JPH09508791A

JPH09508791A - リガンドを発見する方法

Info

Publication number: JPH09508791A
Application number: JP7520455A
Authority: JP
Inventors: サザーン，エドウィン・メロー; ミアー，カリム・ウラー; ケース−グリーン，スティーヴン・チャールズ
Original assignee: Oxford University Innovation Ltd
Current assignee: Oxford University Innovation Ltd
Priority date: 1994-02-01
Filing date: 1995-02-01
Publication date: 1997-09-09
Also published as: US20020031766A1; EP0742837B1; EP0742837A1; DE69521298T2; GB9401833D0; US6080585A; DE69521298D1; ATE202148T1; WO1995021265A1

Abstract

(57)【要約】二次または三次構造を有するＤＮＡまたはＲＮＡ分子などの標的と特異的に相互作用する、オリゴヌクレオチド類または類似体などのリガンドの一つまたは組み合わせを同定する方法。１リガンドを予め反応させて他のリガンドと相互作用させるため標的を開放し、固体表面にアレイを形成する。

Description

【発明の詳細な説明】リガンドを発見する方法序論分子間の相互作用が多くの生物プロセスの基礎を形成しており、これらの相互作用を理解することは基礎研究と医薬品における用途の開発にとって重要である。たとえば、多くの薬物は特異的レセプター分子に結合して作用する。高い特異性と親和性をもって特定の標的に結合するリガンドを発見する研究は困難な場合が多く、組み合わせ化学の導入はこの研究を容易にするが、一つの生物標的に対し一つのリガンドでは目的（たとえば、特異的プロセスを完全に抑制することが目標である場合）によっては十分効果がない場合がある。本発明は協働作用することにより、単一のリガンドよりも、より特異的で、強力な相互作用を生ずるリガンドの組み合わせを発見する新規な方法について述べている。リガンドが協働して作用する仕方には２つの全く異なる方法がある： −タンパク質やＲＮＡなどの生物学的に重要な多くの高分子または高分子集合体は、弱い分子内相互作用によりそれら高分子の活性コンホメーションに保持されている。構造を一部開いた分子へ一つのリガンドを結合することは、本発明者らが示すように、第１のリガンドがないと結合できない他のリガンドの分子との接触を可能にする。これらの追加リガンドは標的分子の衰退を強化することになる。 −多くの生物プロセスは、各反応が別々の高分子に依存する、一連の反応の結果として起こる。たとえば、代謝物を生じる経路は大抵が、多数の酵素の触媒作用を受ける一連のステップを含む。各酵素は、異なるリガンドの標的となり、代謝経路を介して代謝速度に１つの酵素により生ずるよりも大きな効果を生ずる。さらに、薬剤を併用すると治療薬に対する耐性の発現を防止できるという利点がある。すなわち、薬剤の併用は、しばらくすると、変異の結果として耐性が発現する抗生物質や抗癌剤を使用する場合の主要課題である。薬剤が細胞内で異種分子を標的とする混合物から構成されているならば、耐性を得るために複数の変異が必要になるであろう。明らかに、２つの変異が２つの薬剤に同時に耐性を発現する２つのランダムな変異を１つの細胞が受ける機会は、単独の薬剤の作用を抑制するために必要な単独の変異よりはるかに少ない。本発明本発明は、薬剤を設計する方法を提供する。この方法は、標的を用意し、固体表面でアレイを形成するリガンドに標的を適用し、リガンドと標的の間の相互作用を観察し、そしてその観察を標的と相互作用する薬剤の設計に利用することを含む。本発明はまた、一つの標的に特異なリガンドの組み合わせを決定する方法をも提供する。この方法は：ａ）標的に少なくとも１つのリガンドを結合して、標的複合体を形成し、ｂ）標的複合体を、他のリガンドと標的複合体の間で相互作用が起きる条件下で固体表面にアレイを形成する他のリガンドに適用し、そしてｃ）標的複合体と相互作用する少なくとも一つの他のリガンドを同定する、の各工程を含む。標的は核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはタンパク質または炭水化物などの分子内構造を有するポリマー分子あるいは膜などの高分子集合体である。グリコシル核酸などの複合分子も標的と見なせる。リガンドは標的と相互作用しうる分子であり、この相互作用が治療手段または生物テストの基礎を形成しうるものである。本発明にとって重要なのは相互作用の特質ではなく、たとえば、ハイブリッド形成または免疫反応または共有結合を含む他の特異な結合反応である。リガンドの例としては、オリゴヌクレオチド類、ペプチド類、ステロイド類およびグリコシド類がある。本発明は特に二次または三次構造を有する標的に関する。核酸については、ＤＮＡ標的よりＲＮＡ標的の方がより多くの構造を持ち好ましい。固体表面上の標的とリガンドの間の相互作用は、標的の二次または三次構造が保持されるような条件下で行われるのが好ましい。たとえば、ポリヌクレオチド配列間のハイブリッド形成の場合、そのような条件はよく知られておりかつスタンダードＤＮＡハイブリッド形成反応に一般的に使用されるより厳しい条件とは異なっている。アンチセンス・オリゴヌクレオチド類アンチセンス・オリゴヌクレオチド類とＲＮＡは治療薬としての潜在的能力があり、ウイルス、バクテリアおよび寄生病原体を含むある範囲の感染因子並びに癌の治療に関する合理的治療を設計するごく少数の方法の一つを提供する。基礎的な生物研究の場合、これらは遺伝子とその機能の間の関連を発見する方法を提供する。