JPH09507079A

JPH09507079A - 疾患を仲介するためのビタミンｄ▲下３▼類似体と経路

Info

Publication number: JPH09507079A
Application number: JP7517631A
Authority: JP
Inventors: アンソニーダブリュー．ノーマン; ウィリアムエイチ．オカムラ
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1993-12-23
Filing date: 1994-12-23
Publication date: 1997-07-15
Also published as: WO1995017197A1; CA2179288A1; AU1445295A; EP0737070A4; EP0737070A1

Abstract

(57)【要約】１α，２５−（ＯＨ）₂ビタミンＤ₃［１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃］によって仲介されるゲノムまたは非ゲノムの細胞応答を制御する方法。この方法は、ビタミンＣ₃類似体の１，２５−（ＯＨ）₂−プレビタミンＤ₃または１β，２５−（ＯＨ）₂ビタミンＤ₃［１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃］で、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃に対し非ゲノム応答を呈する細胞を処理することを含む。１，２５（ＯＨ）₂−プレビタミンＤ₃は、細胞応答を促進する作動薬として機能し、他方１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃は、拮抗薬として機能する。トランスカルタキアは、非ゲノム応答の一つであり、１，２５（ＯＨ）₂−プレビタミンＤ₃または１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の投与により影響され、制御することができる。ゲノムおよび／または非ゲノム細胞応答を制御するのに使用しうるさらに１５種の類似体が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】疾患を仲介するためのビタミンＤ₃類似体と経路発明の背景本願は、１９９３年１２月２３日付けで出願した同時係属中の米国特許願第０８／１７３，５６１号の一部継続出願である。本発明は、米国国立衛生研究所から与えられた助成番号ＤＫ−０９０１２とＤＫ−１６，５９５に基づいた政府援助によってなされたものである。米国政府は、本発明にある種の権利を有している。１．発明の分野本発明は、一般に、ビタミンＤ内分泌系に関する。さらに詳しくは、本発明は、１α，２５−（ＯＨ）₂ビタミンＤ₃［１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃］によって仲介されるゲノムおよび非ゲノムの細胞応答を制御する方法に関する。２．関連技術の説明本発明の背景を説明しかつ本発明の実施に関する追加の詳細事項を提供するため、本明細書に引用した刊行物と他の参照文献は、本明細書に援用するものである。便宜上、これらの参照文献は、番号で引用し、付属の参考文献リストに明記した。ビタミンＤ₃は、高等動物の広範囲にわたる生物学的応答に感与するセコステロイド（secosteroid）である。これらの生物学的応答としては、カルシウムホメオスタシスの維持、免疫調節および選択された細胞の分化がある。ビタミンＤ₃自体は、生物学的に不活性である。しかし、ビタミンＤ₃の代謝によって、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃のような代謝物が生成すると、ビタミンＤ内分泌系の役割として観察される広範囲の生物学的応答に関与する生物活性化合物が生成する。１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃は、核受容体と相互に作用して多くの生物学的応答を起こす。核受容体とのこの相互作用の結果、遺伝子転写が調節される（１、２、３）。１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃に対する核受容体は、３０種類の組織中に存在していることが分かっており、そして、ステロイドホルモン類、レチノイン酸およびチロキシンの受容体を含むタンパク質の同じスーパーファミリーに属している（１、４、５）。上記ゲノム応答に加えて、サブセットの生物学的応答が、非ゲノム機構を通じて１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃によって仲介されることが明らかになっている（３、６）。これらの生物学的応答としては、トランスカルタキア（transcaltachia）として知られている腸のＣａ²⁺輸送の迅速な刺激がある（７〜９）。トランスカルタキアによってＣａ²⁺チャネルが開放される（１０）。１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃によって仲介される他の非ゲノム細胞応答としては、ラットの骨肉腫細胞の電位差開閉Ｃａ²⁺チャネル（voltage-gated Ca2+ channel ）の開放（１１、１２）ならびに腎臓（１３）、肝臓（１４）、上皮小体細胞（１５）および腸（１６）における他の迅速な作用がある。発明の概要本発明によって、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃のある種の類似体が１α，２５− （ＯＨ）₂Ｄ₃によって仲介される非ゲノム細胞応答を制御するのに有効であることが発見されたのである。本発明の特徴は、非ゲノム細胞応答の拮抗薬または作動薬として機能する特定の類似体が選択されることである。その結果、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃によって仲介される細胞応答を制御することができる。トランスカルタキアは、本発明に従って制御することができる特別の非ゲノム細胞応答である。トランスカルタキアの作動薬として用いることができるビタミンＤ類似体としては、１α，２５−（ＯＨ）₂−プレビタミンＤ₃がある。トランスカルタキアの低下が望ましい場合、１β，２５−（ＯＨ）₂ビタミンＤ₃［１β ，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃］を拮抗薬として用いる。本発明によって提供される制御方法は、各種の細胞が示す、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃のトランスカシアなどの非ゲノム応答を制限または増進するのに有効である。本発明は、生体内および生体外の両方での非ゲノム応答を制御するのに有用である。本発明の他の特徴は、ゲノムまたは非ゲノムの細胞応答を制御するのに有効な１５種の類似体を提供することである。これら１５種の類似体については以下の詳細な説明で説明する。本発明の上記のおよび他の多くの特徴とそれに伴う利点は、添付図面とともに以下の詳細な説明を参照することによって充分に理解できるようになるであろう。図面の簡単な説明図１Ａは、プレビタミンＤ₃の生成を含むビタミンＤ₃生成の代謝図式を示す。図１Ｂは、ホルモンとして活性な形態のビタミンＤ₃すなわち１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の２種の立体配座を示す。図２は、１，２５−（ＯＨ）₂−プレ−ビタミンＤと１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃ の形態の間の平衡関係を示す。図３は、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃、１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃および他の類縁類似体の構造を示す。図４は、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃、１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃および他の類縁類似体の構造を示す。図５Ａは、ビタミンＤが豊富なひなどり由来の灌流された十二指腸の静脈流（ venous effluent）への⁴⁵Ｃａ²⁺の出現に対する１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃および１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の効果を示す。各十二指腸を、⁴⁵Ｃ²⁺（５μＣｉ／ｍｌ）含有ＧＢＳＳで満たし、血管に、最初の２０分間（２５℃）対照の媒体（０．１２５％のウシ血清アルブミンと０．０５μｌのエタノール／ｍｌを含有するＧＢＳＳ）を灌流し、次いで直ちに６０ｐＭの１，２５−（ＯＨ）₂ −ｄ₅−プレ−Ｄ₃、６０ｐＭの１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃または対照の媒体を灌流させた。数値は、各試験グループ内の５個の十二指腸についての平均値±Ｓ．Ｅ．である。（●：１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃、△：１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃、□：対照）。図５Ｂは、灌流された十二指腸のトランスカルタキアを刺激する際の１，２５ −（ＯＨ）₂Ｄ₃と１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃の投与応答の分析結果を示す。試験条件は、図５Ａについて記載したのと同じであった。数値は、各濃度の作動薬で灌流した３〜５個の十二指腸に対する３０分の時点での平均値±Ｓ．Ｅ．である。作動薬に暴露されていない十二腸について^*ｐ＜０．０２、^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００５である。図６は、１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃または１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅ −プレ−Ｄ₃によって剌激された骨肉腫細胞中への⁴⁵Ｃａ²⁺の取り込みの測定結果を示す。左側挿入図は、静止緩衡液（resting buffer）内（Ｒ）、刺激緩衡液内（Ｓ）および最適濃度の１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃に暴露されたとき（Ｃ）の細胞の⁴⁵Ｃａ²⁺取込み特性を示す。ＲＯＳ１７／２．８細胞を実施例１に記載したようにして⁴⁵Ｃａ²⁺について検定した。すべての場合、静止緩衡液に暴露された細胞にセコステロイドを添加した。１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃は⁴⁵Ｃａ²⁺の取込みを刺激し、最大の応答は１．０〜５．０ｎＭの間で起こった（文献２８参照）。データ点は、３組測定値の平均値±Ｓ．Ｄ．を示す。図７Ａは、ブタ腸粘膜由来の１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃核受容体の、１，２５− （ＯＨ）₂Ｄ₃（●）、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃（△）および１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃（▲）に対するアフィニティーを示す。示したデータは、３回の実験の平均値±Ｓ．Ｄ．である。図７Ｂは、ひなどりの腸受容体とブタの受容体の１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃（類似体Ｃ）、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃（類似体ＨＦ）および１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃（類似体ＨＧ）に対するＲＣＩの測定結果を示す。ＲＣＩの数値は、図中に示し、平均値および得られる場合は±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝５）を示し、実施例１に記載したようにして算出した。図８は、精製ヒトＤＢＰの、１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃（○）、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃（△）および１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃（▲）に対するアフィニティーを示す。示したデータは、平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝２）である。図９は、ビタミンＤ欠乏ひなどりに１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃とその類似体４００ｎｇを一回筋肉注射した後のこれら注射したもののオステオカルシン（osteocalcin）の血清濃度に対する効果を示す（●：１，２５−（ＯＨ）₂ Ｄ₃、△：１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃、▲：１，２５−（ＯＨ）₂− ｄ₅−Ｄ₃）。数値は、平均値±Ｓ．Ｅ．（８羽のひなどり／グループ）を示す。図１０Ａは、１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃およびその類似体の１，２５−（ＯＨ）₂ −ｄ₅−プレ−Ｄ₃と１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃をマウスに連続投与した場合の血清Ｃａ²⁺に対する効果を示す。提示したセコステロイド類の提示した投与量をマウスの腹腔内に７日間毎日投与した。数値は平均値±Ｓ．Ｅ．（６頭のマウス／グループ）を示す。対照グループと比較して^*ｐ＜０．０１である。図１０Ｂは、１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃およびその類似体の１，２５−（ＯＨ）₂ −ｄ₅−プレ−Ｄ₃と１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃をマウスに連続投与した場合のオステオカルシンに対する効果を示す。提示したセコステロイド類の提示した投与量をマウスの腹腔内に７日間毎日投与した。数値は、平均値±Ｓ．Ｅ．（６頭のマウス／グループ）を示す。対照と比較して^*ｐ＜０．０１である。図１１は、ＭＧ−６３細胞中の１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃とその類似体の、増殖の阻害（図１１Ａ）とオステオカルシンの誘発（図１１Ｂ）に対する効果を示す（●：１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃、△：１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃、 ▲：１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃）。示したデータは、２回繰返した代表的な実験から得たデータである。図１２は、１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃とその類似体の、ＨＬ−６０細胞の分化に対する効果を示す。その分化作用は、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）還元法で評価した（●：１，２５−（ＯＨ）₂ Ｄ₃、△：１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃、および▲：１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃）。示したデータは、２回繰返した代表的な実験から得たデータである。図１３は、トランスカルタキア検定時の１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の４種のＡ −リングジアステレオマーの選別の結果を示す。血管に、最初の２０分間（２５ ℃）対照の媒体（０．１２５％のウシ血清アルブミンと０．０５μｌのエタノール／ｍｌを含有するＧＢＳＳ）を灌流し、次いで直ちに提示した濃度の要求された類似体または対照の媒体を灌流させて、ＧＢＳＳ中への⁴⁵Ｃａ²⁺（５μＣｉ／ｍｌ）の出現に対する各類似体の効果を測定した。数値は、各実験グループ内の５個の十二指腸についての平均値±Ｓ．Ｅ．である（●：提示した類似体、○：対照）。図１４は、灌流されたひなどりの十二指腸の１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃で刺激された腸の⁴⁵Ｃａ²⁺輸送活性の拮抗作用を示す。各十二指腸は、⁴⁵Ｃａ²⁺（５μ Ｃｉ／ｍｌ）含有ＧＢＳＳで満たし、血管で、最初の２０分間、対照媒体（０．１２５％のウシ血清アルブミンおよび０．０５％μｌのエタノール／ｍｌを含有するＧＢＳＳ）を灌流させ（２５℃）、次に、３００ｐＭの１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃（類似体Ｃ）もしくは３００ｐＭの１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃（類似体ＨＬ）単独またはこれら類似体を混合したもの（３００ｐＭ）を灌流させた。数値は、１グループ当り４個または５個の十二指腸についての平均値±Ｓ．Ｅ．である。図１５は、トランスカルタキアに対する１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の作動薬作用を阻害する１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の性能を評価した結果を示す。図１５Ａの場合は、各種の濃度の１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃を予めまたは同時に灌流された十二指腸に１β，２５− （ＯＨ）₂Ｄ₃（ＨＬ）を加えた。提示したデータは、４個または５個の十二指腸から得た平均値±Ｓ．Ｅ．を示す（●類似体ＨＬおよびＣ［１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃］、○：対照）。図１５Ｂは、３００ｐＭの１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃によるトランスカルタキアの刺激を阻害する１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の投与応答の関係を示す。データは、３２分におけるタイムコースプロット（time-course plot）（図１５Ａに示す）から抽出した処理後（treated）／基本値（basal val ue）の比率の値±Ｓ．Ｅ．を示す。図１６は、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃（Ｃ）によって剌激される骨肉腫細胞への⁴⁵Ｃａ²⁺の取込みの１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃（ＨＬ）による阻害を示す。左側の図は、静止緩衡液中（Ｒ）、刺激緩衡液中（Ｓ）、および最適濃度の１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃に暴露されたとき（Ｃ）の該細胞の⁴⁵Ｃａ²⁺取込み特性を示す。ＨＬとＣの両者を含む各処理では、ＨＬの濃度は上側の値であり、Ｃの濃度は下側の値である。ＲＯＳ１７／２．８細胞を実施例２に記載されているようにして⁴⁵Ｃａ²⁺について検定した。すべての場合、セコステロイド類は、静止緩衡液に暴露されている細胞に添加した。