chasin, Columb
ia University, NY）である。以下の表２はさまざまな
発現ベクターで得られるＯＰ１の収率例を表す。
【００８３】
【表２】
【００８４】CHO細胞は慣用的なリン酸カルシウム法に
よりトランスフェクトできる。CHO細胞を好ましくはpH7
54あるいはpH752でトランスフェクトし、そしてＯＰ１
の収率を高めると思われるので、血清蛋白質を含んだ培
地において処理される。有用な培地は0.1−0.5％の透析
された胎児のウシの血清を含む培地を含む。
よりトランスフェクトできる。CHO細胞を好ましくはpH7
54あるいはpH752でトランスフェクトし、そしてＯＰ１
の収率を高めると思われるので、血清蛋白質を含んだ培
地において処理される。有用な培地は0.1−0.5％の透析
された胎児のウシの血清を含む培地を含む。
【００８５】Ｃ．ＢＳＣ細胞 BSC40-tsA58セルライン(BSC細胞)はCOS細胞に関連した
幾つかの問題に打ち勝つサルの腎細胞の温度感受性株で
ある（1988, Biotechnology 6：1192-1196）。これらの
BSC細胞は、潜在的に有毒な薬剤を外部から添加するこ
とを必要としないで温度を下げることにより迅速に大ス
ケールで遺伝子配列を増幅することができる利点をもっ
ている。さらに、細胞は再利用されうる。すなわち、Ｏ
Ｐ１発現の誘導および刺激後、細胞を新しい成育培地に
移し変え、39.5℃において飽和状態(コンフルエンス)ま
で成育させ、そして温度を33℃に下げることにより再び
誘導することが可能である。BSC細胞は蛋白質を産生す
る安定なセルラインを迅速に確立するために使用されう
る。
幾つかの問題に打ち勝つサルの腎細胞の温度感受性株で
ある（1988, Biotechnology 6：1192-1196）。これらの
BSC細胞は、潜在的に有毒な薬剤を外部から添加するこ
とを必要としないで温度を下げることにより迅速に大ス
ケールで遺伝子配列を増幅することができる利点をもっ
ている。さらに、細胞は再利用されうる。すなわち、Ｏ
Ｐ１発現の誘導および刺激後、細胞を新しい成育培地に
移し変え、39.5℃において飽和状態(コンフルエンス)ま
で成育させ、そして温度を33℃に下げることにより再び
誘導することが可能である。BSC細胞は蛋白質を産生す
る安定なセルラインを迅速に確立するために使用されう
る。
【００８６】トランスフェクトされたBSC細胞は10％のF
CSを含む培地において温度を33℃に低下させることによ
り誘導され、そしてインキュベーションから96時間後に
処理された培地を収穫する。CHO細胞と比較して同定度
の量（例えば、pH717でトランスフェクトされたBSCクロ
ーンから産生培地１mlあたり100〜150ngのＯＰ１）ＯＰ
１ ＲＮＡおよび蛋白質が得られる。
CSを含む培地において温度を33℃に低下させることによ
り誘導され、そしてインキュベーションから96時間後に
処理された培地を収穫する。CHO細胞と比較して同定度
の量（例えば、pH717でトランスフェクトされたBSCクロ
ーンから産生培地１mlあたり100〜150ngのＯＰ１）ＯＰ
１ ＲＮＡおよび蛋白質が得られる。
【００８７】３．ＯＰ１でトランスフェクトされた細胞
の評価 トランスフェクトされたＯＰ１配列の発現レベルは総細
胞ＲＮＡおよび慣用的なハイブリダイゼーション方法を
使用して、ｍＲＮＡのレベル（ノーザンブロット）を分
析することにより種々の系において測定される。通常、
約１×106の細胞がｍＲＮＡの分析に必要である。個々
のセルライン間のデータの比較は、細胞の総数およびｍ
ＲＮＡの総量を内部スタンダードとしてｒＲＮＡを使用
して標準化することにより行うことができる。リボソー
ムＲＮＡは、ハイブリダイゼーションのために該ＲＮＡ
をニトロセルロースフィルターに転写する前に、エチヂ
ウムブロマイドでアガロースゲルを染色することにより
可視化される。リボソームＲＮＡはまたＲＮＡの調製
に、完全さの指示指標を提供する。
の評価 トランスフェクトされたＯＰ１配列の発現レベルは総細
胞ＲＮＡおよび慣用的なハイブリダイゼーション方法を
使用して、ｍＲＮＡのレベル（ノーザンブロット）を分
析することにより種々の系において測定される。通常、
約１×106の細胞がｍＲＮＡの分析に必要である。個々
のセルライン間のデータの比較は、細胞の総数およびｍ
ＲＮＡの総量を内部スタンダードとしてｒＲＮＡを使用
して標準化することにより行うことができる。リボソー
ムＲＮＡは、ハイブリダイゼーションのために該ＲＮＡ
をニトロセルロースフィルターに転写する前に、エチヂ
ウムブロマイドでアガロースゲルを染色することにより
可視化される。リボソームＲＮＡはまたＲＮＡの調製
に、完全さの指示指標を提供する。
【００８８】ＯＰ１蛋白質のレベルはヒトＯＰ１に対す
るウサギの抗血清を使用してウエスタンブロット（イム
ノブロット）により測定することもできる。図４は：CO
S細胞−(Ａ)pH717，(Ｂ)pH731；CHO細胞−(Ｃ)pH754，
(Ｄ)pH752；およびBSC細胞−(Ｅ)pH717および(Ｆ)pW24
におけるＯＰ１の生産を表すイムノブロットである。
るウサギの抗血清を使用してウエスタンブロット（イム
ノブロット）により測定することもできる。図４は：CO
S細胞−(Ａ)pH717，(Ｂ)pH731；CHO細胞−(Ｃ)pH754，
(Ｄ)pH752；およびBSC細胞−(Ｅ)pH717および(Ｆ)pW24
におけるＯＰ１の生産を表すイムノブロットである。
【００８９】サザンブロットは挿入されたＯＰ１配列の
状態およびそれらのコピー数増幅の範囲を評価するため
に使用できる。温度を変化させたBSC細胞における切り
出されたプラスミドのコピー数もまたサザンブロット分
析を使用して決定されうる。
状態およびそれらのコピー数増幅の範囲を評価するため
に使用できる。温度を変化させたBSC細胞における切り
出されたプラスミドのコピー数もまたサザンブロット分
析を使用して決定されうる。
【００９０】II．蛋白質の精製 本発明の組換え体骨形成蛋白質を精製するために開発さ
れた精製計画は迅速で高い効果を示す。プロトコルは３
つのクロマトグラフィーステップ（S-セファロース、フ
ェニルセファロースおよびC-18 HPLC）を含み、そして
約90％純粋なＯＰ１を産生する。
れた精製計画は迅速で高い効果を示す。プロトコルは３
つのクロマトグラフィーステップ（S-セファロース、フ
ェニルセファロースおよびC-18 HPLC）を含み、そして
約90％純粋なＯＰ１を産生する。
【００９１】0.5％ FCSによって処理されたトランスフ
ェクトされたBSC細胞の典型的な2Lの調製物において、
総蛋白質は700mgである。ウエスタンブロットにより見
積もられる培地中のＯＰ１量は約80μgである。ＯＰ１
培地は６M尿素、0.05M塩化ナトリウム、13mM HEPES、pH
7.0に希釈され、そして亜硫酸基を持ちそして強カチオ
ン交換体として働くS-セファロースカラム上に載せられ
る。ＯＰ１は低塩濃度でカラムに結合し、そして血清蛋
白質は除去される。カラムは引き続き２段階の塩溶出で
展開される。最初の溶出（0.1M塩化ナトリウム）は混在
物および約10％の結合したＯＰ１を除去する。そして残
りの90％のＯＰ１は６M尿素、0.3M塩化ナトリウム、20m
M HEPES、pH7.0中に溶出される。
ェクトされたBSC細胞の典型的な2Lの調製物において、
総蛋白質は700mgである。ウエスタンブロットにより見
積もられる培地中のＯＰ１量は約80μgである。ＯＰ１
培地は６M尿素、0.05M塩化ナトリウム、13mM HEPES、pH
7.0に希釈され、そして亜硫酸基を持ちそして強カチオ
ン交換体として働くS-セファロースカラム上に載せられ
る。ＯＰ１は低塩濃度でカラムに結合し、そして血清蛋
白質は除去される。カラムは引き続き２段階の塩溶出で
展開される。最初の溶出（0.1M塩化ナトリウム）は混在
物および約10％の結合したＯＰ１を除去する。そして残
りの90％のＯＰ１は６M尿素、0.3M塩化ナトリウム、20m
M HEPES、pH7.0中に溶出される。
【００９２】この0.3M塩化ナトリウム画分に硫酸アンモ
ニウムを加えて、６M尿素、１M硫酸アンモニウム、0.3M
塩化ナトリウム、20mM HEPES、pH7.0の最終的な溶液状
態を得る。そしてサンプルをフェニルセファロースカラ
ム（疎水性結合クロマトグラフィー）に載せる。ＯＰ１
は高濃度の弱いカオトロピック塩（例えば、１M硫酸ア
ンモニウム）存在下においてフェニルセファロースに結
合させる。ＯＰ１を結合させた後、カラムを、硫酸アン
モニウムの濃度を下げて使用して２段階の溶出で展開す
る。最初の溶出（0.6Mの硫酸アンモニウムを含む）は最
初に混在物を除去する。そして結合したＯＰ１は硫酸ア
ンモニウムを含まない６M尿素、0.3M塩化ナトリウム、2
0mM HEPES、pH7.0緩衝液で溶出する。
ニウムを加えて、６M尿素、１M硫酸アンモニウム、0.3M
塩化ナトリウム、20mM HEPES、pH7.0の最終的な溶液状
態を得る。そしてサンプルをフェニルセファロースカラ
ム（疎水性結合クロマトグラフィー）に載せる。ＯＰ１
は高濃度の弱いカオトロピック塩（例えば、１M硫酸ア
ンモニウム）存在下においてフェニルセファロースに結
合させる。ＯＰ１を結合させた後、カラムを、硫酸アン
モニウムの濃度を下げて使用して２段階の溶出で展開す
る。最初の溶出（0.6Mの硫酸アンモニウムを含む）は最
初に混在物を除去する。そして結合したＯＰ１は硫酸ア
ンモニウムを含まない６M尿素、0.3M塩化ナトリウム、2
0mM HEPES、pH7.0緩衝液で溶出する。
【００９３】フェニルセファロースカラムから溶出され
たＯＰ１を水で透析し、さらに30％アセトニトリル（0.