ゲノム分析によりまだ性状決定されていない遺伝子からの配列に関するデータ量がますます多く作られているので、これに関するニーズがより重要になっている。いくつかのシステム、特に酵母において、遺伝子はクローン化配列の相同的組み換えの標的になることがあるが、他のシステム、特に高級真核は扱いにくく、アンチセンス法が遺伝子活性を低下または除去するより簡単で、一般的な方法を提供できる。アンチセンス剤の主な魅力は、既知配列の遺伝子をすべて標的にする潜在的能力である。すなわちＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子と特異的に相互作用したり、複製、転写、翻訳を抑制したり、ヌクレアーゼによる分解を起こしたりあるいはリボザイムの場合は標的ＲＮＡを直接分解することにより発現を妨害するように分子を設計できる。アンチセンス・オリゴヌクレオチド類を治療薬として用いる可能性が、ホスホロチオエート類似体が培養細胞と動物において感染を完全に抑制することを示したあひる肝炎ウイルスの場合に証明された［Offenspergerら、1993］。他の実験テストでは達成度はさまざまであり［James,1991の最近の総説を参照］、この方法の能力が十分発揮されれば、多数の課題が解決されるに違いない。オリゴヌクレオチド類の分解に対する安定性は、類似体を用いることにより解決できるが、オリゴヌクレオチド類が細胞に入る機構についてはほとんど分かっていない。いくつかの研究により、標的配列にはいくつか感受性の高い場所があり、オリゴヌクレオチドの抑制作用に影響を及ぼす重要因子は標的との相互作用の強度であることを示している。本発明者ら自身および他の研究者の研究は、ＲＮＡ分子とオリゴヌクレオチド類の間の相互作用の強度に影響を及ぼす主要な因子は標的配列の分子内構造であることを示している。オリゴヌクレオチドとその標的の間の相互作用を予測する信頼できる方法がないので、アンチセンス薬剤の設計は大部分が推測に基づくものである。下に述べる方法は、標的配列と潜在的なアンチセンス薬剤すべての間の相互作用の強度の測定に利用できる新規な実験システムに基づいてアンチセンス薬剤を選択する合理的な方法を提供する。この方法は、標的配列に最も効果的に結合するオリゴヌクレオチド類または類似体の発見にも利用できる。この方法は、標的の構造を開放し、互いの結合を高めるために協働的に作用するオリゴヌクレオチド類の組み合わせの発見に拡張することができる。一つ以上の遺伝子産物を含む生物プロセスにおける活性の協働的低下を示す種々のＲＮＡに対するアンチセンス薬剤は、記述された方法でＲＮＡを分析することにより容易に発見できる。特異な遺伝子発現について何も分かっていない細胞内のアンチセンス標的の発見に同じ方法を利用できる。これらの標的は単独のＲＮＡでも混合物でもよい。アンチセンスの設計に全く新しい方法を提供する方法について説明する。核酸を基本にするシステムについて述べた方法は、適切な化学的操作がすでに存在するかあるいは開発できる可能性がある他のすべてのシステムに適合させることができる。リガンドのアレイ標的分子と多数のリガンドの間の相互作用をテストするために、固体基板の表面上にリガンドを作り、それらをすべて反応させかつ同時に分析することができるようにするのが便利である。合成オリゴヌクレオチド類の大型アレイをガラス板またはプラスチックシートの表面に作ることができる［MaskosとSouthern，19 92a，1992b；Southern，MaskosおよびElder，1992；Matson，RampalおよびCoass im，1994］。標識を付けた標的配列のハイブリッド形成はアレイ内の各オリゴヌクレオチドとの相互作用の強度を測定する。ここで述べた用途の場合、本発明者らは３つの型の主要アレイを用いる：１．オリゴヌクレオチド類は基板表面上の線として作り、オリゴヌクレオチド類との標的相互作用はハイブリッド形成を起こさせうるような条件下でオリゴヌクレオチド類に対し直交する線上に標的溶液を適用して分析する。このようにして多数のオリゴヌクレオチドを、いくつかの標的に対しあるいは異なるハイブリッド形成条件下で同じ標的に対し平行して分析できる［MaskosとSouthern，1992 a，1993a］。２．選ばれた短い長さのオリゴヌクレオチド類の一式を効果的な組み合わせ方法により作れる。たとえば、本発明者らは４０９６のヘキサヌクレオチドをすべて6.5ｃｍ×6.5cｍのアレイに６段階の合成（図１）で作ることができる［south ern，MaskosおよびElder，1992］。この種のアレイは、従来の配列情報が利用できない時でも、標的とオリゴヌクレオチド類の相互作用の調査に利用できる。下で述べる２つの方法においてこれらのアレイを利用する。すなわち、１つの方法は、結合に利用することができ、したがって、分子内構造によって結合しない領域を見いだすことを目的にして、既知の核酸配列に結合するオリゴヌクレオチド類の同定について述べる。第２の方法は従来の配列情報が利用できない時に、分化した細胞におけるｍＲＮＡの集団における潜在的アンチセンス標的の同定について述べる。３．各段階の標的配列の塩基類に前駆体を導入しながら、基板の表面に沿って次第に移動させる反応室における段階合成により“走査アレイ”を作る。１つの長いオリゴヌクレオチドの合成に等しい、単一操作により標的分子の全配列を表す１組のオリゴヌクレオチド類を作る。すなわち、その組の各オリゴヌクレオチドが配列上の“窓”を表す。この窓の幅は予め決めることができ、本発明者らが用いる典型的な窓は１０-１５の塩基から成りそして一つの塩基からこの選ばれた長さのものまでを含むすべての長さのオリゴヌクレオチド類が同じ方法で作れることが、走査アレイを作る方法の重要な特徴である（図２）。リガンド結合に対する分子内構造の影響タンパク質、ＲＮＡおよびＤＮＡなど生物高分子は、比較的安定な構造に折りたたまれており、これは生物活性にとって重要なことである。