１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃で刺激された⁴⁵Ｃａ²⁺の最大応答による取込みは、１．０〜５．０ｎＭの間で起こる。データ点は、３組測定の平均値±Ｓ．Ｄ．を示す。図１７は、ビタミンＤ欠乏ひなどりのＩＣＡ（図１７Ａ）とＢＣＭ（図１７Ｂ）に対する１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃、１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃および１α，２５−（ＯＨ）₂−３−エピ−Ｄ₃の投与応答効果を示す。ビタミンＤ欠乏ひなどりに、検定を行う１２時間前、類似体および１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃を筋肉内に投与した。対照のＤ₃は検定を行う４８時間前に投与した。試験結果は、５〜７匹のひなどり群の平均値±Ｓ．Ｅ．として示す。各検定には、負の対照、白抜き棒グラフ（open bar）（−Ｄ）およびビタミンＤ₃ ３．２５ｎｍｏｌの正の対照、黒塗り棒グラフ（solid black bar）を含めた。これらの群間には、ｐ＜０．０１にて有意差があった。別個の生物検定法で、４種のジアステレオマーについて詳細な評価を実施し、その結果を表１に要約してある。図１８は、ＭＧ−６３細胞中４種のＡ−リングジアステレオマーのオステオカルシン誘発に対する効果を示す。１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃と１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の両者を、オステオカルシンを誘発するこれらの性能について互いに独立して評価した（図１８Ａ）（●：１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃、○：１β，２５ −（ＯＨ）₂Ｄ₃（ＨＬ）、□：１β，２５−（ＯＨ）₂−３−エピ−Ｄ₃（ＨＨ））。さらに、オステオカルシンの誘発に対する１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の作用に拮抗する１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の性能を評価した（図１８Ｂ）。この実施例では、１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の濃度は、１０^-9〜１０^-7Ｍに一定に保持し、一方１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の濃度は、１０^-11Ｍから１０^-6Ｍまで変えた（▽：１０^-9Ｍ１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃＋各種濃度の１α，２５−（ＯＨ）₂ Ｄ₃、□：１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃ １０^-8Ｍ＋各種濃度の１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃、△：１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃ １０^-7Ｍ＋各種濃度の１α，２５− （ＯＨ）₂Ｄ₃）。また、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃（●）と１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃（○）は単独で、すなわち他のセコステロイドなしで、評価した。詳細は、実施例２参照。示したデータは、代表的な実験から得たデータであり、３回実験を行った。図１９は、ＨＬ−６０細胞の分化に対する１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃と１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の効果を示す。セコステロイド類の分化作用は、実施例２に記載されているようにしてＮＢＴ還元法で評価した。示したデータは、２回繰返した代表的な実験から得た（●：１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃、○：１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃、▽：１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃ １０^-9 Ｍ＋各種濃度の１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃、△：１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃ １０^-8Ｍ＋各種濃度の１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃、□：１α，２５−（ＯＨ）₂ Ｄ₃ １０^-7Ｍ＋各種濃度の１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃）。図２０は、角化細胞の分化に対する１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃Ａ−リング類似体の効果を示す。ヒト皮膚角化細胞は、実施例２に記載されているようにして、９６ウエルプレートでの組織培養で増殖させた。Ａ−リング類似体を提示した濃度で添加し、次いで［³Ｈ］チミジンを添加することによって、細胞の増殖速度を３時間評価した（●：１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃、□：１β，２５−（ＯＨ）₂ Ｄ₃、△：１β，２５−（ＯＨ）₂−３−エピ−Ｄ₃、◇：１α，２５−（ＯＨ）₂ −３−エピ−Ｄ₃）。図２１は、本発明の類似体：ＧＥ、ＧＦ、ＨＳ、ＩＢ、ＪＤ、ＪＭ、ＪＮ、ＪＯおよびＪＰの構造式を示す。図２２は、本発明の類似体：ＪＲ、ＪＳ、ＪＶ、ＪＷ、ＪＸおよびＪＹの構造式を示す。図２３は、類似体：ＧＥとＧＦを製造する合成経路を示す。図２４（Ａ）と（Ｂ）は、類似体：ＪＭとＪＮそれぞれを実施例６に記載されているようにして試験した結果を示す。この試験では、十二指腸ループ中の⁴⁵Ｃａ²⁺の輸送料を増大させて、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃または１α，２５（ＯＨ）₂−７−デヒドロコレステロール（ＪＭ）または１α，２５（ＯＨ）₂−ルミステロール₃を血管で灌流させ［⁴⁵Ｃａ²⁺（５μＣｉ／ｍｌ緩衝液）］、そして最初の２０分間は対照の媒体を血管で灌流させ、最後の１０分間は２分間隔で静脈流を集めて基本の輸送速度（basal transport rate）を求めた。次に、その十二指腸は、ビヒクルエタノール（最終濃度０．００５％）を含有する対照媒体に腹腔動脈を通じて再度暴露させるか、または３００ｐＭの作動薬または６５０ｐＭの作動薬を血管で灌流させた。静脈流を再び２分間隔で集めて液体シンチレーション分光光度法に付した。処理された相中の試験結果を各十二指腸内の基本の平均輸送に対して正規化した。数値は、平均値±ＳＥＭ（各グループ中ｎ＝４）を示す［（Ａ）ＪＭを灌流、（Ｂ）ＪＮを灌流］。各グラフには、ビヒクル対照と正の対照としての６５０ｐＭの１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃が含まれている。図２５（Ａ）と（Ｂ）は、実施例６に記載したようにして類似体のＪＭとＪＮそれぞれを試験した結果を示す。この試験では、トランスカルタキアに対する作動薬としてのＪＭとＪＮの投与応答を分析した。十二指腸に、図２４について記載したようにビヒクルまたはある範囲の濃度のＪＭまたはＪＮを灌流させた。灌流を４０分行った後の正規化輸送量を、提示した濃度の（Ａ）ＪＭ、（Ｂ）ＪＮに対して示す。図２６は、本発明の類似体類を使用して治療することができる各種の疾患を示すチャートである。図２７は、類似体ＩＢの合成を示す図式である。詳細な説明本発明は、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃によって仲介されるトランスカルタキアなどの非ゲノム細胞応答を制御する方法を提供するものである。上記の非ゲノム細胞応答の活性化は、本発明に従って細胞を１，２５−（ＯＨ）₂−プレビタミンＤ₃（図２に示す化合物ＢＣ）で処理することによって達成される。この１，２５−（ＯＨ）₂−プレビタミンＤ₃は、実施例１に詳細に記載するように、トランスカルタキアの作動薬であることが見出されたのである。本発明の他の態様では、実施例２に記載されているようにして細胞を１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃で処理することによって、１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃で仲介される非ゲノム応答に拮抗させる。１α，２５−（ＯＨ）₂−プレビタミンＤ₃または１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃による治療は、諸実施例に述べられているようにして、すなわち、適当な医薬担体中の類似体を直接注射または灌流することによって、達成することができる。投与レベルは、諸実施例に記載されている投与レベルに類似したレベルが好ましい。処理される細胞のタイプは、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃が仲介する非ゲノム細胞応答を受けることが知られているものであればよい。これらの細胞は、生体内または生体外で処理することができる。例えば、本発明に従って制御することができる好ましい非ゲノム仲介応答は、腸のＣａ²⁺チャネルの開放を行うトランスカルタキアである。カルタキア（ｃａｌｔａｃｈｉａ）の制御は、好ましくは、所望の上記拮抗薬または作動薬の類似体を選別し、それを腸内に灌流することによって達成される。以下の二つの実施例によって、本発明について一層詳細に、プレビタミンＤ₃ または１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃を用いて、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃が仲介する非ゲノム応答を変えることについて述べる。実施例１下記の実施例によって、プレビタミンＤ₃が、１α，２５−（ＯＨ）₂ Ｄ₃によって仲介される２種の非ゲノム細胞応答を刺激するのに有用であることを例証する。具体的に述べると、この実施例は、分離され灌流されたひなどりの十二指腸のトランスカルタキアが剌激され、かつラットの骨原性肉腫細胞のＣａ²⁺ チャネル開放も刺激されることを示す。図１Ａは、ビタミンＤ₃産生の代謝図式を示す。皮膚内に存在しているプロビタミンの７−デヒドロコレステロールが、紫外線の照射によってセコステロイドのビタミンＤ₃に変換される。プレビタミンＤ₃は、ビタミンＤ₃と熱平衡の状態にあり、この変換は［１，７］−シグマトロピックシフト、すなわち、水素の炭素−１９から炭素−９への分子内移動によって行われる。得られた生成物のビタミンＤ₃は、Ｃ／Ｄリング構造に対するＡリングの配向について立体配座が移動性の分子である。この図の下部に示すように、セコ−Ｂリングが炭素６−７の単結合のまわりを回転するため２種の立体配座のうちの一方の配座をとることができる。すなわち、６−ｓ−シス配向の場合、Ａリングは、通常のステロイド配向のようにＣ／Ｄリングに関連して本明細書では「ステロイド様立体配座」と呼称され、そして立体配座が６−ｓ−トランス配向の場合は、Ａリングは、「伸びきり立体配座」で存在している。図１Ｂは１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の２種の配向を示す。１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃は、炭素−６と炭素−７の間の単結合のまわりを自由に回転するので、溶液中で、ステロイド様立体配座（６−ｓ−シス）または伸びきり立体配座（６−ｓ−トランス）の配向をとることができる。 ⁴⁵Ｃａ²⁺は、ＤｕＰｏｎｔ−ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ社から入手した。１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃は、ＨｏｆｆｍａｎＬａＲｏｃｈｅ社（米国ニュージャージー州ナットリー所在）から入手した。［メチル−Ｈ³］チミジン（２Ｃｉ／ｍｍｏｌ）は、ＡｍｅｒｓｈａｍＣｏｒｐ．社から購入した。細胞の培養培地は、ＧＩＢＣＯ社から購入した。ペニシリンとストレプトマイシンは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社（ドイツのマンハイム所在）から購入した。４−ニトロブルーテトラゾリウムは、Ｓｉｇｍａ社から入手した。ヒト血漿ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）は、前に記述（１７、１８）のアフィニティクロマトグラフィーによって製造した。１，２５−（ＯＨ）₂−９，１４，１９，１９，１９− ｄ₅−プレ−Ｄ₃（類似体ＨＦ）の化学合成類似体のＨＦと１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃（類似体ＨＧ）をカーチン− オカムラ（Curtin and Okamura）法（１９）にしたがって合成した。１，２５− （ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃は、約１年間−６０℃で貯蔵し、時々周囲温度まで昇温させて試料を取出し生物学的に評価したところ、試料はビタミン形を４．４％およびプレビタミン形の類似体ＨＦを９５．６％含有しているという分析結果が得られた。時々昇温させることなく同じ温度に維持した１，２５−（ＯＨ）₂ −ｄ₅−プレ−Ｄ₃の類似の試料または新たに合成した試料は、比較したところ、ビタミン形を１．２％およびプレビタミン形を９８．８％含有していることが分かった。この組成測定は、Ｗａｔｅｒｓホトダイオードアレーデテクターを用い、順相カラム（溶媒として９０％の酢酸エチルと１０％ヘキサンを用い、流量が５ｍｌ／ｍｉｎのＷｈａｔｍａｎＰａｒｔｉｓｉｌカラム）の分析用高性能液体クロマトグラフィーで実施した。電子工学的に積分したピーク面積は、一方は２６０ｎｍで得、他方は２６６ｎｍで得た二つの値の平均値であった。［１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃ ＤＥ＝１７，２００、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃ Ｅ＝７，２００］。切取って重量を測定した積分ピーク面積を用いて別個に比較して照合確認したところ、±０．７％で全体が一致することが分かった。保持時間は、次のとおりであった。１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃：約１８分、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅ −プレ−Ｄ₃：約２４．５分であった。これらの保持時間は、これら２種のセコステロイドの非重水素化形のものと殆ど同一である。動物と細胞白色レグホンのひな雄どり（米国カリフォルニア州レイクビュー所在のＬａｋｅｖｉｅｗＦａｒｍｓ社）を孵化の日に入手し、ビタミンＤ補充餌（１．０％カルシウムおよび１．０％リン、米国カリフォルニア州オンタリオ所在の０．Ｈ．ＫｒｕｓｅＧｒａｉｎａｎｄＭｉｌｌｉｎｇ社）で５〜６週間飼育して通常のビタミンＤ₃−豊富ひなどりをつくった。動物を用いる実験は、すべて、ｔｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ−ＲｉｖｅｒｓｉｄｅＣｈａｎｃｅｌｌｏｒ’ｓＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎＡｎｉｍａｌｓｉｎＲｅｓｅａｒｃｈの許可を受けた。ヒト前骨髄球白血病細胞系（ＨＬ−６０）とＭＧ−６３細胞は、ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国メリーランド州ロックビル所在）から入手した。１日齢のＲＩＲひなどりを窓なし室内に入れ、ビタミンＤの豊富餌で１週間飼育し、続いてビタミンＤ欠乏餌（オランダのバーデン所在のＨｏｐｅＦａｒｍｓ社）で続いて５週間飼育した。合計６週間経過してから、グループ分けを行い、１０：１０：８０ｖ／ｖ／ｖのエタノール、Ｔｗｅｅｎ８０、ＮａＣｌ、０．９％で可溶化した４００ｎｇの１，２５ −（ＯＨ）₂Ｄ₃または類似体のＨＦもしくはＨＧを一回筋肉内注射した。セコステロイドを投与してから３，２，４，６，９，１２，１６，２４および３６時間後に羽根の静脈から血液を採取した。これらひなどりのタンパク質に対して生成する特異的抗ひなどり抗血清を用いるラジオイムノアッセイによって血清オステオカルシンを測定した。ＮＭＲＩ系のマウスに通常の餌（ＨｏｐｅＦａｒｍｓ社）を４０〜６０日間与えた。これらのマウスには、１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃または類似体のＨＦとＨＧを７日間毎日皮下に投与した。血清Ｃａ²⁺を原子吸光分光法で測定し、血清オステオカルシンのレベルをラジオイムノアッセイで測定した。ブタの腸粘膜は、ケタラール（Ｋｅｔａｌａｒ）で麻酔した２０ｋｇのブタから得た。その粘膜を削り取り、１，２５ −（ＯＨ）₂Ｄ₃核受容体を調製するときまで−８０℃で貯蔵した（以下を参照）。Ｍｅｒｋ，ＳｈａｒｐａｎｄＤｏｈｍｅ社（米国ペンシルベニア州ウエストポイント）から入手したＲＯＳ１７／２．８細胞を、ダルベッコの改良イーグル培地とハムのＦ−１２培地の１：１混合物でウシ胎児血清（ＧＴＢＣＯ−ＢＲＬ社）を１０％含有する培地で培養した。この培地は、文献（２４）に記載されているようにして、１．１ｍＭＣａＣｌ₂を補充した。⁴⁵Ｃａ²⁺の取込みの試験の場合、細胞を、３．５ｃｍの皿の中に３０，０００細胞／ｍｌの密度で接種し、約５０％の集密度まで増殖させた。カルシウム取込みの検定ＲＯＳ１７／２．８細胞のＣａ²⁺取込みをすでに報告されている（２０）手順を用いて検定した。検定は、１分間を標準にしたが、予備実験はこの１分間が直線的取込みの区間内にあることを実証した。培地を吸引し、細胞を室温のハンクス緩衡食塩水で洗浄し、次いで「静止緩衡液」（１３２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１．３ｍＭのＭｇＣｌ₂，１．２ｍＭのＣａＣｌ₂、１０ｍＭのグルコースおよび２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４を含有）または「剌激緩衡液」（５ｍＭのＮａＣｌ、１３２ｍＭのＫＣｌ、１．３ｍＭのＭｇＣｌ₂，１．２ｍＭのＣａＣｌ₂ 、１０ｍＭのグルコースおよび２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４を含有）で１分間培養した。両方の取込み溶液には、１２．５μＣｉ／ｍｌの⁴⁵Ｃａ²⁺（ＤｕＰｏｎｔ−ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ社）と図２に示す濃度のビタミンＤ作動薬を含有させた。取込みは、上記標識溶液を吸引して停止させ、次に氷冷静止緩衡液で３回洗浄した。細胞に結合した⁴⁵Ｃａ²⁺を、０．５ＭのＮａＯＨとともに２時間インキュベートすることによって抽出し、液体シンチレーションカウンティング法で測定した。ＲＯＳ１７／２．８細胞の単層培養物による⁴⁵Ｃａ²⁺の取込み量は、密度依存性であることが見出された。最大の取込み速度は５０％〜８０％の集密度の培養物の場合に一貫して見られた。腸の⁴⁵Ｃａ²⁺輸送（トランスカルタキア） ⁴⁵Ｃａ²⁺輸送の測定は、すでに報告されている（２１〜２３）ように、灌流されたひなどりの十二指腸で実施した。体重が約５００ｇの通常のビタミンＤ豊富ひなどりをクロロペント（Ｃｈｌｏｒｏｐｅｎｔ）（米国アイオア州ＦｏｒｔＤｏｄｇｅ、０．