JPH09508209A - 毛細管電気泳動を用いる被検体の均一免疫検定および酵素ベース検定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 毛細管電気泳動と蛍光検出システムを用いる均一免疫検定と酵素−基質検定とが記載されている。この方法は、サンプル中の被検体の濃度を検出および／または定量するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称 毛細管電気泳動を用いる被検体の均一免疫検定および酵素ベース検定発明の分野 本発明は、高感度で迅速な均一免疫検定および酵素基質検定に関する。より詳 細には、本発明は、標的被検体の微量濃度の検出および／または定量を可能とす る検出可能に標識した免疫化学物質と毛細管電気泳動とを用いる均一検定に関す る。本発明は、検定を行う方法と、それに用いられる試薬との両方に関する。発明の背景 薬学的薬剤、代謝物または毒素の検出および／またはその濃度の定量の能力は 、現代における病気の診断と管理の中心的な局面である。 ある場合には、そのような被検体は、その生物学的な活性を検定することによ り直接的に検出される。しかしながら、ほとんどの場合、抗体に特異的に結合す るその能力によって、またはその物理的特性（例えば電気泳動的な移動度）によ りそのような分子を検出することがより能率的である。 免疫検定は、抗体が特定の標的被検体を特異的に認識してそれに結合する能力 を活用する検定システムである。免疫検定の概念は、抗体とその対応抗原との間 の特異的化学反応に基づいている。定量は、抗体に結合している抗原を、遊離抗 原から分離し、溶液中の抗 体に結合している抗原または遊離抗原の検出を、特異的な分析スキームにより行 うことを含んでいる。そのような検定は、現代の診断で広範囲に使用されている （次を参照：Ｆａｃｋｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ８： ２１３−２１９（１９８５）； Ｙｏｌｋｅｎ，Ｒ．Ｈ． Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃ ｔ．Ｄｉｓ ． ４：３５（１９８２）； Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｗ．Ｐ．， Ｉｎ：Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９８５）； Ｎｇｏ，Ｔ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｅｄｉｃａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， Ｐｌｅｎｕ ｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８５））。 免疫検定には種々の変法があり、決定的な段階は、物理的分離、又は識別およ び検出である。物理的分離を必要とする免疫検定は不均一免疫検定と呼ばれる。 対照的に、均一免疫検定は、結合してない種から結合した種の除去が不必要なも のを指す。均一検定は、分離段階がなく、より簡単に自動化されるので、多数の 患者のスクリーニングを必要とする用途において、不均一検定よりもより望まし い。 １０^-9Ｍよりも低い濃度レベルで存在する被検体は、固相に基づく「サンドイ ッチ」または拮抗法を用いて通常は検定される。典型的には、そのような検定で 、対象となる抗原は、判断の基となる量（ｊｕｄｉｃｉｏｕｓ ａｍｏｕｎｔ） の抗体に対して標識した抗原と拮抗する。直接的な免疫検定は、典型的には、抗 原の異なる抗原部位に結合する２つの抗体を含むサンドイッチ検定である。１つ の抗体は、固相物質に結合し、抗原を捕らえるように用いられる。 もう一方の抗体は、標識され、結合した抗原から定量的な情報を生じるように用 いられる（Ｃｏｎｅ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｆｏｒｅｎｓ．Ｓｃｉ． ３ ５ ：７８６−７８１（１９９０）；Ｂａｕｇｈ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｆ ｏｒｅｎｓ．Ｓｃｉ． ３６：７９−８５（１９９１）； Ｓｔａｎｄｅｆｅｒ ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ． ３７：７３３−７３８（１ ９９１））。 抗体結合の検出を促進するため、１つまたはそれ以上の反応被検体が典型的に は標識される（例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光性部分、化学発光性部分、 ビーズなどの巨視的標識等による）（次を参照：Ｃｈａｒｄ，Ｔ． ｅｔ ａｌ ． ， Ｉｎ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｗｏｒｋ，Ｔ ．Ｓ．，Ｅｄ．）， Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃ ｏｍｐａｎｙ，ＮＹ（１９７８）； Ｋｅｍｅｎｙ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ． （ Ｅｄｓ．）， ＥＬＩＳＡ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｉ ｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９ ８８））。放射性同位元素は免疫検定で長い間使用されてきた。例えば、Ｏ’Ｌ ｅａｒｙ，Ｔ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．は、ジゴキシン血清濃度についての放射線免疫 検定を説明している（Ｏ’Ｌｅａｒｙ，Ｔ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ．Ｃ ｈｅｍ ．２５：３３２−３３４（１９７９））。そのような危険な物質を扱う困 難さおよび放射性崩壊の問題は、ほかの標識を使用する免疫検定の開発へとつな がった。 特に、酵素は、免疫検定の種々のフォーマットで標識として現在 ，Ｓｙｖａ Ｃｏ．）が、アセタミノフェン、コカインおよびほかの被検体を検 定するのに使用されてきた（Ｈｅｌｐｅｒ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ ． ８１：６０２−６１０（１９８４）； Ｃａｍｂｅ ｌｌ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈ ｅｍ．２４ ：１５５−１５９（１９８６）； Ｋｈａｎｎａ，Ｐ．，米国特許第 ５，１０３，０２１号； Ｃｏｎｅ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｆｏｒｅｎｓ ．Ｓｃｉ． ３５：７８６−７８１（１９９０）；Ｂａｕｇｈ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ． ，Ｊ．Ｆｏｒｅｎｓ．Ｓｃｉ．３６：７９−８５（１９９１）； Ｓｔａ ｎｄｅｆｅｒ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：７３３−７ ３８（１９９１）； Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ ａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒａｐ．２４１ ：５２７−５３３（１９８７）； Ｂａｒｔｏｌｏｎｅ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒａｍ ｃｏｌ． ３７：４７６３−４７７４（１９８８））。 酵素に加え、蛍光性部分も標識としてしばしば用いられる（次を参照：Ｉｃｈ ｉｎｏｓｅ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ：Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ａｎａｌ ｙｓｉｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ，Ｖｏｌ １１０ ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｗｉｎｅｆｏｒｄｎｅｒ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ ．，Ｅｄｓ）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９１ ）。例えば、コカインについての蛍光性分極免疫検定フォーマット がわかっている（Ｓｃｈｗａｔｚ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｅｍ ｅｒｇ．Ｍｅｄ． ９：１６６−１７０（１９９０） ｉｚｕｍｉ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ．Ｅｘｐｅｒ．Ｍｅｄ．１５ ５ ：１５９−（１９８８）； Ｅｄｉｎｂｏｒｏ，Ｌ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌ ｉｎ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２９ ：２４１−（１９９１）； Ｏｋｕｒｏｄｕｄｕ， Ａ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３８：１０４０（１９９２）およ び血清ジゴキシンレベル（Ｏｋｕｒｏｄｕｄｕ，Ａ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉ ｎ．Ｃｈｅｍ．３８ ：１０４０（１９９２））の検定に使用されてきた。Ｗｏｎ ｇ，Ｓ．Ｈ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，はモノクローナル抗体により起こされる、蛍光 に基づく検定プロトコール中でのジゴキシン濃度を測定する自動化した（ＯＰＵ Ｓ）検定装置の使用を説明している（Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｈ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃ ｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３８ ：９９６（１９９２）。Ｌｅｅ，Ｄ．Ｈ．ｅｔ ａｌ． も蛍光分極検定と化学発光検定フォーマットを使用してジゴキシンレベルを検定 することを述べている（Ｌｅｅ，Ｄ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ． ３６ ：１１２１（１９９０）。 上に示したように、電気泳動法も、標的被検体の検出を促進するように使用さ れてきた。そのような方法は、溶液中の分子が固有の電荷を有している事実を利 用する。そこで電界の存在下では、それぞれの分子種は特有な「電気泳動」移動 度で泳動し、存在するさまざまな種が互いに分離されるようになる。そのような 電界の影響下で、すべての変異体は、その変異体の電荷とは反対の、特定の電荷 に向かって移動することになる：より低い電気泳動移動度を有するものは、（比 較的）より高い電気泳動移動度を有するのものよりもより遅く移動することにな り、よって、より高い電気移動度を有するものから分離される。 分子種を分離する電気泳動法の能力を免疫検定の検出能力と組み合わせる免疫 学的電気泳動法、たとえば、免疫固定電気泳動（「ＩＦＥ」、免疫電気泳動（「 ＩＥＰ」）および免疫サブトラクション電気泳動（「ＩＳＥ」）が述べられてき た。そのような検定は、血清タンパク質を検出し定量するために使用されてきた 。 ＩＥＰとＩＦＥは、関連した手法である（Ｂａｃｋｍａｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＥＰ−２．”Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ａｐｐｌｉｃａ ｔｉｏｎｓ Ｇｕｉｄｅ．”（１９９１））。ＩＦＥは、第１段階でアガロース ゲルタンパク質電気泳動を用い、第２段階で免疫沈降を用いる２段階手法である 。免疫グロブリンの分析のための臨床設定では、臨床サンプル（例えば、全血、 血清、血漿、尿、脳脊髄液）が、アガロースゲル上の多数の位置（「レーン」） に置かれる。ゲルを含んでいるサンプルに電界がかけられると、免疫グロブリン が、陰極から陽極にゲルを横断するようになる。その後、特異的免疫グロブリン クラス（典型的には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、κおよびλ）に対する抗体を含 んでなる抗血清が、特定のレーンに適用される。ゲルと抗血清とが温置され、そ の間に、特異的免疫グロブリンと抗体との間に免疫複合体が形成する。そのよう な免疫複合体の位置は、染色により視認される。ゲル上で参照パターンを使用す ることにより、ゲル上に存在する免疫グロブリンの種類を決定できる。特定バン ドの存在は、かくして、特 定の免疫グロブリンタイプに対応するＭタンパク質の存在を示す。ＩＦＥを行う 方法は、Ｃｈｅｎ，Ｆ−．Ｔ．Ａ．米国特許第５，２０２，００６号； Ｃｈｅ ｎ，Ｆ−．Ｔ．Ａ．米国特許第５，１２０，４１３号； Ｈｓｉｅｈ，Ｙ−．Ｚ ．ｅｔ ａｌ．米国特許第５，１４５，５６７号（参照してここに取り入れられ る）により開示されている。 ｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａｌｉｆ．，Ｕ．Ｓ．Ａ． ）はＩＦＥとＩＥＰの両方を行う商業的に入手可能なシステムである（次を参照 ：Ｇｅｂｏｔｔ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，６６９，３６３号； Ｐｅｎｔｏ ｎｅｙ，Ｓ．Ｌ．米国特許第５，２０８，４６６号（参照してここに取り入れら れる）； Ｂ Ｓｅｒｕｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ＩＩ（ＳＰ Ｅ−ＩＩ）Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｕｉｄｅ”（１９９０）； Ｂｅｃｋ ｍａｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＥＰ−２．”Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ ｅｓｉｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｕｉｄｅ”（１９９１）； Ｂｅｃｋ ｍａｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＥＰ−４ ”Ｉｍｍｕｎｏｆｉｘａｔｉｏｎ Ｅｌ ｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｕｉｄｓ”（１９ ９１）； Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ−ＩＦＥ” （１９９０）； Ｂｅｃｋｍ ａｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＥＰ−６ ”Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｅｌ ｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉｎ ｔ ｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｇａｍｍｏｐａｔｈ ｉｅｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｓｅｒｕｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ ｓ．”（１９９０）； Ｃｈｅｎ，Ｆ−．Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈ ｅｍ．３７ ：１４−１９（１９９１））。 免疫サブトラクション電気泳動（ＩＳＥ）は、ＩＦＥの一種である（Ａｇｕｚ ｚｉ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｓｔｒａｔｔｏ ｄａｌ．Ｂｏｌｌ．１ｓｔ Ｓｉ ｅｒｏｔｅｒ，Ｍｉｌａｎｅｓｅ５６ ：２１２−２１６（１９７７）； Ｗｈｉ ｔｅ，Ｗ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．１０：５７１−５７ ４（１９８６）； Ｍｅｒｌｉｎｉ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅ ｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１ ：８４１−８４４（１９８３）； Ｌｉｕ，Ｃ−．Ｍ ．ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，２２８，９６０号（ここに参照して取り入れら れる））。しかしながら、ＩＳＥでは、サンプルは、特定の「標的」タンパク質 に向けられた不溶化された抗体により前処理される。標的タンパク質が存在する と、抗体に結合し、サンプルから除かれる。次にサンプルがゲルに適用され、電 気泳動を受ける。標的タンパク質が初めのサンプルに存在すると、ゲル中のタン パク質の視認は、抗体により除去されていないなら、除去されたバンドが移行し たゲルの位置で「ネガティブバンド（負のバンド、すなわち染色の不在）を明ら かにする。かくて、特定のバンドの不在が、サンプル中の対応する標的タンパク 質の存在を示す。 ＩＥＰ、ＩＦＥおよびＩＳＥは、それぞれ、多段階の操作、並びに分離ゲルと 信号を生ずる染色剤の調製と使用を必要とする。これ らの手法における多大な労力を要することは、臨床設定での明白な障害である。 加えて、これらの手法にまつわる廃棄すべき最終生成物の量は、これらの手法に 関連する類似のコストをさらに押し上げる。 臨床設定でのこれらの方法の欠陥の観点から、より低いコストでより大きな処 理量を可能とする労力のより集約しない方法が求められている。１つのそのよう な方法は、「毛細管電気泳動」（「ＣＥ」）（Ｃｈｅｎ，Ｆ−．Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．７７ ：１４−１９（１９９１）； Ｎｉｅｌｓｅ ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．５３９：１７７（１９９１）； 米国特許第５，１２０，４１３号（ここに参照して取り入れられる））である 。毛細管電気泳動（ＣＥ）は、イオン性種例えばタンパク質、ペプチドおよびほ かの水溶性分子の分離にさらに開発された最も強力な手段の１つである。 この方法は、タンパク質（たとえば、ヒト成長ホルモン）（Ｇｒｏｓｓｍａｎ ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６１：１１８６−１１９４（１９８ ９））およびほかの荷電した物質の迅速で能率的な分離を可能とする。臨床的サ ンプルの成分の分離は２０分未満で典型的に達成される。血漿および血清サンプ ル中のタンパク質の分離は、Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（Ｓｃ ｉｅｎｃｅ２２２ ：２６６−２７２（１９８３））およびＨｊｅｒｔｅｎ，Ｓ． （Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １１：６５５−６９０）（１９９０））に よって試みられた。未処理溶融シリカ毛細管中でのＣＥによる血清タンパク質の 日常的な分析の実行可能性は、立証されている（Ｃｈｅｎ，Ｆ−．Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃ ｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７ ：１４−１９（１９９１）； Ｇｏｒｄｏｎ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３ ：６９−７２（１９９１））。 通常、ＣＥは、毛細管、すなわち約２μｍ〜約２０００μｍ（好ましくは約５ ０μｍ未満、最も好ましくは約２５μｍ以下）の内径を有する管にサンプルを導 入し、管に電界をかけることを含む（Ｃｈｅｎ，Ｆ−．Ｔ．Ａ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍ ａｔｏｇｒ．５１６ ：６９−７８（１９９１）； Ｃｈｅｎ，Ｆ−．Ｔ．Ａ．ｅ ｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１５ ：１１４３−１１６１（１９９２） ）。サンプル成分のそれぞれは、それ自体の個々の電気泳動移動度を有している ので、より大きな移動度を有するものは、より遅い移動度を有するものよりも毛 細管をより速く通り抜ける。したがって、サンプルの成分は、管を通る移行の間 に、毛細管の不連続な帯域に分離される。（Ｈｅｅｇａｒｄ，Ｎ．Ｈ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６４ ：２４７９−２４８２（１９９２）； Ｇｏ ｒｄｏｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：６９−７２（１９ ９１）； Ｆ−．Ｔ．Ａ．米国特許第５，２０２，００６号； Ｃｈｅｎ．Ｆ− ．Ｔ．Ａ．米国特許第５，１２０，４１３号； Ｈｓｅｉｈ，Ｙ−．Ｚ．ｅｔ ａｌ ．米国特許第５，１４５，５６７号）。この方法は、自動化によく適してい る、なぜなら、便利なオンライン注入、検出およびリアルタイムデータ分析を与 えるからである。ＣＥでのタンパク質の検出は、通常、２００ｎｍまたはその近 辺でのペプチド結合の固有紫外線（ＵＶ）吸光度に基づいていて、約１０^-5Ｍの 検出限界を与える。しかしながら、蛍光に基づく検出検定も、記載されている（ Ｌｅｅ，Ｔ．Ｔ．ｅｔ ａ ｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．５９５ ：３１９−３２５（１９９２））。 ＣＥに用いられる毛細管カラムは、約１０ｖ／ｃｍ〜約１０００ｖ／ｃｍの適 用電気泳動場の広い範囲に耐え得なければならない。溶融シリカが、そのような 電圧に耐えられ、また内壁がイオン化して所望の電気浸透性フロー（流れ）を起 こす負の電荷を生じるので、毛細管のための好ましい材料である。 しかしながら、ある場合では、溶融シリカの使用は、望ましくない作用を伴い 得る。たとえば、タンパク質は、正に荷電した部分と負に荷電した部分の両方か らなる高分子電解質である。アルギニンおよびリシン残基のｅ−ＮＨ₂基および グアニジニウム基のｐＫａはそれぞれ１２．０と１０．５であり、これらの基は 、ａ−ＮＨ２末端（これは、７．５〜９のｐＫａを有している）とヒスチジン残 基以外、タンパク質中で正に荷電した部分のほとんどをなす。溶融シリカ表面は 、陽イオン交換体として働く弱い酸性シラノール基を含むので、タンパク質−シ リカ表面相互作用は、イオン交換現象と見ることができる（Ｌａｕｅｒ，Ｈ．Ｈ ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５８：１６６−１６９（１９８６）； Ｇｒｅｎｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｈｏｍａｔｏｇｒ．４７８：６３−７ ０（１９８９））。未処理溶融シリカ毛細管中でタンパク質を電気泳動にかける 初期の試みでは、サンプル帯域のブロードなピークと再現性のない移動をもたら すのみであった（Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２ ：２６６−２７２（１９８３））。シリカ壁とタンパク質の相互作用は、 未処理溶融シリカ毛細管中のＣＥによるタンパク質分離の効率を悪くする原因と 考えられている。 れらの組み合わせの物質で被覆された毛細管は、電気泳動分離の処理の間に未処 理の壁へのタンパク質吸収を制限することがわかった。そのような被覆毛細管は 、広い用途をもってきた。しかしながら、最終的に、これらの皮膜は予想されな いようにして分解する。したがって、未処理毛細管の使用が通常は好ましい。 タンパク質−シリカの相互作用を避けるか、最小にするため、未処理溶融シリ カ毛細管中でのＣＥによるタンパク質分離は、サンプルタンパク質の等電点より も実質的に高いｐＨ（Ｌａｕｅｒ，Ｈ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ ．５８ ：１６６−１６９（１９８６）またはｐＨ≦２．５（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ，Ｒ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：２３２２−２３２７（１９８８））を有す る緩衝液中か、または高い塩濃度を有する比較的塩基性の緩衝液中（Ｇｒｅｅｎ ｅ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｏｍａｔｏｇｒ．４７８：６３−７０（１ ９８９））で、以前は行われた。Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｈ ｒｏｍａｔｏｇｒ．４７８ ：６３−７０（１９８９））は、ｐＨ９．０の０．２ ５Ｍの硫酸カリウム中の０．１ＭのＣＨＥＳ（ＣＨＥＳ：２−（シクロヘキシル アミノ）エタンスルホン酸）緩衝液を用いて未処理溶融シリカカラム中でＣＥに よりモデルタンパク質の分離の高い効率を証明した。しかしながら、０．２５Ｍ 硫酸カリウム中のｐＨそれぞれ７．０と８．０でのＢＥＳ（ＢＥＳ：Ｎ，Ｎ−ビ ス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）およびＨＥＰＥＳ （ＨＥＰＥＳ：４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン 酸）のような同様な双性イオン緩衝液システムを用いることによれば、モデルタ ンパク質の分離は不十分である。緩衝液のｐＨが９．０から７．０に減少すると 、タンパク質は、より正に荷電し、それによりタンパク質−シリカ壁の相互作用 が増加する。この増加した相互作用を避けるため、硫酸カリウムの量を増加させ なければならなく、結果としてＣＥにおいて高い伝導性となる。さらに、複合体 混合物中の、例えば、血清、腹水液および組織抽出物の中のタンパク質は、脂質 および関連するタンパク質の存在により、分離が比較的に困難である。 サンプル中の被検体、特にタンパク質、その濃度を正確に検出し、定量する重 要さの観点で、モデルタンパク質および複合タンパク質混合物の分離を可能とす る一般的に適用可能な方法を開発することが特に望ましい。有機被検体（例えば 、汚染物質、毒素など）を分離するのに追加的に用いられ得、検出の容易な手段 を与え得る毛細管電気泳動法も、特に望ましい。本発明はそのような方法を提供 する。発明の要約 本発明は、標的被検体の微量濃度の検出および／または定量を可能とする検出 可能に標識した免疫化学物質または酵素基質と毛細管電気泳動を用いる高度に鋭 敏で迅速な均一免疫検定および酵素−基質検定を提供する。 詳細には、本発明は、サンプル中の被検体の濃度を検定する方法であって、 （Ａ）発蛍光団を含みかつ被検体に特異的に結合し得る過剰の免 疫グロブリンの存在下、免疫グロブリンと被検体とが免疫グロブリン−被検体複 合体を形成するのに十分な条件下で行われるように前記サンプルを温置し、 （Ｂ）複合体化していない免疫グロブリンから免疫グロブリン−被検体複合体 を分離するのに十分な条件下で行われるように、段階（Ａ）の所定量の温置され たサンプルを毛細管電気泳動に付し、そして （Ｃ）発蛍光団の蛍光を誘発させることにより免疫グロブリン−被検体複合体 を検出し、そしてサンプル中の被検体の濃度に正比例する、誘発された蛍光を検 出することにより被検体の濃度を検定する 各段階を含んでなる方法を提供する。 典型的実施態様は、また、酵素を含むサンプルが、標識されたタンパク質に特 異的に結合することが許容される酵素−基質反応を含み、酵素−基質反応の反応 生成物がＣＥにより分析される。そのような方法は、 （Ａ）サンプルを、発蛍光団を含みかつ酵素に特異的に結合し得る酵素基質の 存在下、酵素基質と酵素とが酵素基質−酵素複合体を形成し反応生成物を形成す るように反応するのに十分な条件下で行われるように温置し、 （Ｂ）標識した酵素基質から反応生成物を分離するのに十分な条件下で行われ るように、段階（Ａ）の所定量の温置されたサンプルを毛細管電気泳動に付し、 そして （Ｃ）発蛍光団の蛍光を誘発させ、サンプル中の反応生成物の濃度に正比例す る、誘発された蛍光を検出することにより反応生成物 を検定する 各段階を含んでなる。 本発明に従えば、発蛍光団を含む免疫グロブリンおよび発蛍光団を含む酵素基 質は、標識づけ反応の間に発蛍光団により標識された免疫グロブリンおよび酵素 基質である。 本発明は、また、特に、フルオロセイン、イソチオシアネート、ローダミン、 フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒ ドラベル、フルオレサミン、テトラメチルローダミン、およびＢＯＤＩＰＹ標識 したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された発蛍光団の使用に関する。 本発明は、また、サンプル中の被検体の濃度を検定する方法であって、 （Ａ）被検体および発蛍光団に特異的かつ拮抗的に結合し得る免疫グロブリン の存在下、免疫グロブリンと被検体とがまたは免疫グロブリンと発蛍光団とが免 疫グロブリン−被検体複合体を形成するのに十分な条件下で行われるように前記 サンプルを温置し、 （Ｂ）未複合化発蛍光団から複合体を分離するのに十分な条件下で行われるよ うに、段階（Ａ）の所定量の免疫グロブリン−被検体または免疫グロブリン−発 蛍光団複合体を毛細管電気泳動に付し、そして （Ｃ）発蛍光団の蛍光を誘発させることにより免疫グロブリン−発蛍光団複合 体を検出し、そしてサンプル中の被検体の濃度に反比例する、誘発された蛍光を 検出することにより被検体の濃度を検定する 各段階を含んでなる方法に関する。 