この構造は、高分子の一次配列、および水素結合、疎水性相互作用等に基づく弱い分子内相互作用によっも変わる。高分子は細胞内のタンパク質とｍＲＮＡのように、他の分子と結合することもある。分子の折りたたみの結果分子内の一部の残基が他の残基よりリガンドに近づいて相互作用しやすくなる。これは標的分子と結合する必要がある薬剤の設計において非常に重要である。本発明者らは、構造の性状決定がよくなされている分子である、ｔＲＮＡ^phe を参考にして折りたたまれた分子に結合できるリガンドを発見する課題について説明する。まず、ＲＮＡ分子の折りたたまれた構造を保持するきびしくない条件下で、Ｎ₃Ｘ₂Ｎ₃型の一般的なアレイに標識付きＲＮＡをハイブリッド形成した。このパターンは７６の塩基配列の内わずか数領域のみがハイブリッド形成に開かれていることを示した（図３およびアレイの構成に関する説明文）。オリゴヌクレオチド類が、長さがモノヌクレオチドから１２量体までの範囲にあり、酵母ｔＲＮＡ^pheの配列の補体を表す、各々が７６のオリゴヌクレオチドからなる１２組を具備する走査アレイを作った。この種のアレイは７６工程からなる１合成で作ることができる（図２ａ）。このアレイへの標識付きｔＲＮＡのハイブリッド形成は、天然分子のすべての領域とオリゴヌクレオチド類が相互作用する程度を示すパターンを与える（図２ａ）。この例で、Ｎ₃Ｘ₂Ｎ₃型の一般的なアレイ（ここでＮは４つの塩基のいずれか一つであり、Ｘは４塩基すべての混合物である）に提出された標的が短い（７６塩基）ので、配列全体を表すオリゴヌクレオチド類の走査アレイを作ることができた。標的がもっと長い場合は、関心領域の同定に一般的なアレイを用い、さらに１つ以上の走査アレイにより一層完全に調査できる。この実験は二次および三次構造が相互作用を決定する上でどの程度重要な役割を果たしているかを説明している。しかし、Ｘ線回折による研究から構造が詳細に知られているこの場合でさえ、相互作用の強度を予測することができないことに留意することが重要である。ｔＲＮＡ分子と相補的オリゴヌクレオチド類の相互作用には予想と一致する部分がある。すなわち、最強の相互作用はＤループ、可変ループおよび３'-末端との相互作用であり、これらすべては不対塩基類を持っている。一方、本発明者らが対形成に利用できると考えていた、分子の５'-末端とアンチコドンループは弱い相互作用のみを示している。ＨＩＶＲＮＡ（図２ｂ）の部分およびＣＦＴＲ遺伝子のエキソンからの転写物を用いた類似の研究が、コンピューターにより不対塩基の存在が予想される領域ではある程度の相互作用は起きるが他の領域では起きず、またアンチセンス薬剤の設計にとって最も重要なことであるが、見かけ上開かれた領域も一部が相補的オリゴヌクレオチド類と相互作用しないことを示した。ハイブリッド形成の強度から測定した相互作用の強度は、最も弱いものと最も強いものの比は１０００倍以上と非常にばらつきが大きい。相互作用の強度がハイブリッド形成パターンの検査から直ちに分かるのが、この方法の主な利点である。標的内の構造による効果とオリゴヌクレオチド類内の構造による効果とを区別することも可能で、これはアンチセンス用のオリゴヌクレオチド類を選択する重要な情報である。本発明者らが天然のＲＮＡについて行ったすべての分析の顕著な特徴は、ごく少数の部位のみが相補的オリゴヌクレオチド類と強く相互作用することで、また本発明者らは相互作用の強度が一つの塩基を加えたり取り除いたりすると突然変化することも度々見ている（たとえば、図２ｂに示すＨＩＶ- ＴＡＲ分析）。アンチセンス薬剤の設計にとって極めて重要なこれらのハイブリッド形成のパターンは、ＲＮＡ分子の構造が大部分分かっていれば、また種々のオリゴヌクレオチド類の相互作用の相対強度の計算に用いるアルゴリズムが現在利用できるものを超えて大いに改良されていれば理論のみから予測できる。このアレイにより提供された情報を与えうる実験システムは他にはない。折りたたまれた標的上で協働作用するリガンドの同定上記方法を用いた多数のｍＲＮＡに関する研究が、ほとんどの塩基類がオリゴヌクレオチド類との対形成に利用できないことを示している。しかし、第１のオリゴヌクレオチドが結合すると、分子内の対から他の塩基を遊離し、さらに遊離した塩基を“パイオニア”が存在しないと結合しないアンチセンス・オリゴヌクレオチド類との対形成に利用し、その結果内部構造の破壊が起きるようである。この予測はｔＲＮＡを用いた実験で実証された。Ｄ-ループおよび天然ＲＮＡの可変ループに強く結合しているオリゴヌクレオチド類は、走査アレイにおけるそれらの位置から同定した。これらの配列の過剰のオリゴヌクレオチド類（リガンド溶液）をｔＲＮＡプローブに添加した場合、走査アレイへのハイブリッド形成は、添加オリゴヌクレオチドがないと弱く結合するがあるいはほとんど結合しない領域への結合の劇的な増加を示した（図４）。このプロセスは反復することができ、すなわちパイオニアが存在すると結合するオリゴヌクレオチド類をそれと共にハイブリッド形成に算入されるが、他の領域は開放され、走査アレイ上に認められる。この操作を続けると、標的のすべてまたはほとんどをオリゴヌクレオチド類と共に二重らせんに持ち込むことができる。この合理的な段階的分析により同定された複合オリゴヌクレオチド類は明らかに、すべての単一オリゴヌクレオチドによって実現できるものより強い“アンチセンス”活性を生じる。アンチセンスを設計する方法としてのこの方法のもう一つの利点は、多数の短いオリゴヌクレオチドの方が長いものより、標的に対しより特異的であり、細胞による取り込みがより効果的に行われ、低濃度で効果的であり［Morganら，1993］、そして分解されにくいことである。本発明者らの行った分析で、テトラヌクレオチド、トリヌクレオチドおよびジヌクレオチド等の非常に短いオリゴヌクレオチド類を含む相互作用は、長く、十分相補的なオリゴヌクレオチド類の間の相互作用より強いことが分かった。