1％TFA）で透析し、そしてC-18逆相HPLCカラムに載せ
る。図５Ａ、Ｂ、およびＣは(Ａ)S-セファロース、(Ｂ)
フェニルセファロース、および(Ｃ)C-18カラムから溶出
したものの(１)クロマトグラムおよび(２)ヂチオスレイ
トール(DTT)で還元後画分のクマジー染色SDS-PAGEゲル
である。酸化されそして還元されたＯＰ１サンプルのゲ
ルによる分離は、還元されたサブユニットが約18kDの見
かけ分子量をもつこと、および図６に示されるように、
ダイマーは約36kDの見かけ分子量をもつことを表す。こ
のサブユニットの大きさは、天然源のbOPの大きさに加
えて、COS細胞から精製されたものの大きさとも同一で
あることが明らかになった。現在のプロトコルは、ゲル
スキャニングにより見積もったところ２Ｌの産生培地で
約30μgのＯＰ１、すなわち約25％の回収、の収量を得
た。
たＯＰ１を水で透析し、さらに30％アセトニトリル（0.
1％TFA）で透析し、そしてC-18逆相HPLCカラムに載せ
る。図５Ａ、Ｂ、およびＣは(Ａ)S-セファロース、(Ｂ)
フェニルセファロース、および(Ｃ)C-18カラムから溶出
したものの(１)クロマトグラムおよび(２)ヂチオスレイ
トール(DTT)で還元後画分のクマジー染色SDS-PAGEゲル
である。酸化されそして還元されたＯＰ１サンプルのゲ
ルによる分離は、還元されたサブユニットが約18kDの見
かけ分子量をもつこと、および図６に示されるように、
ダイマーは約36kDの見かけ分子量をもつことを表す。こ
のサブユニットの大きさは、天然源のbOPの大きさに加
えて、COS細胞から精製されたものの大きさとも同一で
あることが明らかになった。現在のプロトコルは、ゲル
スキャニングにより見積もったところ２Ｌの産生培地で
約30μgのＯＰ１、すなわち約25％の回収、の収量を得
た。
【００９４】別法のクロマトグラフィープロトコルは、
６M尿素非存在下においてS-セファロースクロマトグラ
フィーを行う。そして結合したタンパク質は塩のステッ
プ溶出（例えば、100−400mM塩化ナトリウム）で溶出さ
れる。ＯＰ１のほとんどは約300mMの塩化ナトリウムで
溶出される。そして残りのＯＰ１はさらに６M尿素存在
下の300mMの塩化ナトリウムで溶出されうる。１段階で
最大の回収を達成するために、尿素を使用しない溶出に
代えて６M尿素の溶出を使用してもよい。
６M尿素非存在下においてS-セファロースクロマトグラ
フィーを行う。そして結合したタンパク質は塩のステッ
プ溶出（例えば、100−400mM塩化ナトリウム）で溶出さ
れる。ＯＰ１のほとんどは約300mMの塩化ナトリウムで
溶出される。そして残りのＯＰ１はさらに６M尿素存在
下の300mMの塩化ナトリウムで溶出されうる。１段階で
最大の回収を達成するために、尿素を使用しない溶出に
代えて６M尿素の溶出を使用してもよい。
【００９５】ＯＰ１はまたヒドロキシアパタイトに効果
的に結合する、ただし６M尿素非存在下および低リン酸
濃度（リン酸５mM以下）においてのみである。結合した
ＯＰ１は、１mMから0.5Mのステップ溶出（0.5M塩化ナト
リウム、50mM Tris、pH7.0中で）でカラムから除去され
うる。ＯＰ１は約250mMのリン酸で溶出される。さら
に、溶出ステップの間に尿素（６M）を加えてもよい。
的に結合する、ただし６M尿素非存在下および低リン酸
濃度（リン酸５mM以下）においてのみである。結合した
ＯＰ１は、１mMから0.5Mのステップ溶出（0.5M塩化ナト
リウム、50mM Tris、pH7.0中で）でカラムから除去され
うる。ＯＰ１は約250mMのリン酸で溶出される。さら
に、溶出ステップの間に尿素（６M）を加えてもよい。
【００９６】他の関連したクロマトグラフィー方法もま
た哺乳動物細胞系からＯＰ１を精製するのに有用であ
る。例えば、ヘパリンセファロースをS-セファロースカ
ラムと組み合わせて使用できる。あるいは、Cu2+-固定
化金属イオン親和性クロマトグラフィー(IMAC)は、６M
の尿素を含むリン酸緩衝液（pH7.0）中でＯＰ１を結合
する。
た哺乳動物細胞系からＯＰ１を精製するのに有用であ
る。例えば、ヘパリンセファロースをS-セファロースカ
ラムと組み合わせて使用できる。あるいは、Cu2+-固定
化金属イオン親和性クロマトグラフィー(IMAC)は、６M
の尿素を含むリン酸緩衝液（pH7.0）中でＯＰ１を結合
する。
【００９７】III．マトリックスの調製 本発明の実施には骨、好ましくは哺乳動物、例えばウシ
の骨の入手性を必要とする。骨を洗浄し、骨髄を取り除
き、脱脂され、脱イオン化され、適当な大きさの粒子に
砕かれ、可溶性蛋白質を除去するために抽出され、殺菌
され、そしてさまざまな臨床の使用に有用な移植できる
材料を生産するようなここに開示されたような方法で処
理される。
の骨の入手性を必要とする。骨を洗浄し、骨髄を取り除
き、脱脂され、脱イオン化され、適当な大きさの粒子に
砕かれ、可溶性蛋白質を除去するために抽出され、殺菌
され、そしてさまざまな臨床の使用に有用な移植できる
材料を生産するようなここに開示されたような方法で処
理される。
【００９８】本発明の材料から製造されたさまざまな形
のマトリックスはさまざまな目的で外科的に移植され
る。これらの目的中の主要なものは、さまざまな整形法
の、歯周の、および再構成の方法における骨の形成のマ
トリックスとして、徐放剤のキャリアーとして、あるい
は移植片のためのコラーゲン性コーティング剤として働
かせることである。マトリックスは外科手術において期
待される所望の形とし、あるいは外科手術の間の医者あ
るいは技術者により型づくられてよい。すなわち、局所
性の、皮下の、腹腔内の、あるいは筋肉内の移植片とし
て使用できる；骨折の癒着不良を補うようにあるいは骨
の欠失を満たすように型づくられる。骨の形成あるいは
誘導方法において、材料はゆっくりと体に吸収されそし
て移植片の形であるいはほとんど移植片に近い形で骨と
置き換えられる。
のマトリックスはさまざまな目的で外科的に移植され
る。これらの目的中の主要なものは、さまざまな整形法
の、歯周の、および再構成の方法における骨の形成のマ
トリックスとして、徐放剤のキャリアーとして、あるい
は移植片のためのコラーゲン性コーティング剤として働
かせることである。マトリックスは外科手術において期
待される所望の形とし、あるいは外科手術の間の医者あ
るいは技術者により型づくられてよい。すなわち、局所
性の、皮下の、腹腔内の、あるいは筋肉内の移植片とし
て使用できる；骨折の癒着不良を補うようにあるいは骨
の欠失を満たすように型づくられる。骨の形成あるいは
誘導方法において、材料はゆっくりと体に吸収されそし
て移植片の形であるいはほとんど移植片に近い形で骨と
置き換えられる。
【００９９】さまざまな成長因子、ホルモン、酵素、治
療用組成物、抗生物質、および身体に処理する他の薬剤
もまた、キャリアー物質に吸収させそして移植すると、
マトリックスの材料がゆっくりと吸収されるにつれて時
間をかけて放出させる。こうして、EGF、PDGF、IGF、FG
F、TGFアルファ、およびTGFベータのようなさまざまな
既知の成長因子をin vivoにおいて吸収させうる。材料
は化学療法剤、インスリン、酵素、あるいは酵素の阻害
剤を放出させるために使用されうる。
療用組成物、抗生物質、および身体に処理する他の薬剤
もまた、キャリアー物質に吸収させそして移植すると、
マトリックスの材料がゆっくりと吸収されるにつれて時
間をかけて放出させる。こうして、EGF、PDGF、IGF、FG
F、TGFアルファ、およびTGFベータのようなさまざまな
既知の成長因子をin vivoにおいて吸収させうる。材料
は化学療法剤、インスリン、酵素、あるいは酵素の阻害
剤を放出させるために使用されうる。
【０１００】本発明の材料をいかにして作るかおよび使
用するかの詳細を以下に開示する。
用するかの詳細を以下に開示する。
【０１０１】１．脱イオン化された骨の調製 脱イオン化されたウシの骨のマトリックスは、以前に公
