JPH09509745A - ヘテロジェネアスイムノアッセイ及び蛋白質を検出するためのその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、強力結合反応でのパートナーを含み、該パートナーは、不可逆的に、固体キャリヤー上に固定され、かつ該キャリヤーは、バッファー流れに付されるのに適したものであり、必要なら適切なバッファーで洗浄された後に検出される標識なしの結合対応物が、離解され、かつ検出器により測定されるヘテロジェネアスイムノアッセイ；及びその使用に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘテロジェネアスイムノアッセイ及び蛋白質を検出するためのその使用 発明の技術背景 種々の免疫技術が、蛋白質の選択性及び感受性検出（selective and sensitiv e detection）のために使用されている。特に、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ ）又はＥＬＩＳＡ（エンザイム結合イムノアッセイ）が挙げられる。それらは、 バイオテクノロジーサンプルを分析するための標準手段として使用される。他の アッセイもまた、使用可能である（例えば、Freitag，R．；Scheper,T.;Spreina t，A.，Antranikian，G.の(1991b)On-line monitoring of pullulanase product ionduring continuous culture of Clostridium thermosulfurogenes．Appl．Mi crobiol．Biotechnol．35，471-476、Freitag，R．；Scheper，T.; Schugerl,K. の(1991)Development of a turbidimetric immunoassay for on-line monitorin g of proteins in cultivation processes，Enzyme Microb.Technol.，13，969- 975、Mattiasson，B．；Hakanson H.の(1992)ImmunoChemiCally basedassays fo r process control，in:Modern Biochemical Engineering(A.Fiechter編)Advanc es in Biochem.Eng./Biotechnol.，Vol,46，Springer Verlag Berlin，pp．：81 -101、Middendorf，C.，；Schulze，B．；Freitag，R．；Scheper，T.;Howaldt ，M．；Hoffmann，H.の(1993)On-line immunoanalysis for bioprocess control ，J．Biotechnol.，3，395-403、Miyabayashi，A．；Mattiasson，B.の(1990)A dual streaming potential device used as an affinity sensor for monitorin g hybridoma cell cultivation，Anal．Biochem.，184，165-171、及びStocklei n，W．；Jager，V．；Schmid，R．D．の(1992)Monitoring of mouse immunoglob ulin G by flow injection analytical affinity chromatography，Anal．Chim ．Acta，245(1)，1-6を参照されたい）。 従来のＥＬＩＳＡでは、種々の工程：最適使用範囲までのサンプル希釈、免疫 反応、洗浄工程、及び検出工程が必要とされる。 明らかに、個々の工程は、自動化することができるが、前記アッセイは、依然 、 時間のかかるものであり、労働集約的なものであり、かつ誤差が生じやすいもの である。これは、また、全ての他のイムノアッセイにあてはまる。バイオプロセ スの分析法に関連するこれらのアッセイの他の不利な点は、これらの方法の全て が、極少量の蛋白質を検出することを意図されたものであることである。高濃度 の蛋白質が、バイオプロセスのサンプル中に存在する時には、該サンプルを実質 的に希釈しなければならず、それは、時間のかかることであり、労働集約的なも のであり、かつ誤差が生じやすいものである。 上述の点に加えて、素早く（即ち数分以内に）操作され、多数のサンプルを測 定し、かつ早急に他の種類の問題に適応することができ、十分自動的に操作され 、かつバイオプロセスにおいてオンラインで操作可能なバイオプロセスの分析に 利用できるプロセスはない。 上述の純粋なオフラインのプロセスに加えて、数種の自動化プロセスが、確立 されてきており、例として、次のものがある： −フローポテンシャル(flow potential)における変化により免疫反応を確認する ことを包含するプロセス(Miyabayashia 及びMattiasson、1990)、免疫複合物の 形成における濁りを測定するプロセス（濁りアッセイ、ＴＩＡ）（Freitag ら； 1991a、Middendorfら1993） −連続ＵＶ検出によりヘテロジェネアス競合アッセイを自動化するプロセス （Freitagら；1991b；Stockleinら、1992）及び −自動化されたスルーフロー（throughflow）-ＥＬＩＳＡ技術を用いたプロセス （Mattiason及びHakanson、1992）。 