３ｍｌ／１００ｇ）で麻酔し、次に外科手術で十二指ループを露出させた。腹腔動脈から分岐する血管を照明した（ｌｉｇｈｔ）後、腹腔動脈自体のカニュレーションを行い、同時に血管灌流を開始した。次に、十二指腸ループを切り取り、腹腔静脈のカニュレーションを行ってから、食塩水でぬらしたチーズクロスの層（２４℃）の間に入れた。動脈の灌流を、カニュレーション中に、０．９ｍＭのＣａＣｌ₂を含有させて改良し９５％のＯ₂と５％のＣＯ₂で酸化させた改良グレイ平衡塩類溶液（ＧＢＳＳ）を用いて２ｍｌ／ｍｉｎの流速で開始した。補助ポンプを用いて、ビヒクル（エタノール）または試験物質＋アルブミン（０．１２５％ｗ／ｖの最終濃度）を、血管灌流液中に０．２５ｍｌ／ｍｉｎの流速で導入した。⁴⁵Ｃａ²⁺ （５μＣｉ／ｍｌ）を含有しているが重炭酸塩またはグルコースなしのＧＢＳＳをフラッシュさせて腸の内腔を満たした。基本輸送速度（basal transport rate ）は、腸内腔を⁴⁵Ｃａ²⁺で満たした後、２０分間対照媒体を灌流させることによって確認した。次に、その組織を、さらに４０分間、１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃または１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃に暴露するかまたは対照の媒体に再暴露した。基本試験期間の最後の１０分間および全処理期間中、２分間隔で血管灌流液を収集した。１００μｌずつ２回採取して、⁴⁵Ｃａ²⁺のレベルを液体シンチレーション分光測定法で測定した。試験結果は、４０分間の試験期間に出現する⁴⁵Ｃａ²⁺／平均初期基本輸送期間の⁴⁵Ｃａ²⁺の比率で表す。リガンド結合の試験１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃に対するひなどり腸の核受容体に結合するため［³Ｈ］１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃と競合する各類似体の相対的性能を標準の手順にしたがって生体外の条件下で実施した（２４、２５）。この検定では、濃度を高めた非放射性１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃または試験類似体を、固定飽和量の［³Ｈ］１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃およびビタミンＤ欠乏ひなどりから得たひなどり腸核抽出物とともにインキュベートした。そして［³Ｈ］１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の最大結合百分率の逆数を算出し、類似体と［³Ｈ］１，２５− （ＯＨ）₂Ｄ₃の相対濃度の関数としてプロットした。このプロットによって、各類似体に対して特徴的な真っ直ぐなグラフカーブ（linear curve）が得られ、その傾斜は類似体の競合指数値（competitive index value）（２４）に等しい。次に、各類似体の競合指数値を、競合ステロイドとしての非放射性１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃で得た標準カーブに対して正規化し、相対競合指数（ＲＣＩ）のリニア−スケール（ｌｉｎｅａｒｓｃａｌｅ）上に置いた。なお、１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の定義によるＲＣＩは１００である。１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃受容体に対する結合は、ビタミンＤ豊富ブタから得た粘膜で測定した。凍結（−８０℃）十二指脳粘膜を４倍容積の緩衡液（０．５Ｍのトリス−ＨＣｌ、０．５ＭのＫＣｌ、５ｍＭのジチオトレイトール、１０ｍＭのＮａ₂ＭｏＯ₄、１．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中で音波処理した。高速上澄液（high speed supernatant）を、０．２ｎＭの［³Ｈ］１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃、および最終容積が０．３ｍｌの濃度を上げた非放射性の１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃またはその類似体とともに一夜２５℃でインキュベートし、次いで４℃で５分間インキュベートした。次に、デキストランでコートした冷チャーコールを添加して、相分離を起こさせた。１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃およびその類似体のｈＤＢＰに対する結合は、すでに報告されているのとほぼ同様にして４℃で実施した（２６）。［³Ｈ］１，２５ −（ＯＨ）₂Ｄ₃および１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃またはその類似体をガラス試験管中５μｌのエタノールの中に添加し、最終容積１ｍｌ（０．０１Ｍのトリス−ＨＣｌ、０．１５４ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）でｈＤＢＰ（０．１８μＭ）とともに４℃で４時間インキュベートした。次に、デキストランでコートした冷チャコール０．５ｍｌとを添加して相分離を起こさせた。ＨＬ−６０細胞とＭＧ−６３細胞の培養条件１０％の熱で不活性化したウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ社）、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地に、ＨＬ−６０細胞を１．２×１０⁵ 細胞／ｍｌで接種し、次にエタノール中の１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃またはその類似体（最終濃度＜０．２％）を添加した。空気中５％ＣＯ₂の加温雰囲気中で４日間３７℃で培養した後、ディッシュを振盪して粘着している細胞をはずし、全細胞について、ニトロブルーテトラゾリウム還元検定法によって分化について検定し、そして［³Ｈ］チミジン取込みによって増殖について検定した。熱不活性化チャコールで処理したウシ胎児血清を２％含有するダルベッコの改良イーグル培地２００μｌ中［９６ウエル平底培地プレート（Ｆａｌｃｏｎ，米国ニュージャージー州所在のＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を使用］に５×１０³ 細胞／ｍｌで接種し、次いでエタノール中の１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃またはその類似体（最終濃度＜０．２％）を添加した。空気中５％ＣＯ₂の加温雰囲気中で７２時間３７℃で培養した後、［³Ｈ］チミジン取込みによる増殖の阻害および培地中のオステオカルシン濃度の測定を、相同ヒトラジオイムノアッセイを用いて実施した（２６）。ニトロブルーテトラゾリウム還元検定法超酸化物の産出を、すでに報告されているようにして（２６）、ニトロブルーテトラゾリウム還元活性で検定した。１．０×１０⁵細胞／ｍｌのＨＬ−６０細胞を、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（２００ｎｇ／ｍｌ）およびニトロブルーテトラゾリウム（２ｎｇ／ｍｌ）の新しく調製した同容積の溶液と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。黒色のホルマザン堆積物を含有する細胞の百分率を血球計を用いて測定した。統計的評価データの統計学的評価を非対測定値（ｕｎｐａｉｒｅｄｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ）についてスチューデントの検定法で実施した。この実施例では、２種の重水素化類似体の１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ− Ｄ₃（ＨＦ）および１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃（ＨＧ）の生物学的特性を１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃と比較する。これら類似体の構造を図２に示す。１，２５ −（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃すなわち類似体ＨＦは、動力学的にそのプレビタミン形に抑制されている（２１）（一次重水素の動力学的同位体効果のため）ので、６−ｓ−シス形の１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の類似体（図１）としてしか機能できない。非ゲノム作用 − 図５Ａは、トランスカルタキアの非ゲノム生物学的応答を刺激する１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃と１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃の相対性能の試験結果を示す。生理学的濃度６０ｐＭの１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅− プレ−Ｄ₃を３４分間血管灌流させると、⁴⁵Ｃａ²⁺の輸送量が対照のレベルの４．５倍まで増大した。両者のセコステロイドの⁴⁵Ｃａ²⁺に対する刺激作用は、すでに報告されているように（７、９）２〜８分間以内に有意になった。図５Ｂは、トランスカルタキアを刺激するその性能によって各セコステロイドに対する投与応答の関係を示す。類似体の１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃は、１０ｐＭの投与量でトランスカルタキアを有意に刺激することができ、かつ６０ｐＭのセコステロイドによって最大の応答が得られた。そのトランスカルタキック活性について評価したすべてのセコステロイドについてすべて述べたように、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃の投与応答は二相性である（７〜９）。１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃は、低濃度の２５ｐＭで活性であり、最大の剌激は、６０〜６５０ｐＭの範囲の１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃で達成される（図５Ｂ）。また、その典型的な二相性投与応答も明らかである。プレ形にロックされている類似体１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅− プレ−Ｄ₃の効力が、１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の効力と有意差がないことは図５Ｂから明らかであるが、このことはトランスカルタキアのシグナル導入因子または受容体が、６−ｓ−シス立体配座のセコステロイドに応答できることを示唆している。図６は、ＲＯＳ１７／２．８細胞中への⁴⁵Ｃａ²⁺の取込みを刺激する１，２５ −（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃の性能を評価した結果を示す。１〜１０×１０^-9 Ｍの濃度範囲の１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃がセコステロイド類を適用してから１分間以内に⁴⁵Ｃａ²⁺の最大取込みを起こした。以前の試験によって、これが１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃に対する最大応答の範囲であることが確認されている（１５、２７）。電位差開閉Ｃａ²⁺チャネルは、適当な作動薬［ビタミンＤ類似体類またはジヒドロピリジンＢＡＹＫ−８６４４（１５）］に暴露するか、または細胞膜を脱分極する［１３２ｍＭの細胞外ＫＣｌ（刺激緩衝剤、「実験手順」を参照）によって達成される］ことによって開放される。脱分極細胞外溶液の存在下で⁴⁵Ｃａ²⁺ の取り込みがこのように刺激されるのは、電位差開開Ｃａ²⁺チャネルを表す細胞の特徴であり、この刺激のレベルは、細胞表面におけるＣａ²⁺チャネルの濃度に直接関連がある。したがって、達成することができる⁴⁵Ｃａ²⁺の最大の流入は（図６の挿入図参照）高濃度の細胞外Ｋ⁺の存在下で起こる。Ｋ⁺が低い場合に起こる⁴⁵Ｃａ²⁺取り込みのレベルは、基本取り込み（bassal uptake）を表し、これは静止膜のＣａ²⁺の透過性を反映している。増殖相のＲＯＳ１７／２．８細胞の場合、（刺激）／（静止）の最大比率Ｓ／Ｒは約２．４倍であるがこのことはＣａ²⁺チャネルが１００％開いていることを示している。類似体の１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃と１，２５−（ＯＨ）₂ Ｄ₃の両者は、低Ｋ⁺の環境下で起こる⁴⁵Ｃａ²⁺取り込みの刺激の２倍の該刺激を達成する。プレビタミン形に固定されている１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ− Ｄ₃の生物活性は、ステロイド様立体配座と伸びきりステロイド立体配座に相互に容易に変化する１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃と比べてやはり有意差はない。リガンド結合の試験 − 図７は、ひなどりとブタ由来の腸核１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃受容体に結合する場合のＲＣＩを生体外条件下で測定したときの結果を示す。ひなどりとブタそれぞれについて算出したＲＣＩは次のとおりである。すなわち、１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃（ＲＣＩ＝１００％および１００％）、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃（ＲＣＩ＝９２％および６７％）ならびに１，２５− （ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃（ＲＣＩ＝１０％および４％）である。したがって、これら３種のセコステロイドの腸核受容体に対する結合については、種の差の効果はない。プレビタミン形に動力学的に抑制されているステロイドの１，２５ −（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃は、そのＲＣＩが９０〜１００％から１２〜１４％まで減少しているが、このことは、核１，２５−（ＯＨ）₂−Ｄ₃受容体がプレビタミン６−ｓ−シスおよびビタミンＤ形を識別することができ、そのビタミンＤ形が６−ｓ−シス形または６−Ｓ−トランス形として存在し後者の方が支配的であることを示している。血液コンパートメント内のビタミンＤセコステロイド類の主な担体は、血漿ＤＢＰである。このタンパク質は、２５−（ＯＨ）Ｄ₃および１，２５−（ＯＨ）₂ Ｄ₃それぞれに対して５×１０^-9Ｍおよび５×１０^-8ＭのＫｄでそのリガンドをしっかり捕捉する結合領域を有している（２９）。したがって、リガンドＤＢＰに対するアフィニティーは、血漿中のその「遊離」濃度を有効に決定しかつ標的細胞に対するその相対的利用性に恐らく影響する。図８には、生体外条件下で測定した場合のヒトＤＢＰに対する結合について、１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃および１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃それぞれの（³Ｈ）１，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃との競合曲線を示す。算出したＲＣＩは、１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃については１００％、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃については９５％、および１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃については７％である。この結果は、ＤＢＰリガンドの結合領域は、ステロイド様（６−ｓ−シス）立体配座と比べてビタミンＤ₃セコステロイド類の伸びきり（６−ｓ−トランス立体配座）ステロイド立体配座の方を優先的に選択することを示唆している。したがって、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃をプレビタミン形に凍結するとＲＣＩが１００％から７％まで減少する。ＤＢＰに対するアフィニティがこのように減少することは、実際上、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃の遊離濃度が１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃または１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃と比べて高いことを意味する。ゲノム作用 − 図７〜１０は、１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の五重水素化類似体のプレビタミン形の、生体内条件下および培養細胞中での生物学的効力の評価結果を示す。図９は、ビタミンＤ欠乏ひなどりに、１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃または１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ５−プレ−Ｄ₃の４００ｎｇを一回筋肉注射した後得られる血清オステオカルシンのレベルを示す。１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃は、骨の骨芽細胞中に存在する核１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃受容体との相互作用によってオステオカルシンのデノボ生合成を誘発することを示している。すなわち小量のオステオカルシンが血液中に（骨の再成形の結果）放出されている。この場合オステオカルシンは、ラジオイムノアッセイによって便利に測定することができる（２６）。１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃は、生体内条件下で一回投与した場合、核１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃受容体と相互に有効に作用してオステオカルシンを誘発する性能がほとんどないことは明らかである。これとは対称的に、１，２５ −（ＯＨ）₂Ｄ₃と１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃は、オステオカルシンの血漿中レベルを有意に増大させた。同一量の１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃と１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃を投与したが、重水素化した類似体で処理した方が一貫して高濃度の血漿中オステオカルシン濃度を誘発した。図１０は、１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃または類似体の１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅ −プレ−Ｄ₃と１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃を毎日投与して１週間処理して得られたＣａ²⁺とオステオカルシンの評価については事実上同じであった。