本発明は、上記の方法の実施態様に特に関し、段階（Ａ）で、発蛍光団が、被 検体誘導体、特に、少なくとも１つのヌクレオチド残基を含むものであり、フル オロセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシア ニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドラベル、フルオレサミン、テ トラメチルローダミン、ＢＯＤＩＰＹ標識したオリゴヌクレオチドからなる群か ら選択された蛍光部分を含む。 本発明は、特に、上記方法の実施態様で、被検体誘導体が、蛍光部分を含む少 なくとも１つのヌクレオチド残基を有するオリゴヌクレオチド（好ましくは１０ −量体）を含んでいる実施態様に関する。 本発明は、特に、上記方法実施態様で、発蛍光団が、次式： Ａ−３’−［Ｎ］_x−５’−Ｆ （式中、Ａは検定される被検体であり、Ｎはヌクレオチド誘導体であり、ｘはヌ クレオチド残基の数で、１〜２０の値（特に約１０）であり、およびＦは蛍光部 分（特にテトラメチルローダミン）である。） を有する実施態様に関する。 本発明は、特に、被検体がタンパク質または薬学的化合物であり、サンプルが 、血液、血清、脳脊髄液、尿およびミルクからなる群から選択されるか、または 被検体が非タンパク質有機分子であり、サンプルが、水、土、廃棄物および食物 からなる群から選択される上記方法の使用に関する。 本発明は、特に、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆ ａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）₂フラグメントおよび一本鎖免疫グロブリンから なる群から選択される免疫グロブリンの使用に関する。図面の簡単な説明 図１Ａは、０．５Ｍのリン酸塩、ｐＨ７．０でのモデルタンパク質の電気泳動 図を示している。条件：未処理溶融シリカ毛細管、２５μｍ（ｉ．ｄ．）ｘ２３ ｃｍ；印加電圧、１０ｋＶ／５３μＡ；ピーク：１＝トラシロール（Ｔｒａｓｙ ｌｏｌ）；２＝チトクロームｃ；３＝カルボニックアンヒドラーゼおよび４＝大 豆トリプシン阻害剤。 図１Ｂは、０．５Ｍのリン酸塩緩衝液、ｐＨ９．０（ｒｅｆ１３の図２Ｃから 適用）でのモデルタンパク質の電気泳動図を示している。条件：未処理溶融シリ カ毛細管、２５μｍ（ｉ．ｄ．）ｘ２３ｃｍ；印加電圧、１０ｋＶ／７５μＡ； ピークｉ．ｄ．；図１Ａと同様。 図２は、０．５Ｍのリン酸塩、ｐＨ８．０でのモデルタンパク質の電気泳動図 を示している。条件：未処理溶融シリカ毛細管、２５μｍ（ｉ．ｄ．）ｘ２３ｃ ｍ；印加電圧、１０ｋＶ／６４μＡ；ピーク：１＝ミオグロビン；２＝コンアル ブミン；３＝β−ラクトグロブリンＡ；４＝β−ラクトグロブリンＢ。 図３は、種々の動物種からの心臓チトクロームｃの電気泳動図を示している。 条件：未処理溶融シリカ毛細管、２０μｍ（ｉ．ｄ．）ｘ２５ｃｍ；印加電圧、 １０ｋＶ／３４μＡ；０．４Ｍのリン酸塩緩衝液、ｐＨ４．０。ピーク：１＝馬 ；２＝犬；３＝豚；４＝ニ ワトリおよび５＝マグロ。 図４Ａは、卵白タンパク質の電気泳動図を示している。条件：未処理溶融シリ カ毛細管、２０μｍ（ｉ．ｄ．）ｘ２５ｃｍ；印加電圧、１０ｋＶ／１６μＡ； 緩衝液、２００ｍＭのホウ酸塩、ｐＨ１０．０。ピーク：１＝ＤＭＦおよびリゾ チーム；２＝コンアルブミン；３＝グロブリン；４＝オボムコイドおよびオボア ルブミン。 図４Ｂは、卵白タンパク質の電気泳動図を示している。条件：未処理溶融シリ カ毛細管、２０μｍ（ｉ．ｄ．）ｘ２５ｃｍ；印加電圧、１２ｋＶ／２６μＡ； ３００ｍＭのホウ酸塩緩衝液、ｐＨ１０．０。ピーク：１＝リゾチーム；２＝Ｄ ＭＦ；３＝コンアルブミン；４＝グロブリン；５および６＝オボムコイドおよび オボアルブミン。 図５Ａおよび５Ｂは、正常な血清タンパク質の毛細管電気泳動図を示している 。図５Ａでは、ＣＥは、未処理溶融シリカ毛細管、２０μｍ（ｉ．ｄ．）ｘ２５ ｃｍを使用して行った；印加電圧、２０ｋＶ／１４μＡ；Ｂｅｃｋｍａｎタンパ ク質分析緩衝液。図５Ｂでは、パラゴン（Ｐａｒａｇｏｎ）アガロース電気泳動 システムによりＳＰＥゲルを用いて同じサンプルをＣＥに付した。 図６Ａおよび６Ｂは異常な血清について行った分析図である。図６Ａは異常な 血清タンパク質の毛細管電気泳動図である；図５Ａのような条件。図６Ｂは、パ ラゴンアガロース電気泳動システムによるＳＰＥゲルでの同じサンプルの電気泳 動図である。 図７Ａおよび７ＢはＩｇＧ骨髄腫（ｍｙｅｌｏｍａ）患者の血清タンパク質か らのタンパク質の分析図である。図７Ａは毛細管電気泳動図である；図５Ａのよ うな条件。図７Ｂは、パラゴンアガロー ス電気泳動システムによるＳＰＥゲルでの同じサンプルの電気泳動図である。 図８は２００ｎｍ（Ａ）および２８０ｎｍ（Ｂ）で行った正常な尿サンプルの 毛細管電気泳動図を示している。図５Ａのような条件。 図９は２００ｎｍで行った患者ＣＳＦサンプル（Ａ）および透析されたＣＳＦ サンプル（Ｂ）の毛細管電気泳動図を示す。図５Ａのような条件。 図１０Ａ−１０Ｄは、１００μＬの標識したジゴキシゲニン（１μｇ／ｍｌ） および０μｌのアンチジゴキシンＦａｂ（図１０Ａ）；１０μｌの５μｇ／ｍｌ のアンチジゴキシンＦａｂ（図１０Ｂ）；５０μｌの５μｇ／ｍｌのアンチジゴ キシンＦａｂ（図１０Ｃ）；１００μｌの５μｇ／ｍｌのアンチジゴキシンＦａ ｂ（図１０Ｄ）を用いた反応混合物中の種の分離を引き起こす拮抗ＣＥ／ＬＩＦ 免疫検定の能力を示す。 図１１Ａ−１１Ｄはジゴキシンカリブレーターの各種濃度を用いたジゴキシン の校正を示す：０．４２ｎｇ／ｍｌ（図１１Ａ）；２．７２ｎｇ／ｍｌ（図１１ Ｂ）；５．２１ｎｇ／ｍｌ（図１１Ｃ）および１０．４２ｎｇ／ｍｌ（図１１Ｄ ）。 図１２は、Ｄ−ＢＰ^*とＡｂ−Ｄ−ＢＰ^*の全面積との間の面積の比から得たジ オキシン検量線である。 図１３はＣＥ／ＬＩＦ検定でのバックグラウンドレベルへの血清の影響を示す 。 図１４はオリゴ−ｄ（Ｔ）対ヌクレオチド塩基の電荷の比に対する質量（ｍａ ｓｓ）を示す。 図１５はジゴキシゲニン−３’−ｄ（Ｔ）₁₀−ＴＭＲの合成の略図を示す。 図１６は４ｘ１０^-10Ｍでのジゴキシゲニン−３’−ｄ（Ｔ）₁₀−ＴＭＲ（Ａ ）の電気泳動図と、ジゴキシゲニン−３’−ｄ（Ｔ）₁₀−ＴＭＲ（５０μＬ、８ ｘ１０^-10Ｍ）とのジゴキシンへのＦａｂ（５０μＬ、１０ｐｇ／ｍＬ）の反応 生成物（Ｂ）の電気泳動図を示す。未処理溶融シリカ毛細管７５μｍ（ｉ．ｄ． ）ｘ２５ｃｍが用いられ、印加電圧は７ｋＶ／８０μＡであり、Ｂｅｃｋｍａｎ タンパク質分析緩衝液が使用された。 図１７は、０．４２（Ａ）、２．７２（Ｂ）および５．２１ｎｇ／ｍｌ（Ｃ） での血清カリブレータによるジゴキシン検定混合物の電気泳動図を示す。使用条 件は、図１６と同様である。ピーク：１＝ジゴキシゲニン−３’−ｄ（Ｔ）₁₀− ＴＭＲ；２＝Ｆａｂの抗原−抗体複合体。 図１８は、ＣＥ−ＬＩＦによるジゴキシン検定についての検量線を示す。デー タは、遊離ジゴキシゲニン−３’−ｄ（Ｔ）₁₀−ＴＭＲ対ジゴキシンカリブレー ターの百分率として示してある。 図１９は、フルオロ標識したアンギオテンシンとアンギオテンシン消化（ｄｉ ｇｅｓｔｉｏｎ）混合物の電気泳動図を示す。電気泳動図（Ａ）は標識したアン ギオテンシンＩ＆ＩＩとフルオロ標識のものである。電気泳動図（Ｂ）は（Ａ） に示した混合物のトリプシン消化混合物のものである。電気泳動図（Ｃ）は（Ｂ ）に示した混合物のカルボキシペプチダーゼＰ消化混合物のものである。 図２０は、フルオロ標識したアンギオテンシンＩのプロテイナーゼＫ消化の電 気泳動図を示す。電気泳動図（Ａ）は消化前混合物の ものである。電気泳動図（Ｂ）および（Ｃ）はそれぞれ０．２分、８分消化の後 に得たものである。 図２１はフルオロ標識したアンギオテンシンＩのプロテイナーゼＫ消化の電気 泳動図を示す。電気泳動図（Ｄ）は２４分消化の後に得たものである。電気泳動 図（Ｅ）および（Ｆ）はそれぞれ１０２分、１２４分消化後に得たものである。 図２２はフルオロ標識したアンギオテンシンＩのプロテイナーゼＫ消化の電気 泳動図を示す。電気泳動図（Ｇ）および（Ｈ）はそれぞれ１９０分、３１０分消 化の後に得られた。電気泳動図（Ｉ）は（Ｈ）に示した消化混合物にカルボキシ ペプチダーゼＰを加えた後に得られた。好ましい実施態様の説明 Ｉ．本発明の方法の概観 タンパク質および類似のポリイオン性種を分析するために未処理毛細管とＣＥ を用いる際の問題を克服する努力は、シリカ表面の改質に集中していた。適当な 化学的皮膜を用いることにより、または物理的なマスキングにより、シリカ表面 のゼータ電位が、最小化されるか、または特定の用途に変えられる。中性の官能 基を有する化学的皮膜はシラノエート（Ｓｉ−Ｏ−）のタンパク質の正に荷電し た部分との相互反応を減ずるかまたは除去する。ポリアクリルアミドで被覆され たシリカ毛細管を用いることにより、極端に高い効率で中性または酸性のｐＨで タンパク質分離を行うことが可能である（Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｓ．，Ｊ．Ｃｈｒｏ ｍａｔｏｇｒ．３４７ ：１９１−１９８（１９８５））。Ｎｏｖｏｔｎｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｌｌ ：７３５−７４９（１９ ９０））は、線状ポリアクリルアミドの結合のために適当なＳｉ−Ｃ結合を導入 することにより、塩基性ｐＨ範囲まで、Ｈｊｅｒｔｅｎの皮膜のタンパク質分離 能力を拡張した。シリカ表面のいくつかの他の化学的な改質は、成功したタンパ ク質分離をもたらしたが、制限されたｐＨ範囲においてのみであった（Ｎｏｖｏ ｔｎｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｌｌ：７３５−７ ４９（１９９０）； Ｔｏｗｎｓ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏ ｇｒ．５１６ ：６９−７８（１９９０））。ペンタフルオロ−ベンゾイル被覆し た毛細管が、ｐＨ７．０での１００ｍＭのＫＣｌを含む２００ｍＭのリン酸塩緩 衝液による幅広い等電点の範囲（５〜１１）を有するタンパク質種の優れた分離 を引き起こし 得ることがわかった（Ｓｗｅｄｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ．１８５ ：５１−５６（１９９０））。 しかしながら、化学的に被覆した毛細管は、特に高いｐＨで表面範囲の段階的 な損失をしばしば受ける。さらに、複合タンパク質混合物、例えば、ミルクおよ び血漿（Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２２： ２６６−２７２（１９８３））でのＣＥは、被覆された層へのタンパク質吸収を 受けやすく、このことが分離効率と再現性を減ずる。吸収されたタンパク質を除 くための試験（ｒｕｎ）と試験との間の厳しい洗浄条件の使用が、毛細管皮膜に 悪影響を及ぼし得る。 本発明は、非常に低いレベルの被検体の検出を許容するように未処理溶融シリ カカラムおよび毛細管電気泳動と関連して行われる均一免疫検定フォーマットを 提供することにより毛細管電気泳動の用途を拡張する。もちろん、その最も好ま しい実施態様では、本発明の方法は、１０^-9Ｍ（すなわち、サブμｇ／ｍｌ）ま での濃度で存在する時でもタンパク質およびほかの被検体の分析を可能にする。 さらに、本発明の方法は、複雑な臨床サンプル中に存在するタンパク質を分析す るために用いてもよい。そのような成果はこれまでに可能でなかった。もちろん 、タンパク質１０^-10Ｍ（１００Ｋｄの分子量、１０ｎｇ／ｍｌである）で、Ｃ Ｅ毛細管に注入されるタンパク質の量は、ほんの数フェムトグラムである。その ような少量のタンパク質は、毛細管壁に容易に吸収される。本発明は、この問題 の解決策を提供する。 増加した感度に加え、本発明の方法は、得られ、処理されなければならないサ ンプルの量のかなりの減少を可能とする。したがって 、たとえば、標準的なＣＥ分析は、５μＬ未満（カラムの内径に依存する）を用 いて典型的に行われ、それぞれの分析に必要なサンプル容量は非常に小さく、典 型的には、ナノグラム範囲またはそれより小さい。希釈した検定試薬と血清の数 マイクロリッターの現実的サンプルサイズが十分であろう。よって、検定反応と ＣＥ分離の両方についての総合的な試薬消費は、最も一般的な免疫検定と酵素に 基づく検定より少なくとも１−２桁小さい。 本発明の方法は、ＣＥでの上記の分離方法に基づき免疫検定と酵素検定で遊離 種から結合したものの分離を引き起こすようにＣＥを使用することをさらに許容 する。ほとんどの実際的な免疫検定では、遊離種と結合種とは、多数の潜在的な 干渉物質の存在下で測定されねばならない。したがって、検定反応体の１つに特 有の検出可能なラベルを有することが通常必要であった。関心のもたれる種が、 しばしば比較的に低い濃度であろうから、非常によい感度を与えるラベルと検出 方法を用いる必要があった。さらに、多くの抗原について、抗原−抗体複合体は 遊離抗体から容易に分離し得ないであろう。これらの場合、分離を高める手段を も提供することが必要であった。 しかしながら、本発明の方法に従えば、明確に定められた（ｗｅｌｌ−ｄｅｆ ｉｎｅｄ）電荷をもった有機分子（たとえば、合成オリゴヌクレオチドまたはほ かの同様な分子）で化学的に改質することにより抗原または抗体の電気泳動移動 度を調整することにより抗原−抗体複合体から抗原または抗体の有効な分離を達 成することが可能である。オリゴヌクレオチドは、電荷修飾に対して特に好まし い選択肢である。ヌクレオチドのそれぞれの対の間のホスフェート 基はそれぞれ、８．０を越えるｐＨ値で１つの負の電荷を含んでいる。オリゴヌ クレオチドの３’−末端および５’−末端が、化学的に区別されるので、抗原分 子をオリゴヌクレオチドの一端に結合させ、検出を目的とした標識した分子を他 端に結合させることが可能である。毛細管電気泳動で用いるため、蛍光ラベルお よびレーザー誘発発光（ＬＩＦ）検出（参照してここに取り入れられた以下の文 献を参照：Ｉｃｈｉｎｏｓｅ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒ ｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ １１０，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｗｉｎｅｆｏｒｄｎ ｅｒ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ，ＮＹ（１９９１）； Ｌｉｄｏｆｓｋｙ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．５１ ：１６０２−１６０５（１９７９）； Ｍａｎｉａｎ，Ｂ．Ｓ．