JPH0965887A - ブタ補体インヒビターをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ブタ補体インヒビターをコードするＤＮＡ、
それから発現されるブタ補体インヒビター及び補体イン
ヒビターのスクリーニング方法を提供する。 【解決手段】 ブタ血管内皮細胞からｃＤＮＡライブラ
リーを作製し、スクリーニングすることによりブタ補体
インヒビターをコードするｃＤＮＡを単離し、その塩基
配列を決定した。得られたｃＤＮＡを用いて、ブタ補体
インヒビターを遺伝子組換技術で生産することができ
る。また、ブタ補体インヒビターのプロモーター領域の
解析にも有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はブタ補体インヒビタ
ーをコードするＤＮＡに関する。より詳細は、ブタ補体
活性を抑制するインヒビター蛋白をコードするＤＮＡ、
それから発現されるブタ補体インヒビター蛋白及び補体
インヒビター遺伝子のスクリーニング方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、臓器移植は各国で広く行われてお
り、特に優れた免疫抑制剤（シクロスポリン、ＦＫ５０
６など）の開発により、ヒトからヒトへの臓器移植の拒
絶反応は解決された。しかし、臓器提供者（ドナー）の
不足が深刻な問題となっている。このような問題から、
動物臓器のヒトへの移植、即ち異種移植が研究されてい
る。例えば、欧米では年間約３５００例の心臓移植が行
われているものの、この例数は心臓移植を必要としてい
る患者の約２〜３割にしか満たないのが現状である。ド
ナー動物として、ヒトの近縁種（例えば、ヒヒ、チンパ
ンジーなどの霊長類）を用いることは、ドナー動物数が
少ないことや知能の高いことによる倫理的な点から問題
が多い。それに対して、家畜をドナー動物とする場合に
は問題が少ない。特に、ブタは大量に飼育されており供
給が容易であること、ブタの臓器の大きさはヒトの臓器
に近いこと、系統の保存などの基盤が確立されているこ
となどの利点を有し、ブタの臓器をヒトに移植する研究
が行われている。ブタの臓器をヒトに移植した場合に生
じる拒絶反応のうち、ＭＨＣの関与する細胞性免疫によ
る急性の拒絶反応(Acute rejection)は、ブタとヒトで
は遠縁種の関係にあり、ＭＨＣの類似性がないので、起
こり難いと予測されている。また、万一、このような拒
絶反応が生じた場合でも、上述の優れた免疫抑制剤の使
用により、回避できると考えられている。しかし、ヒト
の血中にはブタに対する抗体が既に存在する（自然抗体
と称される）。その結果、ブタの組織がヒトに移植され
ると、ヒト血中の自然抗体がブタの組織（抗原）を認識
し、抗原・抗体複合体が形成され、この抗原・抗体複合
体がヒトの補体を活性化し、活性化されたヒトの補体が
移植されたブタの組織を壊死させる（拒絶）。このよう
な現象は、移植後速やかに（１時間以内）に起こるの
で、超急性拒絶(Hyperacute rejection)と呼ばれてい
る。

【０００３】補体の活性化による超急性拒絶を抑制する
薬剤は開発されていない。ヒトの組織はヒトの補体によ
る損傷を受けない。これは、ヒトの組織には補体の活性
化反応を抑制する因子が発現しているからであり、この
因子は補体インヒビター（又は補体制御因子）と称され
ている。補体インヒビターとしては、ＤＡＦ(Decay acc
elating factor, CD55)、ＭＣＰ(Membrane cofactor pr
otein, CD46)、ＣＤ５９の３つが重要である。なお、Ｄ
ＡＦ及びＭＣＰはＣ３ｂ及びＣ３／Ｃ５転換酵素の崩壊
亢進により、ＣＤ５９はＣ９ステップの阻害により補体
の活性化を阻止すると考えられている。補体インヒビタ
ーは種による特異性があり、ブタ補体インヒビターはブ
タの補体活性を阻止することはできても、ヒトの補体活
性を阻止することはできない。そのため、ブタの組織が
ヒトに移植されてヒトの補体系が活性化されたとき、ブ
タの補体インヒビターではそれを抑制することはできな
い。その結果、ヒトに移植されたブタ組織は壊死するこ
とになる。