これとは対照的に、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃は、１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃ と１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃の投与量（５μｇ／ｋｇ／日）より２０倍高い投与量（１０μｇ／ｋｇ／日）でしか血清Ｃａ²⁺を上昇させることができなかった。なお、これらの濃度でこれらパラメータをベースラインから有意に上昇させることができた。１，２５−（ＯＨ）₂ −ｄ₅−プレ−Ｄ₃は、対照群より有意に高くオステオカルシン濃度を高めるにはさらに高い投与量（５０μｇ／ｋｇ／日）が必要であった。１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃を一回投与してもひなどりの血清中Ｃａ²⁺は上昇しなかったので（図９）、マウスに起こった血清中のＣａ²⁺とオステオカルシンの増大は、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃から１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃への生体内でのゆっくりとした熱による転化の結果起こったと考えられる。１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃およびその２種の類似体ＨＦとＨＧを［³Ｈ］チミジン取り込み（図１１Ａ）とヒトオステオカルシンの誘発（図１１Ｂ）で測定して、増殖の阻害について、ＭＧ−６３細胞内で評価した。これらの応答は両方とも核１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃受容体で仲介される。これらの検定方法では、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃は、活性が１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃または１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃の活性の約１％に過ぎなかった。さらに、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃は、オステオカルシンを誘発するその性能について１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃と区別できず、そして細胞の増殖を阻害する性能については１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の活性の約９０％を示した。これらの試験結果は、プレビタミン形の１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃は核１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃受容体と有効に相互作用を行うことができないという説明と一致している。ＨＬ−６０細胞の分化は１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃または１，２５−（ＯＨ）₂ −ｄ₅−Ｄ₃の存在によって著しく促進された（図１２）。これに対し、１，２５ −（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃は、１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の効力の１〜４％しか示さなかった。このことは、やはり、ＨＬ−６０の核１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃ 受容体がこのリガンドを有効に捕捉しなかったことを示す。上記実施例で、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃の生物学的特徴を、１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の迅速に相互に転化する６−ｓ配座異性体の対（図１と２）と比較した。この実施例は、２種の非グノム生物学的系が１，２５−（ＯＨ）₂ −ｄ₅−プレ−Ｄ₃類似体に対して充分に応答することを示している。分離した、ひなどりの灌流された十二指腸で試験したトランスカルタキアのプロセス（図５）およびラットの骨原性肉腫細胞系のＲＯＳ１７／２．８細胞におけるＣａ²⁺ チャネル開放のプロセス（図６）の両者は、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ− Ｄ₃と１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の両方に同等の効力で応答する。したがって、これら２種の非グノム系に対するシグナル導入プロセスの応答は、２種の種のラットとひなどりおよび２種のビタミンＤ標的臓器の腸と骨に起こる。この実施例は、類似体１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃が核１，２５− （ＯＨ）₂Ｄ₃受容体と相互に作用してグノム応答を支持できないことを示す。図８は、ブタとひなどりの両方の腸の１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃核受容体がプレビタミン形のセコステロイドを差別することを示している。ひなどりの脳の受容体に結合する１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃のＲＣＩは１０％であり、ブタの腸の受容体の場合は４％であった。したがって、核１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃受容体のリガンド結合領域は、６−ｓ−シスの配座異性体（ステロイド様立体配座）より６−Ｓ−トランス配座異性体（伸びきりステロイド立体配座）を好む。さらに、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃の場合のように、１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃ に５個の重水素原子が存在していても、ＲＣＩは有意に変わらないことが見出された（ひなどりの場合は８９．５％、そしてブタの場合は６７％）。類似体１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃によって試験したときのように、相対的に核１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃受容体が、６−ｓ−シス（ステロイド様立体配座）の１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃を有効に捕捉できないということは、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃がグノム応答の有効な媒体ではないということを示している。図９〜１２は、４種の系において１，２５−（ＯＨ）₂ −ｄ₅−プレ−Ｄ₃、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃および１，２５−（ＯＨ）₂ Ｄ₃がすべて遺伝子転写の核受容体によって仲介される調節を通じて生物学的作用を生成するということを示している。図９は、ひなどりに１，２５−（ＯＨ）₂ −ｄ₅−プレ−Ｄ₃を一回投与した後、血清中オステオカルシン濃度の生体内測定結果を示している。図１０は、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃を毎日投与した場合のマウスの血清中のＣａ²⁺とオステオカルシン濃度の試験結果を示す。図１１は、細胞培養中のＭＧ−６３細胞を用い、細胞増殖の阻害とオステオカルシンの誘発を示す。図１２は、培養中のＨＬ−６０細胞を用いて細胞増殖の阻害を示す。類似体の１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃が、１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃と１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃と比べてグノム応答を適当の行うことができないこと（生体内でのオステオカルシン誘発が２％未満：図９、ＭＧ −６３細胞内での増殖の阻害が１％未満：図１１ａ、ＭＧ−６３細胞内でのオステオカルシン誘発が約２％：図１１Ｂ、およびＨＬ−６０細胞の分化の促進が約１０％）は、核受容体に対するそのＲＣＩが低いことを報告する図８のデータと一致している。その上、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃をマウスに毎日７日間投与したとき（図１０）に血清中のＣａ²⁺とオステオカルシンのレベルを上げる性能が非常に低いということは、１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃のこれらゲノム依存応答を活性化する性能が低いことを示している。また、上記試験結果は、プレビタミン形の１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−プレ−Ｄ₃は、それをビタミン形すなわち１，２５−（ＯＨ）₂− ｄ₅−Ｄ₃に転化するある種の代謝形質転換を受け付けないことも示している。これらの各検定の所要時間は、４０時間（ひなどり、図９）、７日間（マウス、図１０）および９６時間（ＭＧ−６３細胞、図１１。ＨＬ−６０細胞、図１２）であり、そしてビタミン形の１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃が生成した場合、各種のグノム応答の検出可能な表示が出現するのに充分時間がとれるであろう。実際に、マウスに１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₄−プレ−Ｄ₃を連続投与した結果（図１０）は、プレビタミン形は代謝クリアランスを受けてから生物学的に活性な１，２５−（ＯＨ）₂−ｄ₅−Ｄ₃に熱で異性化する機会があることを示している。上記実施例は、プレビタミンＤ形の１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃が、１，２５−（ＯＨ）₂−Ｄ₃の非グノム受容体の作動薬として有効なので、非グノム受容体を利用する生物学的応答を開始するのに使用できることを示している。実施例２この実施例では、１α，２５−（ＯＨ）²Ｄ³の非ゲノム作用を制御するために１β，２５−（ＯＨ）²Ｄ³を拮抗薬として用いることについて述べる。この実施例で使用した化学薬剤は、実施例１に記載したのと同じ起源から入手し、および実施例１に記載したのと同じ方法で製造した。１α，２５−（ＯＨ）² Ｄ³の３種のＡ−リングジアステレオ異性体の化学合成はＭｕｒａｌｉｄｈａｒａｎ他の方法（３０）で行った。動物と細胞ホワイトレグホンのひな雄どり（米国カリフォルニア州レイクビュー所在のＬａｋｅｖｉｅｗＦａｒｍｓ社）を孵化の日に入手し、ビタミンＤ補充餌（１．２％カルシウムおよび０．７％リン、米国カリフォルニア州オンタリオ所在の０．Ｈ．ＫｒｕｓｅＧｒａｉｎａｎｄＭｉｌｌｉｎｇ社）で５〜６週間飼育し通常のビタミンＤ₃豊富なひなどりをつくった。動物を用いる実験は、すべてｔｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ−ＲｉｖｅｒｓｉｄｅＣｈａｎｃｅｌｌｏｒ’ｓＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎＡｎｉｍａｌｓｉｎＲｅｓｅａｒｃｈの認可を受けた。ヒト前骨髄球白血病細胞系（ＨＬ−６０）とヒト骨芽細胞ＭＧ−６３は、ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国メリーランド州ロックビル所在）から入手した。Ｍｅｒｋ，ＳｈａｒｐａｎｄＤｏｈｍｅ（来国ペンシルバニア州ウエストポイント）から入手したラット骨肉腫（ＲＯＳ）１７／２．８細胞と、ダルベッコの改良イーグル培地とハムのＦ−１２培地の１：１混合物でウシ胎児血清（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を１０％含有する培地で培養した。この培地は、文献（３７）に記載されているようにして、１．１ｍＭのＣａＣｌ₂で補充した。⁴⁵Ｃａ²⁺の取り込みの試験の場合、細胞を、３．５ｃｍの皿の中に３０，０００細胞／ｍｌの密度で接種し約５０％の集密度まで増殖させた。カルシウム取り込みの検定ＲＯＳ１７／２．８細胞のＣａ²⁺取り込みをすでに報告されている手順を用いて検定した（３１）。検定は、１分間を標準にしたが、予備実験はこの１分間が直線的取り込みの区間内にあることを示した。培地を吸引し、細胞を室温のハンクスの緩衝食塩水で洗浄し、次に「静止緩衝液」（１３２ｍＭのＮａＣＬ、５ｍＭのＫＣｌ、１．３ｍＭのＭｇＣＬ₂、１．２ｍＭのＣａＣｌ₂、１０ｍＭのグルコースおよび２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐｈ７．４を含有）または刺激緩衝液（５ｍＭのＮａＣＬ、１３２ｍＭのＫＣｌ、１．３ｍＭのＭｇＣＬ₂、１．２ｍＭのＣａＣｌ₂、１０ｍＭのグルコースおよび２５ｍＭのトリス−ＨＣｌｐｈ７．４を含有）とともに１分間インキュベートした。両方の取り込み溶液には、１２．５μＣｉ／ｍｌの⁴⁵Ｃａ²⁺（ＤｕＰｏｎｔＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ社）と図１３に示す濃度のビタミンＤ作動薬を含有させた。取り込みは、上記標識溶液を吸引して停止し、次に氷冷静止緩衝液で３回洗浄した。細胞に結合した⁴⁵Ｃａ²⁺を、０．５ＭのＮａＯＨとともに２時間インキュベートすることによって抽出し、液体シンチレーションカウンティング法で測定した。ＲＯＳ１７／２．８細胞の単層培養物による⁴⁵Ｃａ²⁺の取り込みは、密度依存性であることが見出された。最大の取り込み速度は、５０％〜８０％の集密度の培養の場合に一貫してみられた。腸の⁴⁵Ｃａ²⁺輸送（トランスカルタキア） ⁴⁵Ｃａ²⁺輸送の測定は、先に報告されている（３２〜３４）ように、灌流されたひなどりの十二指腸で実施した。体重が約５００ｇの通常のビタミン豊富ひなどりをクロロペント（米国アイオア州ＦｏｒｔＤｏｄｇｅ、０．３ｍｌ／１００ｇ）で麻酔し、次に外科手術によって十二指腸ループを露出させた。腹腔動脈から分岐する血管を照明してから腹腔動脈自体のカニュレーションを行い、同時に血管灌流を開始した。次に、十二指腸ループを切取り、腹腔静脈のカニュレーションを行ってから、食塩水でぬらしたチーズクロスの層（２４℃）の間に入れた。動脈灌流液は、０．９ｍＭのＣａＣｌ₂を含有させて改良し９５％Ｏ₂と５％ＣＯ₂で酸化させた改良グレイ平衡塩類溶液（ＧＢＳＳ）で構成され、流量は０．２５ｍｌ／分であった。補助ポンプを用いて、ビヒクル（エタノール）または試験物質＋アルブミン（０．１２５％ｗ／ｖの最終濃度）を、血管灌流液中に０．２５ｍｌ／ｍｉｎの流量で導入した。⁴⁵Ｃａ²⁺（５μＣｉ／ｍｌ）を含有しているが重炭酸塩またはグルコースなしのＧＢＳＳをフラッシュさせて脳の内腔を満たした。基本輸送速度は、腸内腔を⁴⁵Ｃａ²⁺で満たした後、２０分間対照媒体を灌流させることによって確認した。次に、その組織を、さらに４０分間、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃または１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃に暴露するかまたは対照の媒体に再暴露した。基本試験期間の最後の１０分間と全処理期間中２分間隔で血管灌流液を収集した。１００μｌずつ２回採取して⁴⁵Ｃａ²⁺のレベルを液体シンチュレーション分光測定法で測定した。試験結果は、４０分間の試験結果に出現する⁴⁵Ｃａ²⁺に対する比率で示す。リガンド結合の試験１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃に対するひなどり腸の核受容体に結合するため、［³ Ｈ］１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃と競合する各類似体の相対的性能を実施例１に記載の手順にしたがって生体外で実施した。この検定では、濃度を高めた非放射性１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃ または試験類似体を、固定飽和量の［³Ｈ］１α，２５−（ＯＨ）²Ｄ³およびビタミンＤ欠乏ひなどりから得たひなどり腸核抽出物とともにインキュベートした。そして、［³Ｈ］１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の最大の結合百分率の逆数を算出し、類似体と［³Ｈ］１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の相対濃度の関数としてプロットした。このプロットによって各類似体に対して特徴的な真っ直ぐなグラフカーブが得られ、その傾斜は類似体の競合指数値に等しい（２５）。次に、各類似体の競合指数値を、競合ステロイドとしての非放射性１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃で得た標準カーブに対して正規化し、相対競合指数（ＲＣＩ）のリニアースケール上に置いた。なお１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の定義によるＲＣＩは１００である。ＨＬ−６０細胞とＭＧ−６３細胞の培養条件１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．社）、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ社）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地に、ＨＬ−６０細胞を１．２×１０⁵細胞／ｍｌで接種し、次にエタノール中の１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃またはその類似体（最終濃度＜０．２％）を添加した。空気中５％ＣＯ₂の加湿雰囲気下３７℃で４日間培養した後、ディッシュを振盪して粘着している細胞をはずし、全細胞について、ＮＢＴ還元検定法で分化について検定し、そして［³Ｈ］チミジン取り込み法によって増殖について検定した。熱不活性化チャコールで処理したウシ胎児血清を２％含有するダルベッコの改良イーグル培地２００μｌ中［９６ウエル平底培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ，米国ニュージャージー州所在のＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社）使用］に５×１０³細胞／ｍｌで接種し、次にエタノール中の１α ，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃またはその類似体（最終濃度＜０．２％）を添加した。空気中５％ＣＯ₂の加湿雰囲気下で７２時間３７℃で培養した後、［³Ｈ］チミジン取り込みによる増殖の阻害および培地中のオステオカルシンの濃度を測定することによって測定されるオステオカルシンのグノム誘発を、相同ヒトラジオイムのアッセイ（３５）を用いて測定した。ＮＢＴ還元検定方法超酸化物の産生を、すでに報告されている（３５）ようにして、ＮＢＴ還元活性によって検定した。１．０×１０⁵細胞／ｍｌのＨＬ−６０細胞を、ホルボール１２ミリステート１３−アセテート（２００ｎｇ／ｍｌ）およびＮＢＴ（２ｍｇ／ｍｌ）の新しく調製した同容積の溶液と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。黒色のホルマザン堆積物を含有する細胞の百分率を血球計を用いて測定した。ヒト皮膚角化細胞を分離し、ＫｉｔａｎｏとＯｋａｄａの方法（３６）を用いて培養した。要約すると、乳癌が見られる患者の生検由来の皮膚を３〜５ｍｍの大きさの小片に切断し、ジスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）の溶液（２０Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ単位／ｍｌ）中に４℃にて一夜浸漬した。