ｅｔ ａｌ ．，米国特許第５，１３７，６０９号）が特に好ましい。 本発明の方法に従う評価に対するサンプルは、臨床的なサンプル（例えば、全 血、ミルク、血清、血漿、尿、脳脊髄液など）であろうが、適当なサンプルは水 、廃棄物、食物などを含む。さらには、酵素−基質に基づく反応での分析に対し ての酵素を含む実験室的な分析サンプルも本発明の範囲内にあると考えられる。 広範囲の被検体が、本発明の方法にしたがって評価され得る（例えば、タンパ ク質（例として免疫グロブリン、受容体、酵素など）、代謝物、悪用物質（例え ば、コカイン、カンナビノイド（ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ）、鎮痛剤など）、 毒素、薬学的薬剤など）。本発明の方法は、タンパク質、薬およびほかの薬学的 薬剤を分析す るのに特に適する。そのような被検体は、サンプル中に１０^-11Ｍの低濃度で存 在していても検出可能である。よって、１００ｋｄの分子量を有するタンパク質 が、１０ｎｇ／ｍｌの濃度であっても検出できる。そのような感度は、分析され るサンプルが、特に、臨床的なサンプルが、分析に先立ち適当な希釈剤で希釈さ れることが好ましいので、望ましい；そのような希釈は、特に、所望の分析比を 達成し、さらには分析の感度を増す。すなわち、未希釈臨床サンプル、特に血清 は、正確な分析を可能とするには余りにも多くの検定を干渉するタンパク質を含 むであろう。血清に焦点を当てると、最も好ましい希釈は、１部の血清に対し１ ０部の適当な希釈剤であるが、１部の血清に対し１００部の希釈剤とした希釈も 使用できる。希釈剤は、好ましくは、ｐＨ７．０のわずかに緩衝させた生理食塩 水、たとえば、ＩＣＳ^TM希釈剤である。 ＩＩ．本発明の好ましいＣＥ／ＬＩＦ法 本発明の方法にしたがえば、被検体の検出と定量とが、ＣＥを用いて達成され る。被検体の検出は、各種の免疫検定または酵素−基質フォーマットのいずれか の使用により達成される。 １つの好ましい実施態様では、直接的な免疫検定が行われる。１つのそのよう な検定では、対象の特異的抗原に対する抗体が、標識（Ａｂ^*）され、対象の抗 原（Ａｇ）を複合体とさせる。免疫反応が、存在するすべてのＡｇの結合を確実 にするように過剰のＡｂ^*の存在下で行われる。このように形成したＡｂ^*−Ａｇ 複合体は、ＣＥにより遊離の標識したＡｂ^*から分離される。本発明のこの実施 態様で遭遇する主な関心事は、Ａｂ^*−Ａｇ複合体からＡｂ^*を 分離するＣＥの能力であろう。以下で検討するように、そのような分離はいくつ かの方法で得られる。本発明のこの実施態様は、高い電気泳動移動度を有するＡ ｇの分析に特に適している。それにもかかわらず、直接分析法は、ビタミンＢ− １２またはジオキシンのような小さなハプテンの濃度を分析するのに容易に使用 される。検定の反応動力学は、均一相の過剰の抗体の存在により、従来の固相に 基づく免疫検定または拮抗免疫検定よりもより好ましい。 本発明の発明の別の実施態様では、直接の酵素−基質反応が行われる。特異的 酵素に対する基質が標識され、酵素−基質反応で特異的酵素と反応させられる。 このようにして形成された酵素基質反応の標識された反応生成物または標識され た酵素−基質複合体がＣＥにより遊離の標識された酵素基質から分離される。 もう１つの実施態様では、標識された抗原（Ａｇ^*）が、与えられ、Ａｂの限 定された量に結合するようにサンプルの標識されていない抗原と拮抗させられる 。ＣＥが用いられて、Ａｇ^*がＡｂ−Ａｇ^*複合体から分離される。直接的な分析 方法に比較して、この実施態様は、低い分子量を有するＡｇの分析に特に適して いる。 最も好ましくは、使用されるＡｂ分子は、好ましくは親和定数１０^-9またはそ れ以上を有するモノクローナル抗体であろう。そのような抗体分子の代わりに、 ポリクローナル抗体、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）₂フラグメント、一本鎖抗体また は可溶化受容体または受容体リガンドが用いられ得る。親和定数１０^-10Ｍを有 するモノクローナル抗体を用いる好ましい実施態様では、抗体濃度１．５ｍｇ／ ｍｌ（１０^-5Ｍ）が、免疫反応で用いられる：そのような濃度は、血清で典型的 に見られる抗原のレベルの１０，０００倍結合し得る 。 上記の実施態様と関連して用いられる標識は、同位元素、酵素、蛍光部分（ｍ ｏｉｅｔｙ）、化学発光部分、常磁性部分または強磁性部分であろう。しかしな がら、最も好ましくは、ラベルは、蛍光部分であろう。適当な発蛍光団は、例え ば、フルオロセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フ ィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドラベル、フルオレサ ミン、テトラメチルローダミン、「ＢＯＤＩＰＹ」標識したオリゴヌクレオチド 、またはそのような蛍光部分を有する被検体を含む。抗体に標識をつけることが 望ましい場合、ローダミン標識が好ましく用いられる。そのような標識された抗 体は、約１０^-10Ｍの濃度で存在するタンパク質種に対する直接免疫検定で用い られる。本発明の抗体または抗原を直接標識するために適当な方法が用いられる 。 電荷と質量に基づく変更が定量的なリガンド分析に必然的に必要とされる。β −フィコエリトリン（ＢＰ^*）のような標識の蛍光特性は、化学的修飾に対する 抵抗である。そこで、β−フィコエリトリンのスクシニル化は、ＢＰ^*よりもさ らに遅く移動する（修飾の程度に依存する）修飾された「ＳＢＰ^*」をもたらす が、スクシニル化した形のＦＱＥは本質的に完全である。これらの特質が、ＣＥ ／ＬＩＦ法の適用性を広げるように他の分子に容易に結合するスクシニル化され たＢＰ^*誘導体を生成させるように使用される。抗原分子の標識づけを促進する ことに加え、修飾された発蛍光団の使用は、標識された分子の電気泳動移動度を 制御する手段を与える。Ｄ−ＳＢＰ^*化合物は、サンプル中に１０^-8〜１０^-11Ｍ 程度の濃度 で典型的に存在する葉酸、ビタミンＢ₁₂、コルチゾルおよびほかのステロイドホ ルモン（同化ステロイドを含む）などの抗原の拮抗免疫検定で用いるのに特に適 する。すべての尿薬物テスト（悪用薬物、典型的には１０^-6〜１０^-8Ｍ）は、こ の技術の能力内に十分に入いる。 本発明の１つの様相は、オリゴヌクレオチドが分子の標識付けを促進し、かつ ＣＥで得られる可能な分解能を増すのに使用される認識に関する。実際、タンパ ク質被検体の場合、一端に発蛍光団ラベルがあり他端に抗原があるようなオリゴ ヌクレオチドに基づく修飾は、本発明のＣＥ／ＬＩＦ方法による抗原−抗体複合 体から標識した抗原の非常にうまくいく分離を得る手段を与える。ｐＩ値４．０ 〜１１．０を有するモデルタンパク質および複合タンパク質混合物が、ｐＨ４． ０〜９．０のリン酸塩緩衝液の存在下で１０分未満でＣＥを用いることにより分 離される。 そのような標識づけを達成する１つの手段は、対照細孔グラス（ｐｏｒｅ ｇ ｌａｓｓ）−３’（９−フルオレニルメトキシカルボニル−アミノ）−（ｄＴ）₁₀ −５’アミンを合成することによる。この試薬は、５−カルボキシテトラメチ ル−ローダミンスクシニルエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕ ｇｅｎｅ，ＯＲ）によりテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）を試薬の３’−アミ ノ末端に結合させて誘導される。誘導体の５’末端は、所望の抗原に結合される 。 ＬＩＦ−ＣＥによるβ−フィコエリトリンに基づく蛍光測定免疫検定に対し、 被検体に対する感度は１０^-11Ｍであり、一方、テトラメチルローダミンのよう な合成発蛍光団のそれは、ほぼ１桁低い 。合成発蛍光団の多数標識づけが用いられ、適当に離隔されるなら、ＬＩＦ信号 の算術的な増幅を与えることができる。 免疫反応が起こると、反応体と生成物を、Ａｂ−ＡＧ複合体を分離するのに十 分な条件下でＣＥに付す。タンパク質に対するＣＥ分離技術は、固体支持体の使 用なしで標識した抗原または抗体の結合したまたは遊離の種を分離する手段を与 える。１０^-9〜１０^-10Ｍの範囲の濃度での種の均一免疫化学的測定を可能とす るレーザー誘導された蛍光検出と関連したこれらの分離技術の適用。 通常のＣＥは、毛細管カラムの内容に基づき２つの区分に一般に分けられる。 「固定されたゲル」ＣＥでは、毛細管が、適当なゲル例えばポリアクリルアミド ゲルで満たされ、サンプルの成分の分離が、成分の大きさと電荷の両者により打 ち立てられる。分析の速度にもかかわらず、固定されたゲルＣＥはいくつかの欠 点を有する、とりわけ、ゲル物質の予想不可能性と非耐久性を有する。これらの 因子は、多数の分析実験が行われる設定で固定されたゲルＣＥを受け入れられな いものとする。 ＣＥの第２の形式（すなわち、「オープン」ＣＥ）では、毛細管が、電導性緩 衝溶液（Ｋｉｍ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９：６８９− ６９２（１９９３））で満たされる。最も好ましくは、緩衝剤は、１５０ｍＭの ホウ酸塩、ｐＨ１０．００±０．２５であるが、約７０ｍＭ〜約４００ｍＭの濃 度が可能である。緩衝剤のモル濃度が増すと、カラムの内部の温度が上がり、よ って成分への温度の影響が１つの因子である状況下では、緩衝剤のより低い濃度 が用いられるべきである。しかしながら、開示されたプロトコールは、被覆され たまたは未処理のカラムを用いタンパク 質性物質の分離と関連して用いられる分離緩衝剤によって達成されることが理解 されるべきである。 毛細管は、次に、負の荷電でイオン化される。そのようなイオン化は、毛細管 壁を負に荷電させるので、緩衝剤から正のイオンを引きつける。溶液の電気的な 中性が保たれねばならないので、毛細管壁に向かう正のイオンの流れが、サンプ ルの成分と緩衝溶液の同様な移動により達成される。この電気浸透性流れ（ｆｌ ｏｗ）は、電荷に関係なく中性種とイオン種の両方を陰極に向けて押しやる固定 された速度成分を与える。「オープンＣＥ」での緩衝液は、伝導と拡散に対して 安定である。したがって、ゲルに基づく電気泳動で得られるものと極めて似てい る分離が「オープンＣＥ」で得られる。 オープンＣＥは例えば臨床サンプル分析に対して多くの望ましい特質を有して いる：分析は、ゲルを充填したカラムを必要としないので、特定のゲルを充填し たカラムで行われる分析実験の数に対する固有の制限が避けられる；毛細管カラ ムが処理されないと、被覆されたカラムに関する予想不可能性の雰囲気（ａｕｒ ａ）が避けられる；サンプルサイズが小さい（通常、希釈サンプル５〜２００μ ｌ程度）；サンプル分析時間が速い、すなわち、約２０分未満；さらに、プロト コールがそれ自体自動化に役立つ、よって、能率的で、有効なサンプル分析に必 要な労働技術を少なくする。毛細管カラムは、取扱の容易さのために外側を被覆 してもよい（たとえば、ポリアミド材料を用いて）。 本発明の方法は、未処理のまたは被覆したカラムのいずれも用いることができ るが、カラムは未処理であることが好ましい。未処理毛細管カラムが用いられる と、好ましくは、分離緩衝剤は、米国特 許第５，１２０，４１３号（ここに、参照して取り入れる）に開示されたもので ある。適当なカラムは、さらに、ここに参照して取り入れられたＧｕｔｔｍａｎ ，Ａ．，米国特許第５，２１３，６６９号；Ｂｕｒｏｌｌａ，Ｖ．Ｐ．，米国特 許第５，１９８，０９１号；Ｓｈｉｅｈ，Ｃ−．Ｈ．，米国特許第５，０９８， ５３９号に開示されている。 直接免疫検定では、Ａｂ^*が過剰であるなら、処理されたまたは未処理の毛細 管が使用されるかに関係なく、オープンチューブ毛細管電気泳動分離の原理は、 分離に対して選択された条件（緩衝剤組成、ｐＨなど、メチルセルロースまたは ＰＶＡなどの添加剤の使用なし）下での分子種の電荷対質量の比に基づく。Ａｂ^* とＡｂ^*−Ａｇ複合対との間の分離の効率は、反応の過剰Ａｂ^*を容易に調節す る。タンパク質抗原については、多数の負にまたは正に荷電した部分からなる分 子またはデキストランのような大きな中性の分子によるＡｂ^*の化学的修飾は、 電荷対質量比を変えてＡｂ^*−Ａｇ複合体からのＡｂ^*の分離を十分に促進する。 正の電荷を導入するまたはＡｂ^*の正の電荷を増す修飾は、ほとんどの血清タン パク質からのＡｂ^*の分離を促進する最も好ましい方法である。そのような修飾 の使用は、標準的なランニング緩衝剤の下でのＣＥのより鋭いピークをもたらす 。Ｆａｂフラグメントを有するモノクローナル抗体は、抗体の明確に定められた 化学修飾に対して望ましい。ジゴキシンに対しては、分子量９８１のハプテン、 Ｆａｂフラグメントのような抗体の結合は、Ａｂ^*からのＡｂ^*−ジゴキシン複合 体の十分な動揺（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）を可能とすることがなく、十分な 分解能に影響を及ぼさない。拮抗免疫検定は、標識したジゴ キシンを用いる最も望ましいルートであろう。例えば、ジゴキシンは、約５００ の分子量を有する発蛍光団であり理想的には標識後２つのスルホニル基またはカ ルボキシル基を含む小さな分子であろう発蛍光団により標識されうる。そのよう なＡｇ^*の電荷対質量比は、２／１５００または１／７５０であり、よって、適 当な緩衝条件下でＣＥによりＡｂ−Ａｇ^*から効果的に分離される。正味の正に 荷電したＡｇ^*は実際的な選択肢であろう。 標識の存在は、自動化されまたは半自動化された手段により好ましくは測定さ れる。発蛍光団が用いられる好ましい実施態様では、検出は、レーザー誘導され た蛍光（「ＬＩＦ」）検出器を用いて引き起こされる。例示的な検出器は、発蛍 光団を励起するのに適当な１〜３ミリワットのヘリウムネオンレーザー（５４３ ．５ｎｍ）を含むであろう。５４３．５ｎｍで放射する適当な２．５ミリワット の緑色ヘリウム−ネオンレーザーはＰａｒｔｉｃｌｅ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ｓ ｙｓｔｅｍｓ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ．から入手できる。レーザー出力は、レー ザーラインフィルターを用いて好ましくはろ過され、分離毛細管の検出領域に焦 点が合わせられる。好ましい実施態様では、検出システムはＬＩＦ検出器を有す るＰ／ＡＣＥシステムへの標準的ＳＭＡ−９０５ファイバコネクタへのレーザヘ ッドカップラーを用いてＰ／ＡＣＥ^TMシステム（ＯＺ Ｏｐｔｉｃｓ，Ｏｎｒａ ｒｉｏ，Ｃａｎａｄａから入手可能）へと組み入れられる。蛍光放射は、好まし くは、毛細管をその焦点に保持するパラボラレフレクターを用いて集められ、平 行にされ、スキャッターマスクが、激しいレーザースキャッターの面でパラボラ の前面を横断して好ましくは置かれる。平行化された放射は、まず、ノッチフィ ルター（５４３．ｎｍブロッキング）を通され、次に５８０ｎｍで中心に置いた ９ｎｍバンドパスフィルターを通される（このようなフイルターはＢａｒｒ Ａ ｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｗｅｓｔｆｏｒｄ，ＭＡおよびＯｒｉｅｌ，Ｓｔｒａｄｆ ｏｒｄ，ＣＴから入手できる）。