表された方法により調製される（Sampath and Reddi (1
2983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80：6591-6595）。
ウシの骨幹（１−10日齢）は屠殺場から得られ新鮮なう
ちに使用される。骨は筋肉と脂肪を取り去り、骨膜を洗
い、冷水による水圧で骨髄を取り除き、冷やした無水ア
ルコールに浸し、そして-20℃で貯蔵する。そして乾燥
しそして破壊により断片化しそして大きな製粉機により
粉にされる。注意を要することは液体窒素を使用するこ
とにより発熱を防ぐことである。粉にされた骨は70−85
0μm、好ましくは150μm−420μmの範囲の粒子の大きさ
の粉にされ、そして３倍容のクロロホルムおよびメタノ
ール（３：１）で約２時間、２度洗浄することにより脱
脂する。そして微粒子状の骨を等容の無水エタノールで
洗浄し、そして脱脂された骨の粉を生じさせるために等
容の無水エーテルで乾燥させる。そして脱脂された骨の
粉を10倍容の0.5N HClで４℃において40分間、４回連続
して処理して脱イオン化する。最後に、中和のための洗
浄を大量の水を用いて脱イオン化された骨の粉に行う。
表された方法により調製される（Sampath and Reddi (1
2983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80：6591-6595）。
ウシの骨幹（１−10日齢）は屠殺場から得られ新鮮なう
ちに使用される。骨は筋肉と脂肪を取り去り、骨膜を洗
い、冷水による水圧で骨髄を取り除き、冷やした無水ア
ルコールに浸し、そして-20℃で貯蔵する。そして乾燥
しそして破壊により断片化しそして大きな製粉機により
粉にされる。注意を要することは液体窒素を使用するこ
とにより発熱を防ぐことである。粉にされた骨は70−85
0μm、好ましくは150μm−420μmの範囲の粒子の大きさ
の粉にされ、そして３倍容のクロロホルムおよびメタノ
ール（３：１）で約２時間、２度洗浄することにより脱
脂する。そして微粒子状の骨を等容の無水エタノールで
洗浄し、そして脱脂された骨の粉を生じさせるために等
容の無水エーテルで乾燥させる。そして脱脂された骨の
粉を10倍容の0.5N HClで４℃において40分間、４回連続
して処理して脱イオン化する。最後に、中和のための洗
浄を大量の水を用いて脱イオン化された骨の粉に行う。
【０１０２】２．グアニジン抽出 このようにして調製された脱イオン化された骨のマトリ
ックスは５倍容の４Mグアニジン-HCl，50mM Tris-HCl，
pH7.0で16時間４℃において抽出される。懸濁液をフィ
ルターでこす。不溶性の物質を集めそしてマトリックス
を組み立てるのに使用する。この物質は基本的に大部分
コラーゲン性であり、それは骨形成および軟骨形成活性
を持たない。
ックスは５倍容の４Mグアニジン-HCl，50mM Tris-HCl，
pH7.0で16時間４℃において抽出される。懸濁液をフィ
ルターでこす。不溶性の物質を集めそしてマトリックス
を組み立てるのに使用する。この物質は基本的に大部分
コラーゲン性であり、それは骨形成および軟骨形成活性
を持たない。
【０１０３】３．マトリックスの処理 すべての骨のマトリックスの主要な成分はType-Iコラー
ゲンである。コラーゲンに加えて、上で開示されたよう
に抽出された脱イオン化された骨は総量の５％の割合を
示す非コラーゲン性蛋白質を含む。異種性のマトリック
ス中の、これらの非コラーゲン様蛋白質はそれ自身潜在
的な抗原として存在し、そして免疫原性および／あるい
は阻害成分を構成する。そのような成分は同種型の移植
片においてもまた、骨の分化の発生カスケードを妨げる
ことにより骨形成を阻害する。マトリックス粒子をコラ
ーゲン繊維修飾剤で処理することにより、潜在的に望ま
しからぬ成分がマトリックスから抽出され、そしてマト
リックスの材料の表面の構造が変えられる事が本発明に
より見いだされた。
ゲンである。コラーゲンに加えて、上で開示されたよう
に抽出された脱イオン化された骨は総量の５％の割合を
示す非コラーゲン性蛋白質を含む。異種性のマトリック
ス中の、これらの非コラーゲン様蛋白質はそれ自身潜在
的な抗原として存在し、そして免疫原性および／あるい
は阻害成分を構成する。そのような成分は同種型の移植
片においてもまた、骨の分化の発生カスケードを妨げる
ことにより骨形成を阻害する。マトリックス粒子をコラ
ーゲン繊維修飾剤で処理することにより、潜在的に望ま
しからぬ成分がマトリックスから抽出され、そしてマト
リックスの材料の表面の構造が変えられる事が本発明に
より見いだされた。
【０１０４】今日最も好ましい繊維修飾剤は加熱した水
性溶媒で、最も好ましくは水である。さまざまな量の脱
脂され、脱イオン化されグアニジンで抽出された骨のコ
ラーゲンを湯浴中のガラスのフラスコで一定の速度で撹
拌しながら水中（１g/30ml）で加熱し、そして指示され
た温度において１時間保つ。幾つかの例においては、水
は加熱前にコラーゲンを膨張させることを助けるために
0.1M酢酸で置き換えられる。温度は室温、および約37
℃、45、55、65、75において一定に保たれる。熱処理
後、マトリックスをフィルターで濾過しそして凍結乾燥
して移植に使用する。
性溶媒で、最も好ましくは水である。さまざまな量の脱
脂され、脱イオン化されグアニジンで抽出された骨のコ
ラーゲンを湯浴中のガラスのフラスコで一定の速度で撹
拌しながら水中（１g/30ml）で加熱し、そして指示され
た温度において１時間保つ。幾つかの例においては、水
は加熱前にコラーゲンを膨張させることを助けるために
0.1M酢酸で置き換えられる。温度は室温、および約37
℃、45、55、65、75において一定に保たれる。熱処理
後、マトリックスをフィルターで濾過しそして凍結乾燥
して移植に使用する。
【０１０５】マトリックス材料の形態に対するお湯の処
理の効果は図６と図１の光学顕微鏡写真の比較から明ら
かである。図６は(ａ) 37℃、(ｂ) 45℃、(ｃ) 55℃、
(ｄ)65℃において処理された、効果的に変化したコラー
ゲンの表面の形態を表す。図１の光学顕微鏡写真は非処
理のラットおよびウシの骨のマトリックスの形態を表す
（それぞれＡ、およびＢ）。写真から明らかなように、
お湯の処理は粒子の表面の微小なくぼみの程度を少なく
とも約10倍増加させ、実質的に粒子の多孔性をも増加さ
せる（図１のＢおよび図５のＣ，Ｄを比較せよ）。マト
リックス粒子のこの形態の変化は実質的に粒子の表面積
を増加させる。穴およびくぼみの大きさを注意深く測定
すると、マトリックス粒子への熱い水性溶媒の処理は１
μmから100μmの範囲の粒子の穴およびくぼみの直径を
生じさせることが明らかである。
理の効果は図６と図１の光学顕微鏡写真の比較から明ら
かである。図６は(ａ) 37℃、(ｂ) 45℃、(ｃ) 55℃、
(ｄ)65℃において処理された、効果的に変化したコラー
ゲンの表面の形態を表す。図１の光学顕微鏡写真は非処
理のラットおよびウシの骨のマトリックスの形態を表す
（それぞれＡ、およびＢ）。写真から明らかなように、
お湯の処理は粒子の表面の微小なくぼみの程度を少なく
とも約10倍増加させ、実質的に粒子の多孔性をも増加さ
せる（図１のＢおよび図５のＣ，Ｄを比較せよ）。マト
リックス粒子のこの形態の変化は実質的に粒子の表面積
を増加させる。穴およびくぼみの大きさを注意深く測定
すると、マトリックス粒子への熱い水性溶媒の処理は１
μmから100μmの範囲の粒子の穴およびくぼみの直径を
生じさせることが明らかである。
【０１０６】お湯の処理により産生された抽出物の特性
から、この処理はまたそのマトリックス中への共存がin
vivoにおいて新しい骨の形成を妨げるような成分を除
去していることも明らかにしている。図８はお湯で処理
したウシのマトリックスから単離された抽出物の214nm