表皮を真皮から剥がしとり、カルシウムとマグネシウムを含有していないリン酸緩衝食塩水で洗浄し、０．２５％トリプシン溶液中、室温で１０分間インキュベートし振盪した。次に、１０％のウシ胎児血清を含有するリン酸緩衝食塩水を添加して反応を停止させた。４℃で１０分間８００ｒｐｍで遠心分離にかけて細胞を集めた。リン酸緩衝食塩水でさらに洗浄した後、得られたペレットを、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社から入手した２５ｃｍ² のプリマリアフラスコ（ｐｒｉｍａｒｉａｆｌａｓｋ）中の培地内に懸濁させた。その角化細胞を空気中５％ＣＯ₂の雰囲気内で３７℃で培養した。数時間後に培地を新しい培地で取り替えた。その培地［表皮増殖因子（５ｎｇ／ｍｌ）、ウシ下垂体抽物（３５〜５０μｇ／ｍｌ）及び抗生物質類を含有する、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．社から入手した角化細胞培地］を集密状態になるまで１日おきに新しいものと取り替えた。次に、その角化細胞を９６ウェルプレートで培養し、２４時間後、各種濃度のビタミンＤ類似体で処理し、次いで１μＣｉの［³Ｈ］チミジンで３時間パルスラベリングをおこなった。培養物をリン酸緩衝食塩水で３回洗浄し、次いで１０％（ｖ／ｖ）の氷冷トリクロロ酢酸で２回洗浄した。細胞を１ＭのＮａＯＨで可溶化し、その放射能を液体シンチレーション測定法で測定した。統計的評価データの統計学的評価を実施例１と同じ方法で実施した。この実施例では、ビタミンＤ内分泌系の各種成分の非ゲノム及びゲノムの応答に対する作動薬として作用する性能について、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の３種のＡ−リングジアステレオマーの生物学的特徴の比較を行った。これらセコステロイド類の構造を図３と４に示す。二つの不斉中心が炭素−１と炭素−３に位置している。天然に存在するホルモン１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃のＡ−リングの２個のヒドロキシル基の配向は、１αと３βである。非ゲノム機構を通じて起こることが分かっている１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の生物学的応答は、トランスカルタキアと呼ばれる、腸Ｃａ²⁺の迅速なホルモン刺激である（２２）。図１３は、セコステロイドホルモンの４種のＡ−リングジアステレオマーの相対性能を示す試験結果を示す。最適の作動薬は、天然に存在するホルモンの１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃（Ｃと呼称する）である。⁴⁵Ｃａ²⁺輸送の刺激は、個のホルモンを導入して４分以内に始まる。本発明者らは、トランスカルタキアの投与応答カーブが二相性であり、最大の刺激は６５０ｐＭの１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃で起こることをすでに示した（２１、２２）。また１α，２５−（ＯＨ）₂−３−エピ−Ｄ₃（ＨＨ）がトランスカルタキアを部分的に刺激できることも明らかである。これに対して、３００ｐＭの１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃（ＨＬ）は、この濃度でトランスカルタキアを刺激することはできない。他のデータ（記載していない）では、１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の濃度を９００ｐＭまで上げても、トランスカルタキアの一貫して検出可能な刺激はなかった。図１４は、トランスカルタキアを刺激する１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の作用を阻害する１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の性能を示す。十二指腸を１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃と１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の両者で灌流して剌激すると、トランスカルタキアの特徴的な剌激がなくなった。このことは、１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃ が１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の拮抗薬として機能して、本発明に従って非ゲノム応答を制御することができることを示している。図１５Ａには、３００ｐＭの１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃で刺激されたトランスカルタキアを阻害するのに有効な各種濃度の１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の評価を示す。図１５Ｂは、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃で刺激されたトランスカルタキアを、１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の濃度を変えることによって阻害する投与応答を要約して示す。６０ｐＭという低い濃度の１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃で３００ｐＭの１α，２５− （ＯＨ）₂Ｄ₃を阻害することができることは明らかである。図１６は、ＲＯＳ１７／２．８細胞中への⁴⁵Ｃａ²⁺取り込みの作動薬または拮抗薬として機能する１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の性能の評価結果を示す。ＣａｆｆｒｅｙとＦａｒａｃｈ−Ｃａｒｓｏｎが最初に報告しているように、この応答は、非ゲノム機構によってジヒドロピリジン感受性Ｃａ²⁺チャネルを開放する１ α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃またはその類似体の性能によって起こる（２０）。１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃は、この系では最も効力が高い作動薬である。１０^-8Ｍという高い濃度の１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃は、この系で最も効力が高い作動薬である。１０^-8Ｍという高い濃度の１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃は、⁴⁵Ｃａ²⁺の取り込みを刺激する場合効力がなかった。しかし、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃と１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃をＲＯＳ１７／２．８細胞に同時に添加したところ、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃で仲介される⁴⁵Ｃａ²⁺の取り込みは完全に阻害された。ビタミンＤ欠乏ひなどりの生体内での腸⁴⁵Ｃａ²⁺吸収（ＩＣＡ）と骨Ｃａ²⁺の可動化（ＢＣＭ）の生物学的応答を１２時間以内に起こす４種のＡ−リングジアステレオマーの相対的性能を測定した。１７図は、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃、１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃（ＨＬ）および１α，２５−（ＯＨ）₂−３−エピ− Ｄ₃（ＨＪ）のＩＣＡと、ＢＣＭの試験結果を示す。表Ｉの一部に、４種のジアステレオマー全てのＩＣＡとＢＣＭの試験結果が要約されている。ＩＣＡとＢＣＭの最も強力な剌激剤は、予想どおり、基準化合物の１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃ であった。したがって、１００ｐｍｏｌの１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃のが生成する活性をＩＣＡとＢＣＭの両方について１００％と定めた。したがって、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の１００ｐｍｏｌの投与量に均等なＩＣＡまたはＢＣＭの生物学的応答を達成するのに必要な比較類似体の投与量を算出して百分率に変換した。類似体の１α，２５−（ＯＨ）₂−３ −エピ−Ｄ₃は、検出可能なＩＣＡまたはＢＣＭを有する唯一のジアステレオマーであったが、そのＩＣＡまたはＢＣＭは基準の１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃のわずか１．５〜２．８％に過ぎなかった。２種のジアステレオマーの１β，２５− （ＯＨ）₂Ｄ₃と１α，２５−（ＯＨ）₂−３−エピ−Ｄ₃は、ＩＣＡとＢＣＭは０．１％未満であった。３β−ヒドロキシル基または１α−ヒドロキシル基の配向が変化すると、ビタミンＤ欠乏ひなどりの生体内の生物活性が大きく減少する。また、表Ｉには、ひなどりの腸１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃核受容体およびＤＢＰに生体外で結合する上記４種のジアステレオマーの相対性能も要約してある。１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃核受容体は、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃に対する生体内のゲノム反応の予想されるメディエーター（Ｍｅｄｉａｔｏｒ）である。やはり、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃は基準化合物であり、そのＲＣＩは定義により１００％である。類似体１α，２５−（ＯＨ）₂−３−エピ−Ｄ₃の場合のように配向が３β−ヒドロキシルから３α−ヒドロキシルへ反転すると、ＲＣＩがわずか２４％にまで減少した。しかし、類似体の１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃と１α，２５−（ＯＨ）₂−３−エピ−Ｄ₃の場合のように、１α−ヒドロキシルの配向が１ β−ヒドロキシルの配向へと配向が変化すると、ＲＣＩは１％末満の値まで劇的に減少した。この試験結果は、炭素−１のヒドロキシルの配向が、１α，２５− （ＯＨ）₂Ｄ₃核受容体に対するリガンドの高いアフィニティーを得る場合に演ずる重要な役割を強調している。４種のジアステレオマーのＤＢＰに結合する場合のＲＣＩ値も、ビタミンＤセコステロイド類の炭素−１と炭素−３におけるヒドロキシル基の配向の重要性を強調している。この場合も、基準類似体は１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃と定義されたが、ＤＢＰに対する最適のリガンドは２５−（ＯＨ）Ｄ³であり、そしてそのＲＣＩが６６，７００であることを理解することが重要である。２５−（ＯＨ）Ｄ³のＲＣＩを１００％と定めたならば、２５−（ＯＨ）Ｄ³のＲＣＩはわずか０．１５％である。これは、炭素−１にα−ヒドロキシルが存在するとＤＢＰに対するリガンドのアフィニティーが著しく減少するということの反映である。類似体ＨＬとＨＨの場合のように、１α−ヒドロキシルが１βの配向に反転すると、それぞれＲＣＩ値が６５．７倍および４．４倍に増大し、このことは、１α−ヒドロキシルがないとそれら類似体は一層１−デオキシ類似体のように挙動することを示している。１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃が、カルビンジン−Ｄ_28kとして知られているビタミンＤ依存性カルシウム結合タンパク質を誘発するゲノム応答を、ビタミンＤ欠乏ひなどりの生体内で阻害できるかどうか評価した。ひなどりの腸内でのカルビンジン−Ｄ_28kの発現は、核１α，２５ −（ＯＨ）₂Ｄ₃受容体の占有性（occupancy）との関連が深いゲノム事象であることはすでに報告されている（４１）。表１１に要約した試験結果は、１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃は、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃と同時にまたは１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃より２時間前に投与されると、腸カルビンジン−Ｄ_28kの出現を阻害できないことを示している。実際は、１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃は、このゲノム応答に対して弱い作動薬活性を有している。すなわち、１β，２５−（ＯＨ）₂ Ｄ₃を６．５ｎｍｏｌもの大量を投与すると、１２時間の時点で、０．６５ｎｍｏｌの１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃によって誘発される量の５０％のレベルのカルビンジン−Ｄ_28kが出現する。このことは、１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃を投与すると核受容体に対するＲＣＩは有限でしかも低いということと一致している（表Ｉ参照）。図１８Ａと１８Ｂに、ＭＧ−６３細胞中にオステオカルシンを誘発する４種のジアステレオマーの効力を示す試験結果が記載されている。さらに、１α，２５ −（ＯＨ）₂Ｄ₃が誘発するオステオカルシンの拮抗薬として機能する１β，２５ −（ＯＨ）₂Ｄ₃の性能も記載してある（図１８Ｂ）。すでに報告されているように、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃はＭＧ−６３細胞系内でオステオカルシンに対する強力な作動薬であり（３５）、半最大誘発（half-maximal induction）は、３．８×１０^-9Ｍの濃度の１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃で起こる（図１８Ａ）。それらのＥＤ₅₀濃度を用いて前記４種のジアステレオマーについて相対効力を算出できる。すなわち、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃＝１００％、１α，２５−（ＯＨ）₂ −３−エピ−Ｄ₃＝１７％、１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃＝２％、そして１β，２５−（ＯＨ）₂−３−エピ−Ｄ₃＝１．２％である。これらの試験結果は、表Ｉに示すこれら４種のジアステレオマーに対する核１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃受容体に対するＲＣＩ値に対応している。１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃と１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の両者を、１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の濃度を１０^-9〜１０^-7Ｍとして、ＭＧ−６３細胞に同時に加えると（図１８Ｂ）、１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃ による拮抗薬の作用の徴候はまったくなかった。２種のエピマーの１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃および１β，２５−（ＯＨ）₂ＤのＨＬ−６０細胞の分化を促進する性能をＮＢＴ還元法によって評価し、また、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃によって仲介される細胞分化の拮抗薬として機能する１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の性能を測定した。その試験結果を図１９に示す。何回もすでに報告されているように、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃はＨＬ−６０細胞の分化の強力な刺激薬であり、その半最大濃度（half-maximal conce ntration）は１．５×１０^-8Ｍであった。細胞分化の半最大刺激（half-maximal stimulation）を達成した１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の濃度は２．５×１０^-7Ｍであったが、約１０倍高い。１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃が１α，２５−（ＯＨ）₂ Ｄ₃の細胞分化作用に拮抗するという徴候は、やはり全くなかった。図２０は、ヒト角化細胞の増殖を阻害する１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃と３種のＡ−リングジアステレオマーの効力の評価結果を示す。増殖を５０％阻害するための、効力の相対的順序は１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃、１α，２５−（ＯＨ）₂ −３−エピ−Ｄ₃、１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃および１β，２５−（ＯＨ）₂−３ −エピ−Ｄ₃（１：６．２：２７：７５）であった。やはり、細胞増殖の最も強力な阻害剤は１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃であり、最も効力が低いのは１β，２５ −（ＯＨ）₂Ｄ₃であった。別の試験（データは記載していない）で、１α，２５ −（ＯＨ）₂Ｄ₃で仲介される角化細胞の阻害に拮抗する１β，２５−（ＯＨ）₂ Ｄ₃の効力を試験した。ＭＧ−６３細胞について図１８Ｂに示した結果と同様に、１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃は、５×１０^-8Ｍの濃度で存在している場合、１× １０^-9Ｍの１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の作用を阻害できなかった。この実施例は、ホルモンとして活性な形態のビタミンＤ₃の４種のＡ−リングジアステレオマー（図３参照）の生物学的特徴を例示する。１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃だけが生物学的系中に天然に存在していることが知られている。これら４種の化合物の構造の唯一の差は、炭素−１と炭素−３のヒドロキシル基の配向である。核１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃受容体のリガンド結合領域は、天然に存在するホルモンの１α、３βの配向を明らかに好み、かつ３種の他のＡ−リングジアステレオマー間の差を識別することもできることは明らかである（表ＩのＲＣＩ値参照）。炭素−Ｃにおけるヒドロキシルの正しい配向は、炭素−３におけるヒドロキシルの配向より重要である。したがって、１ α−ヒドロキシルが１β配向に反転するとＲＣＩが１００％から０．８％まで変化し、一方３β−ヒドロキシルが３α−ヒドロキシルに反転すると１００％から２４％まで減少するだけである。腸核受容体に対するＲＣＩデータと、４種のジアステレオマーのＤＢＰに対するＲＣＩデータを比較すると、ビタミンＤ、セコステロイド類に対するこれら２種のリガンド結合領域の固有の優先性が明らかに強調されている。ＤＢＰは、ビタミンＤ代謝物に対する重要な血漿輸送タンパク質である。