【０００４】前記のような、ブタの臓器をヒトに移植す
る際の問題点を解決するには、遺伝子工学的方法によ
り、ブタの臓器にヒトの補体インヒビターを予め発現さ
せておけばよい。ブタの心臓を移植する場合には、ブタ
の血管内皮細胞にヒトの補体インヒビターを予め発現さ
せておけばよい。このような観点から、ヒトの補体イン
ヒビター遺伝子を組み込んだ遺伝子組換ブタ（トランス
ジェニックブタ）の研究が盛んに行われている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、ヒト補
体インヒビターを組み込んだトランスジェニックブタを
用いて、異種移植を行うことが研究されている。現在の
ところ、このトランスジェニックブタ作製に使用されて
いるプロモーターはヒト補体インヒビター由来のもの又
はウイルス由来のものが用いられている。しかし、補体
インヒビターのブタでの発現には、ブタ由来の補体イン
ヒビターのプロモーターがより有効であると考えられ
る。そこで、上記のプロモーターを獲得するためには、
まず、ブタ補体インヒビターのｃＤＮＡを得る必要があ
る。しかしながら、いままでブタ補体インヒビターのｃ
ＤＮＡについては知られていない。本発明者等は、かか
る観点から、ブタ補体インヒビターのｃＤＮＡの発現ク
ローニングを行ったところ、細胞にブタ補体に対する抵
抗性を付与し、ヒトＭＣＰに高い相同性を示すｃＤＮＡ
を得た。また、この過程で、新たなｃＤＮＡライブラリ
ーのスクリーニング方法を見出した。本発明はかかる知
見に基づいてなされたもので、本発明はブタ補体インヒ
ビターのｃＤＮＡ、それから発現されるブタ補体インヒ
ビター蛋白及び補体インヒビター遺伝子のスクリーニン
グ方法を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明は、 配列番号１で示される塩基配列又はこの塩基配列の一
部からなるＤＮＡ； 配列番号１で示される塩基配列の第５９番目から第１
１４７番目までの配列からなるＤＮＡ又はこの配列を有
するＤＮＡ； 配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるブタ補体
インヒビター； 配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａ又はこの塩基配列を有するＤＮＡ； ｃＤＮＡライブラリーを宿主に導入した後、宿主に対
する抗体及び補体成分を加え、生存宿主を分離すること
からなる補体インヒビター遺伝子を有するクローンのス
クリーニング方法；に関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下、本発明をより詳細に説明す
る。本発明にかかる配列番号１に示される塩基配列は、
ブタ補体インヒビターをコードするｃＤＮＡ（以下、ｐ
ＭＣＰｃＤＮＡという）であり、かかるｃＤＮＡは、例
えば、以下の方法により調製することができる。

【０００８】まず、ｍＲＮＡの調製を行う。ｍＲＮＡの
調製は常法に準じて行うことができ、例えば、ブタ補体
インヒビターを発現している細胞、組織などから通常の
方法、例えば、グアニジウムチオシアネート法、ホット
フェノール法、リチウム塩を用いる方法などを用いて全
ＲＮＡを抽出し、得られたＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セル
ロースカラムに通すことによりｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）を調製することができる。なお、この工程
で、抽出細胞としては、補体インヒビターの高発現部位
と考えられるブタ血管内皮細胞を用いるのが好ましく、
ブタ血管内皮初代培養株又はブタ血管内皮樹立細胞株Ｐ
ＡＥ細胞(J. Biol. Chem. 262, 4098, 1987参照)が好適
に使用される。

【０００９】次に、ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡからのｃＤ
ＮＡの合成は、通常の方法（例えば、Gublerら、Gene,
25, 263, 1983)又は市販のｃＤＮＡ合成キット（例え
ば、ファルマシア社製、アマシャム社製、ベーリンガー
・マンハイム社製等）を利用して行うことができる。得
られたｃＤＮＡは、必要に応じて長塩基対のものを分別
した後、常法に準じファージベクターであるλｇｔ１１
に挿入したり、又は適当なプラスミドベクターに挿入す
ることによりｃＤＮＡライブラリーを調製する。

【００１０】かくして調製されたｃＤＮＡライブラリー
からｐＭＣＰｃＤＮＡのクローニングを行う。ｐＭＣＰ
ｃＤＮＡのクローニングは、慣用のプラークハイブリダ
イゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法、
標識化特異抗体を用いる方法などにより行うことができ
るが、本発明者らは、抗補体活性による新たなスクリー
ニング法を見出しており、この方法が好適に用いられ
る。即ち、ｃＤＮＡライブラリーを適当な細胞に挿入し
た後、当該細胞に対する抗体（抗血清）及び補体成分
（目的種の血清、この場合にはブタ血清）を加え補体活
性を刺激し、抗補体作用を有する細胞を選択することに
より、目的とするｃＤＮＡを含む細胞のクローニングを
行うことができる。より詳細には、後記の実施例に示さ
れるように、プラスミドベクターライブラリーを常法に
準じてヒトリンパ芽球細胞ＪＹ２５細胞(J. Immunology
141, 4283, 1988参照)に導入し、抗生物質含有培地で
培養することにより細胞の予備選択を行う。なお、プラ
スミドベクターは抗抗生物質遺伝子を含んでいるので、
当該ベクターが導入された細胞は抗生物質含有培地中で
も生存・増殖することができる。抗生物質含有培地によ
る予備選択は、細胞の選択性を高めるために行われる
が、場合によっては省略することもできる。次いで、予
備選択された細胞に抗ＪＹ２５抗体（抗血清）及び補体
成分（目的種の血清、この場合にはブタ血清）を添加し
て補体活性を刺激する。ｐＭＣＰ遺伝子を含むプラスミ
ドが導入されている細胞は、細胞中で補体インヒビター
が発現されており、補体の活性化が阻害されるので、当
該細胞は生存することができる。この抗生物質含有培地
による選択及び補体による選択を繰り返すことにより、
目的とするｃＤＮＡ（ｐＭＣＰｃＤＮＡ）を含む細胞の
クローンを得ることができる。この方法によれば、ブタ
補体インヒビター（ｐＭＣＰ及びそれ以外のブタ補体イ
ンヒビター）のｃＤＮＡを容易に採取することができ
る。また、ブタ以外にも、この方法を各種動物のｃＤＮ
Ａライブラリーに適用することにより、各種動物の補体
インヒビターのｃＤＮＡを採取することができる。