における吸光のトレースであり、それぞれのピーク（も
しくは画分）のin vivoの骨の形成に対する効果を示
す。
から、この処理はまたそのマトリックス中への共存がin
vivoにおいて新しい骨の形成を妨げるような成分を除
去していることも明らかにしている。図８はお湯で処理
したウシのマトリックスから単離された抽出物の214nm
における吸光のトレースであり、それぞれのピーク（も
しくは画分）のin vivoの骨の形成に対する効果を示
す。
【０１０７】大スケールの調製作業（100gウシマトリッ
クス、お湯処理）からの抽出物を集め、0.1％ TFAによ
り酸性化し、そしてMillipore Delta Prep Cartrigeを
使用してC-18 HPLCカラムで測定した。画分を25ml/分の
流速で50mLの間隔で集め、適当にプールしてトレースさ
れた各ピークを分離した。そしてこれらの画分のそれぞ
れを組換え体ＯＰ１および適切なラットのマトリックス
キャリアー（後記参照）とともに移植し、そしてその骨
形成活性に対する効果を測定した。第１２画分のみが、
同種型の移植における骨の形成を阻害するようである。
その阻害活性は用量に依存するようである。このピーク
に存在する阻害成分の除去は異種性の移植における骨形
成活性の維持に必要である可能性がある。図９は１２日
目の移植片においてアルカリホスファターゼ活性および
カルシウム含有量で調べた、お湯で処理されたマトリッ
クスからの完全な溶剤抽出物の骨形成活性に対する影響
を表す。どのような抽出も行われないで移植されたラッ
トのキャリアーマトリックスおよびＯＰ１をポジティブ
コントロールとして使用する。お湯で処理されたウシの
マトリクス100グラムから得られた溶剤抽出物を蒸発さ
せそして６Mの50％アセトニトリル/0.1％ TFA中に溶解
させた。その100−300μlのアリコートを既知量の組換
え体ＯＰ１、および25mgのラットマトリックスキャリア
ーと混合し、そししてアッセイした（以下を参照せ
よ）。結果は抽出物が用量に依存して新しい骨の形成を
阻害することを明らかに示している。
クス、お湯処理）からの抽出物を集め、0.1％ TFAによ
り酸性化し、そしてMillipore Delta Prep Cartrigeを
使用してC-18 HPLCカラムで測定した。画分を25ml/分の
流速で50mLの間隔で集め、適当にプールしてトレースさ
れた各ピークを分離した。そしてこれらの画分のそれぞ
れを組換え体ＯＰ１および適切なラットのマトリックス
キャリアー（後記参照）とともに移植し、そしてその骨
形成活性に対する効果を測定した。第１２画分のみが、
同種型の移植における骨の形成を阻害するようである。
その阻害活性は用量に依存するようである。このピーク
に存在する阻害成分の除去は異種性の移植における骨形
成活性の維持に必要である可能性がある。図９は１２日
目の移植片においてアルカリホスファターゼ活性および
カルシウム含有量で調べた、お湯で処理されたマトリッ
クスからの完全な溶剤抽出物の骨形成活性に対する影響
を表す。どのような抽出も行われないで移植されたラッ
トのキャリアーマトリックスおよびＯＰ１をポジティブ
コントロールとして使用する。お湯で処理されたウシの
マトリクス100グラムから得られた溶剤抽出物を蒸発さ
せそして６Mの50％アセトニトリル/0.1％ TFA中に溶解
させた。その100−300μlのアリコートを既知量の組換
え体ＯＰ１、および25mgのラットマトリックスキャリア
ーと混合し、そししてアッセイした（以下を参照せ
よ）。結果は抽出物が用量に依存して新しい骨の形成を
阻害することを明らかに示している。
【０１０８】繊維修飾剤に接触させた後、処理されたマ
トリックスを、以下の手続きの形にしたがって洗浄し、
どのような抽出成分をも除去する： １．TBS(Tris緩衝塩)に１g/200mlで懸濁させそして４℃
において２時間撹拌する；あるいは６M尿素、50mM Tris
-HCl，500mM NaCl，pH7.0（UTBS）あるいは水に懸濁さ
せそして室温(RT)で30分間撹拌する（pH値を中和状態に
するのに十分な時間）； ２．遠心しそして洗浄ステップを繰り返す；そして ３．遠心して；上清を捨てて；残渣を水で洗い；そして
凍結乾燥する。
トリックスを、以下の手続きの形にしたがって洗浄し、
どのような抽出成分をも除去する： １．TBS(Tris緩衝塩)に１g/200mlで懸濁させそして４℃
において２時間撹拌する；あるいは６M尿素、50mM Tris
-HCl，500mM NaCl，pH7.0（UTBS）あるいは水に懸濁さ
せそして室温(RT)で30分間撹拌する（pH値を中和状態に
するのに十分な時間）； ２．遠心しそして洗浄ステップを繰り返す；そして ３．遠心して；上清を捨てて；残渣を水で洗い；そして
凍結乾燥する。
【０１０９】他の有用な繊維修飾剤はトリフルオロ酢酸
およびフッ化水素のような酸、およびジクロロメタン、
アセトニトリル、イソプロパノール、およびクロロホル
ムのような有機溶媒およびそれらの薬剤の組み合わせを
含む。これらの他の繊維修飾剤を使用したマトリックス
の処理は、これらの繊維修飾剤が脱イオン化され、グア
ニジン抽出された骨のコラーゲン粒子に対して及ぼす効
果の詳細な物理的な分析とともに、米国特許出願第422,
613号（1989年10月17日出願）に開示され、その開示は
引用により本明細書に含まれる。
およびフッ化水素のような酸、およびジクロロメタン、
アセトニトリル、イソプロパノール、およびクロロホル
ムのような有機溶媒およびそれらの薬剤の組み合わせを
含む。これらの他の繊維修飾剤を使用したマトリックス
の処理は、これらの繊維修飾剤が脱イオン化され、グア
ニジン抽出された骨のコラーゲン粒子に対して及ぼす効
果の詳細な物理的な分析とともに、米国特許出願第422,
613号（1989年10月17日出願）に開示され、その開示は
引用により本明細書に含まれる。
【０１１０】コラーゲンのマトリックスの材料は、好ま
しくは水に不溶性の、非接着性粒子からなる微粉末の形
をとる。新しい骨の成育あるいは持続した放出が望まれ
る所で単に所定の容積に圧縮して、周辺組織によってそ
の場所に保持して使用される。あるいは、この粉末は身
体に素早く吸収されるような例えば、ゼラチンあるいは
ポリ乳酸コーティングのカプセルに入れてもよい。この
粉末は与えられた寸法の容積に形づくりそして該粒子を
例えば可溶性の、種に関して生物的に適合できるコラー
ゲンを使用して内部接着することによりその形状に維持
することもできる。この粉末材料はまたシート状、棒
状、ビーズ状、あるいは他の肉眼で見える形につくるこ
ともできる。
しくは水に不溶性の、非接着性粒子からなる微粉末の形
をとる。新しい骨の成育あるいは持続した放出が望まれ
る所で単に所定の容積に圧縮して、周辺組織によってそ
の場所に保持して使用される。あるいは、この粉末は身
体に素早く吸収されるような例えば、ゼラチンあるいは
ポリ乳酸コーティングのカプセルに入れてもよい。この
粉末は与えられた寸法の容積に形づくりそして該粒子を
例えば可溶性の、種に関して生物的に適合できるコラー
ゲンを使用して内部接着することによりその形状に維持
することもできる。この粉末材料はまたシート状、棒
状、ビーズ状、あるいは他の肉眼で見える形につくるこ
ともできる。
【０１１１】IV．骨形成具の構成 上で説明されたような組換え体蛋白質および他の構成物
は以下に記述される任意の方法を用いて、適当なマトリ
ックス調製物中に混合および分散させうる。
は以下に記述される任意の方法を用いて、適当なマトリ
ックス調製物中に混合および分散させうる。
【０１１２】１．エタノール沈澱 マトリックスをグアニジン−塩酸に溶解している骨形成
蛋白質に加える。サンプルを回転運動により撹拌して低
温においてインキュべートする。そしてサンプルをさら
に回転運動により撹拌する。混合物に冷たい無水のエタ
ノールを加え、撹拌およびインキュベートする。遠心後
（微量遠心管、高遠）上清を除去する。マトリックス