最高のアフィニティーを有するリガンドは２５−（ＯＨ）Ｄ₃であるが、ＤＢＰは１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃、２４Ｒ，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃および親のビタミンＤ₃も著しいアフィニティーで捕捉する。２５−（ＯＨ）Ｄ₃に１α−ヒドロキシルを付加すると、ＲＣＩが１／６６６になる（３）。しかし、ＤＢＰおよび４種のジアステレオマーに対する核１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃受容体を、ＲＣＩの相対値で比較することができる（表１）。類似体の１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃（ＨＬ）と１β，２５ −（ＯＨ）₂−３−エピ−Ｄ₃（ＨＨ）のように、１α−ヒドロキシルが１β配向に反転すると、それぞれＤＢＰのＲＣＩ値が６５．７倍および４．４倍に増大する。このことは、１α−ヒドロキシルがないと、これら類似体は一層１−デオキシ類似体のように挙動することを示唆している。これら４種のジアステレオマーの中で１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃はＲＣＩ値が最低であるが、このことは１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃が生体内の環境下で、これら４種のジアステレオマーの中で最高の「遊離（ｆｒｅｅ）」濃度または最大の「有用性」有していることを意味する。ビタミンＤ欠乏ひなどりの標準バイオアッセイ系では、体内条件下で前記４種の化合物を評価した結果（３７）は、天然に存在するホルモンの１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃および１α，２５−（ＯＨ）₂−３−エピ−Ｄ₃（類似体ＨＪ）だけがＩＣＡとＢＣＭを刺激する重要な性能を持っていることを示した（図１７と表Ｉ参照）。したがって、１α，２５−（ＯＨ）₂−３−エピ−Ｄ₃は、１α，２５− （ＯＨ）₂Ｄ₃がＩＣＡとＢＣＭを刺激する活性の２．８％と１．５％をもっている。このことは、腸の核１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃受容体に対するアフィニティーが減少していることと一致している（ＲＣＩ＝２４％）。残りの２種のジアステレオマーの１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃（ＨＬ）を１β，２５−（ＯＨ）₂−３ −エピ−Ｄ₃（ＨＨ）はＩＣＡとＢＣＭを事実上欠いていた。このことは、やはり腸の１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃欠く受容体に対するこれらのジアステレオマーのアフィニティーが少ないことと一致している（ＲＣＩは、それぞれ０．２と０．８である）。ＩＣＡとＢＣＭの応答は体内条件下で起こり、両方とも恐らくビタミンＤリガンドに応答する成分の統合した組合せに対する応答を示すので、応答する成分のどの部分がゲノム応答と非ゲノム応答を構成しているのか分からない。しかし、ＩＣＡとＢＣＭの応答の両者は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡ合成の阻害剤のアクチノマイシンＤを投与することによって阻害することができるので（３８、３９）、核１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃受容体への結合およびＩＣＡとＢＣＭの間の充分な相関関係が報告されている（３）。したがって、この３種のジアステレオマーのＩＣＡとＢＣＭが低いことは、そのＲＣＩ値が低いことと関連するが、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃に対する核受容体が、炭素−１と炭素− ３のヒドロキシル基の配向に対する特異性が高いことを強調している。最適の配向は、明らかに１αと３βである。また、これら４種のジアステレオマーは、培養中の角化細胞の増殖の阻害に対して特異な効果を示した（図２０）。１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃＞１α，２５− （ＯＨ）₂−３−エピ−Ｄ₃＞１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃＞１β，２５−（ＯＨ）₂ −３−エピ−Ｄ₃という相対活性は、やはり、生物学的応答を行う際の、１αと２βのヒドロキシル基の配向が重要であることを強調している。この実施例は、灌流されたひなどりの十二指腸で検定して、トランスカルタキアの非ゲノム応答に対する作動薬について、該４種のジアステレオマーの生物活性を示す。３種の非天然のジアステレオマーが活性を殆ど欠いている先に考察したＩＣＡとＢＣＭのゲノム応答とは対照的に、これらジアステレオマーのうち２種はトランスカルタキアを刺激する活性がきわめて高い。１α，２５−（ＯＨ）₂ −３−エピ−Ｄ₃を３００ｐＭで灌流すると、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の約８０％の活性を示し；そして１β，２５−（ＯＨ）₂−３−エピ−Ｄ₃は３００ｐＭで２０から３０％の活性を示す。１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃だけが作動薬活性がなかった。したがって、トランスカルタキアの非ゲノム応答に関連するホルモン応答成分は、核１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃受容体とは異なるリガンド特異性を有していることは明らかである（表ＩのＲＣＩの試験結果と比較のこと）。推定上のトランスカルタキア膜応答成分（putative transcaltachic membrane respons e element）（４０）は、３αヒドロキシルの存在に対して一層耐性である。本発明にしたがって、この実施例は、類似体の１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃（ＨＬ）が、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃によって剌激されるトランスカルタキア（図１５）とラット骨芽細胞の⁴⁵Ｃａ²⁺の取り込み（図１６）の両者に対する強力な拮抗薬であることを示す。１β，２５−（ＯＨ）₂ Ｄ₃と１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃を同時に灌流させた場合、場合によっては、腸を１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃にのみ８分間予め暴露し続いて１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃を灌流させたときでさえ、腸を１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃に暴露することによる明確な阻害があった。この実施例は、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃の類似体が、１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃によって刺激される生物学的応答の拮抗薬として機能できることを例証する。図１８と図１９および表ＩＩに示した結果に基づいて、１β，２５−（ＯＨ）₂ Ｄ₃の拮抗作用は、Ｃａ²⁺チャネルを開放する非ゲノム応答に限定されているとも考えられる。１β，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃は、以下のゲノム応答：ひなどりの生体内条件下でのカルビンジン−Ｄ_28kの誘発（表ＩＩ）、ＭＧ−６３細胞内でのオステオカルシンの誘発（図１８）、またはＨＬ−６０細胞の細胞分化の阻害（図１９）を阻害できなかった。本発明にしたがって、ビタミンＤ₃の１５種の類似体を合成し、ビタミンＤ内分泌系のゲノムおよび／または非ゲノムの応答を制御する活性を有することを示した。これら１５種の類似体を図２１と図２２に示し、表ＩＩＩに列挙した。これらの類似体は、先に述べた２種の類似体と同じ方式で投与できる。これら類似体は、他のステロイドホルモンまたはステロイド様ホルモン（例えば、エストラジオール、テストステロン、スタノローン、プロゲステロン、コルチゾール、アルドステロン、レチノイン酸およびチロキシン）の機構と類似の機構で制御されるゲノム機構を含むビタミンＤ内分泌系内の広範囲の各種応答を制御するのに有効である。これら類似体のいくつかは、表ＩＩＩに示すように、非ゲノム機構を制御するのに有効である。また、これら類似体のいくつかは、表ＩＩＩに示すように、基準の１α，２５− （ＯＨ）₂Ｄ₃と同様にゲノムと非ゲノムの両方の機構を制御するのに有効である。これらの類似体は、皮膚の症状（例えば乾癬）、骨の症状（例えば骨祖しょう症、静脈性骨形成異常症）、ならびに乳癌、結腸癌、前立腺癌および白血病のような腫瘍疾患、アルツハイマー症に関与すると考えられる神経成長因子などの脳タンパク質のごときヘイプロテイン（hey-protein）の誘発を含むビタミンＤ内分泌系の機能不全に関連する各種疾患を治療するのに有用である。ビタミンＤ代謝に関連する各種疾患は、図２６に示してある。これら類似体は、これらの疾患群の治療と診断に有用である。これら類似体の合成と有用性は、以下の実施例でさらに説明する。実施例３１４−エピ−１，２５−（ＯＨ）₂−Ｄ₃（ＧＥ）および１４−エピ−１，２５−（ＯＨ）₂−プレ−Ｄ₃（ＧＦ）の合成と生物活性図２３に示すように、類似体ＧＥとＧＦは、公知のＡ−リングホスフィンオキシド１０（４１）と適当な（ＣＤ）ケトン１４で製造した。ビタミンＤ₃をオゾン分解して容易に得ることができるグルンドマンズケトン（Grundmann's ketone ）１１（４２）を、すでに報告されているように（４３）、Ｃ−２５にて選択的に酸化してアルコール１２にした。アルコール１２を、塩基を用いてエピマー化してシス縮合ヒドロインダノン１３を得た。得られた粗混合物は、７１／２９の比率の１３／１２で構成されていたが、ＨＰＬＣによって、精製１３が４９％の収率（回収された１２に対して６０％の収率）で実際に単離された（４４、４５、４６）。Ｃ−２５ヒドロキシルをトリメチルシリル（ＴＭＳ）エーテルとして保護してＣＤフラグメント１４が得られ、次にそのシリルエーテルをテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）で脱保護して１αヒドロキシル化１４− エピ−ビタミンＧＥを得た。このＧＥ類似体に８０℃でゆるやかな熱的［１，７］シグマトロピー水素シフトを行わせて（ベンゼン−ｄ₆）、プレビタミンＧＦを得た。腸のカルシウム吸収（ＩＣＡ）と骨のカルシウム代謝（ＢＣＭ）を生体内で測定し、すでに述べたようにして（３７）、ビタミンＤ欠乏ひなどり系で類似体ＧＥとＧＦを１α，２５−（ＯＨ）₂−Ｄ₃（３）と比較した。この標準のくる病ひなどり検定の試験結果は、標準投与量の１α，２５−（ＯＨ）₂−Ｄ₃と比較して、ＩＣＡとＢＣＭに対して観察された活性の百分率として報告することができる（４７）。ＩＣＡの測定については、これら２種の類似体ＧＥとＧＦはそれぞれ１α，２５−（ＯＨ）₂−Ｄ₃に比べてその活性の３．９％および＜０．１％を示した。ＢＣＭの測定についても類似の結果（それぞれ＜０．０１％と２％）が得られた。ＧＥとＧＦの類似体は、ひなどりの腸の核受容体に結合する性能について生体外で評価した。この検定では、これら類似体は、そのひなどり腸受容体の相対競合指数（ＲＣＩ）（１α，２５−（ＯＨ）₂−Ｄ₃は定義によって１００である）によって評価した（４８）。ＧＥとＧＦそれぞれのＲＣＩ値は、１５．０±２．０および１．６±０．９であった。ＧＥにみられる生体内カルセミック活性（ca lcemic activity）の欠如は、そのＲＣＩ値１５とはいくぶん一致していない。ＧＥは、その必要な活性化（転写を刺激する前にステロイドホルモン受容体を必要とする）を誘発せずにひなどり腸の受容体に結合すると考えられる。このことから、ＧＥの１４−エピ構造の特徴がステロイドホルモンの１α，２５−（ＯＨ）₂−Ｄ₃の拮抗薬としての有用なパラメータになる。また類似体ＧＥとＧＦは、ヒトビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）を用いる第二の生体外ステロイド競合検定（４９）に付した。この検定下、各類似体を、そのヒトＤＢＰに結合する性能について天然のホルモンの１α，２５−（ＯＨ）₂ −Ｄ₃と比較して評価した。ひなどりの腸受容体の検定結果と同様に、ヒトＤＢＰのデータはＲＣＩ値として表した（１α，２５−（ＯＨ）₂−Ｄ₃の値は１００と定義する）。ヒトＤＢＰは、天然の代謝物２５−ＯＨ−Ｄ₃に対して最高のアフィニティーを有している（２、ＲＣＩ＝６６，８００）ことに注目すべきである。類似体ＧＥとＧＦに対するヒトＤＢＰのＲＣＩ値は、それぞれ１２．１±２．１と２．２±０．７であった。上記の試験結果は、ＧＥとＧＦがそれぞれ、核ＶＤＲ（ＧＥ）と遺伝子転写の調節（ＧＥ）および非ゲノムの迅速な作用によってアノベート（anovate）される膜ＶＤＲ（ＧＦ）を含む生物学的応答に有用であることを示す。合成プロトコルの詳細は、次のとおりである。１４−エピ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃（ＧＥ）図２３に示すように、１０（６７ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（１．４ｍＬ）に溶解した溶液に−７８℃でアルゴン雰囲気下、撹拌しながら、ｎ−ブチルリチウム（７４μＬ，０．１２ｍｍｏｌ、１．５５Ｍヘキサン溶液）を添加して濃オレンジ色の溶液を得た。乾燥ＴＨＦ（０．４６ｍＬ）中のＣＤケトン１４（２７．１ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）を添加した後、得られた溶液を３時間 −７８℃で撹拌し次いで室温まで昇温させた。濃縮した後、残留物をエーテル（３ｍＬ）に溶解し、ＮａＨＣＯ₃の飽和溶液（３ｍＬ）と食塩水（brine）（３ｍＬ）で洗浄した。得られたエーテル溶液を乾燥し（ＭｇＳＯ₄）、濃縮した後、得られた粗製残留物をフラッシュクロマトグラフィーで精製して４８．２ｍｇ（８６％収率）の保護されたビタミン１５を得た。このビタミン１５をＴＢＡＦ（０．７９ｍＬ、０．７９ｍｍｏｌ、ＴＨＦに溶解した１Ｍ溶液）で処理した。３時間後、溶媒を除き、粗製残留物をＥｔＯＡｃ（５ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を洗浄し（水３ｍＬおよび食塩水３ｍＬ）、乾燥し（ＮａＳＯ₄）、濾過し次いで濃縮した。ＨＰＬＣ（５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、ＲａｉｎｉｎＤｙｎａｍａｘ６０オングストロームカラム）で精製し、減圧乾燥して１１ｍｇ（８１％収率）の類似体ＧＥを得た。¹Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ）：（ＣＤＣｌ₃）δ０．８７（３Ｈ，Ｃ₂₁−ＣＨ₃，ｄ，Ｊ〜６．４Ｈｚ），０．９０（３Ｈ，Ｃ₁₈−ＣＨ₃，ｓ），１．２２（６Ｈ，Ｃ_26,27−ＣＨ₃，ｓ），２．３１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ〜１３．２Ｈｚ，７．２Ｈｚ），２．４６（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ〜１４．３Ｈｚ），２．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ〜１３．３Ｈｚ，３．５Ｈｚ），４．２３（１Ｈ，Ｈ₃，ｍ），４．４４（１Ｈ，Ｈ₁，ｔ，Ｊ〜５．４Ｈｚ），５．００（１Ｈ，Ｈ₁₉，ｂｒｓ），５．３４（１Ｈ，Ｈ₁₉，ｂｒｓ），６．１４および６．３３（２Ｈ，Ｈ_6.7− ＡＢパターン，ｄ，Ｊ〜１１．２Ｈｚ）。１４−エピ−１α，２５−ジヒドロキシプレビタミンＤ₃（ＧＦ）ベンゼン−ｄ₆（２ｍＬ）に類似体ＧＥ（４．９ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）を溶解した溶液を、減圧下、凍結融解サイクに３回付した後、サーモスタット付きのバス（８０℃）中に入れた。４時間後、その溶液を室温まで冷却し、ビタミン／プレビタミンの比率を¹Ｈ−ＮＭＲインテグレーション法によって測定した（約７：９３）。その溶液を濃縮し、次にＨＰＬＣ（１００％ＥｔＯＡｃ、ＲａｉｎｉｎＤｙｎａｍａｘ６０Ａカラム）で精製し、溶出順にエピ−ビタミン５（０．３ｍｇ）とエピ−プレビタミン５’（３．７ｍｇ）を得た。デ−Ａ，Ｂ−２５−ヒドロキシコレスタン−８−オン（１２）この化合物は、（４３）に記載されているのと類似の手順を用いて製造した。ＣＣｌ₄（１５ｍＬ）、ＣＨ₃ＣＮ（１５ｍＬ）およびｐＨ７の緩衡水溶液（１９ｍＬ、０．０５ＭのＫＨ₂ＰＯ₄および０．０５ＭのＮａＯＨ）にケトン１１（１．０ｇ、３．８ｍｍｏｌ）を溶解した溶液に、ＲｕＣｌ₃・Ｈ₂Ｏ（７８．４ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）とＮａＩＯ₄（２．８３ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）を添加した。４５℃で激しく撹拌したところ、黒色溶液が黄色に変色した。その不均一な懸濁液は、５日間以内に元の黒色に戻った。有機層を分離し、水性層をＣＨ₂Ｃｌ₂（４×２０ｍＬ）で抽出した。有機層を合し、食塩水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過し、次いで濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（３５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、減圧乾燥して、４３２ｍｇ（収率４０％）の２５−ヒドロキシ−グルンドマンズケトンを無色油状物として得た。デ−Ａ，Ｂ−１４−エピ−２５−ヒドロキシ−８−コレスタノン（１３）メタノール（４２１μＬ）に１．０ＭのＮａＯＭｅを溶解した溶液に、ＭｅＯＨ（１２０μＬ）中の１２（９９．９ｍｇ、０．３５６ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下室温で添加した。４８時間撹拌後、氷冷混合物を酢酸（４９μＬ、０．８６ｍｍｏｌ）でクエンチし水で希釈した。得られた粗製混合物をヘキサンで抽出し、有機層を合し、食塩水（３×１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過し、次いで濃縮して、約７１％のエピ−異性体１３と約２９％の出発物質１２からなる混合物を得た。ＨＰＬＣ（２５×１ｃｍＲａｉｎｉｎ、シリカゲル、３５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、溶出順に４９ｍｇのエピ−ケトン（４９％）と２５ｍｇの出発物質（２５％）を得た。デ−Ａ，Ｂ−１４−エピ−２５−トリメチルシリルオキシ−８コレスタノン（１４）Ｎ−（トリメチルシリル）−イミダゾール（２５９．７ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ）を、１３（１７３．４ｍｇ、０．６１８ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（７ｍｌ）による溶液に撹拌しながら滴下して加えた。得られた混合物をアルゴン雰囲気下４．５時間撹拌し、次にシリカゲルの短いカラム（１５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を直接通過させた。溶出液を濃縮しフラッシュクロマトグラフィー（１５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）に付し、減圧乾燥した後、１９４．２ｍｇ（収率８９％）のＴＭＳで保護されたアルコール１４を無色油状物として得た。生物活性を示す試験の詳細は、次のとおりである。腸のカルシウム吸収（ＩＣＡ）と骨のカルシウム可動化（ＢＣＭ）ＩＣＡとＢＣＭは、すでに報告されているようにして、ビタミンＤ欠乏ひなどりの生体内で測定した（３７、４７）。