ＴＩＡシステムを除いて、これらのプロセスは、かなり労力を要するものであ り、かつ莫大な費用をかけてのみ自動化することができる。ＴＩＡシステムは、 実際の工業的プロセスにおいて使用されかつその価値が改良された唯一のもので ある。不利な点は、それぞれのアッセイために新しい抗体溶液を使用しなければ ないないので、抗体の消費量が高いということである。 全てのシステムは、分析のための材料の消費量が高いが、有効寿命（ＴＩＡを 除く）及び自動化の程度（ＴＩＡを除く）は低い。システムは汚染され易く、か つ望ましくない物質の分離は、不可能であるか又は希釈によってのみ達成可能で ある。ＴＩＡのみが希釈を必要としない。 発明の概要 従って、本発明の目的は、次の最小要件を満たすイムノアッセイを開発するこ とである： −親和力反応を用いた、一般的に適用可能な分析システム； −反復使用可能な（例えば少なくとも100回のアッセイ）親和性成分の固定化 （immobiliSation）； −サンプルの希釈の不要性； −望ましくない物質の容易な除去； −十分な自動化； −容易に適応された測定範囲； −汚染危険性のないこと； −変動可能な検出可能性； −任意の時に検量可能であること； −オンライン及びオフライン分析のための使用（１時間あたり少なくとも10個の サンプル）； −調整の容易性； −免疫性カートリッジ（an immune cartridge）を用いて、異なるＩｇＧを分析 することが可能であること（固定蛋白質Ａ又はＧを用いる） 本発明によれば、測定装置（図１を参照されたい）は、フローインジェクショ ン分析(flow injection analysis)の原理をベースとする新規なヘテロジェネア スイムノアッセイ（ヘテロジェネアス溶離アッセイ）をベースとするものである 。ここで、強力結合反応のあるパートナーは、固体キャリヤー上に不可逆的に固 定され、後者は、好ましくは、スルーフローカートリッジ(throughflow cartrid ge)に入れられる。適切なキャリヤー材料上における結合パートナーの固定後、 標識なしのサンプルを、そのシステムを絶え間なく通過するバッファー流れに入 れ、かつ該固定化材料に通す（図２を参照されたい）。結合パートナーは、サン プルからのその特定対応物に結合するが、全ての他の物質は、キャリヤー流れに より除去される。アナライト(analyte)(対応物)及び望ましくない物質の分離を 行う。 結合物質を、その後、キャリヤーバッファーから溶離バッファーへの変更により 抽出する。洗浄及び処理工程は、特定の分析問題に依存して行われ得る。抽出物 質は、例えば、それらの濃度又はそれらの生物学的特性の発見のために、その後 、検出器により分析される。検出器のシグナル(detector signal)及び評価方法 に依存して、サンプル中のアナライトの濃度は、例えば、ピーク面積(peak inte gral)に比例し得る。新しいサンプル(fresh sample)がカートリッジ中に置かれ る前に、洗浄、処理又は平衡化が可能である。 本発明は、従って、ヘテロジェネアスイムノアッセイであって、強力結合反応 でのパートナーを含み、該パートナーは、不可逆的に、固体キャリヤー上に固定 され、かつ該キャリヤーは、バッファー流れに付されるのに適したものであり、 必要なら、適切なバッファーでの洗浄後に検出される標識なしの結合対応物が、 溶離され、かつ検出器により検出されることを特徴とする該ヘテロジェネアスイ ムノアッセイ；蛋白質を検出するためのその使用；及び本発明のイムノアッセイ を用いて蛋白質を検出するための方法に関するものである。 上記の分析のシステム及び原理は、サンプルを数分以内に分析するのに適する ものである。蛋白質（この場合、対応する抗体はカートリッジ中に固定される） 、免疫グロブリン（固定化蛋白質Ａ／Ｇによる）、又はアビジン／ビオチン若し くはラクチン／グリコシル化高分子等の高い結合定数を有する他のシステムを検 出することが可能である。 本発明のイムノアッセイは、次の利点を有する： −装置を、独立して操作し、かつ十分に自動化することが可能なこと； −サンプルを、オンライン及びオフラインの両方で分析可能なこと； −必要とされる分析時間が短いこと（例えば、ほんの数分）； −イムノアッセイの感受性を、カートリッジ前又は後に蛍光染料又は他のマーカ ーに結合することにより高めることが可能なこと； −分析を、細胞含有サンプルにおいて行うことが可能なこと； −溶離条件を最適化することにより、微生物がカートリッジ中で又はフローシス テム中で成長しないようにし、かつ更なる洗浄サイクルが必要とならないように することが可能なこと； −イムノアッセイの測定範囲が、注入量(累積結果(cumulative effect))を変動 することにより調節可能であり、かつこのようにして、極めて低い濃度を測定す ることが可能なこと； −測定装置を用いることにより、サンプルを直接（即ち、希釈なしに、処理なし に）、入れることが可能なこと（分析する物質の濃度が非常に高い場合、例えば ミリリットルあたり数ミリグラムの場合には、測定範囲は、分散体の温度を高め ることにより、高い方へ調節することが可能である）； −装置を、数百のサンプルを順々に単一分析することが可能なオートサンプラー に結合することが可能なこと； −（蛋白質の蛍光又はＵＶ吸収の測定に特に適する）数種の方法での検出が可能 なこと； −望ましくない物質及びアナライト間で分離が起こるので、望ましくない物質の 組成が変化した時にも、信頼できる分析が達成可能なこと；基準測定(reference measurement)が不要であること； −この新規な組み合わせを用いて、種々の洗浄工程が含まれ得るような、汚染や 分裂(disruption)のない自動的な分析が可能なこと；そのシステムは、任意の所 望のシステムについて反復使用が可能である。 