を、冷やした濃縮エタノール水溶液により洗浄し、そし
て凍結乾燥する。
蛋白質に加える。サンプルを回転運動により撹拌して低
温においてインキュべートする。そしてサンプルをさら
に回転運動により撹拌する。混合物に冷たい無水のエタ
ノールを加え、撹拌およびインキュベートする。遠心後
（微量遠心管、高遠）上清を除去する。マトリックス
を、冷やした濃縮エタノール水溶液により洗浄し、そし
て凍結乾燥する。
【０１１３】２．アセトニトリル トリフルオロ酢酸で
の凍結乾燥 この方法において、アセトニトリル トリフルオロ酢酸
(ACN/TFA)溶液中の骨形成蛋白質をキャリアー材料に加
えた。サンプルを何度も激しく渦巻き撹拌してその後凍
結乾燥する。骨形成蛋白質をさまざまな濃度で、そして
幾つかの精製段階において加える。この方法は今日好ま
れている。
の凍結乾燥 この方法において、アセトニトリル トリフルオロ酢酸
(ACN/TFA)溶液中の骨形成蛋白質をキャリアー材料に加
えた。サンプルを何度も激しく渦巻き撹拌してその後凍
結乾燥する。骨形成蛋白質をさまざまな濃度で、そして
幾つかの精製段階において加える。この方法は今日好ま
れている。
【０１１４】３．尿素での凍結乾燥 尿素緩衝液中において調製された骨形成蛋白質について
は、蛋白質をマトリックス材料と混合し、何度も渦巻き
撹拌し、そして凍結乾燥する。凍結乾燥された材料は
「そのまま」移植に使用される。
は、蛋白質をマトリックス材料と混合し、何度も渦巻き
撹拌し、そして凍結乾燥する。凍結乾燥された材料は
「そのまま」移植に使用される。
【０１１５】４．緩衝化塩溶液からの凍結乾燥 生理学的塩溶液中のＯＰの調製物もまたマトリックスを
渦巻き撹拌しそして骨形成活性のある材料を生産するた
めに凍結乾燥する。
渦巻き撹拌しそして骨形成活性のある材料を生産するた
めに凍結乾燥する。
【０１１６】これらの方法はまた、持続された放出の目
的のために他の活性のある治療剤、ホルモン、およびさ
まざまな生物的に活性のある成分を吸着させるために使
用されうる。
的のために他の活性のある治療剤、ホルモン、およびさ
まざまな生物的に活性のある成分を吸着させるために使
用されうる。
【０１１７】Ｖ．バイオアッセイ さまざまなマトリックスの機能はin vivoにおけるラッ
トのバイオアッセイにより評価される。ラットにおける
研究は、適切なマトリックス中での骨形成の効果が、マ
トリックス内に分散された骨形成蛋白質の量に依存して
いることを示している。もしもマトリックスだけが移植
されたならば、活性は観察されない。もしも上に開示さ
れたように処理されずに移植されたときは、文献に記述
されたタイプの脱イオン化され、グアニジン抽出された
異種性の骨マトリックス材料はキャリアーとして効果が
なく、骨を誘導できず、そして炎症性の免疫応答を生じ
る。多くの同種型マトリックス材料もまたキャリアーと
して有効でない。以下は、対照マトリックスおよび上で
述べられたように調製されたマトリックス材料から骨形
成具を作成するために、およびそれらの骨形成の利用性
を評価するためにさまざまな方法を示す。
トのバイオアッセイにより評価される。ラットにおける
研究は、適切なマトリックス中での骨形成の効果が、マ
トリックス内に分散された骨形成蛋白質の量に依存して
いることを示している。もしもマトリックスだけが移植
されたならば、活性は観察されない。もしも上に開示さ
れたように処理されずに移植されたときは、文献に記述
されたタイプの脱イオン化され、グアニジン抽出された
異種性の骨マトリックス材料はキャリアーとして効果が
なく、骨を誘導できず、そして炎症性の免疫応答を生じ
る。多くの同種型マトリックス材料もまたキャリアーと
して有効でない。以下は、対照マトリックスおよび上で
述べられたように調製されたマトリックス材料から骨形
成具を作成するために、およびそれらの骨形成の利用性
を評価するためにさまざまな方法を示す。
【０１１８】移植 本明細書に引用して取り入れられている、Sampath and
Reddi (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80：6591-
6595）により記述されている骨の誘導のバイオアッセイ
は、軟骨性骨の分化の活性を監視するために使用でき
る。このアッセイは、エーテルの知覚麻痺下における受
容ラットの皮下部位への異種性のウシ試験サンプルを移
植することからなる。オスのLong-Evansラット、28−32
日齢、を使用した。水平な切れ込み（１cm）を胸部の領
域の上の皮膚に滅菌状態でつくり、そしてくぼみを鋭い
切開によりつくる。約25mgの試験サンプルをくぼみの中
に深く移植しそして切れ込みを金属製の皮膚クリップで
閉じる。移植の日を実験の日と呼ぶ。移植片は12日目に
除去した。従属栄養の部位は、独立栄養部位の使用によ
り起こりうるあいまいさなしに骨の誘導の研究を可能と
する。
Reddi (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80：6591-
6595）により記述されている骨の誘導のバイオアッセイ
は、軟骨性骨の分化の活性を監視するために使用でき
る。このアッセイは、エーテルの知覚麻痺下における受
容ラットの皮下部位への異種性のウシ試験サンプルを移
植することからなる。オスのLong-Evansラット、28−32
日齢、を使用した。水平な切れ込み（１cm）を胸部の領
域の上の皮膚に滅菌状態でつくり、そしてくぼみを鋭い
切開によりつくる。約25mgの試験サンプルをくぼみの中
に深く移植しそして切れ込みを金属製の皮膚クリップで
閉じる。移植の日を実験の日と呼ぶ。移植片は12日目に
除去した。従属栄養の部位は、独立栄養部位の使用によ
り起こりうるあいまいさなしに骨の誘導の研究を可能と
する。
【０１１９】細胞の変化 移植の成功は：(１)一日目の多核性白血球による一過的
な浸潤；(２)二日目および三日目の間充組織細胞の遊走
および増殖；(３)五日目および六日目の軟骨細胞の出
現；(４)七日目の軟骨のマトリックスの形成；(５)八日
目の軟骨のカルシウム沈着；(６)九日目および十日目の
血管の侵入、造骨細胞の出現、および新しい骨の形成；
(７)十二日目から十八日目の造骨細胞および骨の改造の
出現および移植されたマトリックスの溶解；そして(８)
二十一日目の小骨における造血骨の骨髄分化を含むマト
リックス誘導軟骨性骨の発育の段階を経由して制御され
た発達をもたらす。その結果は、新しい骨の形は移植さ
れたマトリックスの形をとるということを表す。
な浸潤；(２)二日目および三日目の間充組織細胞の遊走
および増殖；(３)五日目および六日目の軟骨細胞の出
現；(４)七日目の軟骨のマトリックスの形成；(５)八日
目の軟骨のカルシウム沈着；(６)九日目および十日目の
血管の侵入、造骨細胞の出現、および新しい骨の形成；
(７)十二日目から十八日目の造骨細胞および骨の改造の
出現および移植されたマトリックスの溶解；そして(８)
二十一日目の小骨における造血骨の骨髄分化を含むマト
リックス誘導軟骨性骨の発育の段階を経由して制御され
た発達をもたらす。その結果は、新しい骨の形は移植さ
れたマトリックスの形をとるということを表す。
【０１２０】組織学的な評価 組織学切片の作成および染色が、移植片の骨形成の程度
を決定するために好ましい。移植片をブアン溶液で固定
し、パラフィンで包み、そして６−８μmの切片に切断
する。トルイジン ブルーあるいはヘモトキシリン／エ
オシンによる染色は軟骨性骨の究極的発育を明らかに証
明している。十二日目の移植片は、移植片が新しく誘導
された骨を含んでいるかどうかを決定するのに通常十分
である。
を決定するために好ましい。移植片をブアン溶液で固定
し、パラフィンで包み、そして６−８μmの切片に切断
する。トルイジン ブルーあるいはヘモトキシリン／エ
オシンによる染色は軟骨性骨の究極的発育を明らかに証
明している。十二日目の移植片は、移植片が新しく誘導