検定の４８時間前にＣａなしの餌の上に置かれたひなどりに、検定の１２時間前に、０．１ｍＬのエタノール／１，２− プロパンジオール（１：１、ｖ／ｖ）中のビタミンＤ代謝物もしくは類似体またはビヒクルを筋肉内注射した。検定の時点で、４．０ｍｇの⁴⁰Ｃａ²⁺５μＣｉの⁴⁵ Ｃａ²⁺（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）をエーテルで麻酔された動物の十二指腸内に入れた。３０分後、試験ひなどりを断頭して血液を集めた。０．２ｍＬの血漿の放射能含有量を液体シンチレーションカウンター（ＢｅｃｋｍａｎＬＳ８０００）で測定して、吸収された⁴⁵Ｃａ²⁺の量（ＩＣＡの尺度）を求めた。ＢＣＭ活性は、原子吸光分析法で測定した全血清カルシウムの増加から推定した。１α，２５−（ＯＨ）₂−Ｄ₃のひなどり腸受容体のステロイド競合検定ひなどりの腸１α，２５−（ＯＨ）₂−Ｄ₃受容体に対する競合結合の測定は、ヒドロキシルアパタイトバッチ検定法（４８）を用いて実施した。標準量の［³ Ｈ］−１α，２５−（ＯＨ）₂−Ｄ₃に増大した量の非放射性１α，２５−（ＯＨ）₂−Ｄ₃または類似体を加え、ひなどりの腸のサイトソールとともにインキュベートした。類似体類の相対競合指数（ＲＣＩ）は、結合した最大１α，２５−（ＯＨ）₂−［³Ｈ］−Ｄ₃の百分率×１００（ｐｅｒｃｅｎｔｍａｘｉｍｕｍ１α，２５−（ＯＨ）₂−［³Ｈ］−Ｄ₃ ｂｏｕｎｄ×１００）を縦軸に、および［競合体］／［１α，２５−（ＯＨ）₂ −［³Ｈ］−Ｄ₃］を横軸にプロットすることによって、求めた。特定の類似体に対して得られたラインの傾斜を、１α，２５−（ＯＨ）₂−Ｄ₃に対して得られたラインの傾斜で割り算し、この値に１００を掛け算してＲＣＩ値が得られる。定義によって、１α，２５−（ＯＨ）₂−Ｄ₃に対するＲＣＩは、１００である。２５−ＯＨ−Ｄ₃ヒトビタミンＤ結合タンパクのステロイド競合検定ヒトビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）のステロイド競合検定は、結合タンパク質としてヒトＤＢＰ（Ｇｃ−Ｇｌｏｂｕｌｉｎ、米国ミズーリ州セントルイス所在のＳｉｇｍａ社）を用いて実施した。０．８μＬの０．１Ｍバルビタール緩衡液ｐＨ８．６中のＤＢＰ（０．０１５ｍｇ）、および［³Ｈ］−２５−ＯＨ −Ｄ₃（０．９ｐｍｏｌ、２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社、米国イリノイ州アーリントン・ハイツ所在）、および０．１ｍＬのエタノール中の非放射性競合体（適当な範囲の濃度の試験類似体または標準の２５−ＯＨ−Ｄ₃）を２組、氷上のコニカルチューブ中でインキュベートした。２時間後、０．２ｍｌのチャーコールデキストランスラリー（４ｇのチャーコール、０．４ｇのデキストラン、２００ｍＬのバルビタール緩衡液中）を添加した。インキュベーションを氷上でさらに３０分間続け、そのチューブ９００×ｇで１０分間遠心分離した。ＤＢＰに結合した［³Ｈ］−２５−ＯＨ−Ｄ₃を示す三重水素を、上澄み液の一部分について液体シンチレーション測定法で測定した。各類似体について少なくとも３組の検定を行った。データは［競合体］／［［Ｈ³］−２５−ＯＨ −Ｄ₃］対１／［結合最大量の％（％ maximum bound）］としてプロットした。相対競合指数、すなわちＲＣＩは、さきに報告されているように（４９）、［競合体の傾斜］／［２５−ＯＨ−Ｄ₃の傾斜］×１００として算出した。このようなプロットによって、各類似体に特徴的な直線変換がなされ、その傾斜は、類似体の競合指数の値に等しい（各類似体は、［³Ｈ］−２５−ＯＨ−Ｄ₃との競合で検定されたが、そのデータは、そのＲＣＩが１００に設定されている１α，２５ −（ＯＨ）₂−Ｄ₃の結合に対して表される。したがって、１α，２５−（ＯＨ）₂ −Ｄ₃のＲＣＩ＝１００であり、２５−ＯＨ−Ｄ₃のＲＣＩ＝６６，８００である。実施例４ − １α，１８，２５−（ＯＨ₃）−Ｄ₃（ＨＳ）と１α，２５−ジヒドロキシ−トランス−イソタキステロール（１，２５−トランス−イソ−Ｔ）（ＪＤ）の合成と生物活性ＨＳは、次のようにして製造した。第一に、ＨＳの保護されたアルコール前駆体を次のようにして製造した。１８−アセトキシ−２５−［（トリメチルシリル）オキシ］−１α−［（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ビタミンＤ₃ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル］エーテル（化合物Ａ）を、Ｍａｙｎａｒｄ他、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５７巻、３２１４〜３２１７貞、１９９２年に記載されている手順で製造した。化合物Ａ（１３９ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）を無水エチルエーテル（０．２ｍＬ）に溶解し、ＬｉＡｌＨ₄（２１ｍｇ，５．４ｍｍｏｌ）をエーテル（０．５ｍＬ）に溶解した溶液に滴下して加えた。得られた反応混合物を３０分間撹拌し、その期間に溶液は粘調になり、さらに０．２ｍＬのエーテルを添加した。２０分間撹拌した後、反応混合物を酢酸エチル（１ｍＬ）でクエンチし、次いで半融ガラス漏斗で濾過した。得られた灰色の固体を酢酸エチル（５ｍＬ）で洗浄し、合した濾液を濃縮した。粗製残留物をフラッシュクロマトグラフィー（２０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、減圧乾燥して１０２ｍｇ（収率７８％）の保護されたアルコール前駆体を得た。その前駆体の分析結果は、次のとおりである。ＨＳは、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド（２．１６μＬ，０．２１６ｍｍｏｌ，ＴＨＦ中１Ｍ）を、上記の保護されたアルコール前駆体（１８．１ｍｇ，０．０２４ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２ｍＬ）に溶解した溶液に添加することによって製造した。得られた混合物を室温で２０時間撹拌し、次いで濃縮乾固した。得られた残留粗製物質を、シリカゲルの短カラムを通じて直接フラッシュクロマトグラフィー（ＥＴＯＡＣ）に付し、次にＨＰＬＣ（ＲａｉｎｉｎＤｙｎａｍａｘ、１．０×２５ｃｍ、８μｍシリカのカラム、ＥｔＯＡｃ）で精製し、減圧乾燥してＨＳ（７ｍｇ、収率７０％）を白色泡状物として得た。ＨＳの分析結果は、次のとおりである。ＪＤは、次のように前駆体Ａ〜Ｄを製造し反応させることによって、合成した。（１Ｓ，３Ｒ，６Ｓ）−１，３−ジ（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−２５−トリメチルシリルオキシ−９，１０−セココレスタ−５（１０），６，７−トリエン（Ａ）。新しく精製した１，２−ジヨードエタン（４１２ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）とサマリウム金属（２８６ｍｇ、１．９０ｍｍｏｌ）を減圧乾燥し、アルゴン雰囲気下４ｍＬのＴＨＦ中に懸濁させた。この溶液を、濃い青色になるまで２時間撹拌した。安息香酸プロパルギル（４７７ｍｇ、０．５７０ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ₃）₄（６５．８ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）を６ｍＬのＴＨＦに溶解して得た溶液をカニューレを通じて添加した。新たに蒸留したイソプロパノール（０．５ｍＬ）を添加し、その溶液を正圧のアルゴン雰囲気下１４時間撹拌した。Ｎａ₂ＣＯ飽和水溶液３（２ｍＬ）を添加して反応を停止させた。有機層をエーテルで希釈し、その混合物をＮａ₂ＣＯ３［３×１０ｍＬ］で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥し、次いで濃縮した。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、２％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、次にＨＰＬＣ（２％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、ＲａｉｎｉｎＤｙｎａｍａｘカラム、流速８ｍＬ／分）に付してＡを製造した。（１Ｓ，３Ｒ，６Ｓ）−１，３，２５−トリヒドロキシ−９，１０−セココレスタ−５（１０），６，７−トリエン（Ｂ）。上記ビニルアレンＡ（０．１０５４ｇ、０．１４６９ｍｍｏｌ）にＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、１．６ｍｌ、１．６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液をアルゴン雰囲気下１９時間撹拌した。水（１ｍＬ）を添加し、次にその溶液を３０分間撹拌した。得られた混合物をエーテル（３×１５ｍＬ）で抽出し、エーテル抽出液を食塩水（１×１０ｍＬ）で洗浄し、次いで乾燥した（ＭｇＳＯ₄）。濃縮した残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、８０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）に付し、次にＨＰＬＣ（８０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、ＲａｎｉｎＭｉｃｒｏｓｏｒｂカラム、流速４ｍＬ／分）に付して、精製された脱保護ビニルアレンＢをその６Ｒ−ジアステレオマーとともに（ＮＭＲインテグレーション法によって約９２：８の比率）（４６．１ｍｇ、全収率７５．３％）を得た。シェーブ・リサイクルＨＰＬＣ（shave-recycle HPLC）で分離することによって、純品のＢを得ることができ、分光分析法で特性を決定できた。７，８−シス−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃（Ｃ）。撹拌棒が入っている１０ｍＬフラスコ中の上記ビニルアレンＢ（１９．７ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）および（ｎｐ）（ＣＯ）₃Ｃｒ（１４．７ｍｇ、０．０５５７ｍｍｏｌ）に、１ｍＬのアセトン（ＣａＳＯ₄から蒸留）を添加した。凍結−ポンプ−融解のサイクルを４回行うことによって混合物の脱酸素を実施した後、その溶液を正圧のアルゴン雰囲気下、４０℃で４時間撹拌した。アセトンを減圧で除き、生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、８０％のＥｔＯＡＣ／ヘキサン）で精製し、次にＨＰＬＣ（８０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、ＲａｉｎｉｎＭｉｃｒｏｓｏｒｂカラム、流量４．０ｍＬ／分）で分離して、下記の溶出順で３成分を得た。すなわち、多量生成物Ｃ（１７．０ｍｇ、８６．４％）、回収された出発物質の前駆体Ｂ（１．４ｍｇ、７．１％）および少量生成物（１．５ｍｇ、７．６％）である。１α，２５−ジヒドロキシ−シス−ソタキステロール（Ｄ）アセトン−ｄ₆の１ｍＬ中の前駆体Ｃ（１０．４ｍｇ、０．０２５０ｍｍｏｌ）をＮＭＲ管に入れた。そのＮＭＲ管をフォイルでふたをし、アルゴンでフラッシュし、次に５７℃で加熱した。０、２３、８５、１７７、４５４および１０９９分の時間間隔で反応混合物をＮＭＲ分析で監視した。熱生成物３５が約１１３０分のｔ_1/2で生成することがＮＭＲインテグレーションによって観察された。他の生成物はみとめられなかった。１８．５時間後溶媒を除き、次いで直ちにＨＰＬＣ（８０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、ＲａｉｎｉｎＭｉｃｒｏｓｏｒｂカラム、流量４ｍＬ／分）によって生成物を出発物質から分離して、純品の前駆体Ｄ（４．５ｍｇ、収率４３％）を得た。前駆体Ｄの分析データは、次のとおりである。前駆体Ｄ（７．５ｍｇ、０．０１８０ｍｍｏｌ）の溶液をアルゴン雰囲気下エーテル（１ｍｌ）に溶解した。エーテルに溶解したヨウ素溶液（０．４９ｍＭ、１５０μｌ）を添加し、得られた溶液を室内照明の存在下、正圧アルゴンの雰囲気下で８時間攪拌した。その溶液を濃縮して粗製の油状残留物を得た。その粗製残留物をＨＰＬＣ（ＲａｉｎｉｎＭｉｃｒｏｓｏｒｂ、シリカ、１０ｍｍ×２５ｃｍ、１１％のイソプロパノール／ヘキサン）に付してＪＤを得た（３．９ｍｇ、収率５２％）。ＪＤの分析データは、次のとおりである。ＨＳとＪＤは、実施例２に記載されているのと同じ生物活性を有している。ＨＳの生物学的応答は、６−Ｓ−シスと６−Ｓ−トランスの立体配座を取ることができる点で、１，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃に似ている。実施例５ − ２３−（ｍ−（ジメチルヒドロキシメチル）−２２−イン−２４，２５，２６，２７−テトラノル−１α−ＯＨ−Ｄ₃（１Ｂ）の合成と生物学的特性１Ｂを図２７に記載の手順にしたがって製造した。合成のステップ１で、３− ヨード安息香酸を、８０ｍｌのＭｅＯＨおよび３ｍｌのＨ₂ＳＯ₄中で１４時間還流する。得られた生成物（Ｃ₈Ｈ₇Ｏ₂Ｉ）をＨ₂Ｏ／ヘキサン混合物から再結晶させる。ステップ２で、ＰＰｈ₃ＰｄＣｌ₂、ＣｕＩおよびＥｔ₂ＮＨの存在下、Ｃ₈ Ｈ₇Ｏ₂ＩをＣ₁₄ Ｈ₂₂Ｏと反応させる。生成したＣ₂₂Ｈ₂₈Ｏ₃は、２０％の酢酸エチルを含有するヘキサンの溶媒を用いフラッシュクロマトグラフィーで得られた。ステップ３で、ステップ２の生成物を、Ｓ．Ａ．Ｂａｒｒａｃｋ他、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５３巻、１７９０貞、１９８８年に記載の手順にしたがって、５５ｍｇのＯＨ、１８３ｍｇのクロロクロム酸ピリジニウム（ＰＤＣ）、１２ｍｇのトリクロロ酢酸ピリジニウム（ＰＴＦＡ）および１００ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂と反応させた。この反応は、室温で５時間実施した。得られた黒色の混合物をろ過し、ＣＨ₂ＣＲ₂で洗浄し、酢酸エチルで抽出し淡黄色の油状物を得た。この油状物をフラッシュクロマトグラフィーに付してＣ₂₂Ｈ₂₆Ｏ₃を得た。ステップ４で、ステップ３の生成物を、７０ｍｇのホスフィンオキシド、８２ μｌのｎ−ブチル、３５ｍｇのＣＤケトンのＴＨＦ溶液２ｍｌと反応させた。ｎ −ブチルは、ホスフィンオキシドのＴＨＦ溶液に滴下して加えた。得られたオレンジ色の溶液を−７８℃で１０分間攪拌し、ＴＨＦ中のＣＤリングケトンを滴下して加えた。その反応混合物を−７８℃で４時間攪拌した。この時点で、溶液は淡黄色に変わった。その溶液を水でクエンチし酢酸エチルで抽出し、次いでＮａ₂ ＳＯ₄で乾燥した。溶媒を減圧蒸発させ、得られた生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した。ステップ５で、ステップ４の生成物を２ｍｌのＴＨＦ中の５３μｌのＭｅＬｉと反応させた。ステップ４の生成物の室温のＴＨＦによる溶液にＭｅＬｉを滴下して加えた。得られた混合物を室温で１時間攪拌し、Ｈ₂Ｏでクエンチした。得られた生成物をＨ₂Ｏで洗浄し、次いで乾燥した。ステップ６で、ステップ５の生成物１０ｍｇを１ｍＬのＴＨＦに溶解した。６０μｌのＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１ｍ）を滴下して加え、その溶液を室温で一夜攪拌した。得られた混合物を短容積のＡｌ₂Ｏ₃（中性）を通過させ次いで酢酸エチルで抽出した。得られた生成物はＮＭＲとＵＶによってＩＢと同定された。ＩＢの生物活性は、６−Ｓ−シスと６−Ｓ−トランスの立体配座をとることができるので、１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃のゲノムおよび非ゲノムの生物活性に似ている。実施例６ − １α，２５−（ＯＨ）₂−７−ＤＨＣ（ＪＭ）および１α，２５ −（ＯＨ）₂−ルミステロール₃（ＪＮ）の合成と生物活性。ＪＭとＪＮは、両者ともにトランスカルタキアを刺激するが、核ビタミンＤ受容体（Ｎ−ＶＤＲ）または血清ビタミンＤ輸送タンパク質（ＤＢＰ）に結合する場合、１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃と競合しない、閉じたＢ−リングの類似体である。ＪＭすなわち１α，２５−（ＯＨ）₂−７−デヒドロコレステロール、およびＪＮすなわち１α，２５−（ＯＨ）₂−７−ルミステロール₃を、次のようにして合成した。公知の１α，２５−（ＯＨ）₂−プレビタミンＤ₃（１２０ｍｇ）のメタノール溶液に、室温で３時間、光を照射した（Ｈａｎｏｖｉａ４５０ワット中圧水銀灯、パイレックスフィルター、λ＞３００ｎｍ）。得られた溶液を濃縮し、次にＨＰＬＣ（ＲａｉｍｉｎＭｉｃｒｏｓｏｒｂ、５μｍシリカ、１０ｍｍ×２５ｃｍ、１１％イソプロパノール／ヘキサン）に付して、溶出順に、ＪＭ（９．１ｍｇ、７．６％）、ＪＮ（１５．０ｍｇ、１２％）および出発物質の１ α，２５−（ＯＨ）₂−プレビタミンＤ₃（１０．６ｍｇ、８．８％）を得た。ＪＭの同定特性は、次のとおりである。ＪＮの同定特性は、次のとおりである。生物学的検定は、次のように実施した。ホワイトレグホーンの雄ひなどり（ＨｙｌｉｎｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、米国カリフォルニア州レイクビュー所在）を孵化の日に入手し、ビタミンＤ補充餌（Ｏ．Ｈ．ＫｒｕｓｅＧｒａｉｎ＆Ｍｉｌｌｉｎｇ社、米国カリフォルニア州オンタリオ所在）で４〜５週間飼育した（４００〜６００ｇ）。ビタミンＤ欠乏ひなどりを用いた場合は、これらひなどりをくる病誘発餌（５０）で４週間飼育した。腸の⁴⁵Ｃａ²⁺輸送の測定（トランスカルタキア）Ｃａ²⁺輸送（トランスカルタキア）の測定を、すでに報告されているのとほぼ同様に（６、８）、灌流されたひなどりの十二指腸で行った。ひなどりをクロロペント（０．３ｍｌ／１００ｇ）で麻酔し、十二指腸ループを露出させた。腹腔動脈から分岐している３対の血管を結紮してから腹腔動脈自体のカニュレーションを行った。０．９ｍＭのＣａＣｌ₂を添加して改良し９５％のＯ₂／５％のＣＯ₂ で酸素化されたゲイ平衡塩類溶液（ＧＢＳＳ）を用い、流量２ｍｌ／ｍｉｎで動脈灌流を開始した。補助ポンプを用いて、ビヒクル（０．００５％エタノールｖ／ｖ、最終濃度）または試験類似体とアルブミン（０．１２５％ｗ／ｖ最終濃度）を、流量０．２５ｍｌ／ｍｉｎで血管灌流液に導入した。次に腸ループを切取り、⁴⁵Ｃａ²⁺（５μＣｉ／ｍｌ）を含有するＧＢＳＳ（ＮａＨＣＯ₃とグルコースを含まず）を腸内腔にフラッシュして満たした。腸内腔溶液は、０．２５ｍｌ／分の流量で常に新しいものにして、上皮ブラシ縁における⁴⁵Ｃａ²⁺の定常濃度を保証した。この腸の標本は、２７℃で、食塩水で湿らせたチーズクロスの層で湿潤状態を維持した。各十二指腸に、その内腔に⁴⁵Ｃａ²⁺を満たした後、２０分間、対照媒体（ビヒクル）を灌流させて、基本輸送速度を求めた。次いで、この組織を、さらに４０分間、試験類似体に暴露するかまたはビヒクルの灌流を続けた。静脈流を、基本輸送期間中および処理期間中、２分間隔で集めて、液体シンチーレーションによって⁴⁵Ｃａ²⁺活性について検定した。試験結果は、処理された相の各時間間隔で出現する⁴⁵ Ｃａ²⁺（４０分＝２０のデータ点）／平均基本速度（初期の２０分間）の比率で表す（６、５１）。受容体とＤＢＰの結合ひなどりの腸核受容体に結合する場合、［³Ｈ］−１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃と競合する類似体の相対性能の測定を、すでに報告されている方法（２５）にしたがって生体外で実施した。この検定では、増大させた濃度の非放射性１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃または類似体のＪＭもしくはＪＮを、固定飽和量の［³Ｈ］−１α ，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃とともにインキュベートし、次いでひなどりの腸の核の抽出物をビタミンＤ欠乏ひなどりから得た。