【００１１】かくして選別されたクローンからのｐＭＣ
ＰｃＤＮＡ（又はその一部を含むｃＤＮＡ断片）の単離
は、慣用のｃＤＮＡ単離法に準じて行うことができ、更
に必要に応じて当該ｃＤＮＡをサブクローニングし、ｐ
ＭＣＰｃＤＮＡ（又はその一部）を単離してもよい。な
お、得られたＤＮＡが、ｐＭＣＰｃＤＮＡの一部を含む
ｃＤＮＡである場合には、当該ＤＮＡをプローブとし
て、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることに
より、全長のｐＭＣＰｃＤＮＡを有するクローンを選別
することができる。得られたｐＭＣＰｃＤＮＡの塩基配
列は、例えば、ジデオキシ法などの慣用の方法又は市販
のＤＮＡシークエンサー（例えば、アプライドバイオシ
ステムズ社製）を用いて決定することができる。

【００１２】上述の方法により、ｐＭＣＰｃＤＮＡのク
ローニング及び塩基配列の決定を行うことができ、後記
の実施例で得られたｐＭＣＰｃＤＮＡは１３６５ｂｐの
塩基長(配列番号１)を有し、ブタ補体インヒビターをコ
ードする領域は１０８９ｂｐであった。そして、そのう
ち、約６００ｂｐの翻訳領域ではヒトＭＣＰｃＤＮＡと
高い相同性（約７０％）を示した。配列番号１の塩基配
列より推定されるブタ補体インヒビターの総アミノ酸数
は３６３残基（配列番号２）であった。

【００１３】かくして得られたｐＭＣＰｃＤＮＡは、そ
れを用いた慣用の遺伝子工学的方法により、十分量のブ
タ補体インヒビターを生産することが可能となるので、
ブタ補体インヒビターの生産に有用である。例えば、ｐ
ＭＣＰｃＤＮＡを、適当なベクターに組み込んで発現ベ
クターを調製し、これを適当な宿主に導入して得た組換
体を培養することによりブタ補体インヒビターを得るこ
とができる。なお、ベクターに組み込むＤＮＡ断片とし
て、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡ断片又はそれを含むＤＮＡ断片を用いてもよい。ベ
クターとしては、必要に応じて、発現のために必要なプ
ロモター、ＳＤ配列、ターミネター、エンハンサー、各
種マーカーなどを有するものを用いることができ、また
宿主としては、例えば、大腸菌、枯草菌等の細菌、酵母
等の微生物、動植物細胞などを用いることができる。な
お、宿主細胞の種類により、目的ペプチドの糖鎖の種類
やグリコシル化度の異なるものが産生されること；宿主
細胞中で発現された前駆体ペプチドのＮ及び／又はＣ末
端アミノ酸配列がシグナル・ペプチダーゼなどによりプ
ロセッシングを受け、種々の末端アミノ酸配列を有する
ペプチドが得られることなどは、当業者において周知で
ある。

【００１４】また、配列番号２に示されるアミノ酸配列
からなる本発明のブタ補体インヒビターは、ブタの補体
の活性化を阻止する作用を有しており、またヒト補体の
活性化に対しても阻止性を有しており、補体の活性化を
阻害する薬剤として有用である。なお、配列番号２に示
されるアミノ酸配列からなる本発明のブタ補体インヒビ
ターに関し、当該インヒビターと実質的に同効である限
り、そのアミノ酸配列の一部が欠失又は他のアミノ酸に
より置換されていたり、他のアミノ酸配列が一部挿入さ
れていたり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に１又は２以上の
アミノ酸が結合していたり、あるいは糖鎖が同様に欠失
又は置換されていてもよい。