された骨を含んでいるかどうかを決定するのに通常十分
である。
【０１２１】生物学的マーカー アルカリ ホスファターゼ活性は骨形成のマーカーとし
て使用できる。この酵素活性は移植片のホモジェナイズ
化の後に、分光光度法により測定できる。活性はin viv
oにおいて９−10日目に最大に達しそしてその後ゆっく
りと減少する。組織学的な検査で骨の形成を示さない移
植片は、この分析条件において、ほとんどあるいは全く
アルカリ ホスファターゼ活性を示さない。この分析は
移植片がラットから除去された後に、素早く骨形成の評
価を得ることおよび定量することに有用である。あるい
は、骨の形成量は移植片のカルシウム含有量を測定する
ことにより決定され得る。
て使用できる。この酵素活性は移植片のホモジェナイズ
化の後に、分光光度法により測定できる。活性はin viv
oにおいて９−10日目に最大に達しそしてその後ゆっく
りと減少する。組織学的な検査で骨の形成を示さない移
植片は、この分析条件において、ほとんどあるいは全く
アルカリ ホスファターゼ活性を示さない。この分析は
移植片がラットから除去された後に、素早く骨形成の評
価を得ることおよび定量することに有用である。あるい
は、骨の形成量は移植片のカルシウム含有量を測定する
ことにより決定され得る。
【０１２２】結果 種々の細胞源からのおよび種々の程度に精製された（１
−５％純粋から30−90％純粋）ＯＰ１で、約25mgのマト
リックスを使用して上述のようにin vivoにおいて骨形
成活性を試験した。以下の表３は全部の３つの細胞タイ
プにおいて発現されたＯＰ１の組織学的な点数を示す。
−５％純粋から30−90％純粋）ＯＰ１で、約25mgのマト
リックスを使用して上述のようにin vivoにおいて骨形
成活性を試験した。以下の表３は全部の３つの細胞タイ
プにおいて発現されたＯＰ１の組織学的な点数を示す。
【０１２３】
【表３】
【０１２４】表３に詳細に示されている組織学的点数
は、ＯＰ１が細胞源にかかわらず活性をもち、そしてそ
の活性は天然のウシＯＰ１ににているということを表
す。骨誘導活性は高度に再現性があり、用量に依存して
いる。組換え体ＯＰ１の骨形成活性のさらなる証明は図
１０および図１１の写真により提供される。
は、ＯＰ１が細胞源にかかわらず活性をもち、そしてそ
の活性は天然のウシＯＰ１ににているということを表
す。骨誘導活性は高度に再現性があり、用量に依存して
いる。組換え体ＯＰ１の骨形成活性のさらなる証明は図
１０および図１１の写真により提供される。
【０１２５】図１０Ａ−ＦはCOS、BSC、およびCOS細胞
から発現された組換え体ＯＰ１を使用した同種型の移植
片の組織を記録した写真である。マイクログラフ（220
×に拡大）は本発明の骨形成蛋白質により誘導された完
全な発生カスケードの図による証明を提供し、このこと
はマトリックスと一緒に移植されたときに、組換え体に
より生産されたＯＰ１だけで軟骨性骨の形成を誘導する
のに十分であることを確認するものである。図１０Ａで
証明されたように、ＯＰ１を含まない同種型の移植片は
移植後１２日目に新しい骨の形成を示さない。移植され
た骨のマトリックス(m)および周辺の間充組織だけが見
られる。逆に、ＯＰ１を含んだ移植片は移植後７日目に
既に広範囲な軟骨形成の証明を示している（図１０Ｂ、
550ng BSC生産蛋白質、30％純粋）。ここで、新しく形
成された軟骨、軟骨芽細胞(Cb)、軟骨細胞(Cy)はマトリ
ックス(m)にぴったりと接触している。９日目の移植片
の軟骨の分化により、軟骨のカルシウム沈着、軟骨細胞
の肥大、血管の侵入、および新しい骨の形成の開始が全
て明らかになった（図１０Ｃ、220ng COS生産蛋白質、
約５％純粋）。キャピラリーの侵入(c)および血管内皮
の近くの好塩基性の造骨細胞の出現（矢印で示された）
は特に明らかである。移植の１２日後までに広範囲な骨
形成および改造がおきた（図１０Ｄ（220×）、および
図１０Ｅ（400×）、CHO生産蛋白質、約60％純粋）。造
骨細胞によりつくられて新しく形成された骨は多核の造
骨細胞(Oc)により改造されつつあり、移植されたマトリ
ックスは再吸収されつつあり、そして改造された骨によ
り取り替えられつつある。新しく形成された小骨の骨の
骨髄の出現もまた明らかである。最後に、小骨内部の造
血骨の骨髄の分化は、移植後22日目に観察され得る（図
１０Ｆ、500ngのBSC生産蛋白質、30％純粋）。このとき
までに、ほとんどの移植されたマトリックス(m)は再吸
収されそして赤血球および顆粒細胞系および巨核細胞を
含んだ骨の骨髄の要素で満たされた小骨を含む新しく形
成された骨により占められている。同様な組織学的な観
察が、90％よりも純粋なＯＰ１蛋白質の調製物を取り込
んだ移植片でも見られた。
から発現された組換え体ＯＰ１を使用した同種型の移植
片の組織を記録した写真である。マイクログラフ（220
×に拡大）は本発明の骨形成蛋白質により誘導された完
全な発生カスケードの図による証明を提供し、このこと
はマトリックスと一緒に移植されたときに、組換え体に
より生産されたＯＰ１だけで軟骨性骨の形成を誘導する
のに十分であることを確認するものである。図１０Ａで
証明されたように、ＯＰ１を含まない同種型の移植片は
移植後１２日目に新しい骨の形成を示さない。移植され
た骨のマトリックス(m)および周辺の間充組織だけが見
られる。逆に、ＯＰ１を含んだ移植片は移植後７日目に
既に広範囲な軟骨形成の証明を示している（図１０Ｂ、
550ng BSC生産蛋白質、30％純粋）。ここで、新しく形
成された軟骨、軟骨芽細胞(Cb)、軟骨細胞(Cy)はマトリ
ックス(m)にぴったりと接触している。９日目の移植片
の軟骨の分化により、軟骨のカルシウム沈着、軟骨細胞
の肥大、血管の侵入、および新しい骨の形成の開始が全
て明らかになった（図１０Ｃ、220ng COS生産蛋白質、
約５％純粋）。キャピラリーの侵入(c)および血管内皮
の近くの好塩基性の造骨細胞の出現（矢印で示された）
は特に明らかである。移植の１２日後までに広範囲な骨
形成および改造がおきた（図１０Ｄ（220×）、および
図１０Ｅ（400×）、CHO生産蛋白質、約60％純粋）。造
骨細胞によりつくられて新しく形成された骨は多核の造
骨細胞(Oc)により改造されつつあり、移植されたマトリ
ックスは再吸収されつつあり、そして改造された骨によ
り取り替えられつつある。新しく形成された小骨の骨の
骨髄の出現もまた明らかである。最後に、小骨内部の造
血骨の骨髄の分化は、移植後22日目に観察され得る（図
１０Ｆ、500ngのBSC生産蛋白質、30％純粋）。このとき
までに、ほとんどの移植されたマトリックス(m)は再吸
収されそして赤血球および顆粒細胞系および巨核細胞を
含んだ骨の骨髄の要素で満たされた小骨を含む新しく形
成された骨により占められている。同様な組織学的な観
察が、90％よりも純粋なＯＰ１蛋白質の調製物を取り込
んだ移植片でも見られた。
【０１２６】図１１はお湯で処理されたウシマトリック
スおよびＯＰ１（BSCで生産された）を使用した異種性
の移植片の移植後１２日目の組織学を表す顕微鏡写真で
ある。造血骨の骨髄の要素の出現は、ＯＰ１をもちいた
異種性移植の骨形成活性が同種型の移植のそれとパラレ
ルである事を表す、マイクロ写真において明らかである
（図１１と図１０Ｄおよび図１０Ｅを比較せよ）。
スおよびＯＰ１（BSCで生産された）を使用した異種性
の移植片の移植後１２日目の組織学を表す顕微鏡写真で
ある。造血骨の骨髄の要素の出現は、ＯＰ１をもちいた
異種性移植の骨形成活性が同種型の移植のそれとパラレ
ルである事を表す、マイクロ写真において明らかである
（図１１と図１０Ｄおよび図１０Ｅを比較せよ）。
【０１２７】ＯＰ１のマトリックスの移植により示され
そして図１０および図１１において明らかにされた細胞
の変化は、胎児の発生の間に起こる軟骨性骨の分化に本
当ににている。軟骨性骨の分化は優勢なルートであった
が、移植片の外側の表面の膜内部の骨の形成の証明もあ