これらの相互作用は通常のWatson-Crick対形成によるものではないようで、したがって、ここで提案された方法により明らかにされ、かつアンチセンス薬剤設計に関係のある予想外の相互作用を表しているようである。アンチセンス薬剤は通常天然のヌクレオチド類から作られたオリゴヌクレオチド類から構成されておらず、類似体からのものである。重要な特徴は下記の通りである：１．これらの薬剤は標的配列に特異的に結合する。２．これらは標的細胞に入りうる。３．これらは細胞での分解に耐性がある。４．これらは標的核酸の崩壊かその機能の抑制を誘発する。これらの基準は天然のオリゴヌクレオチド類より、ある程度修飾したオリゴヌクレオチド類および／または類似体の方がよくマッチしている。類似体の合成に用いた化学はアレイ作成に容易に適合し、したがって、ここで述べた方法はいかなる類似体にも適合させることができる。さらに、多数の潜在的に望ましい修飾、たとえば、細胞の浸透を促進したりあるいは結合に対するその効果が簡単には予測できない標的分子への結合を高める部分の付加がある。アレイ上に必要な構造を作るために合成ルートが見いだされたならば、このアレイ方法によりこれらの測定を簡単かつ直接的方法で行うことができるようになる。すなわち、これは現在知られている修飾の中で最も役立つケースである。他のリガンド／標的相互作用明らかに、アンチセンス・オリゴヌクレオチド類を参考にして説明した原理は他の型のリガンドの組み合わせの発見に用いることができる。要点は下記の通りである： −アレイの種々の細胞を占めるリガンドの個性が知られている潜在的なリガンドの一つからアレイを作ることができなければならない。 −アレイ内のリガンドと標的分子の相互作用を検出することができなければならない。しかし、標的、溶液リガンドおよびアレイ上のリガンドは必ずしも同じ型の分子である必要はないことに留意すべきである。たとえば、溶液中の挿入剤と共に、オリゴヌクレオチド類のアレイを使用することができ、また逆にオリゴヌクレオチド結合に対する種々の挿入剤の作用を研究するためにオリゴヌクレオチドアレイを使用することができる、すなわち標的タンパク質との相互作用を研究するために溶液中およびアレイ上で種々の型の薬剤を使用することができる。リガンドライブラリー溶液リガンドが種々の構造を有する分子の混合物を包含するならば、この方法の能力は拡大する。再びオリゴヌクレオチド類を例にとると、本発明者らは種々のオリゴヌクレオチド類がｔＲＮＡ^pheの種々の領域を開放し、各相互作用が他のオリゴヌクレオチド類との相互作用を自身で可能にすることを見いだした。この分析は各溶液オリゴヌクレオチドを用いて別々に行った。標的と複合体がアレイに結合した後で結合溶液オリゴヌクレオチドを同定することが可能であったならば、溶液リガンドは所定のサイズ範囲のオリゴヌクレオチド配列すべての混合物を包含できるであろう。個々のオリゴヌクレオチド類あるいはこれらのオリゴヌクレオチドがこのようにしてアレイに結合した後の分析分解物を同定する方法は、1993年7月30日に先に出願された特許出願ＧＢ9315847.5に記述されている。この二重組み合わせ法の利点は非常に大きく、一つの分析で調べた相互作用の数はアレイ上のリガンドと溶液中のリガンドの数の積に等しい。アレイ上および溶液中のオクタヌクレオチド類の場合、これは４¹⁶＝４×１０⁹になる。結合リガンドリガンドの対または高倍数のリガンドは競合反応、すなわち標的分子の内部構造の再形成を抑制して折りたたみ分子への結合を強化する。これらは標的の構造を開くことにより結合速度も上げる。リガンドが合体されるとこれら両プロセスが強化されるので、３分子あるいは高次の相互作用が二分子相互作用に縮小される。ジ・トリおよびテトラヌクレオチドあるいは他のリガンドなど短いヌクレオチドを含む一対のオリゴヌクレオチド類がそれら両者を結合させる柔軟なリンカーにより合体されうることは容易に想像できる。相互作用部分を共に結合する効果は、たとえば、共有結合による架橋、キレート化あるいは標的分子との電荷またはファンデルワールス相互作用による、標的への一つ以上のリガンドの結合を強化することによりさらに広げることができる。これにより他のリガンドが標的に結合する回数を多くすることができる。大きな細胞透過性など他に望ましい特質を有するリンカーはリガンドの特性をさらに改良することができる。リガンドはたとえば、一部では標的と相互作用し、また他の部分は触媒活性を備えることで、リボザイムの基礎を形成できる。実施例配列作成装置セル形成に用いる装置は合成を行う基板に対するシールを良くしなければならない。本発明者らは基板としてガラスを用いた。ガラスに対するシールが良くかつオリゴヌクレオチド合成で用いる溶媒や化学薬品に耐えられる材料はテフロンだけであった。反応室を形成する壁を機械加工する前にセルの表面を仕上げねばならないので、本発明者らはガラス表面に押し付けた時に良いシールが得られるダイアモンドの形をした鋳型を作ることができた（Southernら，1994）。一方、ガラス表面にそれが押し付けられた時に、カットを用いた時と同じ線に表面工具を走らせて旋盤で環状鋳型を切ることができる（図２ａ）。セルの深さは約0.5 ｍｍである。環状構造の頂部と底部に直径1.0ｍｍの孔をドリルで開け、後部から先端を切り詰めた１９ゲージ（外径1.1ｍｍ）の注射針を取り付けて入り口と出口の孔を作った。テフロン反応セルに関してガラス板を移動させるのに用いた親ねじで取り付けたレイルにテフロンセルを載せた。皿のようにくぼんだポリエチレンクッションを用いて取り付けた“Ｇ”クランプをレイルに固定しガラス板に圧力をかけ、反応セルをシールした。ＡＢＩ３８１Ａオリゴヌクレオチド合成機の枠の前部にレイルを搭載し、普通はカラムに接続した供給ラインを反応セルに接続することができた。アレイ作成ガラス板（５０×２２０×３ｍｍ）はまず共有結合で結びつけられたリンカーで被覆した［MaskosとSouthern，1993］。