【００１５】

【発明の効果】以上のように、本発明のｐＭＣＰｃＤＮ
Ａを用いることにより、ブタ補体インヒビターを遺伝子
工学的に生産することが可能となり、十分量のブタ補体
インヒビターを提供することができる。ｐＭＣＰｃＤＮ
Ａ塩基配列よりブタ補体インヒビターのアミノ酸配列を
決定することができるので、このアミノ酸配列からブタ
補体インヒビターをコードするＤＮＡを合成することが
でき、これを用いてもブタ補体インヒビターを遺伝子工
学的に生産することが可能である。遺伝子工学的方法に
よれば、天然に存在する蛋白質のアミノ酸配列のみなら
ず、塩基配列を修飾することにより、一又は二以上のア
ミノ酸の置換、挿入、欠失した蛋白質や、他の蛋白との
融合蛋白質を生産することができる。更に、本発明のｐ
ＭＣＰｃＤＮＡは、ブタ補体インヒビターのプロモータ
ー領域の解析に有用である。また、本発明のスクリーニ
ング方法によれば、各種動物の補体インヒビターのｃＤ
ＮＡを容易に採取することができる。

【００１６】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に
説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものでは
ない。

【００１７】実施例１１）ブタ血管内皮細胞からの全ＲＮＡ抽出とｐｏｌｙ
（Ａ）⁺ＲＮＡの精製 ブタ血管内皮細胞初代培養株又はＰＡＥ細胞（１×１０
⁸細胞）を１５ｃｍシャーレ１０枚に加え、更に５．５
Ｍ ＧＴＣ（グアニジンチオシアネート）溶液を３ｍｌ
／シャーレに添加した。この際、溶液は多量のＤＮＡの
ため粘性を有するが、１８ゲージの注射針のついたシリ
ンジ（３０ｍｌ）にて溶液の吸引排出を２０〜３０回繰
り返すことによりＤＮＡを細断し、粘性を低下させた。
次いで、高速遠心（８００ｒｐｍ）して残渣を除去し、
上清をポリアロマーチューブ（４０ｍｌ）に入れたＣｓ
ＴＦＡ溶液（１７ｍｌ）の上に重層し一晩超遠心した。
上部のＧＴＣ層と中間のＤＮＡ層をそっと取り除き、残
りは廃棄した。チューブを逆さまにし余分な水分を取り
除き、チューブの底から２ｃｍを切取り氷の上に置い
た。チューブの底のＲＮＡをブルーチップの先で擦り取
り、６００μｌの４Ｍ ＧＴＣ溶液に溶かし込んだ。軽
く遠心し、不溶物を落した。６００μｌ当たり１５μｌ
の１Ｍ酢酸と４５０ｍｌのエタノールを加え、−２０℃
で３時間以上冷した後マイクロチューブ中（４℃）１０
分間遠心した。

【００１８】上清を除き、ＲＮＡを１ｍｌの新しく調製
したＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、ｐＨ８．０）に迅速に溶解した。軽く遠心し、
上清を採取した。上清３３０μｌ当たり１３μｌの２Ｍ
ＮａＣｌを加え、−２０℃で数時間以上冷却して、全
ＲＮＡを調製した。全ＲＮＡからのｐｏｌｙ（Ａ）⁺Ｒ
ＮＡ（ｍＲＮＡ）の分離精製は、クロンテック社のｍＲ
ＮＡ精製キット（原理はオリゴ（ｄＴ）−セルロースカ
ラムを用いたアフィニティーグロマトグラフィー）を使
用して行った。即ち、ｄＴ樹脂を充填したカラムを洗浄
用緩衝液で数回洗浄し、その後サンプルを乗せ、再度洗
浄用緩衝液で洗浄し、次いで溶出用緩衝液でｄＴ樹脂に
付いていたＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を溶出し、エタノール沈
殿後ｃＤＮＡの調製に使用した。

【００１９】２）ｃＤＮＡライブラリー作製 上記で得られたｍＲＮＡ（４μｇ）に蒸留水を加えて１
７μｌにし、６８℃で５分間加熱した。氷上で１０分間
冷却した後、以下のものを加えた。 x5 ファースト ストランド緩衝液 6 μl 0.1M DTT 3 μl RNasin 1 μl リンカープライマー(1.6μg/μl) 3.3 μl dNTP溶液 (10mM) 2 μl 添加後、速やかに撹拌し、次いで４３℃２分間放置し、
Super scriptIIを添加し、４３℃で１時間インキュベー
トした後、氷上に置いた。次いで、上記の反応液に氷上
で下記のものを添加した。 ddH₂O 134.3 μl x5 セカンド ストランド緩衝液 48 μl dNTP溶液 (10mM) 4 μl 0.1M DTT 9 μl 氷上で５分間放置し、以下のもの添加した。 DNAポリメラーゼ I (5U/μl) 12 μl RNaseH (1.5U/μl) 2.7 μl 添加後、速やかに撹拌し、１６℃１５０分間インキュベ
ートし、T4 DNA ポリメラーゼ(3U/μl)４μｌを添加し
た。１６℃１５分間次いで３７℃１０分間インキュベー
トした。２５０μｌのフェノール／クロロホルムで抽出
し、更にフェノール／クロロホルムに１００μｌ ＴＥ
を加えて抽出し、抽出液をまとめ、これに以下のものを
添加した。 3M 酢酸ナトリウム 40 μl キャリヤー (グリコーゲン) 10 μl 100% エタノール 1 ml 添加後、−２０℃で一晩（又は−８０℃で１時間）イン
キュベートした後、遠心（15,000 rpmで２０分間）し、
７０％エタノールで洗浄し、遠心（15,000 rpmで５分
間）し、１５μｌ ＴＥに溶解した。