る。
そして図１０および図１１において明らかにされた細胞
の変化は、胎児の発生の間に起こる軟骨性骨の分化に本
当ににている。軟骨性骨の分化は優勢なルートであった
が、移植片の外側の表面の膜内部の骨の形成の証明もあ
る。
【０１２８】図１２および図１３は本発明の同種型の移
植片（図１２）および本発明の異種性移植（図１３）の
アルカリホスファターゼ特異的活性およびカルシウム含
有量により決定されるような、移植後１２日目の骨形成
活性の用量依存性を表す。すべての場合において、ＯＰ
１蛋白質の濃度（イムノブロット染色あるいはゲルスキ
ャニングにより定量された）はナノグラムで表されてい
る。それぞれの場合において、骨の誘導活性はすべての
細胞において用量依存的にＯＰ１に対して特異的であ
る。
植片（図１２）および本発明の異種性移植（図１３）の
アルカリホスファターゼ特異的活性およびカルシウム含
有量により決定されるような、移植後１２日目の骨形成
活性の用量依存性を表す。すべての場合において、ＯＰ
１蛋白質の濃度（イムノブロット染色あるいはゲルスキ
ャニングにより定量された）はナノグラムで表されてい
る。それぞれの場合において、骨の誘導活性はすべての
細胞において用量依存的にＯＰ１に対して特異的であ
る。
【０１２９】本発明はその精神または必須の特性から離
れることない他の特定の形で具体化されうる。したがっ
て本明細書中の態様はすべての面において例示的な限定
されないものとして考えられ、本発明の範囲は前述の記
述よりもむしろ添付された請求の範囲により決定され、
請求の範囲と均等の目的および範囲内において生じるす
べての変化はしたがってここに包含されることを意図さ
れている。
れることない他の特定の形で具体化されうる。したがっ
て本明細書中の態様はすべての面において例示的な限定
されないものとして考えられ、本発明の範囲は前述の記
述よりもむしろ添付された請求の範囲により決定され、
請求の範囲と均等の目的および範囲内において生じるす
べての変化はしたがってここに包含されることを意図さ
れている。
【０１３０】
配列番号：１ 配列の長さ：１３９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列
【０１３１】配列番号：２ 配列の長さ：１３２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列
【０１３２】配列番号：３ 配列の長さ：１１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列
【０１３３】配列番号：４ 配列の長さ：１１７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列
【０１３４】配列番号：５ 配列の長さ：１１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列
【０１３５】配列番号：６ 配列の長さ：１１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列
【０１３６】配列番号：７ 配列の長さ：１８２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ ハイポセティカル：なし アンチセンス：なし 起源 生物名：ウシ 組織の種類：骨 直接の起源 ライブラリー名：ヒト胎盤 配列
【０１３７】
【０１３８】
【０１３９】
【０１４０】
本発明自身、さらにそのさまざまな特徴、本発明の前述
のおよび他の目的は添付の図面とともに解釈されると
き、以下の説明からより完全に理解される。
のおよび他の目的は添付の図面とともに解釈されると
き、以下の説明からより完全に理解される。
【図１Ａ】脱イオン化され、脱脂されたラットの骨コラ
ーゲン粒子の電子顕微鏡写真（5000x）である。
ーゲン粒子の電子顕微鏡写真（5000x）である。
【図１Ｂ】脱イオン化され、脱脂されたウシの骨コラー
ゲン粒子の電子顕微鏡写真（5000x）である。
ゲン粒子の電子顕微鏡写真（5000x）である。
【図２Ａ】ヒトＯＰ１遺伝子のプレプロフォームの完全
長のｃＤＮＡおよびコードされるアミノ酸配列（Seq. I
D No.７）を表す図である。
長のｃＤＮＡおよびコードされるアミノ酸配列（Seq. I
D No.７）を表す図である。
【図２Ｂ】図２Ａの続きを示す図である。
【図３Ａ】ＯＰ１の哺乳動物細胞における発現のために
考案されたさまざまな発現ベクターの制限地図を示す図
である。
考案されたさまざまな発現ベクターの制限地図を示す図
である。
【図３Ｂ】ＯＰ１の哺乳動物細胞における発現のために
考案されたさまざまな発現ベクターの制限地図を示す図
である。
考案されたさまざまな発現ベクターの制限地図を示す図
である。
【図３Ｃ】ＯＰ１の哺乳動物細胞における発現のために
考案されたさまざまな発現ベクターの制限地図を示す図
である。
考案されたさまざまな発現ベクターの制限地図を示す図
である。
【図３Ｄ】ＯＰ１の哺乳動物細胞における発現のために
考案されたさまざまな発現ベクターの制限地図を示す図
である。
考案されたさまざまな発現ベクターの制限地図を示す図
である。
【図３Ｅ】ＯＰ１の哺乳動物細胞における発現のために
考案されたさまざまな発現ベクターの制限地図を示す図
である。
考案されたさまざまな発現ベクターの制限地図を示す図
である。
【図３Ｆ】ＯＰ１の哺乳動物細胞における発現のために
考案されたさまざまな発現ベクターの制限地図を示す図
である。
考案されたさまざまな発現ベクターの制限地図を示す図
である。
【図４】ＣＯＳ細胞−(Ａ)pH717，(Ｂ)pH731；ＣＨＯ細
胞−(Ｃ)pH754，(Ｄ)pH752およびBSC細胞−(Ｅ)pH717，
(Ｆ)pW24；から発現されたＯＰ１を比較するウエスタン
ブロット（イムノブロット）を示す電気泳動写真であ
る。
胞−(Ｃ)pH754，(Ｄ)pH752およびBSC細胞−(Ｅ)pH717，
(Ｆ)pW24；から発現されたＯＰ１を比較するウエスタン
ブロット（イムノブロット）を示す電気泳動写真であ
る。
【図５Ａ−１】ＢＳＣ細胞から発現され、Ｓ−セファロ
ースで精製されたＯＰ１の溶出図である。
ースで精製されたＯＰ１の溶出図である。
【図５Ｂ−１】ＢＳＣ細胞から発現され、フェニルセフ
ァロースで精製されたＯＰ１の溶出図である。
ァロースで精製されたＯＰ１の溶出図である。
【図５Ｃ−１】ＢＳＣ細胞から発現され、Ｃ−１８カラ
ムで精製されたＯＰ１の溶出図である。
ムで精製されたＯＰ１の溶出図である。
【図５Ａ−２】ＢＳＣ細胞から発現され、Ｓ−セファロ
ースで精製されたＯＰ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの電気
泳動写真である。
ースで精製されたＯＰ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの電気
泳動写真である。
【図５Ｂ−２】ＢＳＣ細胞から発現され、フェニルセフ
ァロースで精製されたＯＰ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの
電気泳動写真である。
ァロースで精製されたＯＰ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの
電気泳動写真である。
【図５Ｃ−２】ＢＳＣ細胞から発現され、Ｃ−１８カラ
ムで精製されたＯＰ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの電気泳
動写真である。
ムで精製されたＯＰ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの電気泳
動写真である。
【図６】ヂチオスレイトールで還元後（18kD，レーン
５）の酸化状態の完全なダイマー（36kD，レーン１）お
よび対応するモノマーと分子量スタンダード（レーン２