使用されるキャリヤーは、合成の又は天然のポリマー又はガラス、特にはSeph arose 4B、Eupergit、Eurocell ONB及びVA-Epoxy-Biosynth 等の従来のキャリヤ ーであってもよく、該粒径は、好ましくは、100 〜200 μｍである。所望の強力 結合反応のパートナーは、吸着によりイオン的に又は共有的にキャリヤーに結合 可能であり、後者が好ましい。 共有結合を形成するために、キャリヤーを、従来の方法により活性化させなけ ればならない。これは、キャリヤー上のヒドロキシル基を、グルタルジアルデヒ ド等の二官能価の物質と反応させること（その後、結合パートナーが結合）によ り、ヒドロシキル基をアミノ又はカルボキシル基に転化すること（その後、結合 パートナーが結合）（例えばカルボジイミド法を用いる）により、又はヒドロシ キル基を末端エポキシ機能を有する基に転化すること（その後、結合パートナー が付加）により行うことができ、後者の方法が好ましい。 次の実施例は、本発明を説明することを意図するものである。実施例１ システムを、次のアナライトについて試験した：アンチトロンビンIII、rt-PA 、及びＩｇＧ型の抗体。最初の２つのアナライトは、ポリ−及びモノクローナル 抗体を用いて試験し、かつＩｇＧ抗体は蛋白質Ａ及びＧを用いて試験した。 rt-PA アッセイについては、Sepharose 4B、Eupergit、Eurocell ONB、及びVA -Epoxy-Biosynth をキャリヤーとして用いて試験した。リン酸カリウムバッファ ー(0.1M、pH=7.4)を、キャリヤー、洗浄／処理及び平衡バッファーとして使用し た。0.1Mのリン酸カリウムバッファーのアルカリ範囲(pH=12.3)で、及びグリシ ンバッファーの酸性範囲(0.1M、pH2.0)で溶離が可能であった。 20-100μｌのサンプルを、それぞれのケースにおいて注入し（10秒間）、その 後、洗浄を170 秒行い、そして150 秒間溶離させて、検出した。30秒間の平衡時 間後、新規な注入を行うことができた。 検出を、スローフロースペクトロフォトメーター（throughflow spectrophoto meter）中において行った（273 nmでの励起、340 nmでの発光の測定）。 図面の簡単な説明 図Ｉは、異なる固定材料を用いたrt-PAについての検量線を示す。 図IIは、蛋白質の蛍光における溶離溶液のpHの影響を示す。 図IIIは、ＡＴＩＩＩ測定についての長期安定を示す−相関係数は、直線の匂 配が減少している時でさえ、かなり高い。測定日あたりのある単純な二点検量(o ne simple two-points calibration)は、この結果を考慮に入れるのに十分なも のである。 図IVは、先の二点検量後の異なる測定日における測定値の同一性を示す。 図Ｖは、従来のエリザでの測定値と、自動ヘテロジェネアスアッセイでの測定 値との間の同一性を示す。 図VIは、外来蛋白質により生じる妨害は、洗浄工程により除去可能であること を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シェーパー トーマス ドイツ連邦共和国 デー30179 ハノーヴ ァー ドイムリングヴェーク ６ (72)発明者 ノーエ ヴォルフガング ドイツ連邦共和国 デー88400 ビベラッ ハ ケーレスライン 87−１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヘテロジェネアスイムノアッセイであって、強力結合反応でのパートナーを 含み、該パートナーは、不可逆的に、固体キャリヤー上に固定され、かつ該キャ リヤーは、バッファー流れに付されるのに適したものであり、適切なバッファー を用いた必要とされる任意の洗浄後に検出される標識なしの結合対応物が、溶離 され、かつ検出器より測定されることを特徴とする該ヘテロジェネアスイムノア ッセイ。 ２．結合パートナーが、カートリッジ中に含まれる請求項１に記載のヘテロジェ ネアスイムノアッセイ。 ３．対応物が、抗体又は蛋白質である請求項１又は２に記載のヘテロジェネアス イムノアッセイ。 ４．結合パートナーが、蛋白質、免疫グロブリン、又はアビジン／ビオチン若し くはラクチン／グリコシル化高分子等の高い結合定数を有するシステムである請 求項１又は２に記載のヘテロジェネアスイムノアッセイ。 ５．使用される対応物が、感受性を高めるために標識される請求項１〜４のいず れか１項に記載のヘテロジェネアスイムノアッセイ。 ６．対応物が、固体キャリヤー上の固定パートナーに結合し、かつ該固定パート ナーが、必要なら洗浄された後に、溶離され、かつ検出器により測定されること を特徴とする対応物の検出法。