【００２０】上記で得た溶解液（４μｌ）に氷上で、以
下のものを添加した。 x10 リゲーション緩衝液 2 μl SalI アダプター (1μg/μl) 1.2 μl ddH₂O 9.8 μl T4 DNAリガーゼ 10 ユニット(3μ
l程度) 添加後、８℃一晩インキュベートし、７０℃３０分間加
熱し不活化した。次いで、この溶液（２０μｌ）に以下
のものを添加した。 x10 NotI 緩衝液 (東洋紡H) ４ μl x10 トリトン 4 μl x100 BSA 0.4 μl ddH₂O 5.6 μl NotI (500U/μl) 4 μl 添加後、３７℃２時間インキュベートし、７０℃３０分
間加熱不活化した。

【００２１】上記の溶液に以下のものを添加した。 1M NaCl 7 μl ddH₂O 22 μl グリコーゲン (10μg/μl) 1 μl 添加後、小型遠心型ゲル濾過装置に付し(3,000 rpm 3分
間)、ミリポアフィルター(UFCP3 TK50)で脱塩し、遠心
(10,000 rpm 5分間)した後、上清を除去し、１００μｌ
ＴＥを加えて遠心(10,000 rpm 15分間)した。上清を除
去した後、更に１００μｌ ＴＥを加えて遠心(10,000 r
pm 15分間)し、上清を除去し、１００μｌ (1/10)ＴＥ
を加えて遠心(10,000 rpm 20分間)した。上清を除去
後、３０μｌ(1/10)ＴＥに分散し、フィルターを逆さま
にし遠心(5,000 rpm 5秒 2回)することによりｃＤＮＡ
を得た。

【００２２】氷上で以下の試料を混合した。 cDNA 30 μl 発現ベクター[pMSF＋(HygroB)] 21 μl x10 リゲーション緩衝液 12 μl ddH₂O 56 μl T4 DNA リガーゼ (4.6U/μl) 1.5 μl 混合後、８℃一晩放置し、７０℃３０分間加熱して非働
化した後、ミリポアフィルター(UFCP3 TK50)で脱塩し
た。その後、遠心(10,000 rpm 15分間)し、上清を除去
し、１００μｌ ＴＥを加え遠心(10,000 rpm 15分間)し
た。上清を除去した後、更に１００μｌ ＴＥを加えて
遠心(10,000 rpm 15分間)し、上清を除去し、１００μ
ｌ (1/10)ＴＥを加えて遠心(10,000 rpm 20分間)した。
上清を除去後、３０μｌ (1/10)ＴＥに分散しフィルタ
ーを逆さまにし遠心(5,000 rpm 5秒)することによりｃ
ＤＮＡライブラリー３０μｌを得た(1.2x10⁶クローン,
平均サイズ:1.5kbp)。得られたｃＤＮＡライブラリーの
構造の概要を図１に示す。

【００２３】３）ｐＭＣＰｃＤＮＡのクローニング 対数増殖期にあるヒトリンパ芽球細胞ＪＹ２５細胞(１
ｘ１０⁸／１０キュベット）をＨｅＢＳ(800μl)に分散
させ、これに上記のｃＤＮＡライブラリー（２０μｌ／
１０キュベット）を加え、エレクトロポレーション(250
V 960μF)した。細胞を、２００ｍｌのＤ．ＭＥＭ［２
０％ＦＣＳ、ＩＴ（インスリン／トランスフェリン）、
ＰＳ（ペニシリン／ストレプトマイシン）含有］に分散
させ、２４時間培養した。次いで、４００μｇ／ｍｌの
ハイグロマイシンＢを含有するＤ．ＭＥＭ（１０％ＦＣ
Ｆ、ＩＴ、ＰＳ含有）に再分散させ、１０〜１４日培養
した（１ｘ１０⁷細胞）後、ＰＢＳで洗浄した。洗浄し
た細胞を補体セレクションに付した。即ち、細胞に、セ
レクション用Ｄ．ＭＥＭ(10ml FCS＋10ml ブタ血清＋80
ml D.MEM＋1ml 抗JY25抗体＋667μg 抗DAF抗体＋100μg
抗MCP抗体含有)を添加し、３７℃２時間インキュベー
トした。反応後、Ｄ．ＭＥＭで１回洗浄し、生存細胞数
をトリパンブルー染色で数えた（生存細胞数：０．１〜
１％）。なお、抗ＤＡＦ抗体及び抗ＭＣＰ抗体は選択性
を高めるために加えた。生細胞をＰＢＳで洗浄後、１０
０ｍｌ Ｄ．ＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）に再分散させ、２
４時間培養した。その後、上記のハイグロマイシンＢ含
有培地での培養及び補体セレクションを２回繰り返した
（生存細胞数は最終的に２０％になった）。