板をグリシドキシプロピル・トリメトキシシラン／ジイソプロピルエチルアミン／キシレン（容積比；17.8：１：69）の混合物に浸漬し、８０℃に加熱し、この温度に９時間保持し、さらにエタノールとエーテルで洗浄した。第２工程では、これらの板を触媒量の硫酸を含有するヘキサエチレン・グリコール中で８０℃に加熱し、この温度に１０時間保持し、さらにエタノールとエーテルで洗浄し、空気乾燥しさらにマイナス２０℃で貯蔵した。オリゴヌクレオチド合成はキャッピング工程を省略し、ホスホルアミデートの化学用標準試薬を用いた。保護基除去後の遮断を伴う、標的配列の補体に対応した順番に塩基を結合するＡＢＩ３８１Ａをプログラムした。規模は0.2μｍｏｌの合成に相当し、反応室を丁度満たせるような容積になるように少し調整した。３０％アンモニア中の最終保護基除去は、ナイロンブロック（３００×３００ ×３０ｍｍ）にカットし、シリコンゴム（厚さ３ｍｍ）のシートによりシールし、正方形の各辺に沿った４本のボルトを用いて２枚のマイルド鋼板（厚さ６ｍｍ）の間にアセンブリ全体をクランプにより室の縁に押しつけた室（２３０×２３０×２０ｍｍ）を包含する特別に作ったボンベの中で行った。５５℃で５〜８時間保持後、ボンベを開放する前に４℃に冷却した。この板をエタノール、続いてＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ（0.01Ｍ,ｐＨ7.8,0.1％ＳＤＳ）とエタノールで洗浄し、さらに空気気流中で乾燥した。ハイブリッド形成反応本発明者らは走査アレイを用いた実験において、５'末端に標識を付けるためにポリヌクレオチドキナーゼを用いてガンマ-³²Ｐ、ガンマ-³³Ｐまたはガンマ-³ ⁵ Ｓ-ＡＴＰにより標識した合成オリゴヌクレオチド類、ＲＮＡリガーゼを用いて５'-³²Ｐシトシン-３'，５'-ジホスフェートにより３'末端に標識したＲＮＡあるいはＴ７またはＳＰ６ポリメラーゼを用いてα-³²Ｐまたはα-³⁵ＳＵＴＰを組み込んだＰＣＲアンプリファイド断片から作ったＤＮＡ断片の転写物、などの種々の標的分子を用いた。これらはすべて優れたハイブリッド形成標的になる。ほとんどのハイブリッド形成反応は３-4.5ＭのＴＭＡＣlまたは1.0ＭのＮaＣlを含有する溶液中で、４-２５℃にて行った。ハイブリッド形成後、これらの板をハイブリッド形成溶媒ですすぎ、クリングフィルムを介して貯蔵りん光体スクリーン（富士ＳＴＩＩＩ）に曝露し、これをＭolecular Ｄynamics 400ＡＰhosphor Ｉmager で走査した。図２と図４に示す実施例では、実験条件は下記の通りであった：ｔＲＮＡ^phe（１０pmol，Ｓigma）をシトシン-３'，５'-ジホスフェート（３０００Ci／mmol，Ａmersham）とＴ４ＲＮＡリガーゼ（９ユニット，Ｐharmacia ）と共にＨＥＰＥＳ緩衝液（５０mＭ，ｐＨ7.4；２０mＭＭgＣl２，3.3mＭＤＴＴ，１μＭＡＴＰ，１０μg/mlＢＳＡ，１０% ＤＭＳＯ）に溶かし、３７℃ で３０分保温後、反応物をスパンカラムで分離しさらに標識したＲＮＡを3.5ＭのＴＭＡ（１０ml）に溶かした。ハイブリッド形成はアレイ表面にその溶液を約１ml適用し、次いで同じ寸法の第２のガラス板を重ねて行った。この“サンドイッチ”を４℃の密封した箱の中に１８-２４時間置いた。板を分離し、アレイをハイブリッド形成溶媒中４℃ですすぎ、上述のように分析した。図４に示した協働実験の場合、Ｄ-ループGCTCTCCCAACT、可変ループGACCTCCAG ATT、または TpsiCループAACACAGGACCTに対応する冷たいオリゴヌクレオチド類を、板に適用する前に、ハイブリッド形成条件下でｔＲＮＡと共に少なくとも１８時間保温した。図面図１すべてがテトラヌクレオチド配列からなる説明のためのアレイである。これは、このフォーマットで表示するためには複雑すぎる、ヘキサヌクレオチドをすべて包含する最小の有用なアレイのサイズの１６分の１である。左側の上から下まである文字は、オリゴヌクレオチド類合成の間の行と列に適用された塩基前駆体の順番を示している。各セルの中の文字は、そのセルの中で合成されたオリゴヌクレオチドの配列を示している。継続的な行または列の各々が前の層から４つを包含するように、次第に拡がる行と列を単に重ねるだけでより大きなアレイができる。すべての場合、このアレイは長さｓの全部で４^sの可能性があるオリゴヌクレオチド配列を包含する。このようなアレイへハイブリッド形成した結果を図３に示す。合成のある段階で４つの塩基すべての混合物を適用することによりより複雑なアレイを作ることができる。たとえば、すべてのオクタヌクレオチド類から、４混合塩基を２つの中央位置に適用しＮ₃Ｘ₂Ｎ₃型のアレイを作ると、４０９６のセルを作ることができる。この場合各セルには１６種類のオクタヌクレオチド類が含まれている。このようなアレイへハイブリッド形成した結果を図３に示す。図２ａ環状パッチ内のガラス基板にオリゴヌクレオチドの前駆体を適用して走査アレイを作る。標的配列の５'末端塩基の補体に対応する第１の塩基は、板の左端に適用され、次いでこの板を所定のオフセットにより動かし、さらに第２の塩基を添加する。このプロセスを配列全体について反復して行う。中央線上に作ったオリゴヌクレオチドの長さは、オフセットにより分割されたセルの直径に等しく、この場合直径＝３０ｍｍ、オフセット＝２．５ｍｍであるから、３０／２．５＝１２の最大オーバーラップが得られる。単一塩基までサイズを小さくした範囲のオリゴヌクレオチド類は中央線をセグメント・フランキングして作られる。上部パネルは末端標識ｔＲＮＡにハイブリッド形成した７６塩基のｔＲＮＡ^ph ^e を表す走査アレイを示している。Ｄ-ループの領域における強いハイブリッド形成、可変ループへのより穏やかなハイブリッド形成、およびアンチコドン・ループおよび分子の５'-末端への非常に弱いハイブリッド形成に留意する必要がある。