検出は、エンド−オンタイプの光電子倍増管（ 例えば、Ｒ３７４、ハママツ）を用いて好ましくは達成される。 高分子（例えば、血清中のタンパク質）は、上記の手順で検定される。特定の タンパク質の抗原決定基部分が、拮抗免疫検定に用いられる。したがって、例え ば、フェリチンに特異的なモノクローナル抗体が使用されてその対応する抗原決 定基の位置を決める。フェリチンのトリプシン消化（ｔｒｙｐｔｉｃ ｄｉｇｅ ｓｔｉｏｎ）は多くのペプチドフラグメントをもたらすであろう。モノクローナ ル抗体に結合した単一フラグメントは、スポットされ配列決定される。この抗原 フラグメントを含む合成ペプチドは、特異的モノクローナル抗体に対するフェリ チンの拮抗種として発蛍光団により標識される。標識した小さなペプチドの分析 と修飾は、タンパク質のそれよりも実質的に容易である。実際、Ａｂ−Ａｇ複合 体の解離定数が、抗原濃度のそれに匹敵するかそれよりも低い限り、上記の方法 はうまくいく。 本発明と関連して用いられる毛細管電気泳動計測システムは、周知である。特 に好ましい計測器は、少なくとも２つの異なるサンプルのアリコートの同時評価 を可能とする多チャンネル装置である；より好ましくは、装置は、多数の電気泳 動図が得られ比較されるように複数のアリコートを同時的に分析する能力を有す る。特に好ましい毛細管電気泳動システムは、Ｇｅｒａｌｄ Ｌ．Ｋｌｅｉｎに よる「多チャンネル自動化毛細管電気泳動システム（Ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）」なる表題の同時係属米国出願番号第０７／９１６，３０８号 （参照してここに取り入れられる）に開示されている。 特に好ましい毛細管電気泳動システムは、Ｐ／ＡＣＥ^TM高性能毛細管電気泳動 システム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）（Ｃｈｅｎ， Ｆ−．Ｔ．Ａ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３８：１６５１−１９５３（１９９２）； Ｃｈｅｎ，Ｆ−．Ｔ．Ａ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．５５９：４４５−４５ ３（１９９１）；Ｆｕ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：９ ７０（１９９１）；Ｃｈｅｎ，Ｆ−．Ｔ．Ａ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：１ ０６１ （１９９）；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ ．６３ ：６９−７２（１９９１）（すべて参照してここに取り入れられる）であ る。そのような計測器は、電気泳動図の正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ） がオン−ボードコンピュータソフトウエア（例えばＳｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ^TM ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｕ ｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）により達成されるので最も好ましい。 本発明のＣＥ免疫検定方法は、ＬＩＦシグナル検出法と組み合わせた時、１０^-9 〜１０^-10Ｍの濃度の被検体を検定することができる。実際、ここに記載のＣ Ｅ／ＬＩＦシステムは、最も良く知られた発蛍光団（フルオロセイン、テトラメ チルローダミン、および「ＢＯＤＩＰＹ」標識したオリゴヌクレオチドが例であ る）について １０^-12〜１０^-11Ｍの範囲での検出限界を示す。よって、ＣＥ／ＬＩＦ免疫検定 フォーマットはほとんどの臨床的検定の要件に合致する。よって、高感度レーザ ー誘導された蛍光（ＬＩＦ）検出器と組み合わせたそのような発蛍光団の使用は 、光学的吸光度測定により検出され得るよりも４〜６桁低い濃度での被検体の検 出を可能とする。この範囲の検出限界は、今までに可能でなかったまたは実際的 でなかった多くの適用を可能とする。 ＩＩ．本発明の使用 被検体のそのような微小濃度を測定する能力は、本発明のＣＥ／ＬＩＦ法に、 明確に定められた基質を用いてＣＥと関連した多くの応用を可能とさせる。発蛍 光団標識したプライマーを用いるＤＮＡ配列決定および発蛍光団標識した抗原ま たは抗体による免疫定量は少数の例である。両方の方法は、特定の化学反応を取 り調べるために標識した分子を用いることに依存する。標識したオリゴヌクレオ チドまたは免疫化学物質が、多くのＤＮＡに基づくプローブ化学（ｐｒｏｂｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ）に適用可能であり、また、痕跡汚染物および検定手順 のほとんどが行うのがやっかいで困難な食品および環境化学に適用可能である。 Ａ 診断応用 組織損傷および代謝は、末梢循環への酵素の漏れをもたらす。血液の組織−特 異的酵素活性の早期の検出は、診断医学で非常に有意義な印である。酵素活性の 臨床的分析のほとんどは、酵素濃度１０^-8〜１０^-9Ｍに基づいている。酵素は、 約１０³分子毎分の典型的 な基質回転率（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｒａｔｅ）を有するの で、末梢循環酵素を検出する酵素検定は、分光光度検出を確実とするために必要 とされるであろう生成物の１０^-4〜１０^-5Ｍの濃度を生じるために約１０分間必 要であろう。 残念なことに、そのような検定条件は常に達成されるわけではない。多数の臨 床的に適切な酵素が、１０^-8〜１０^-9Ｍよりも著しく低い濃度で循環中に見つけ られる。よって、そのような酵素の分析は実質的により長い温置期間を必要とす る。ほかの場合には、酵素反応の生成物または基質が水溶液中で不安定である。 基質の遅い加水分解が、検定のバックグランドレベルを増加する。そのような因 子は、比較的低い酵素活性の臨床的測定を時間消費的で面倒で、誤差の起こりや すいプロセスとさせる。 しかしながら、本発明のＣＥ／ＬＩＦ実施態様の使用を通じ、酵素の１０^-13 Ｍ濃度の測定が、短い温置期間で容易に達成される。たとえば、アンギオテンシ ン変換酵素（ＡＣＥ）（これは、アンギオテンシンＩのアンギオテンシンＩＩへ の開裂を触媒する）およびレニン（これは、アンギオテンシノゲンのアンギオテ ンシンＩへの開裂を触媒する）は、血液中のアンギオテンシンＩおよびＩＩレベ ルを調整する。循環中のこれらの酵素のレベルは、高血圧の原因であり、酵素は 、いくつかの血圧降下剤の標的である。そのような薬剤を定義し、使用する、ま たは高血圧を診断する１つの難点は、ＡＣＥおよびレニン血清レベルを容易に測 定する無力さであった。しかしながら、本発明は、ＡＣＥについて基質としてＮ −末端または他の非干渉部位（Ｉ^*）で発蛍光団により標識したアンギオテンシ ンＩを用いてＣＥ／ＬＩＦ検定を行うことによりＡＣＥおよびレニ ン濃度を測定するのに使用される。反応の加水分解生成物は、アンギオテンシン ＩＩ^*およびヒスチジルロイシンであろう。これらの生成物は、ＬＩＦにより検 出された標識およびＣＥによりＩ^*から効果的に分離される。酵素活性の定量は 、固定された時間フレームの下で生成物ＩＩ^*からバックグランドを引くことに より誘導される。 本発明のＣＥ／ＬＩＦ法は、また、低い濃度で存在し得るリポタンパク質を分 析するように使用される。そのような分析は、脂質環境で蛍光を発するが水溶液 中では蛍光を発しない親油性染料を用いて達成される。 Ｂ．生物工学的応用 遺伝子工学的につくられた薬は、典型的にはタンパク質であり、再形成を必要 とする注入可能な形態であるかまたはより一般的には液体の形態に処方してある 。プロテアーゼ汚染物質および熱的変性が特に長期保存下でのタンパク質処方の 分解の重要な原因である。よって、痕跡プロテアーゼ活性の分析は、非常に重要 である。しかしながら、本発明は、その末端でまたはもう１つの非干渉部位で発 蛍光団により標識したタンパク質またはペプチドプロテアーゼ基質を用いてＣＥ ／ＬＩＦ検定を行うことによりプロテアーゼ濃度を測定するために使用される。 反応の加水分解生成物は、ＬＩＦにより検出された標識およびＣＥにより未開裂 の基質から効果的に分離される。酵素活性の定量は、定められた時間フレームの 下で生成物からバックグランドを引くことにより得られる。 同様にして、ＣＥ／ＬＩＦシステムは、シンテターゼ（Ｓｙｎｔ ｈｅｔａｓｅ）活性、制限酵素活性またはＤＮＡハイブリッド形成プロセスを検 定するために使用されてもよい。例えば、二本鎖ＤＮＡ中でインターカレートさ れたときのみ蛍光を発する親油性蛍光分子を用いることにより、本発明のＣＥ／ ＬＩＦ法が、ＤＮＡレベルを定量するため、またはハイブリッド形成された分子 の検出を促進するために使用される。そのような方法は、特に、１つのプローブ した種の増幅がプローブのヌクレオチドの数に理論的に等しい時、ＤＮＡプロー ブに基づく技術に広く適用性を有する。上記のプロセスの生成物は、ＣＥによる 基質から適切に分離されＬＩＦによりモニターされる。 Ｃ．食物毒素および環境汚染物の応用 Ｔ₂毒素、アフラトキシンなどの食物毒素の分析は、農業および食品サービス 産業で重大な関心事である。本発明の方法は、そのような毒素に対する非常に感 度のよい検定を明確にするのに容易に適する。同様に、本発明は、空気、水また は土の中の低レベル有機環境汚染物を検出し、定量するのにも使用される。現在 、そのような分析は、固相抽出（ＳＰＥ）、さらにガスクロマトグラフィーおよ び質量分析を典型的には必要とする。これらの手順は、行うのに面倒で費用がか かる。本発明のＣＥ／ＬＩＦ法は、そのような方法に代わるものである。 上記のように、ＣＥの評価は、典型的には、視覚的になっている、すなわち、 サンプルの電気泳動図が、ピークの存在を決定するように評価される。ピークの 下の面積が、検定される被検体の濃度に対応している。典型的には、電気泳動図 は、縦軸に検出単位（例え ば蛍光）をプロットし、水平軸上で検出領域へカラムを通る横断する成分の時間 をプロットすることにより得られる。結果は、個々のピークにより境を接する面 積から典型的に得られる単位値で得ることもできる。 ２つの電気泳動図（またはピークの下の相対的な面積）を比較するため、電気 泳動図を正規化することが好ましい。典型的には、正規化は次の３段階を含む： （１）ベースライン正規化；（２）吸光度正規化；および（３）時間正規化。 ベースライン正規化は、それぞれが共通の水平ベースラインをもつように電気 泳動図を調整することにより典型的には達成される；有益的には、このことは、 初めのベースラインが０軸線の下または上ににある時、全体的な電気泳動図を上 方向または下方向にそれぞれシフトすることを単に必要とする。ベースライン正 規化により共通な軸線をつくることができる。 吸光度正規化は、血清、アルブミン中の最も支配的なタンパク質成分に基づき 電気泳動図を調節するか別のタンパク質カリブレーターにより電気泳動図を調節 することにより好ましくは達成される。典型的には、カリブレーターと関連する 電気泳動図のピークは「最も高い」ピークである。カリブレーターについて単一 吸光度最大値を選択することにより、電気泳動図内のすべてのピークが比例する ように調節される。よって、吸光度正規化は、たとえば、分析されるサンプルの それぞれの量の違いを調整する。 時間正規化は、得られる電気泳動図を一定の領域に入れるために主に遂行され る。好ましくは、このことは、処理済サンプルおよび未処理サンプルの分析に先 立って加えられる２つの「マーカー」の 使用により達成される。マーカーは、毛細管カラムを横断でき、サンプル成分の 検出時間をひとまとめに扱うそれぞれの時間で検出され得るように選択される。 よって、検出されたサンプル成分が（たとえば、分析されるサンプルの量の可変 性に依存して）異なる時間で検出されるなら、２組の成分の相対的検出時間が、 マーカーを使用して正規化される。 最も好ましくは、２つのマーカーは次のようにして調製される：２０ｍｇのジ クロロ安息香酸をベンジルアルコール４０μｌに溶解させ、この混合物をＩＣＳ^TM 希釈剤（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）のような適当 な緩衝溶液１００ｍｌに加える。この溶液のアリコートを、処理されたサンプル または未処理のサンプルに加えると、それらは、同じ相対的な濃度のマーカーを 含むようになる。分析の間、これらのマーカーはサンプル成分と共にカラムを横 断する。電気泳動移動度は、典型的には、ジクロロ安息香酸ピークが「第１」の 検出されたピークとして現れるようにし、さらにサンプル成分、つぎに、「最後 の」検出されたピークのベンゾイルアルコールが続くようにする。よって、サン プル成分に帰せられるピークが２つのマーカーにより一括される。 そのような時間正規化の別の実施態様では、マーカーは、被検体−抗体複合体 の位置を一括するように選択されてもよい。 吸光度正規化のように時間正規化は、個々の電気泳動図のピークの下の相対的 面積が同じであるように達成され；このような正規化は、単に、２つの電気泳動 図が相互に正確に比較されるようにする。そのような時間正規化の方法論は、Ｆ −．Ｔ．Ａ．Ｃｈｅｎ，米国特許第５，１３９，６３０号（ここに参照して取り 入れられる） により開示されている。電気泳動図での信号−ノイズ比を向上させる方法は、Ａ ｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ｄ．，米国特許第５，０９８，５３６号（ここに参照して 取り入れられる）により開示されている。 視覚的に方向づけられた分析に対する別のアプローチは、スラブ−ゲルＩＦＥ 結果が得られる方法、すなわち、Ｍ−タンパク質の位置でのバンドに基づく。電 気泳動図ピークをそのようなバンドに変換する方法と装置（ａｐｐａｒａｔｉ） は、Ｇｅｒａｌｄ Ｌ．ＫｌｅｉｎとＳｔｅｖｅｎ Ｐ．Ｋａｔｚｍａｎによる 「毛細管電気泳動データを表示する方法と装置（Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐ ａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃ ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｄａｔａ）」なる表題の同時係属米国出願番号第０７ ／９１１，３０７号（ここに参照して取り入れられた）に開示されている。 以上本発明を一般的に説明したが、本発明は、説明上示した以下の例（特に断 らない限り本発明を限定することを意図するものではない）を参照することによ りより容易に理解されよう。 例１ リン酸塩緩衝液中におけるＣＥによるタンパク質分離 リン酸塩は広範囲の緩衝ｐＨを与え、ｐＨ２〜１２の範囲ではＵＶ領域におい て透明である。リン酸塩のタンパク質分離能力を特徴づけるために毛細管電気泳 動を行った。 適当量の０．４または０．