【００２４】上記で得られた生存細胞（１ｘ１０⁶）を
遠心(1,000 rpm 5分間)した後、細胞をＰＢＳで洗浄し
た。次いで、０．６％ＳＤＳ／１０ｍＭ ＥＤＴＡ混合
液４００μｌを加え、十分に混合し、室温で２０分間放
置した。５Ｍ ＮａＣｌ １００μｌを加えて十分に混合
し(細胞は白く変色した)、４℃で一晩放置した後、遠心
(15,000 rpm 15分間)し、上清を採取した。得られた上
清に、フェノール/クロロホルム(200μl+200μl)を加
え、遠心(12,000 rpm 2-3分間)し、上清を採取した。上
清に、１０μｌ（４μｇ）のポリアクリルアミドを添加
し、更に１ｍｌのエタノールを加え、−８０℃で２時間
放置した。７０％エタノールを加えて洗浄後、沈殿を２
０μｌ ＴＥに分散した。

【００２５】上記で得たｃＤＮＡ(2μl)を５０μｌの大
腸菌(MC1061)にエレクトポレーション(2.5kV 25μF 400
Ω)した。各キュベット(計10キュベット)のサンプルに
９５０μｌのＳＯＣ培地を直ちに添加した。撹拌(20 rp
m)しながら３７℃で１時間インキュベートした。インキ
ュベートしたサンプルは以下のように取り扱った。 (1)プレートにサンプル(15μlサンプル/プレート)を塗
布し、４℃でプレートを保存した。 (2)残りのサンプルは２ｍｌのＴＢＫ⁺に添加し、撹拌し
ながら３７℃で一晩培養した後、ミニ精製（プラスミド
ＤＮＡの少量調製）した。ミニ精製したｃＤＮＡ(2mlサ
ンプル)を２０μｌ ＴＥに分散させた。得られたｃＤＮ
Ａにおいて、１０μｌは制限酵素(Xhol+NotI)で切断
し、アガロースゲルを用いてｃＤＮＡのサイズをチェッ
クした。また、残りのサンプルは、ＪＹ２５細胞にエレ
クトロポレーションし前述の補体セレクション法により
選択し、生存細胞数を求めた。

【００２６】上記のチェックを行った後、前記の保存プ
レートのうち、高生存率プレートから４０コロニーを採
取し、コロニーを２ｍｌのＴＫＢ⁺で一晩培養した。培
養物をミニ精製し、制限酵素(Xhol+NotI)で切断し、各
ｃＤＮＡの挿入サイズをチェックし、サイズによりクロ
ーンを分類した。このうち、ｃＤＮＡの長さ及び頻度よ
り適当と思われるｃＤＮＡ及びバルクｃＤＮＡ（対照）
をＪＹ２５細胞に再度エレクトロポレーションし、前述
の補体セレクション法により分析した。その結果を図２
に示す。図２に示されるように、バルクｃＤＮＡを導入
した細胞[JY25(-pMCPcDNA)]においては生存率が極めて
悪いが、選別したｃＤＮＡ(pMCPcDNA)を含む細胞[JY25
(+pMCPcDNA)]は高い生存率を示し、ブタ補体に対して抵
抗性を示した。

【００２７】高い生存率を示した細胞からｃＤＮＡを分
離し、制限酵素(Xhol+NotI)で切断し、ｐＢＳＩＩＫＳ⁺
に結合させ、常法に準じて塩基配列の決定を行った。そ
の結果、当該ｃＤＮＡは塩基数１３６５ｂｐの塩基配列
（配列番号１）を有し、ブタ補体インヒビターをコード
する領域は１０８９ｂｐであった。そして、そのうち、
約６００ｂｐの翻訳領域ではヒトＭＣＰと高い相同性
（約７０％）を示した。配列番号１の塩基配列より推定
されるブタ補体インヒビターの配列を配列番号２に示
す。当該インヒビターの総アミノ酸数は３６３残基であ
った。