図２ｂ下のパネルは、同じ領域の試験管で標識を付けた転写物へハイブリッド形成したＨＩＶＴＡＲ要素の７６塩基を表す走査アレイを示している。他のところへのハイブリッド形成より１０倍強い、一つの１２量体への強いハイブリッド形成に留意する必要がある。この１２量体は、隣接１２量体とpseudo-half-knotを形成する他の研究者［Eckerら，1992］が示したループの領域に対応する。図３Ｎ₃ＸＸＮ₃型のアレイへのｔＲＮＡ^pheをハイブリッド形成すると（ここでＮは４種の塩基のいずれか一つでありそしてＸは４種すべての混合物である）、セルに１６の関連配列の混合物を含有するアレイ上に６５５３６種のオクタヌクレオチドがすべて存在する。この結果は配列の領域がほとんどすべてハイブリッド形成に開かれていることを示している。これらは、図２ａに示した走査アレイで詳細に調べることができる。図４ハイブリッド形成溶液にｔＲＮＡ標的と共に非放射性オリゴヌクレオチド類（パネルに示した構造内の位置および正確な１２量体）含有効果。添加したオリゴヌクレオチド類がない場合ハイブリッド形成しない配列の領域への結合の大幅な増加はこれらの領域が開放されていることを示していることに留意する必要がある。第３および第４のパネルは、第２のオリゴヌクレオチドを添加すると、第１のオリゴヌクレオチドのみでは開かれない領域を露呈することを示している。図５ウサギのβ-グロビンｍＲＮＡに対する協働アンチセンス・オリゴヌクレオチド類。ウサギのグロビン系については多くのことが知られている。これは分離されさらに試験管での翻訳により性状決定された最初のｍＲＮＡの一つであった。本発明者らはアンチセンス介入のモデルとしてこのｍＲＮＡを研究に用いた。調製にあたり、本発明者らはこのｍＲＮＡの開始コドン（塩基５４-５６の肉太の文字でマークしたａｔｇ）の周りの１２２塩基に対し相補的なオリゴヌクレオチド類の走査アレイを作った。図に示した折りたたみ構造は、エネルギー最小化プログラムｍｆｏｌｄによって計算した自由エネルギーが最小の構造で、なぐり書きにより表示している。標識付きＲＮＡのハイブリッド形成は分子上の太線でマークした塩基４６-６２に対し相補的な領域で相互作用を示した。本発明者らはこの１７量体に対応するデオキシリボオリゴヌクレオチドを作った。複合体の再ハイブリッド形成は、予想通り、塩基４６-６２の位置にはシグナルはないが、塩基３２-４５には破線でマークした新しいシグナルを示した。コンピューターの予測からは、塩基４６-６２が塩基３２-４５と相互作用する徴候はないので、これは驚くべき結果である。これに反して、これらの塩基の間には９塩基の単一鎖の領域があり、これはあらゆる相互作用を分断するのに十分なものである。したがって、この実験は、エネルギー計算やコンピューターによって作った構造の調査によっては予測することができないようなアンチセンス薬剤の設計に関わりがある相互作用を示唆している。図６ヒトＣＦＴＲ遺伝子（この遺伝子の変異はのう胞性線維症発症の原因である）の領域である、同じ配列への補体から４つのアレイを作った。これらのアレイは、ガラス基板上でヘキサエチレン・グリコールリンカーを用いて誘導したもので Southernら（1994）が記述した通りに作った。ａ）天然のデオキシリボヌクレオチドを３'末端を介してガラスに結びつけた。ｂ）天然のデオキシリボヌクレオチドを５'末端を介してガラスに結びつけた。ｃ）デオキシリボホスホチオエート（このアレイは他の３つに対し反対の方位に露呈されていることに留意する必要がある）。ｄ）リボヌクレオチド。これらのアレイはすべて同一条件下（3.5Ｍテトラメチルアンモニウムクロライド、４℃）で、アレイにより被覆されたＣＦＴＲ遺伝子のエキソン１０の部分である、CCTGGCACCATTAAAGAAAATATCATCTTTGGTGTTTCCTAT配列とハイブリッド形成した。デオキシリボヌクレオチドは両化学方位において本質的に同じ結果を与えるが、類似体であるデオキシリボホスホチオエートとリボヌクレオチドは全く異なった結果を与える。差異は予想通りであるが、この実験はデータを一つの類似体から他の類似体へ外挿する際の困難を示しており、さらに類似体を含むアンチセンス薬剤の候補を同定する場合のアレイ技法の能力を証明している。図７ＨＩＶのＲｅｖ応答要素（ＲＲＥ）は、ウイルスゲノムから遺伝子発現を規制する際のその中心的位置の故に、アンチセンス・オリゴヌクレオチドによる治療手段の立派な潜在的標的であると考えられる。しかし、図７ａに示すように、コンピューターにおける分子モデル化は、ＨＩＶＲＮＡのこの領域が複雑な折りたたみ構造を持つ可能性があることを示唆しており、これはこのＲＮＡのヌクレアーゼへの感受性を分析することにより確認された。この構造ではアンチセンス標的の領域を選択することが困難になる。本発明者らは２段プロセスにおけるハイブリッド形成特性を分析した。第１に、選択された長さのオリゴヌクレオチド類をすべて包含するアレイである、“普遍的”アレイに標識付きＲＮＡをハイブリッド形成した。この実験で、本発明者らは２つの型の普遍的アレイを用いた、すなわち４０９６のヘキサヌクレオチド（図７ｂ）すべてを含有する型のアレイと６５，５３６のオクタヌクレオチド（図７ｃ）すべてを含有する型のアレイの２つである。後者のアレイでは、各セルは一般式ＮＮＮＸＸＮＮＮ（Ｎは特定の塩基、Ｘは４種すべての混合物である）の１６種類のオクタヌクレオチドの混合物を含有する、４０９６のセルのみが存在した。これら普遍的アレイは限定的長さの配列のみを有し、ハイブリッド形成に最も良く利用される標的配列の中の領域を明らかにしているので、使用すべき最適オリゴヌクレオチドを指示しない。これらのエリアを、下記に述べる走査アレイを用いてより詳細に分析した。普遍的アレイを作るために用いた方法はオリゴヌクレオチド類を散布する線において主要オリゴヌクレオチド類の半分の長さのオリゴヌクレオチド類を生じる。