−４）を比較したＢＳＣ細胞から精製されたＯＰ１のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動写真である。
５）の酸化状態の完全なダイマー（36kD，レーン１）お
よび対応するモノマーと分子量スタンダード（レーン２
−４）を比較したＢＳＣ細胞から精製されたＯＰ１のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動写真である。
【図７Ａ】水中で37℃において熱処理された、脱イオン
化され、脱脂されたウシの骨のマトリックスの走査電子
顕微鏡写真（約1000x）である。
化され、脱脂されたウシの骨のマトリックスの走査電子
顕微鏡写真（約1000x）である。
【図７Ｂ】水中で45℃において熱処理された、脱イオン
化され、脱脂されたウシの骨のマトリックスの走査電子
顕微鏡写真（約1000x）である。
化され、脱脂されたウシの骨のマトリックスの走査電子
顕微鏡写真（約1000x）である。
【図７Ｃ】水中で55℃において熱処理された、脱イオン
化され、脱脂されたウシの骨のマトリックスの走査電子
顕微鏡写真（約1000x）である。
化され、脱脂されたウシの骨のマトリックスの走査電子
顕微鏡写真（約1000x）である。
【図７Ｄ】水中で65℃において熱処理された、脱イオン
化され、脱脂されたウシの骨のマトリックスの走査電子
顕微鏡写真（約1000x）である。
化され、脱脂されたウシの骨のマトリックスの走査電子
顕微鏡写真（約1000x）である。
【図８】湯で処理された子ウシのマトリックスから単離
された抽出物の214nmにおける吸光の記録を示すグラフ
であり、個々の画分はin vivoの骨の形成への阻害効果
を同定した。
された抽出物の214nmにおける吸光の記録を示すグラフ
であり、個々の画分はin vivoの骨の形成への阻害効果
を同定した。
【図９Ａ】お湯で処理されたマトリックスの抽出物のＯ
Ｐ１活性に対する阻害効果をアルカリホスファターゼ活
性を抽出溶媒の濃度の増加との関連で測定することによ
り表した棒グラフである。
Ｐ１活性に対する阻害効果をアルカリホスファターゼ活
性を抽出溶媒の濃度の増加との関連で測定することによ
り表した棒グラフである。
【図９Ｂ】お湯で処理されたマトリックスの抽出物のＯ
Ｐ１活性に対する阻害効果を１２日目の移植片のカルシ
ウム含有量を抽出溶媒の濃度の増加との関連で測定する
ことにより表した棒グラフである。
Ｐ１活性に対する阻害効果を１２日目の移植片のカルシ
ウム含有量を抽出溶媒の濃度の増加との関連で測定する
ことにより表した棒グラフである。
【図１０Ａ】ＣＯＳ，ＢＳＣおよびＣＨＯ細胞から発現
され、そして軟骨形成の発生カスケードに続くＯＰ１の
同種の移植片の光学顕微鏡写真（200×）である。
され、そして軟骨形成の発生カスケードに続くＯＰ１の
同種の移植片の光学顕微鏡写真（200×）である。
【図１０Ｂ】ＣＯＳ，ＢＳＣおよびＣＨＯ細胞から発現
され、そして軟骨形成の発生カスケードに続くＯＰ１の
同種の移植片の光学顕微鏡写真（200×）である。
され、そして軟骨形成の発生カスケードに続くＯＰ１の
同種の移植片の光学顕微鏡写真（200×）である。
【図１０Ｃ】ＣＯＳ，ＢＳＣおよびＣＨＯ細胞から発現
され、そして軟骨形成の発生カスケードに続くＯＰ１の
同種の移植片の光学顕微鏡写真（200×）である。
され、そして軟骨形成の発生カスケードに続くＯＰ１の
同種の移植片の光学顕微鏡写真（200×）である。
【図１０Ｄ】ＣＯＳ，ＢＳＣおよびＣＨＯ細胞から発現
され、そして軟骨形成の発生カスケードに続くＯＰ１の
同種の移植片の光学顕微鏡写真（200×）である。
され、そして軟骨形成の発生カスケードに続くＯＰ１の
同種の移植片の光学顕微鏡写真（200×）である。
【図１０Ｅ】ＣＯＳ，ＢＳＣおよびＣＨＯ細胞から発現
され、そして軟骨形成の発生カスケードに続くＯＰ１の
同種の移植片の光学顕微鏡写真（200×）である。
され、そして軟骨形成の発生カスケードに続くＯＰ１の
同種の移植片の光学顕微鏡写真（200×）である。
【図１０Ｆ】ＣＯＳ，ＢＳＣおよびＣＨＯ細胞から発現
され、そして軟骨形成の発生カスケードに続くＯＰ１の
同種の移植片の光学顕微鏡写真（200×）である。
され、そして軟骨形成の発生カスケードに続くＯＰ１の
同種の移植片の光学顕微鏡写真（200×）である。
【図１１】ＢＳＣ細胞から発現されたＯＰ１およびお湯
で処理された外因性ウシマトリックスを使用した本発明
の異種性移植物の組織構造（１２日目）の光学顕微鏡写
真である。
で処理された外因性ウシマトリックスを使用した本発明
の異種性移植物の組織構造（１２日目）の光学顕微鏡写
真である。
【図１２】ＣＯＳ，ＢＳＣおよびＣＨＯ細胞から発現さ
れたＯＰ１を含む同種移植片のアルカリホスファターゼ
活性およびカルシウム含有量により測定された１２日目
の同種移植片の薬剤量依存性を表すグラフである。
れたＯＰ１を含む同種移植片のアルカリホスファターゼ
活性およびカルシウム含有量により測定された１２日目
の同種移植片の薬剤量依存性を表すグラフである。
【図１３Ａ】ＣＯＳおよびＢＳＣ細胞において発現され
たＯＰ１の薬剤量に対する依存性を蛋白質の濃度の増加
に対する（ngで表される薬剤量曲線）アルカリホスファ
ターゼ活性を測定することにより表した棒グラフであ
る。
たＯＰ１の薬剤量に対する依存性を蛋白質の濃度の増加
に対する（ngで表される薬剤量曲線）アルカリホスファ
ターゼ活性を測定することにより表した棒グラフであ
る。
【図１３Ｂ】ＣＯＳおよびＢＳＣ細胞において発現され
たＯＰ１の薬剤量に対する依存性を蛋白質の濃度の増加
に対する（ngで表される薬剤量曲線）異種性移植片（１
２日目）におけるカルシウム含有量を測定することによ
り表した棒グラフである。
たＯＰ１の薬剤量に対する依存性を蛋白質の濃度の増加
に対する（ngで表される薬剤量曲線）異種性移植片（１
２日目）におけるカルシウム含有量を測定することによ
り表した棒グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 595148888 2725 Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ Ｒｏａｄ，Ｋ ａｌａｍａｚｏｏ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｕ ｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅ ｒｉｃａ (72)発明者 デーヴィッド・シー ルージャー アメリカ合衆国マサチューセッツ州02132, ウエスト・ロックスベリー，エッジミア・ ロード 150，アパートメント ４ (72)発明者 エンジン オズカイナック アメリカ合衆国マサチューセッツ州01757, ミルフォード，パーデュー・ドライブ 44 (72)発明者 ロイ・エイチ・エル パング アメリカ合衆国マサチューセッツ州02053, メドウェイ，キンバリー・ドライブ 16
Claims (1)
- 【請求項１】 活性な骨形成蛋白質を生産する方法であ
って、該骨形成蛋白質は、酸化状態で結合している一対
のポリペプチド鎖を含み、該一対のポリペプチド鎖は軟
骨性骨形成を誘導し得る構造のダイマー種を形成し、該
一対のポリペプチド鎖の少なくとも一方は、１１４また
はそれ以上のアミノ酸を有し、かつ、(i)以下のアミノ
酸配列： または(ii)該アミノ酸配列と少なくとも70％の配列相同
性を有するポリペプチドを含み、以下の工程： （ａ）該ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列
を含む遺伝物質を提供する工程； （ｂ）該遺伝物質を宿主細胞へ導入する工程；および （ｃ）該宿主細胞内の該遺伝物質を発現させる工程を包
含する、方法。
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