【００２８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１３６５ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源：ブタ血管内皮細胞 配列 GGAACTCGGA GAGGTCTCCG CTAGGCTGGT GTCGGGTTAC CTGCTCATCT TCCCGAAA 58 ATG ATG GCG TTT TGC GCG CTG CGC AAG GCA CTT CCC TGC CGT CCC 103 Met Met Ala Phe Cys Ala Leu Arg Lys Ala Leu Pro Cys Arg Pro 5 10 15 GAG AAT CCC TTT TCT TCG AGG TGC TTC GTT GAG ATT CTT TGG GTG 148 Glu Asn Pro Phe Ser Ser Arg Cys Phe Val Glu Ile Leu Trp Val 20 25 30 TCG TTG GCC CTA GTG TTC CTG CTT CCC ATG CCC TCA GAT GCC TGT 193 Ser Leu Ala Leu Val Phe Leu Leu Pro Met Pro Ser Asp Ala Cys 35 40 45 GAT GAG CCA CCG AAG TTT GAA AGC ATG CGG CCC CAA TTT TTG AAT 238 Asp Glu Pro Pro Lys Phe Glu Ser Met Arg Pro Gln Phe Leu Asn 50 55 60 ACC ACT TAC AGA CCT GGA GAC CGT GTA GAG TAT GAA TGT CGC CCC 283 Thr Thr Tyr Arg Pro Gly Asp Arg Val Glu Tyr Glu Cys Arg Pro 65 70 75 GGG TTC CAG CCC ATG GTT CCT GCG CTT CCC ACC TTT TCC GTC TGT 328 Gly Phe Gln Pro Met Val Pro Ala Leu Pro Thr Phe Ser Val Cys 80 85 90 CAG GAC GAT AAT ACG TGG TCA CCC CTC CAG GAG GCT TGT CGA CGA 373 Gln Asp Asp Asn Thr Trp Ser Pro Leu Gln Glu Ala Cys Arg Arg 95 100 105 AAA GCC TGT TCG AAT CTA CCA GAC CCG TTA AAT GGC CAA GTT AGC 418 Lys Ala Cys Ser Asn Leu Pro Asp Pro Leu Asn Gly Gln Val Ser 110 115 120 TAC CCA AAT GGG GAT ATG CTG TTT GGT TCA AAG GCT CAG TTT ACC 463 Tyr Pro Asn Gly Asp Met Leu Phe Gly Ser Lys Ala Gln Phe Thr 125 130 135 TGT AAC ACT GGT TTT TAC ATA ATT GGA GCC GAG ACT GTG TAT TGT 508 Cys Asn Thr Gly Phe Tyr Ile Ile Gly Ala Glu Thr Val Tyr Cys 140 145 150 CAG GTT TCT GGG AAT GTT ATG GCC TGG AGT GAG CCC TCC CCG CTA 553 Gln Val Ser Gly Asn Val Met Ala Trp Ser Glu Pro Ser Pro Leu 155 160 165 TGT GAG AAG ATT TTG TGT AAA CCA CCT GGC GAA ATT CCA AAT GGA 598 Cys Glu Lys Ile Leu Cys Lys Pro Pro Gly Glu Ile Pro Asn Gly 170 175 180 AAA TAC ACC AAT AGC CAT AAG GAT GTA TTT GAA TAC AAT GAA GTA 643 Lys Tyr Thr Asn Ser His Lys Asp Val Phe Glu Tyr Asn Glu Val 185 190 195 GTA ACT TAC AGT TGT CTT TCT TCA ACT GGA CCG GAT GAA TTT TCA 688 Val Thr Tyr Ser Cys Leu Ser Ser Thr Gly Pro Asp Glu Phe Ser 200 205 210 CTT GTT GGA GAG AGC AGC CTT TTT TGT ATT GGG AAG GAC GAG TGG 733 Leu Val Gly Glu Ser Ser Leu Phe Cys Ile Gly Lys Asp Glu Trp 215 220 225 AGT AGT GAC CCC CCT GAG TGT AAA GTG GTC AAA TGT CCA TAT CCA 778 Ser Ser Asp Pro Pro Glu Cys Lys Val Val Lys Cys Pro Tyr Pro 230 235 240 GTA GTC CCA AAT GGA GAA ATT GTA TCA GGA TTT GGA TCA AAA TTT 823 Val Val Pro Asn Gly Glu Ile Val Ser Gly Phe Gly Ser Lys Phe 245 250 255 TAC TAC AAA GCA GAG GTT GTA TTT AAA TGC AAT GCT GGT TTT ACC 868 Tyr Tyr Lys Ala Glu Val Val Phe Lys Cys Asn Ala Gly Phe Thr 260 265 270 CTT CAT GGC AGA GAC ACA ATT GTC TGC GGT GCA AAC AGC ACG TGG 913 Leu His Gly Arg Asp Thr Ile Val Cys Gly Ala Asn Ser Thr Trp 275 280 285 GAG CCT GAG ATG CCC CAA TGT ATC AAA GAT TCC AAG CCT ACT GAT 958 Glu Pro Glu Met Pro Gln Cys Ile Lys Asp Ser Lys Pro Thr Asp 290 295 300 CCA CCT GCA ACC CCA GGA CCA AGC CAT CCA GGA CCT CCC AGT CCC 1003 Pro Pro Ala Thr Pro Gly Pro Ser His Pro Gly Pro Pro Ser Pro 305 310 315 AGT GAT GCA TCA CCA CCT AAA GAT GCT GAG AGT TTA GAT GGA GGA 1048 Ser Asp Ala Ser Pro Pro Lys Asp Ala Glu Ser Leu Asp Gly Gly 320 325 330 ATC ATC GCT GCA ATT GTT GTG GGC GTC TTA GCT GCC ATT GCA GTA 1093 Ile Ile Ala Ala Ile Val Val Gly Val Leu Ala Ala Ile Ala Val 335 340 345 ATT GCT GGT GGT GTA TAC TTT TTT CAT CAT AAA TAC AAC AAG AAA 1138 Ile Ala Gly Gly Val Tyr Phe Phe His His Lys Tyr Asn Lys Lys 350 355 360 AGG TCG AAG TAA 1150 Arg Ser Lys 363 AACTGATGTG CTTAAAGTAA AAGTTGCTGA GAGGACGTGG AATCCAGCCC CTTCCCTCTC 1210 CTGTGCTGCT GCCTGGGTCC CGTTTTGCAT GTCATGACTG TGTGCTTCCA AAAAATGCCT 1270 TTTGTTCGTA TTTTTTTGCC TAAACGCATG ATTTTGTCTC TACTTGAATT AAATCATCAC 1330 TGAATCCACG CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 1365