５Ｍ リン酸一ナトリウム、−二ナトリウム、及び ／または−三ナトリウムを混合することによってｐＨ４〜１０のリン酸塩緩衝液 を調製した。血清タンパク質分離のために用いた緩衝液はホウ酸塩を基剤とする タンパク質分析用緩衝液（ベックマンインスツルメンツ社）であった。全ての緩 衝液は使用前に０．４５μｍフィルターを通して濾過した。タンパク質標準はシ グマバイオケミカルズ（Sigma Biochemicals）（St.Louis、ＭＯ）及びサーヴァ バイオケミカルズ（Serva Biochemicals）（Westbury、ＮＹ）から入手した。タ ンパク質または血清サンプルは、０．０１％ナトリウムアジド、７５ｍＭ塩化ナ トリウム及び２０ｍＭリン酸カリウムを含むサンプル希釈緩衝液、ｐＨ７．０（ ＰＢＳ）に溶解または希釈した。各タンパク質濃度は０．３〜１ｍｇ／ｍｌであ った。新鮮な卵白をＰＢＳで１〜５０倍に希釈した。サンプル希釈剤に電気浸透 性フローマーカー（ＥＯＦ）としてジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を０．００ ２％ｖ／ｖ量加えた。 毛細管電気泳動は、Ｐ／ＡＣＥ^TM２１００システム（ベックマンインスツルメ ンツ社、フラートン、ＣＡ）と、ＩＢＭ ＰＳ／２モデル５５ＳＸによって制御 されるＰ／ＡＣＥシステムソフトウエアとを用いて行われた。実験後のデータ分 析はベックマンインスツルメンツ社、フラートン、ＣＡ、によるシステム ゴー ルド^TMソフト ウエアで行われた。一般的には長さ２５ｃｍ（検出器窓まで１８．５ｃｍ）×内 径（i.d.）２０または２５μｍの毛細管カラム（ポリミクロテクノロジーズ（Po lymicro Technologies）、フェニックス、ＡＺ）をＰ／ＡＣＥカートリッジ型（ 開口部５０×２００μｍ）に組み込んだ。ＵＶ吸光度によるon-line 検出は２ ００ｎｍで行われた。毛細管は、毛細管を取り巻く循環冷却剤で電気泳動中、周 囲温度（通常２３℃）に維持された。サンプルは１５から３０秒間の加圧注入（ ０．５ｐｓｉ）によって導入された。電気泳動は各電気泳動図に示される電圧で 行われた。実験と実験との間に毛細管を１．０Ｎ水酸化ナトリウム及び水で次々 に洗い（高圧、１５ｐｓｉ、各１２秒間洗浄）、その後ランニング緩衝液で再コ ンディショニングした（高圧、１５ｐｓｉ、１〜３分間すすぐ）。 図１Ａ及び１Ｂは、４つのモデルタンパク質のそれぞれｐＨ７及び９の０．５ Ｍリン酸塩緩衝液による分離を示す。表１はタンパク質及びそれらのｐＩを列挙 したものである。緩衝液ｐＨ７．０では、ウシ肺トリプシン阻害剤（ピーク１） 及びチトクロームＣ（ピーク２）が電気浸透性フローマーカー（ＤＭＦ）より速 く移動し、カルボニックアンヒドラーゼ（炭酸脱水酵素ともいう）（ピーク３） 及び大豆トリプシン阻害剤（ピーク４）は予想通りＤＭＦより遅く移動する。し かしｐＨ９．０の緩衝液では（図１Ｂ）チトクロームＣ（ピーク２）はＤＭＦよ り遅く移動し、そのｐＩが１０．６５であることから予想されるカチオンではな くアニオンのように振る舞う。 ＣＥでのリン酸塩緩衝液ｐＨ９．０におけるチトクロームＣの異常な移動挙動は 、多分チトクロームＣの正電荷部分がリン酸塩によって溶媒化し、溶媒化錯体と して移動することによる。同様なタンパク質移動挙動はスウェドベルグ（Swedbe rg，S.A.）（Anal.Biochem．185巻51−56ページ、1990）によりペンタフルオロ- ベンゾ イル被覆毛細管中でｐＨ７．０の０．５Ｍリン酸塩緩衝液を用いて観察されてい る。 図２はｐＨ８．０の０．５Ｍリン酸塩緩衝液を用いるミオグロビン、コンアル ブミン、並びにβ−ラクトグロブリンＡ及びＢの分離を示す。ミオグロビン及び コンアルブミン─それぞれ７．０及び６．６のｐＩ値を有する─がよく分離され る一方、β−ラクトグロブリンＢ及びＡはよく分離（resolve）される。非イオ ン界面活性剤を含む緩衝剤を用いる同様なタンパク質混合物の分離もオクタデシ ルトリクロロシランで誘導された溶融シリカ毛細管で実現されている（タウンズ （Towns,J.K.）ら、Anal.Chem.63巻、1126-1132ページ、1991）。わずか０．２ のｐＩ差を示すタンパク質種がこの緩衝条件のもとでＣＥによってよく分離され 、これは被覆毛細管の使用に頼らずともこの緩衝系が一般的に利用できることを 示している。 実験と実験の間に毛細管を塩基及び水で洗い、その後ランニング緩衝液を用い てさらにすすいだ。図２で用いられたタンパク質混合物及び２５μｍ×２３ｃｍ の毛細管中でｐＨ８の緩衝液を用いて９回の連続した実験を行った。表２は移動 時間、ピークの高さ及び各ピークの合計面積の再現性を示す。 マコーミック（McCormick,R.）（Anal.Chem.60巻、2322-2327ページ、1988）は 、ｐＨ１．５〜５．０の０．１５Ｍリン酸塩緩衝液がｐＩ値５．０〜１１．０を 有するペプチド類及び多くのタンパク質種の分離に極めて効果的であるように考 えられることを観察した。ｐＨ３．０以下のリン酸塩緩衝液の存在下では大部分 のタンパク質は正に荷電し、一方シリカ表面はほとんど中性で、十中八、九部分 的にイオン化している。緩衝液のｐＨが高まるにつれてシリカ表面はイオン化さ れ、負に荷電した表面を作り出す。５．０以上の緩衝液ｐＨでは、多分タンパク 質のシリカ壁への吸着により、リン酸塩緩衝液中におけるタンパク質分離効率は 低下し始めた。ｐＨ５．０ではタンパク質のカルボン酸部分が部分的にイオン化 し、他方すべてのアミノ及びグアニジン基は完全に正に荷電する。ｐＨ値５．０ 以上、濃度０．１５〜０．２５Ｍのリン酸塩緩衝液は、負に荷電したシリカ表面 へのタンパク質吸着を阻止するのに十分な電荷の反発を容易にはおこさない。 上記データによって示されるように、ｐＨ値４．０以上でタンパク質とシリカ 表面との相互作用を阻止するには実質的に高濃度のリン酸塩が必要であった。チ トクロームＣはｐＨ４．０、０．４Ｍリン酸塩緩衝液で５種類すべてからほぼベ ースラインで分離される。同じｐＨでもより低い緩衝剤濃度ではブロードで分離 されていない電気泳動図が得られるに過ぎず、チトクロームＣ種と毛細管壁との 間の顕著な相互作用が示唆される（図３）。 溶融シリカカラムにおいてＣＥによるタンパク質分離を行うために高濃度リン 酸塩緩衝液を使用する場合に提案されたメカニズムは、ラウアー（Lauer,H.H.） ら（Anal.Chem.58巻、166-169ページ、1986）及びグリーン（Greene,J.S．）ら （J.Chromatogr.478巻、63-70ページ、1989）によって提案されたイオン交換メ カニズムと同じである。タンパク質とリン酸塩との溶媒化錯体の形成が本来のタ ンパク質電荷を変化させる（スウェドベルグ、Anal.Biochem．185巻、51-56ペー ジ、1990）；これは電気浸透性フローマーカーに対するタンパク質の観察された 移動順序と一致する。 エメリック（Emerick,R.J.）（Amer.Instit.Nutr．22巻、1925-1928、1987） は、ｐＨ値６．５以上のリン酸塩緩衝液はタンパク質−ケイ酸複合体形成を阻止 することを観察した。ミチウク（Mitsyuk,B.M.）ら（Inorg.Chem.17巻、471-473 、1972）はシリカとリン酸塩とが相互作用してドナー-アクセプター型の複合体 を形成すると提案した。ｐＨ値５．０より大におけるリン酸塩とシリカ表面との 間のこのような相互作用は、実質的により高濃度のリン酸塩を必要とする動的コ ーティング現象（マコーミック、Anal.Chem．60巻、2322-2327、1988）をあらわ す。 ＣＥにおける高イオン強度緩衝液の使用は、熱を生成する大きい電流を生み出 す結果となる。小直径毛細管の使用はその電流を減らす。しかし上記適用の大部 分においては電圧勾配は典型的には３００〜４００Ｖ／ｃｍであり、他方電流は ３０から７５μＡまで変化した。こうしてＣＥシステムはこの熱を効率的に排除 するための十分な冷却剤循環を含むべきである（ラッシュ（Rush,R.S．）ら、An al.Chem.63巻、1346-1350ページ、1991）；ベロ（Bello,M.S.）ら、J.Chromatog r.625巻323-330ページ、1992）。 未被覆溶融シリカ毛細管を使用する毛細管電気泳動はこうして血清、腹水、尿 及びＣＳＦなどの複雑なタンパク質混合物の分析に使用できることが証明されて いる。高濃度リン酸塩を含む緩衝系の使用により、広範囲の緩衝液ｐＨにわたっ て迅速に、確実に、そしてすぐれた精度をもってタンパク質分析が実施できる。 ＣＥにおける高イオン強度緩衝液の使用は高電流を生み出し、ジュール熱を発生 させる。小直径カラムの使用及び冷却剤循環はこの発熱効果を減ずる。 リン酸塩緩衝系を使用するタンパク質分離のメカニズムはリン酸塩イオンとシ リカ表面との動的相互作用、及びタンパク質のリン酸塩アニオンによる溶媒和錯 体形成に基づく。後者はタンパク質−シリカ壁相互作用を最小にする。ここに示 した実験的証拠は中性及び塩基性ｐＨにおける動的コーティング現象の役割を示 している。最も重要なことは、本緩衝系が、広範囲の使用ｐＨをもつことと並ん で、関心とせるタンパク質種の最適分離をするための適切な緩衝ｐＨの選択を可 能とすることである。 例２ ホウ酸塩緩衝液及びベックマンタンパク質分析用緩衝液におけるタンパク質分 離 例１に記載されたホウ酸塩及びベックマンタンパク質分析用緩衝液を用いて毛 細管電気泳動を行った。ｐＨ９．０より大のホウ酸塩を基剤とする緩衝液は多く のタンパク質の分離に広く適用できるようにみえた。例えば卵白タンパク質は図 ４に示すように４つのゾーン─コンアルブミン、グロブリン類、オボアルブミン 、オボムコイド─に分離された（２００ｍＭホウ酸塩、ｐＨ１０）。卵白のリゾ チームピークは見られない；多分それは中性マーカー（ＤＭＦ）と同時移動する かまたは毛細管壁に吸着されるためであろう。同一実験条件下で正真正銘の卵リ ゾチームサンプル、０．５ｍｇ／ｍｌをＣＥ分析すると、リゾチームピークはな かった；これはほぼ全部が毛細管壁に吸着されることを示す。 ホウ酸塩緩衝液濃度を３００ｍＭに高めると、はっきりした(well-defined)分 離パターンが得られた（図４Ｂ）。リゾチームは２．６分の位置にはっきり認め られた（２．９分に見られる中性マーカーの前）。これは緩衝液ｐＨより１．０ ｐＨ単位だけ高い１１．０にリゾチームの等電点があることと一致する。高濃度 ホウ酸塩緩衝液は非常に強い塩基性のタンパク質であるリゾチームのシリカ表面 への吸着を阻止する（チェン（Chen,F-T.A．）、Clin.Chem.38巻、1651-53ペー ジ、1992）。残りのタンパク質はそれぞれの等電点に応じた順序で移動した。オ ボムコイド（ｐＩ＝４．６）は６〜６．６分に現れ、グロブリン（ｐＩ＝５．５ −５．８）は５．２及び５．３５分に２つのブロードなピークとして移動し、及 びコンアルブミン（ｐＩ＝６．６）は４．３分に現れた。各タンパク質ピー クは正真正銘のサンプルと同時に注入することによって同定された。オボムコイ ド及びオボアルブミンはタンパク質混合物の６７％、グロブリンは１３％、コン アルブミンは１６％を構成すると計算され、リゾチームは微量成分であり、３． ５％に過ぎない。 ヒト血清タンパク質のＣＥによる日常的分析の可能性がチェンら（Clin.Chem. 37巻、14−19ページ、1991）及びゴードン（Gordon,M.G．）ら（Anal.Chem.63巻 、69−72ページ、1991）によって示された。チェン（J.Chromatogr.516巻、69− 78ページ、1991）は、迅速なタンパク質分析のためには内径≦２５μｍをもった 毛細管カラムの使用が有利であることを証明した。図５Ａ及び５Ｂは正常なヒト 血清タンパク質分離パターンを示す：（図５Ａ）ＣＥにより、２０μｍ（内径） ×２５ｃｍ毛細管を用い、ベックマンタンパク質分析用緩衝液を用いて電圧勾配 ８００ｖ／ｃｍで分析、及び（図５Ｂ）アガロースゲル電気泳動による分析。血 清タンパク質フラクションの各々を明確に同定することができる。ガンマ−グロ ブリンが真っ先にあらわれ、その後ベータ、アルファ２、アルファ１、アルブミ ン及び少量のプレアルブミンが続く。より高いイオン強度の同一緩衝液の使用に よって、実質的によりよく分離される血清タンパク質分離が得られる（チェンら 、J.Chromatogr．516巻、69−78ページ、1991；チェン、Clin.Chem.38巻、1651 −53ページ、1992）、緩衝液への高濃度塩の添加は、ＣＥによるタンパク質分離 において概してピークの広がりの原因となるタンパク質−タンパク質相互作用を 最小にするようにみえる。 図６Ａ及び６Ｂにそれぞれ示されるように、異常なコントロール血清サンプル はＣＥ法及びアガロースゲル電気泳動法の両方によっ てほぼ同一の分離パターンを示した。骨髄腫患者からの血清サンプルを毛細管及 びアガロースゲル電気泳動装置の両方によって分析し、比較した。図７Ａ（ＣＥ ）及び図７Ｂ（アガロースゲル電気泳動）に示されるように、２つの方法によっ てほぼ同一のパターンが得られた。 同じホウ酸塩を基剤とする緩衝液系も尿試料の分析に使用できる；このサンプ ルは調製段階なしにＣＥシステムに直接導入することができる。タンパク質及び すべての他のイオン性種の分離を図８に示す。ここでは２００ｎｍでの吸光度を モニターすることによってかなり複雑なパターン（Ａ）が得られた。クレアチニ ン、馬尿酸、核酸分解産物などを含む小さな有機分子を確認することができた。 しかしながら２８０ｎｍでの吸光度をモニターして得られたパターンは明らかに より少ないピークを示す。図８の（Ｂ）に示されるように、尿酸が１３７秒で移 動する主要ピークとして確認される。尿中タンパク質は５５〜１００秒で移動す ると予想される。 脳脊髄液（ＣＳＦ）は図９に示すように多くの興味深いＣＥ分離パターンを示 す。ここでも尿の場合のようにサンプルは予備濃縮なしにＣＥシステム（Ａ）に 導入することができる。図９の（Ａ）を追跡した電気泳動図は、プレアルブミン の顕著なピークを含む（純粋なプレアルブミンとの同時注入によって同定した） 、正常なタンパク質分離パターンを示す。正常な血清タンパク質分離ゾーンの外 側に見いだされるいくつかのピークは多分、ＣＥにおいて検出される小分子であ る；なぜならばそれらはその他のゲル電気泳動法に必要な固定及び染色過程にお いて失われないからである。図９の軌跡（Ｂ）は分子量カットオフ１４ｋｄを有 する膜を経る透析後の同一 ＣＳＦサンプルの電気泳動図を示す。 例３ ジゴキシゲニンのＣＥ／ＬＩＦ検出 本発明の競合的ＣＥ／ＬＩＦ法を用いて血清中のジゴキシゲニンレベルを測定 した。ジゴキシゲニンをβ−フィコエリトリン（“ＢＰ^*”）で標識し、制限量 の抗ジゴキシンＦａｂの存在下で温置し、ＣＥに付した。 ジゴキシゲニン標識β−フィコエリトリン（Ｄ−ＢＰ^*）は、ほぼすべてのβ −フィコエリトリン分子が少なくとも１つのジゴキシゲニン分子で確実に標識さ れるように、ジゴキシゲニン−ＮＨＳとβ−フィコエリトリンとをＰＢＳ中で２ ０：１モル比で反応させることによって合成した。Ｄ−ＢＰ^*の保存溶液を２ｍ ｇ／ｍｌＢＳＡを含むＩＣＳ希釈液で希釈した。免疫反応のためには１．０μｇ ／ｍｌ Ｄ−ＢＰ^*溶液１００μｌをジゴキシンに対する過剰のアフィニティー 精製Ｆａｂ（ベーリンゲーマンハイム社（Boehringer Mannheim Corp．））と共 に温置した。