分析の結果驚いたことは、これらのトリヌクレオチドとテトラヌクレオチドの中には標的と強く相互作用するものがあることである（図７ａとｂの均一な強度の線を参照）。他の標的を用いた場合、オリゴヌクレオチド配列は異なるが、同じ特徴が見られる。あるケース(Southernら，1994)では、本発明者らは標的とジヌクレオチドの間の相互作用を認めた。これらの相互作用は標的ＲＮＡの折りたたみの結果のようである。この折りたたみはオリゴヌクレオチドとの相互作用に特に好都合である構造、たとえば、重層半らせん、における配列の短いストレッチを与えるかもしれない。これらの観察はアレイ分析の利用に基づく、アンチセンス設計への新規な方法を示唆している。すなわち、この構造において特異的な方法で相互作用すると見られる短いオリゴヌクレオチド類は標的にとって特異的なアンチセンス剤のカクテルに、混合物の１成分としてあるいは結合した複合分子の１成分として、組み込むことができる。図８図７で分析したＲＲＥの領域は、最長１７量体のオリゴデオキシリボオリゴヌクレオチド類から作った走査アレイについも分析した。Ｒｅｖ結合領域においてただ一つのオリゴヌクレオチドが3.5ＭのＴＭＡＣｌ中３７℃で強い相互作用を示した（図８ａ）。このオリゴヌクレオチドを溶液中で標的と結合した場合および複合体をアレイに再度適用した場合、溶液オリゴヌクレオチドがないと結合しないオリゴヌクレオチド類といくつかの部位が相互作用を示した（図８ｂ）。［１ＭのＮaＣl中２０℃にてホスホチオエート類似オリゴヌクレオチド類の配列上でＲＲＥ標的を分析した場合同じ領域に結合した（図８ｃ）］。図９ＲＮＡ分子に結合して作用することが知られている薬剤であるネオマイシンの存在下で、図８に示す分析を繰り返し行った。ネオマイシンが存在すると、オリゴヌクレオチド類とＲＲＥの相互作用のパターンがかなり変わった（図９ａとｂ）。特に、ネオマイシンが存在しないとほとんど結合しない領域が、ネオマイシンが存在するとより強く結合する。図１０マグネシウムはＲＮＡの折りたたみ特性に顕著な効果があることが知られており、本発明者らは図２ａと４で示した実験に用いた走査アレイを用いてｔＲＮＡの結合特性に対するマグネシウムの効果について調べた。マグネシウムイオンがないと結合しない（図１０ａ）オリゴヌクレオチド類がマグネシウムが存在すると結合することがある（図１０ｂ）。図１１ＴＡＲ要素はＨＩＶのもう一つの重要な標的である。本発明者らは天然オリゴデオキシリボオリゴヌクレオチド類のアレイ、および普通アンチセンス剤として使用される類似体、２'-Ｏ-メチルリボヌクレオチドを用いて作ったアレイとのそのハイブリッド形成特性を分析した（図１１ｃ）。同じ領域が両ケースでハイブリッド形成、すなわちステムループのループを形成することが分かったが、この領域で二重らせんを形成する配列は一つか二つに過ぎず、最強の相互作用を有する配列の正確な位置は各類似体と異なっている。天然オリゴデオキシリボオリゴヌクレオチド類を用いた実験において、本発明者らは“パイオニア”としてアンチセンス配列を選び（図２ｂと１１ａ）、さらに構造を開くためにアンチセンス配列を用いた。溶液リガンドに対応する領域における結合の喪失と他の部位での新たな結合に留意する必要がある。複合体がアレイに結合すると、複合体がないと結合しなかったオリゴヌクレオチド類からかなりの収率で二重らせんが得られる（図１１ｂ）。結論上記実施例は、固体支持体上のアレイに関する分析により可能となったリガンドの設計、性状決定および発見への新しい方法をいくつか説明している。本発明者らはこの方法がどのようにして： −リガンドとの相互作用に対し開かれている標的領域を同定することができるか、 −いずれか単独よりも通常は強く、異なった相互作用を与えるために協働作用するリガンドの組み合わせを同定することができるか、 −予想外の方法でそれらを結合させられるような構造になっている標的（たとえば、非常に短いオリゴヌクレオチド類への標的ＲＮＡ）の領域を発見することができるか、を示した。実施例で用いたアレイと協働リガンドは、種々の型の化学物質から作ったもので、この方法が普遍的な方法であることを説明している。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年３月５日【補正内容】差し替え用紙第２頁の翻訳文各酵素は、異なるリガンドの標的となり、代謝経路を介して代謝速度に１つの酵素により生ずるよりも大きな効果を生ずる。さらに、薬剤を併用すると治療薬に対する耐性の発現を防止できるという利点がある。すなわち、薬剤の併用は、しばらくすろと、変異の結果として耐性が発現する抗生物質や抗癌剤を使用する場合の主要課題である。薬剤が細胞内で異種分子を標的とする混合物から構成されているならば、耐性を得るために複数の変異が必要になるであろう。明らかに、２つの変異が２つの薬剤に同時に耐性を発現する２つのランダムな変異を１つの細胞が受ける機会は、単独の薬剤の作用を抑制するために必要な単独の変異よりはるかに少ない。本発明本発明は、リガンドを比較する方法を提供する。この方法は、分子内構造を有するポリマー性分子である標的および固体表面でアレイの形をした複数の異なるリガンドを用意し、リガンドのアレイに溶液中の標的を適用し、そしてアレイの異なるリガンドと標的の相互作用の間の定量的な差を観察することを含む。但し、リガンドがオリゴヌクレオチド類またはオリゴヌクレオチド類似体でない場合には、標的は核酸である。本発明はまた、一つの標的に特異なリガンドの組み合わせを決定する方法を提供する。この方法は：ａ）標的に少なくとも１リガンドを結合して、標的複合体を形成し、ｂ）標的複合体を、他のリガンドと標的複合体の間で相互作用が起きる条件下で固体表面にアレイを形成する他のリガンドに適用し、そしてｃ）標的複合体と相互作用する少なくとも一つの他のリガンドを同定するの各工程を含む。差し替え用紙第２６−２７頁の翻訳文請求の範囲１．