【００２９】配列番号：２ 配列の長さ：３６３ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Met Met Ala Phe Cys Ala Leu Arg Lys Ala Leu Pro Cys Arg Pro 5 10 15 Glu Asn Pro Phe Ser Ser Arg Cys Phe Val Glu Ile Leu Trp Val 20 25 30 Ser Leu Ala Leu Val Phe Leu Leu Pro Met Pro Ser Asp Ala Cys 35 40 45 Asp Glu Pro Pro Lys Phe Glu Ser Met Arg Pro Gln Phe Leu Asn 50 55 60 Thr Thr Tyr Arg Pro Gly Asp Arg Val Glu Tyr Glu Cys Arg Pro 65 70 75 Gly Phe Gln Pro Met Val Pro Ala Leu Pro Thr Phe Ser Val Cys 80 85 90 Gln Asp Asp Asn Thr Trp Ser Pro Leu Gln Glu Ala Cys Arg Arg 95 100 105 Lys Ala Cys Ser Asn Leu Pro Asp Pro Leu Asn Gly Gln Val Ser 110 115 120 Tyr Pro Asn Gly Asp Met Leu Phe Gly Ser Lys Ala Gln Phe Thr 125 130 135 Cys Asn Thr Gly Phe Tyr Ile Ile Gly Ala Glu Thr Val Tyr Cys 140 145 150 Gln Val Ser Gly Asn Val Met Ala Trp Ser Glu Pro Ser Pro Leu 155 160 165 Cys Glu Lys Ile Leu Cys Lys Pro Pro Gly Glu Ile Pro Asn Gly 170 175 180 Lys Tyr Thr Asn Ser His Lys Asp Val Phe Glu Tyr Asn Glu Val 185 190 195 Val Thr Tyr Ser Cys Leu Ser Ser Thr Gly Pro Asp Glu Phe Ser 200 205 210 Leu Val Gly Glu Ser Ser Leu Phe Cys Ile Gly Lys Asp Glu Trp 215 220 225 Ser Ser Asp Pro Pro Glu Cys Lys Val Val Lys Cys Pro Tyr Pro 230 235 240 Val Val Pro Asn Gly Glu Ile Val Ser Gly Phe Gly Ser Lys Phe 245 250 255 Tyr Tyr Lys Ala Glu Val Val Phe Lys Cys Asn Ala Gly Phe Thr 260 265 270 Leu His Gly Arg Asp Thr Ile Val Cys Gly Ala Asn Ser Thr Trp 275 280 285 Glu Pro Glu Met Pro Gln Cys Ile Lys Asp Ser Lys Pro Thr Asp 290 295 300 Pro Pro Ala Thr Pro Gly Pro Ser His Pro Gly Pro Pro Ser Pro 305 310 315 Ser Asp Ala Ser Pro Pro Lys Asp Ala Glu Ser Leu Asp Gly Gly 320 325 330 Ile Ile Ala Ala Ile Val Val Gly Val Leu Ala Ala Ile Ala Val 335 340 345 Ile Ala Gly Gly Val Tyr Phe Phe His His Lys Tyr Asn Lys Lys 350 355 360 Arg Ser Lys 363

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｃＤＮＡライブラリーの概要を示す
図である。

【図２】本発明のｐＭＣＰｃＤＮＡを含むＪＹ２５細胞
について、補体セレクション法による生存率を示す図で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で示される塩基配列又
   はこの塩基配列の一部からなるＤＮＡ。
2. 【請求項２】 配列番号１で示される塩基配列の
   第５９番目から第１１４７番目までの配列からなるＤＮ
   Ａ又はこの配列を有するＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列番号２で示されるアミノ酸配
   列からなるブタ補体インヒビター。
4. 【請求項４】 配列番号２で示されるアミノ酸配
   列をコードするＤＮＡ又はこの塩基配列を有するＤＮ
   Ａ。
5. 【請求項５】 ｃＤＮＡライブラリーを宿主に導
   入した後、宿主に対する抗体及び補体成分を加え、生存
   宿主を分離することからなる補体インヒビター遺伝子を
   有するクローンのスクリーニング方法。