条件：２ｋＶ／１０ｓ ｉｎｊ；７ｋＶ／７４μａ。 ＣＥは、ＵＶ吸光度検出器を除去し、ＬＩＦ検出器を設置するという変更を加 えたＰ／ＡＣＥシステム２１００を用いて行われた。１．０ミリワット ヘリウ ムネオン レーザー（５４３．５ｎｍ）を用いてβ−フィコエリトリン標識を励 起した。レーザー アウトプットは１０ｎｍレーザー ラインフィルターを用い て濾過し、５ｃｍ焦点距離凸レンズを用いて分離毛細管の検出領域に焦点を合わ せた。放物線反射鏡─これは毛細管をその焦点に固定している─を用いて蛍光放 出物を集め、平行にした。強レーザースキャッター面 におけるパラボラの前面を通って散乱マスクを置いた。平行になった放出物は先 ず始めに特別注文のノッチフィルター（５４３．５ｎｍブロック（blocking）） を通過し、その後５８０ｎｍに中心のある９ｎｍ帯域通過フィルターを通過し（ 両フィルター共、バールアソシエーツ（Barr Associates）から購入した）、最 後にend-on型光電子増倍管（Ｒ３７４、ハママツ）の光電陰極に達した。ヒト血 清をベースにしたＣＥのカリブレーターは濃度０．４２、２．７２及び５．２１ ｎｇ／ｍｌ濃度で行われた。 ＬＩＦ検出器（５４３ｎｍにおける緑色−Ｈｅ／Ｎｅレーザー励起）を設置し た改良Ｐ／ＡＣＥを用いて７５μｍ×３２ｃｍ毛細管でＣＥを行うとき、Ｄ−Ｂ Ｐ^*の顕著な吸着が１０^-5Ｍで認められ、それはブロードなＤ−ＢＰ^*ピークを形 成した。１０^-6Ｍ以下では、多分シリカ壁への吸着によって、このＤ−ＢＰ^*ピ ークは消失した。アルブミンのＤ−ＢＰ^*への添加は検出を顕著には改善しなか ったとはいえ、精製免疫グロブリン（０．５ｍｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳで希釈し たＤ−ＢＰ^*の使用は、図１０Ａに示すような優れたピーク対称性と検出感度を もたらした。 ＣＥのＡｂ−Ａｇ^*複合体を区別する能力を測定するためにＦａｂ １０μｌ 、Ｆａｂ ５０μｌまたはＦａｂ １００μｌ（溶液は５μｇ／ｍｌＦａｂであ った）を反応液に与えた。これら実験の電気泳動図はそれぞれ図１０Ｂ、１０Ｃ 及び１０Ｄに示される。実験は、Ｄ−ＢＰ^*がＣＥ（改良Ｐ／ＡＣＥで７１μｍ ×３２ｃｍ毛細管を用いる；１０^-8Ｍ被検体）によって抗ジゴキシンＦａｂ及び Ｄ−ＢＰ^*複合体からよく分離されることを示した。 合成ジゴキシゲニン標識β−フィコエリトリン（Ｄ−ＢＰ^*）の 各β−フィコエリトリン上にジゴキシゲニンが存在することは、過剰の抗体をＤ −ＢＰ^*に加えた図１０Ｄから明らかであり、生成した混合物は全Ｄ−ＢＰ^*分子 が抗体と種々の比率で完全に複合体化していることを示す。これは図１０Ｄには Ｄ−ＢＰ^*ピークが存在しないことからわかる。いくつかの肩をもったブロード な不均一なピークは、Ｆａｂと、β−フィコエリトリンに異なる数のジゴキシゲ ニン分子が結合した種との間の種々のモル比の抗体−抗原複合体を示唆した。Ｄ −ＢＰ^*に結合するＦａｂが多ければ多い程、そのＦａｂ分子のより近くに移動 する複合体が生成する。 ２．５〜２５ｎｇ／ｍｌ（１０^-11〜１０^-10Ｍに相当する）でＣＥ−ＬＩＦに よるＤ−ＢＰ^*の分析が示された。Ｄ−ＢＰ^*２．５ｎｇ／Ｌ（１０^-11Ｍに相当 ）では、Ｄ−ＢＰ^*に起因するシグナルはベースライン ノイズの約１０倍であ り（データは示さない）、このＬＩＦシステムの優れた検出下限が示される。 ジゴキシンの目盛り定めを図１１Ａから１１Ｄまでに示す；これらは濃度０． ４２ｎｇ／ｍｌ（図１１Ａ）；２．７２ｎｇ／ｍｌ（図１１Ｂ）；５．２１ｎｇ ／ｍｌ（図１１Ｃ）及び１０．４２ｎｇ／ｍｌ（図１１Ｄ）のジゴキシン カリ ブレーター５０μｌを用いた目盛り定めを示す。この一連の電気泳動図における 遊離標識抗原（Ｄ−ＢＰ^*）に関連したピーク及び標識抗原−抗体複合体（Ａｂ −Ａｇ^*）に関連したピークの相対的サイズから明らかなように、これらサンプ ルにおけるジゴキシン濃度が増加すると、抗体に対するジゴキシンと標識ジゴキ シンとの間の競合が容易に明らかになる。サンプル中のジゴキシン濃度が増加す ると、電気泳動図に見られる遊離ジゴキシン量も標識抗原−抗体複合体を犠牲に して増加する 。この傾向は分析法の有効性を証明する。Ｄ−ＢＰ^*の面積とＡｂ−Ｄ−ＢＰ^*（ Ａｂ−Ａｇ^*）及びＤ−ＢＰ^*の総面積との比を用いると、図１２に示すジゴキシ ン校正曲線が得られた。反応動力学から、免疫反応プロトコルによると免疫反応 は１０分間でその終点に達することがわかる。図１３は、使用したＬＩＦ条件下 では１〜３希釈の血清が比較的小さい蛍光バックグラウンドを与えることを示し ている。 まとめて言うと、これら実験は、臨床的に有用な分析濃度限界（１０^-9〜１０^-10 ）内の被検体の検出に用いることができるＣＥ／ＬＩＦに基づく免疫検定法 をあらわしている。β−フィコエリトリン標識の代わりにその他の発蛍光団、例 えばランニング緩衝液のｐＨには無関係な、十分明確な電荷をもつ、抗原に付着 するローダミンまたはフルオレッセイン誘導体などが用いられる。正に荷電して いる種は、標準条件下ではＣＥによって比較的シャープなピークを与えるのが普 通であり（負電極の方へ向かう電気浸透性フロー）、ＣＥ／ＬＩＦ免疫検定では 最も好ましい競合種である。 例４ ジゴキシゲニンの改良ＣＥ／ＬＩＦ検出法 ニールセン（Nielsen,R.G.）ら（J.Chromatogr．539巻、177-185ページ、1991 ）は、ＣＥを用いて抗体−抗原反応を研究することができること、及び抗原及び 抗体分子が匹敵するサイズならば、明らかにより大きい抗体−抗原複合体による ピークは、遊離抗体及び遊離抗原によるピークからはっきりと分離し得ることを 示唆した。測定はＵＶ吸光度を用い、タンパク質濃度約４×１０^-5Ｍで、高濃度 の阻害可能物質は存在しない条件のもとで行われた。したがって このような条件は典型的臨床的サンプルの評価の場合は役立たなかった。 本発明により、そしてＣＥを改良して臨床的サンプル中に存在するタンパク質 及び被検体の評価に用いることができるようにする目的で、これに代わるＣＥ／ ＬＩＦ法を用いた。この代わりのＣＥ／ＬＩＦ法ではベックマンインスツルメン ツ社、フラートン、ＣＡ、によるレーザー誘起性蛍光システムを備えたＰ／ＡＣ Ｅ^TM２１００を、ＩＢＭ ＰＳ２ ５６ＳＸ型によって制御されるＰ／ＡＣＥシ ステム ソフトウェアと共に用いた。ＣＥ／ＬＩＦのための毛細管カラムは普通 は２７ｃｍ長さ（検出器窓まで２０ｃｍ）×７５μｍ内径であり（ポリミクロテ クノロジーズ、フェニックス、ＡＺ）、蛍光を集める楕円形の鏡を有するＰ／Ａ ＣＥ^TMカートリッジ型に組み立てられた。５４３．５ｎｍで放射する２．５ミリ ワット 緑色ヘリウム−ネオンレーザーはパーティクル メジャリング システ ムズ（Particle Measuring Systems）、ボルダー、ＣＯ、から購入した。ＬＩＦ Ｅ検出器つきＰ／ＡＣＥシステムの標準ＳＭＡ−９０５ファイバーコネクターへ のレーザーヘッドカップラーはＯＺオプティックス（OZ optics）、オンタリオ 、カナダ、の製品であった。蛍光シグナルは５９０±９ｎｍの狭い帯域フィルタ ー（オリール（Oriel）、スタンフォード、ＣＴ）を介して集められ、一方レー ザービームは５４３．５ｎｍでノッチフィルターによって拒絶された（バールア ソシエーツ（Barr Associates）、ウエストフォード、ＭＡ）。 別のＣＥ／ＬＩＦ実施態様においてはジゴキシゲニン抗原をオリゴヌクレオチ ドに結合させた。このような結合は標識抗原の電気泳 動移動度を変えた。オリゴヌクレオチドの質量−負電荷の比はオリゴヌクレオチ ド長─２〜５ヌクレオチド─と共にほぼ直線的に減少するが、１０ヌクレオチド より上で迅速にプラトー（plateau）に達する。ヌクレオチド数が増加すると、 質量−負電荷の比は約１０ヌクレオチドで−３２７のプラトーに達し、緩衝液ｐ Ｈ８．６では不定数のヌクレオチドで−３０６に達することもある（図１４参照 ）。こうして開放毛細管における合成オリゴヌクレオチドの電気泳動移動度は、 １０量体またはそれより大きければオリゴ鎖の長さと共に大体一定である。 上記の理論に基づき、（ｄＴ）₁₀のオリゴヌクレオチドが、抗原としてのジゴ キシンの免疫化学的研究のための電荷調節剤として選ばれた。蛍光標識としてテ トラメチルローダミン（ＴＭＲ）が選ばれた。オリゴヌクレオチドを改質して、 その３’末端がジゴキシゲニン付加物を含み、その５’末端がテトラメチルロー ダミン標識を含むようにした。試薬はＣＰＧ−３’（ＦＭＯＣ−アミノ）−（ｄ Ｔ）₁₀−５’アミンから次の方法で作った（ＣＰＧ：コントロール有孔グラス； ＦＭＯＣ：９−フルオレニルメトキシカルボニル）。ＣＰＧ−３’（ＦＭＯＣ− アミノ）−（ｄＴ）₁₀−５’アミンの合成は１００ｎｍｏｌ ＣＰＧ−３’−Ｆ ＭＯＣ−アミノカラム（クロンテック（Clontech）パロアルト、ＣＡ）で開始し た。合成はファルマシアＤＮＡ合成器で行われた。オリゴ（ｄＴ）₁₀の５’末端 をＮ−ＭＭＴ−Ｃ₆−アミノ改質剤（ＭＭＴ：モノメトキシトリチル）、ＣＥホ スフォルアミダイト（クロンテック、パロアルト）でキャッピングした。Ｎ−Ｍ ＭＴ保護基を５０％酢酸で除去するとＣＰＧ−３’（ＦＭＯＣ−アミノ）−（ｄ Ｔ）₁₀−５’アミンが生 成した。 ＣＰＧ−３’（ＦＭＯＣ−アミノ）−（ｄＴ）₁₀−５’アミン固相（５０ｎｍ ｏｌ）の１部をアセトニトリル（１．０ｍｌ）中で室温で一晩かけて５−カルボ キシテトラメチルローダミン スクシンイミジルエステル（５ｍｇ，モレキュラ ープローブス（Molecular Probes）、ユージーン、ＯＲ）で誘導体化した。生成 した深紅色固相はテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）で誘導体化したｄ（Ｔ）₁₀ であった。ＴＭＲ−誘導固相を室温で２時間アンモニア分解すると、逆相カラム （ベックマンＯＤＳスフェロゲル）で分画されて３’アミノ−（ｄＴ）₁₀−５’ −ＴＭＲを与える混合物が得られた。ジゴキシゲニン−ＮＨＳエステル（ＮＨＳ ：Ｎ−ヒドロキシ スクシンイミジルエステル；ベーリンゲル マンハイム、イ ンディアナポリス、ＩＮ）を３’アミノ−（ｄＴ）₁₀−５’−ＴＭＲに加えると 、３’ジゴキシゲニン−（ｄＴ）₁₀−５’−テトラメチルローダミン［３’−Ｄ −（ｄＴ）₁₀−５’−ＴＭＲ］が生成した。これをＰＢＳで溶出するゲル濾過ク ロマトグラフィー（セファデックスＧ−２５カラム、０．７ｃｍ×１５ｃｍ）に よって精製した。３’−ジゴキシゲニン−（ｄＴ）₁₀−５’−ＴＭＲの合成法は 図１５に示される。各中間体の純度をＨＰＬＣ及びＣＥによってモニターした。 最終産物はＣＥ／ＬＩＦによると、図１６曲線（Ａ）に示されるように均質であ る。合成分子の機能的活性はジゴキシン免疫検定で証明された。 ジゴキシンに対するヤギ抗血清から単離したアフィニティ精製Ｆａｂ’断片を 用いて免疫検定を行った（ベーリンゲル マンハイム、インディアナポリス、Ｉ Ｎ）。０．４２、２．７８２及び５．２ １ｎｇ／ｍｌにおける血清を基剤とするジゴキシンカリブレーターをベックマン インスツルメンツ社、ブレア、ＣＡ、から入手した。抗体を２ｍｇ／ｍｌ ＢＳ Ａを含むＰＢＳで希釈した。３’−Ｄ−（ｄＴ）₁₀−５’−ＴＭＲ、４×１０^{-1 0} Ｍ、の５０μｌアリコートを血清カリブレーター１０μｌ及び２ｍｇ／ｍｌＢ ＳＡ含有ＰＢＳ ２０μｌと混合した。免疫反応はＦａｂ’抗体（１．０μｇ／ ｍｌ）２５μｌの添加で開始され、室温で１０分間（終点）行った。免疫反応生 成物の分析は、レーザー誘起性蛍光検出器（上記）を備えた自動毛細管電気泳動 装置で行われた。実験後のデータ分析はベックマンインスツルメンツ社、フラー トン、ＣＡ、によるシステム ゴールド^TMソフトウェアを用いて行われた。 過剰のＦａｂ’抗ジゴキシンを改質抗原、３’ジゴキシゲニン−（ｄＴ）₁₀− ５’−ＴＭＲ（１０^-9Ｍ）に加えると、図１２曲線（Ｂ）に示す電気泳動図が得 られた。新しいブロードなピークが３．５５分に発生し、他方図１２曲線（Ａ） の７．０６分に見られた３’−ジゴキシゲニン−（ｄＴ）₁₀−５’−ＴＭＲ種の シャープなピークは完全に消失した。７．０６分のピークを犠牲にした３．５５ 分の新しい、よりブロードなピークの出現は、Ｆａｂ’と３’−ジゴキシゲニン −（ｄＴ）₁₀−５’−ＴＭＲとの１：１複合体の形成を示した。３’−ジゴキシ ゲニン−（ｄＴ）₁₀−５’−ＴＭＲとの抗体複合体で認められるブロードなピー クは本質的にＦａｂ’分子の電気泳動移動度のイメージをあらわす。Ｆａｂ’抗 体−結合−及び遊離３’−ジゴキシゲニン−（ｄＴ）₁₀−５’−ＴＭＲ種は明ら かによく分離され、ジゴキシン免疫検定には十分適している。 ジゴキシン免疫検定における血清を基剤トするジゴキシン カリ ブレーターの使用が、ジゴキシン濃度０．４２ｎｇ／ｍｌ（曲線Ａ）、２．７２ ｎｇ／ｍｌ（曲線Ｂ）及び５．１３ｎｇ／ｍｌ （曲線Ｃ）で図１７に示される 。サンプル中のジゴキシン濃度が高まると、遊離３’−ジゴキシゲニン−（ｄＴ ）₁₀−５’−ＴＭＲのピークも増加した。その間、抗原−抗体複合体で認められ るピークは減少することがわかった。この傾向はＣＥ／ＬＩＦ分析法の有効性を 示した。競合的免疫検定は次の平衡式によってあらわすことができる： 各電気泳動図における遊離３’−ジゴキシゲニン−（ｄＴ）₁₀−５’−ＴＭＲ（ Ａｇ^*）のピークの蛍光シグナルの、総蛍光シグナルに対する面積比を用いてジ ゴキシン校正曲線（図１８）を作成した。結合−及び遊離３’−ジゴキシゲニン −（ｄＴ）₁₀−５’−ＴＭＲの量を同時に得ることができる。観察された反応動 力学は、この免疫反応条件下では免疫検定が１０分以内に平衡に達することを示 す（フレイターク（Freytag,J.W.）ら、Clin．Chem．30巻、417-420ページ、198 4）。 上記の結果は免疫検定のためのＣＥ／ＬＩＦの有用性を示している。標識抗原 、特異的抗体のための競合種、の電気泳動移動度の調節は競合免疫検定で示され ている（ルベンシュタイン（Rubenstein,K.E．）ら、Biochem.Biophys.Res.Comm un．47巻、846-850ページ、1972）；ジョリー(Jolley,M.E．)ら、Clin.Chem.27 巻、1190-1197ページ、1981）。オリゴヌクレオチドの使用は免疫検定のための 標識ハプテンの電荷に基づく変形の１例である。 大きい分子、例えばタンパク質抗原に対しては、タンパク質抗原のエピトープ に対するモノクローナル抗体が好ましい。エピトープは普通はアミノ酸５〜１０ の合成ペプチドであり、それは免疫検定のための競合種として用いられる。タン パク質抗原の直接検定のためには抗体の電気泳動移動度を、好適にはタンパク質 抗原のためのモノクローナル抗体を用いて調節することができる。抗体−抗原複 合体は、抗原及び改質抗体の電荷−対−質量比の算術平均値である電荷−対−質 量比をもつと考えられる。こうして、もし抗体が発蛍光団標識されており、タン パク質抗原に関してその過剰が用いられるならば、生成した複合体量はタンパク 質抗原の濃度に正比例するはずである。こうして固相分離でサンドイッチ免疫検 定に必要な１組の抗体種（シュールス（Schuurs,A.H.W.M.）ら、Clin.Chem.Acta .81巻、1-8ページ、1977）でなく、むしろ単一の抗体種がＣＥ／ＬＩＦ法を用い る免疫検定において必要とされる。