リガンドを比較する方法であって、分子内構造を有するポリマー性分子である標的および固体表面でアレイの形をした複数の異なるリガンドを用意し、リガンドのアレイに溶液中の標的を適用し、そしてアレイの異なるリガンドと標的の相互作用の間の定量的な差を観察することを含み；但し、リガンドがオリゴヌクレオチド類またはオリゴヌクレオチド類似体でない場合には、標的は核酸である；ことを特徴とする方法。。２．標的に対して特異的なリガンドの組み合わせを決定する方法であって、ａ）標的に少なくとも一つのリガンドを結合して標的複合体を形成し、ｂ）他のリガンドと標的複合体の間で相互作用を可能にする条件下で、標的複合体を固体表面上にアレイを形成している他のリガンドに適用し、ｃ）標的複合体と相互作用する少なくとも一つの他のリガンドを同定する、の各工程を含む方法。３．標的複合体に少なくとも一つの他のリガンドを結合し、次に工程ｂ）およびｃ）を反復する追加工程を含む、請求の範囲第２項に記載の方法。４．一つのリガンドがオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体であり、別のリガンドがペプチドであることを特徴とする、請求の範囲第２項または第３項に記載の方法。５．２つのリガンドがリンカーにより結合していることを特徴とする、請求の範囲第２項から第４項のいずれか一つに記載の方法。６．工程ａ）において標的に結合して標的複合体を形成すべき少なくとも一つのリガンドが、標的をリガンドのライブラリーと混合し、標的に結合する少なくとも一つのリガンドをライブラリーから選択ことにより選択される、請求の範囲第２項から第５項のいずれか一つに記載の方法。７．標的が核酸であり、リガンドがオリゴヌクレオチド類またはオリゴヌクレオチド類似体であることを特徴とする、請求の範囲第１項から第６項のいずれか一つに記載の方法。８．リガンドが、オリゴアリファティック・エーテル類、挿入剤、正に荷電した残基、キレート剤および親油性剤から選択される他の化学的部分の付加または置換により修飾されたオリゴヌクレオチド類似体であることを特徴とする、請求の範囲第７項に記載の方法。９．リガンドがリボザイムの基礎を形成することを特徴とする、請求の範囲第１項から第８項のいずれか一つに記載の方法。１０．標的および一つ以上のリガンドの化学的種類が異なつていることを特徴とする、請求の範囲第１項から第９項のいずれか一つに記載の方法。１１．少なくとも一つのリガンドが標的に共有結合で結合していることを特徴とする、請求の範囲第１項から第１０項のいずれか一つに記載の方法。１２．標的がＲＮＡであることを特徴とする、請求の範囲第１項から第１１項のいずれか一つに記載の方法。１３．標的が二次または三次構造を有する分子であり、二次または三次構造を保持するような条件下でリガンドのアレイと相互作用させることを特徴とする、請求の範囲第１項から第１２項のいずれか一つに記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ケース−グリーン，スティーヴン・チャールズイギリス国オックスフォードオーエックス４・１ジェイピー，ユニオン・ストリート 32エイ，シルヴィア・ハウス，フラット２

Claims

【特許請求の範囲】１．薬剤を設計する方法であって、標的を用意し、リガンドに標的を適用して固体表面にアレイを形成し、リガンドと前記標的の間の相互作用を観察し、さらにこの観察を標的と相互作用する薬剤の設計に利用することを含む方法。２．標的に対して特異的なリガンドの組み合わせを決定する方法であって、ａ）標的に少なくとも一つのリガンドを結合して標的複合体を形成し、ｂ）他のリガンドと標的複合体の間で相互作用を可能にする条件下で、標的複合体を固体表面上にアレイを形成している他のリガンドに適用し、ｃ）標的複合体と相互作用する少なくとも一つの他のリガンドを同定する、の各工程を含む方法。３．標的複合体に少なくとも一つの他のリガンドを結合し、次に工程ｂ）およびｃ）を反復する追加工程を含む、請求の範囲第２項に記載の方法。４．標的が核酸であり、リガンドがオリゴヌクレオチド類またはオリゴヌクレオチド類似体であることを特徴とする、請求の範囲第１項から第３項のいずれか一つに記載の方法。５．一つのリガンドがオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体であり、別のリガンドがペプチドであることを特徴とする、請求の範囲第２項または第３項に記載の方法。６．２つのリガンドがリンカーにより結合していることを特徴とする、請求の範囲第２項から第５項のいずれか一つに記載の方法。７．リガンドが、オリゴアリファティック・エーテル類、挿入剤、正に荷電した残基、キレート剤および親油性剤から選択される他の化学的部分の付加または置換により修飾されたオリゴヌクレオチド類似体であることを特徴とする、請求の範囲第４項から第６項のいずれか一つに記載の方法。８．リガンドがリボザイムの基礎を形成することを特徴とする、請求の範囲第１項から第７項のいずれか一つに記載の方法。９．標的および一つ以上のリガンドの化学的種類が異なっていることを特徴とする、請求の範囲第１項から第８項のいずれか一つに記載の方法。１０．少なくとも一つのリガンドが標的に共有結合で結合していることを特徴とする、請求の範囲第１項から第９項のいずれか一つに記載の方法。１１．工程ａ）において標的に結合して標的複合体を形成すべき少なくとも一つのリガンドが、標的をリガンドのライブラリーと混合し、標的に結合する少なくとも一つのリガンドをライブラリーから選択ことにより選択される、請求の範囲第２項から第１０項のいずれか一つに記載の方法。１２．標的がＲＮＡであることを特徴とする、請求の範囲第１項から第１１項のいずれか一つに記載の方法。１３．標的が二次または三次構造を有する分子であり、二次または三次構造を保持するような条件下でリガンドのアレイと相互作用させることを特徴とする、請求の範囲第１項から第１２項のいずれか一つに記載の方法。