溶液中の過剰抗体の使用は、従来の固相に基 づくサンドイッチ免疫検定法で見いだされるよりも好都合な反応動力学をもたら すはずである。 抗体または抗原の電荷調節と強力な毛細管電気泳動分離との組み合わせはレー ザー誘発蛍光検出と共に、臨床診断に使用するための多くの他の免疫検定の強力 な道具となることが約束される。 例５ 酵素分析におけるＣＥ／ＬＩＦ検出 本発明のＣＥ／ＬＩＦ法を用いてシアニン色素で標識したアンギオテンシンＩ タンパク質（asp-arg-val-tyr-Ile-his-pro-phe-his-leu）のプロテアーゼ触媒 加水分解の動態を研究した。アンギオテンシンＩを、５３２ｎｍに励起を、５８ ０ｎｍに放射をもつシアニ ン色素であるＣｙ３で標識し、その後プロテアーゼで消化した。消化反応産物− アンギオテンシンII（asp-arg-val-tyr-Ile-his-pro-phe）を含むことが知られ ている─をＣＥ/ＬＩＦ法を用いて分析した。 より詳細に述べると、Ｃｙ３；次の構造を有するカルボキシル活性化シアニン 色素（バイオロジカル ディテクション システムズ（Biological Detection S ys-tems）、ピッツバーグ、ＰＡ）： を使用してアンギオテンシンＩ、アンギオテンシンII（シグマケミカル、セント ルイス、ＭＯ）及びアスパラギン酸を標識した。その標識法は結合Ｃｙ３標識を 有する各タンパク質のＮ−α−末端アスパラギン酸残基を生起した。 これら標識タンパク質及びアスパラギン酸を作るために、アンギオテンシンＩ 、アンギオテンシンII及びアスパラギン酸の別々の溶液を作った。その濃度はｐ Ｈ７．５の５０ｍＭリン酸塩緩衝液中１．０ｍｇ／ｍＬであった。その後各溶液 ４６ｎモルをＣｙ３ ８０ｎモルを含む３つの異なる容器に加え、室温で１時間 反応させた。各反応の反応産物をＣ₁₈逆相カラム上でクロマトグラフィーに付し た；ダイオードアレイ検出器を備えたベックマン システム ゴールドＬＣ装置 で、メタノールと２０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ６． ０を溶出液として用いた。純度はＬＣ、ＣＥ及びＵＶ／可視分光測光を用いて確 認した。 ＣＥ／ＬＩＦシステムはベックマンインスツルメンツ社、フラートン、ＣＡ、 から入手したレーザー誘起性蛍光システムを備えたｐ／ＡＣＥ２１００であった 。この装置はＩＢＭ ＰＳ／２ ５５ＳＸ型でＰ／ＡＣＥシステムソフトウエア で制御されていた。実験後データ分析はＰ／ＡＣＥシステムに備えられているシ ステム ゴールド ソフトウエアで行われた。毛細管カラムは全長２７ｃｍ（検 出器窓まで２０ｃｍ）、直径２０μｍで、フェニックス、ＡＺ、のポリミクロ テクノロジーズから購入した。毛細管カラムは蛍光を集めるための楕円形鏡をも ったＰ／ＡＣＥカートリッジ型に組み立てられた。５３２ｎｍを放出する１５ミ リワット 周波数−二重ダイオードレーザーはアモコ レーザー（Amoco Laser ）、ナパーヴィル、ＩＬ、から提供され、ＬＩＦ検出器をもったＰ／ＡＣＥシス テムの標準ＳＭＡ−９０６ファイバーコネクターにヘッドカップルしたレーザー はＯＺオプティックス、オンタリオ、カナダ、の製品であった。蛍光シグナルを オリール（スタットフォード、ＣＴ）から供給された５９０ｎｍ±９ｎｍの狭い 帯域フィルターを通して集めた。レーザービームはアップライドフィジックス（ Applied Physics）、トランス、ＣＴ、から供給された５３２ｎｍノッチフィル ターによって拒絶された。５ミリワット 緑色ヘリウム−ネオンレーザー（５４ ３ｎｍ）はデンバー、ＣＯ、のパーティクル メジャメント システムから購入 した。 プロテイナーゼＫによるアンギオテンシンＩ消化を実施する前に、コントロー ル消化実験及びコントロール電気泳動を上記のＰ／Ａ ＣＥシステムで行った；その際２０秒間の低圧注入（０．５ｐｓｉ）を用い、サ ンプル構成成分を室温、電圧勾配７４０Ｖ／ｃｍ（２０ｋＶ、３０μＡ）で、ｐ Ｈ１０．２の２００ｍＭホウ酸塩緩衝液中で移動させた。図１９、電気泳動図Ａ は、移動時間２．１分及び２．２４分にそれぞれピークを示すＣｙ３−アンギオ テンシンＩ及びＩＩの１０^-8Ｍコントロールサンプルの相対的移動時間を示す； ４．２分移動時間のピークは１０^-9Ｍ濃度のＣｙ３二酸である。電気泳動図Ａを 得るために用いた溶液に酵素トリプシンを加えると、図１９（Ｂ）に示される電 気泳動図は２．８分にあらわれる単一ペプチド断片を示す。Ｃｙ３−アンギオテ ンシンＩ及びＣｙ３−アンギオテンシンＩＩ（アンギオテンシンＩプロテイナー ゼＫ消化の産物）に対するトリプシン消化の特異性は、この単一ペプチド断片が Ｃｙ３−asp-argであることを示唆する。カルボキシペプチダーゼＰをトリプシ ン消化物を含む混合物に加えると、図１９（Ｃ）に示されるようにＣｙ３−アス パラギン酸が形成される。 Ｃｙ３−アンギオテンシンＩのプロテイナーゼＫ消化を行うために、Ｃｙ３− アンギオテンシンＩの１０^-8Ｍ溶液（ｐＨ８．０の０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ緩 衝液中）９０μＬと、０．１Ｕ／ｍＬの溶液活性を有する１０μＬプロテイナー ゼＫとを室温で温置した。消化期間中反応物からサンプルを採取し、サンプル構 成成分を上記のようにＣＥ／ＬＩＦによって分析した。 基準マーカー、Ｃｙ３−二酸、及びＣｙ３−アンギオテンシンＩの反応前電気 泳動図を得た（図２０電気泳動図Ａ参照）。プロテイナーゼＫを反応混合物に添 加直後、反応時間０．１分で、約３０％のＣｙ３−アンギオテンシンＩが加水分 解されてＣｙ３−アンギオ テンシンＩＩになった（図２０の電気泳動図（Ｂ）参照）。図２０、電気泳動図 （Ｃ）に示すように、プロテイナーゼＫ添加の８分後にはほとんどすべてのＣｙ ３−アンギオテンシンＩがＣｙ３−アンギオテンシンＩＩに転換され、２．２５ 分移動時間にピークがあった。移動時間２．８分の微量産物Ｘも生成し始める。 ２４分の反応時間後、化合物ＸはＣｙ３−アンギオテンシンＩＩに代わって主要 産物となり、第二の微量成分Ｙが形成される。これは図２１、の電気泳動図、電 気泳動図（Ｄ）に示され、２．６分にＹがあらわれる。 図２１の電気泳動図Ｅ及びＦに見られるように連続消化後には化合物Ｙが増加 し、Ｚが形成される。Ｚの電気泳動移動はＸの電気泳動のすぐ後に示される。最 後に、連続及び完全消化後、化合物Ｚは増加し、結局、唯一の最終産物となる。 （図２２電気泳動図Ｇ及びＨ参照。）この最終産物は図１９電気泳動図（Ｂ）に 示すＣｙ３−アンギオテンシンＩ及びＩＩのトリプシン消化産物のそれに一致す る。Ｃｙ３−アンギオテンシンタンパク質の徹底的消化の最終産物である化合物 ＺをカルボキシペプチダーゼＰの存在下で消化すると、Ｃｙ３−アスパラギン酸 が生成物である。これは図１９電気泳動図Ｃによって実証される。 上記の実験は蛍光標識基質を用いるＬＩＦ／ＣＥに基づく酵素検定の有用性を 証明する。標識物質は安定であるから、それは少量酵素含有検定に十分適合し、 制限酵素活性またはＤＮＡハイブリダイゼーションプローブ検定にまで広げて使 用することができる。後者の場合標識基質またはプローブをＣＥによって生成物 から分離し、ＬＩＦによってモニターすることができる。本発明の方法は先行技 術のサンプル基質が妨害の可能性をもつ状態において酵素分析のために特に適し ている。本発明により、蛍光標識ペプチドを安定基質として用いて、酵素の活性 及び特異性が調べられる。標識基質上の酵素活性は、標識ペプチドを、ＣＥ／Ｌ ＩＦによって容易に分離、確認できる少なくとも１つの生成物に短くする。さら に蛍光標識をつけたペプチド基質を用いて複雑な混合物中の酵素を最小の妨害下 で分析することができる。 本発明をその特定の実施態様と関連づけて述べたが、それはさらに変更可能で あり、この適用は本発明の原理に概ねしたがい、本出願が、関係する技術内の公 知または一般的実用範囲内にあり、以上に説明され、この後に添付される請求の 範囲にしたがう本質的特徴にあてはまるような、本開示からの逸脱を含めた本発 明のいかなる変法、使用または応用を網羅するものであることは当然である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．サンプル中の被検体の濃度を検定する方法であって、 （Ａ）発蛍光団を含みかつ前記被検体に特異的に結合し得る過剰の免疫グロブ リンの存在下、前記免疫グロブリンと前記被検体とが免疫グロブリン−被検体複 合体を形成するのに十分な条件下で行われるように前記サンプルを温置し、 （Ｂ）複合体化していない免疫グロブリンから前記免疫グロブリン−被検体複 合体を分離するのに十分な条件下で行われるように、段階（Ａ）の所定量の免疫 グロブリン−被検体複合体を毛細管電気泳動に付し、そして （Ｃ）前記発蛍光団の蛍光を誘発させることにより前記免疫グロブリン−被検 体複合体を検出し、そして前記サンプル中の前記被検体の濃度に正比例する、誘 発された蛍光を検出することにより被検体の濃度を検定する 各段階を含んでなる方法。 ２．前記被検体が、タンパク質、ペプチド、薬学的薬剤および悪用薬物からな る群から選択される請求項１記載の方法。 ３．前記サンプルが、血液、血清、脳脊髄液、尿、水、土、廃棄物、食物およ びミルクからなる群から選択される請求項１記載の方法。 ４．前記タンパク質が酵素、受容体、免疫グロブリンまたは毒素からなる群か ら選択される請求項２記載の方法。 ５．前記被検体が、前記サンプル中に１０^-10Ｍ未満の濃度で存在している請 求項１記載の方法。 ６．段階（Ａ）で、前記免疫グロブリンが、ポリクローナル抗体、モノクロー ナル抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）₂フラグメントおよび一本鎖免疫グ ロブリンからなる群から選択される請求項１記載の方法。 ７．段階（Ａ）で、前記発蛍光団が、フルオロセイン、イソチオシアネート、 ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フ タルアルデヒドラベル、フルオレサミン、テトラメチルローダミン、およびＢＯ ＤＩＰＹ標識したオリゴヌクレオチドからなる群から選択される請求項１記載の 方法。 ８．段階（Ｂ）で、前記毛細管電気泳動が、未被覆の溶融シリカカラム中で行 われる請求項１記載の方法。 ９．段階（Ｃ）で、蛍光の誘発がレーザーで起こされる蛍光誘発である請求項 １記載の方法。 １０．サンプル中の被検体の濃度を検定する方法であって、 （Ａ）前記被検体および発蛍光団に特異的かつ拮抗的に結合し得る免疫グロブ リンの存在下、前記免疫グロブリンと前記被検体とがまたは前記免疫グロブリン と前記発蛍光団とが免疫グロブリン−被検体複合体を形成するのに十分な条件下 で行われるように前記サンプルを温置し、 （Ｂ）未複合化発蛍光団から前記複合体を分離するのに十分な条件下で行われ るように、段階（Ａ）の所定量の免疫グロブリン−被検体または免疫グロブリン −発蛍光団複合体を毛細管電気泳動に付し、そして （Ｃ）前記発蛍光団の蛍光を誘発させることにより前記免疫グロブリン−発蛍 光団複合体を検出し、そして前記サンプル中の前記被 検体の濃度に反比例する、誘発された蛍光を検出することにより被検体の濃度を 検定する 各段階を含んでなる方法。 １１．前記被検体がタンパク質であり、前記サンプルが、血液、血清、脳脊髄 液、尿およびミルクからなる群から選択される請求項１０記載の方法。 １２．段階（Ａ）で、前記タンパク質が酵素、受容体、免疫グロブリンまたは 毒素である請求項１１記載の方法。 １３．前記被検体が非タンパク質有機分子であり、前記サンプルが水、土、廃 棄物および食物からなる群から選択される請求項１０記載の方法。 １４．段階（Ａ）で、前記タンパク質が、酵素、受容体、免疫グロブリンまた は毒素である請求項１３記載の方法。 １５．段階（Ａ）で、前記免疫グロブリンが、ポリクローナル抗体、モノクロ ーナル抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）₂フラグメントおよび一本鎖免疫 グロブリンからなる群から選択される請求項１０記載の方法。 １６．段階（Ａ）で、前記発蛍光団が、フルオロセイン、イソチオシアネート 、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ− フタルアルデヒドラベル、フルオレサミン、テトラメチルローダミン、ＢＯＤＩ ＰＹ標識したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された蛍光部分を含む被検 体誘導体である請求項１記載の方法。 １７．前記被検体誘導体が、フルオロセイン、イソチオシアネート、ローダミ ン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコ シアニン、ｏ−フタルアルデヒドラベル、フルオレサミン、テトラメチルローダ ミン、ＢＯＤＩＰＹ標識したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された蛍光 部分を含む少なくとも１つのヌクレオチド残基を含む請求項１６記載の方法。 １８．前記被検体誘導体が、フルオロセイン、イソチオシアネート、ローダミ ン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアル デヒドラベル、フルオレサミン、テトラメチルローダミン、ＢＯＤＩＰＹ標識し たオリゴヌクレオチドからなる群から選択された蛍光部分を含む少なくとも１つ のヌクレオチド残基を有するオリゴヌクレオチドを含む請求項１７記載の方法。 １９．前記蛍光部分が、テトラメチルローダミンである請求項１８記載の方法 。 ２０．前記オリゴヌクレオチドが１０のヌクレオチド残基を含む請求項１８記 載の方法。 ２１．前記発蛍光団が次式： Ａ−３’−［Ｎ］_x−５’−Ｆ （式中、Ａは検定される被検体であり、Ｎはヌクレオチド誘導体であり、ｘはヌ クレオチド残基の数で、１〜２０の値であり、及びＦは蛍光部分である。） を有する請求項１８記載の方法。 ２２．ｘ＝１０であり、Ｆがテトラメチルローダミンである請求項２１記載の 方法。 ２３．段階（Ｂ）で、前記毛細管電気泳動が未被覆の溶融シリカ カラム中で行われる請求項１０記載の方法。 ２４．段階（Ｃ）で、蛍光の誘発がレーザーで起こされる蛍光誘発である請求 項１０記載の方法。 ２５．サンプル中の酵素を検定する方法であって、 （Ａ）サンプルを、発蛍光団を含みかつ酵素に特異的に結合し得る酵素基質の 存在下、酵素基質と酵素とが酵素基質−酵素複合体を形成し反応生成物を形成す るように反応するのに十分な条件下で行われるように温置し、 （Ｂ）標識した酵素基質から反応生成物を分離するのに十分な条件下で行われ るように、段階（Ａ）の所定量の温置されたサンプルを毛細管電気泳動に付し、 そして （Ｃ）発蛍光団の蛍光を誘発させ、サンプル中の反応生成物の濃度に正比例す る、誘発された蛍光を検出することにより反応生成物を検定する 各段階を含んでなる方法。 ２６．前記発蛍光団が反応性シアニン染料である請求項２５記載の方法。 ２７．前記反応生成物が、酵素基質を含む前記発蛍光団の加水分解生成物を含 む発蛍光団である請求項２５記載の方法。 ２８．前記酵素が、プロテアーゼである請求項２７記載の方法。