［³Ｈ］−１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の最大結合量の百分率の逆数を算出し、類似体および［³Ｈ］−１α，２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃の相対濃度の関数としてプロットした。各類似体の競合指数値を、競合ステロイドとしての非放射性１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃で得られた標準曲線に対して正規化し、相対競合指数（ＲＣＩ）のリニアースケール上においた。なお、１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃のＲＣＩは、１００と定義する。ビタミンＤ類似体が血漿輸送タンパク質のビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）に結合する相対性能の測定は、類似の方式（５２）で実施した。ＪＭとＪＮは、２個のＡ−リングヒドロキシＮ基の固定配向が異なっている。すなわち、ＪＭは１α−アキシアルおよび３β−エクアトリアルであり、ＪＮは１α−エクアトリアルおよび３β−アキシアルである。また、ＪＭとＪＮは、６−Ｓ−シス形の１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の類似体であることは明らかであり、したがって、ＪＭとＪＮは、伸びきり６−Ｓ−トランス立体配座で存在することはできない。上記生物学的試験の結果を要約して以下に示す。トランスカルタキア図２４Ａと２４Ｂは、類似体ＪＭとＪＮそれぞれの２種の濃度、ビヒクル対照（エタノールのみ）および正の対照としての６５０ｐＭの１α，２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃で仲介された静脈流中の⁴⁵Ｃａ²⁺の出現を示す。トランスカルタキアを開始する際の３００ｐＭのＪＭの効力は、対照より有意に大ではなく、かつ６５０ｐＭのＪＭで誘発される応答は、天然の代謝物で誘発される応答の６０％にすぎない。しかし、ＪＮで灌流すると、１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃とほぼ同一の剌激を生成したが、ＪＮは、輸送⁴⁵Ｃａ²⁺の比率が１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃よりわずかに低かった。図２５Ａと２５Ｂは、それぞれＪＭとＪＮの投与応答曲線を示す。各棒グラフは、その濃度において類似体が誘発する最大応答とみなされる図２５Ａと２５Ｂの４０分のデータ点を示す。類似体ＪＮは、結局、６５０ｐＭの１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃が達成する最大刺激と均等の４倍プラトー（4-fold plateau）に１３００ｐＭで到達する。６５０ｐＭの類似体ＪＭの⁴⁵Ｃａ²⁺輸送比は、２．５がピークであり、ＪＭの濃度を１３００ｐＭまで上げてもそれ以上増大しなかった。Ｎ−ＶＤＲおよびＤＢＰの結合これらの試験の結果を表ＩＶに要約してある。ＪＭとＪＮは、いずれも、核受容体に結合するときに１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃と有意に競合はしない。他の試験結果は、Ｎ−ＶＤＲの結合性が非常に低いのはゲノム活性を欠いていることに関連することを示しており（７、８、１１）、したがって、これら類似体は、両者ともに遺伝子レギュレーターとして有効ではない。上記の試験結果は、ＪＭとＪＮがともにトランスカルタキアのような非ゲノム機構を制御するのに有用であることを示している。これら２種の類似体は、先に述べたように、非ゲノム応答に対する作動薬として用いて作用させることができる。実施例７ − （９α，１０α）および（９β，１０β）−１α，２５−ジヒドロキシ−７−デヒドロコレステロール−１α，２５（ＯＨ）₂−ピロカルシフェロール（ＪＯ）および１α，２５（ＯＨ）₂−イソプロピルカルシフェロール₃（ＪＰ）の合成と生物活性ＪＯとＪＰを以下の手順で製造した。１滴の２，４，６−トリメチルピリジンを含有するＤＭＦ（１５ｍＬ）に１α ，２５−（ＯＨ）₂−プレビタミンＤ₃（５４．２ｍｇ）を溶解した溶液にアルゴンをフラッシュし、これをねじ蓋付きバイアルびん中で１８時間１５６℃で加熱した。溶液を冷却し濃縮し、得られた粗混合物をＨＰＬＣ（ＲａｉｎｉｎＭｉｃｒｏｓｏｒｂ、５μｍシリカ、１０ｍｍ ×２５ｃｍ、１１％のイソプロパノール／ヘキサン）に付して溶出順に１，２５ −イソピロコレカルシフェロール（７．３ｍｇ、１３．５％）、１，２５−ピロコレカルシフェロール（２０．１ｍｇ、３７．１％）および１，２５−ビタミンＤ₃（２．１ｍｇ、３．９％）を得た。その粗混合物を¹Ｈ−ＮＭＲ分光法で分析したところ、ピロ異性体／イソピロ異性体の比率は、３：１であった。ＪＯのスペトルデータは、次のとおりである。ＪＰのスペクトルデータは、次のとおりである。ＪＯとＪＰは、両者とも、６−Ｓ−シス立体配座にロックされているので、類似体のＪＭとＪＮが達成するのと同じ非ゲノム作用を有している。実施例８ − （１Ｓ，３Ｒ，６Ｓ）−７，１９−レトロ−１，２５−（ＯＨ）₂ −Ｄ₃（ＪＶ）と（１Ｓ，３Ｒ，６Ｓ）−７，１９−レトロ−１，２５−（ＯＨ）₂−Ｄ₃（ＪＷ）の合成と生物活性類似体ＪＶは、以下のようにして合成した。（１Ｓ，３Ｒ，６Ｓ）−１、３−ジ（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ −２５−リメチルシリルオキシ−９，１０−セココレスタ−５（１０），６，７ −リエン（Ａ）は出発物質であり、まず次のようにして製造した。新たに精製した１，２−ジヨードエタン（４１２ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）とサマリウム金属（２８６ｍｇ、１．９０ｍｍｏｌ）を減圧乾燥し、次にアルゴン雰囲気下で４ｍＬＴＨＦ中に懸濁させた。この溶液を、濃色の青色になるまで２時間撹拌した。安息香酸プロパルギル（４７７ｍｇ、０．５７０ｍｍｏｌ）とＰｄ（ＰＰｈ₃ ）₄（６５．８ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）を６ｍＬのＴＨＦに溶解した溶液をカニューレによって添加した。新たに蒸留したイソプロパノール（０．５ｍＬ）を添加し、得られた溶液を正圧アルゴンの雰囲気下で１４時間撹拌した。Ｎａ₂ ＣＯ₃飽和水溶液（２ｍＬ）を添加して、反応を停止させた。有機層をエーテルで希釈し、次にその混合物をＮａ₂ＣＯ₃（３×１０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄ で乾燥し、次いで濃縮した。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、２％ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）、続いてＨＰＬＣ（２％ＥｔＯＡＣ／ヘキサン、ＲａｉｎｉｎＤｙｎａｍａｘカラム、流量：８ｍＬ／ｍｉｎ）によって精製してビニルアレンＡ（０．３０８５ｇ、収率７５．５％）を得た。生成物は、¹ Ｈ−ＮＭＲ分析法で同定した。この物質は、トリオールとして一層安定である。（１Ｓ，３Ｒ，６Ｓ）−１，３，２５−トリヒドロキシ−９，１０−セココレスタ−５（１０），６，７−トリエン（ＪＶ）を次のようにして製造した。ビニルアレンＡ（０．１０５４ｇ、０．１４６９ｍｍｏｌ）にＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、１．６ｍＬ、１．６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液をアルゴン雰囲気下で１９時間撹拌した。水（１ｍＬ）を添加し、その溶液を３０分間撹拌した。得られた混合物をエーテルで抽出し（３×１５ｍＬ）、そのエーテル抽出液を食塩水で洗浄し（１×１０ｍＬ）、次いで乾燥した（ＭｇＳＯ₄）。濃縮して得た残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、８０％ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）に付し、次にＨＰＬＣ（８０％ＥｔＯＡＣ／ヘキサン、ＲａｉｎｉｎＭｉｃｒｏｓｏｒｂカラム、流量４ｍＬ／ｍｉｎ）に付して、精製された脱保護ビニルアレンＪＶをその６Ｒ−ジアステレオマーのＪＷとともに得た（ＮＭＲインテグレーション法で約９２：８の比率）（４６．１ｍｇ、全収率７５．３％）。シエーブ−リサイクルＨＰＬＣによる分離によって、純晶のＪＶを得ることができ、かつ分光分析法で特性を決定することができた。（１Ｓ，３Ｒ，６Ｓ）−１，３，２５−トリヒドロキシ−９，１０−セココレスタ−５（１０），６，７−トリエンとしても知られているＪＷを、上記溶液から次のようにして単離した。（６Ｓ／６Ｒ）−ビニルアレンであるＪＶとＪＷ（２．６ｍｇ、０．００６２ｍｍｏｌ、６Ｓ：６Ｒの比率は約９２：８である）をメタノール−ｄ４（１ｍＬ）に溶解した溶液をＮＭＲ用石英管中に調整した。その溶液にアルゴンを飽和させ（３０分間）、次にそのＮＭＲ管にふたをし、Ｈａｎｏｖｉａ４５０ワット中圧灯からの紫外線を３０分間照射した。ＮＭＲスペクトル中のＣ₁₈−Ｍｅシグナルを積分（in tegrate）したところ、２種の異性体の約５０：５０の混合物であることがわかった。溶媒を除き、次いで生成物をＨＰＬＣ（１１％のイソプロパノール／ヘキサン、ＲａｉｎｉｎＭｉｃｒｏｓｏｒｂカラム、流量６ｍＬ／ｍｉｎ）で分離した。重なっているピークの前の部分から純晶の（６Ｒ）−ビニルアレンＪＷ（０．９ｍｇ、収率３５％）を得た。この生成物を分光分析法で同定し、特性を決定した。ＪＶとＪＷの生物活性は、１，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃が達成する生物活性に似ている。実施例９ − １，２５−（ＯＨ）₂７，８−シス−Ｄ₃（ＪＲ）と１，２５−（ＯＨ）₂−５，６−トランス−７，８−シス−Ｄ₃（ＪＳ）の合成と生物活性。ＪＲをＪＶから以下のようにして合成した。撹拌棒が入った１０ｍＬフラスコ中のビニルアレンＪＶ（１９．７ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）と（ｎｐ）（ＣＯ）₃Ｃｒ（１４．７ｍｇ、０．０５５７ｍｍｏｌ）に１ｍＬのアセトン（ＣａＳＯ₄から蒸留）を添加した。凍結−ポンプ− 融解のサイクルを４回行って、上記混合物の脱酸素を行った後、得られた溶液を正圧アルゴンの雰囲気下４０℃で４時間撹拌した。アセトンを減圧で除き、生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、８０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、次にＨＰＬＣ（８０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、ＲａｉｎｉｎＭｉｃｒｏｓｏｒｂカラム、流量４０ｍＬ／分）によって分離して、３成分を次の溶出順に得た。すなわち、大量生成物ＪＲ（１７．０ｍｇ、８６．４％）、回収された出発物質ＪＶ（１．４ｍｇ、７．１％）および小量のシスーイソタキステロール（１．５ｍｇ、７．６％）である。ＪＲをＮＭＲで分析して、以下の試験結果を得た。５，６−トランス−７，８−シス−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃（ＪＳ）を、ＪＲをヨウ素触媒シスートランス異性化反応に付して合成した。その手順は、次のとおりであった。７，８−シス類似体ＪＲ（約５．０ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）に、０．１ｍｏｌ％のＩ₂のエーテル溶液（１ｍＬ、９．８×１０^-6Ｍ）を添加した。得られた溶液をアルコン雰囲気下で３０分間撹拌し、溶媒を除去し、次いでＨＰＬＣで生成物を分離した。最初の分離（８０％酢酸エチル／ヘキサン、ＲａｉｎｉｎＭｉｃｒｏｓｏｒｂカラム、流量４ｍＬ／分）で二つの画分を得た。これら画分を各々ＮＭＲ分析に付した。画分Ｉは生成物Ａ、ＢおよびＣを含有しＷそして画分ＩＩは生成物Ｂ、ＣおよびＤを含有していた。これら二つの画分のＨ−ＮＭＲ分析結果および重量によって、これら４種の生成物Ａ、Ｂ、ＣおよびＤが総合して約８：３２：４２：１８の比率で得られたと推定した。これら４種の生成物は、¹Ｈ−ＮＭＲ分析によって次の幾何異性体として同定された。すなわち、Ａは５，６−シス−７，８−トランス、Ｂは５，６−トランス−７，８−トランス、Ｃは５，６−トランス−７，８−シス（ＪＳ）、そしてＤは５，６−シス−７，８−シス（ＪＲ）である。ＨＰＬＣ（１１％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、ＲａｉｎｉｎＭｉｃｒｏｓｏｒｂカラム、流量６ｍＬ／ｍｉｎ）で精製を繰返して、結局、分光法による特性決定に適している純晶の（ＪＳ）（０．５ｍｇ、無色で粘性のある油状物）を得た。ＪＲとＪＳの生物活性を、前記諸実施例に記載してきたひなどりの腸受容体ステロイド競合検定法で測定した。ＪＲとＪＳは、ともに、天然ホルモンが受容体に結合する性能を有意に抑制する。これらの試験結果は、ＪＲとＪＳも、トランスカルタキアなどの非ゲノム機構を調節するのに有用であることを示している。実施例１０ − ２２−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−２３，２４，２５，２６，２７，ペンタノル−Ｄ₃（ＪＸ）と２２−（ｍ−ヒドロキシフェニル−２３，２４，２５，２６，２７−ペンタノル− Ｄ₃（ＪＹ）の合成と生物活性乾燥ＴＨＦ（１．８ｍＬ）中のＡ−リングホスフィンオキシド（４８ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を−７８℃まで冷却し、次にｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中１．５Ｍ、０．０７４ｍＬ、０．１１ｍｍｏｌ）を注射器で滴下して加えた。得られた濃赤色の溶液を１０分間撹拌し、適当なＣＤ−リングケトン（２８ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（０．６ｍＬ）に溶解した溶液で、カニューレを用いて処理した。得られた混合物を、−７８℃で２時間撹拌し、室温まで昇温させ、次いで水（５ｍＬ）でクエンチした。水性層を分離してＥｔＯＡｃで抽出した（３×５ｍＬ）。合した有機層を食塩水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し濃縮した。得られた粗製残留物を、短いシリカゲルカラム（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって迅速濾過を行って精製し、保護されたビタミン２０．１ｍｇ（収率４６％）を得た。この得られたビタミン（２０．１ｍｇ、０．０３１５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１ｍＬ）中に入れて、アルゴン雰囲気下に置き、ＴＢＡＦ（０．３２ｍＬ、ＴＨＦ中１Ｍ、０．３２ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。１８時間撹拌後、溶媒を一部分蒸発させ、残留物を水（５ｍｌ）で希釈した。水性層をＥｔＯＡｃで抽出した後（３×５ｍＬ）、有機層を合し、食塩水で洗浄し、次いでＮａ₂ＳＯ₄で乾燥した。残留物をＨＰＬＣ（２０％ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）で精製し、減圧乾燥して４．７ｍｇ（収率３６％）のＪＸを得た。ＪＸのスペクトルデータは、次のとおりである。乾燥ＴＨＦ（２．８ｍＬ）のＡ−リングホスフィンオキシド（７０ｍｇ、０．１５４ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で−７８℃に冷却し、次にｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中１．５Ｍ、０．１００ｍＬ、０．１５４ｍｍｏｌ）を注射器によって付加した。得られた溶液を１０分間撹拌し、次に適当なＣＤ−リングケトン（４１ｍｇ、０．１０２ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（０．８５ｍＬ）に溶解した溶液を滴下して加えて処理した。得られた混合物を−７８℃で２時間撹拌し、次に１時間かけて室温まで昇温させた。溶媒を一部分蒸発させ、次に５ｍＬの水でクエンチした。水性層を分離し、ＥｔＯＡｃで抽出した（３×５ｍＬ）。合した有機層を食塩水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、次いで濃縮した。得られた粗製残留物を、短いシリカゲルカラム（２％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって迅速濾過を行って精製し、１９．２ｍｇ（収率２９％）の保護されたビタミンを得た。乾燥ＴＨＦ（１ｍＬ）中の保護されたビタミン（１９．２ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下におき、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、０．３０ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。１８時間撹拌後、溶媒を一部分蒸発させ、次いで水（５ｍＬ）で希釈した。水性層をＥｔＯＡｃで抽出した後（３×５ｍＬ）、有機層を合して、これを食塩水で洗浄し、次にＮａ₂ＳＯ₄で乾燥した。残留物をＨＰＬＣ（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、減圧乾燥して２．８ｍｇ（収率２３％）のＪＹを得た。ＪＹのスペクトルデータは、次のとおりである。ＪＸとＪＹの生物活性は、これら２種の類似体が６−ｓ−シスと６−ｓ−トランスの両方の立体配座を取ることができるので、１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の生物活性に似ている。本発明の代表的な実施態様を説明してきたが、本明細書の開示事項は代表的なものに過ぎず、各種の他の変形、適応および改変を本発明の範囲内で行うことができることに当該技術分野の当業者は注目すべきである。したがって、本発明は、本明細書に示したような特定の実施態様に限定されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 31/59 ＡＤＵ 9454−4ＣＡ６１Ｋ 31/59 ＡＤＵＡＤＶ 9454−4ＣＡＤＶ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者オカムラウィリアムエイチ. アメリカ合衆国カリフォルニア州 92507 リバーサイドバイアリンタダ 1285

Claims

【特許請求の範囲】１．１α，２５−（ＯＨ）₂ビタミンＤ₃によって仲介される、細胞のゲノムまたは非ゲノムの細胞応答を制御する方法であって、プレビタミンＤ₃、１β，２５−（ＯＨ）₂ビタミンＤ₃、１４−エピ−１，２５−（ＯＨ）₂−Ｄ₃（ＧＥ）、１４−エピ−１，２５（ＯＨ）₂−プレ−Ｄ₃（ＧＦ）、１α，１８，２５−（ＯＨ）₃−Ｄ₃（ＨＳ）、２３−（ｍ−（ジメチルヒドロキシメチル）フェニル）−２２−イン−２４，２５，２６，２７−テトラノル−１α−ＯＨ−Ｄ₃（ＩＢ）、１α，２５−ジヒドロキシ−トランス−イソタキステロール（１，２５−トランス−イソ−Ｔ）（ＪＤ）、１α，２５−（ＯＨ）₂−７−ＤＨＣ（ＪＭ）、１α，２５−（ＯＨ）₂−ルミステロール₃（ＪＮ）、１α，２５−（ＯＨ）₂−ピロカルシフェロール₃（ＪＯ）、１α，２５−（ＯＨ）₂−イソピロカルシフェロール₃（ＪＰ）、１，２５−（ＯＨ）₂−７，８− シス−Ｄ₃（ＪＲ）、１，２５−（ＯＨ）₂−５，６−トランス−７，８−シス− Ｄ₃（ＪＳ）、（１Ｓ，３Ｒ，６Ｓ）−７，１９−レトロ−１，２５−（ＯＨ）₂ −Ｄ₃（ＪＶ）、（１Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）−７，１９−レトロ−１，２５−（ＯＨ）₂−Ｄ₃（ＪＷ）、２２−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−２３，２４，２５，２６，２７−ペナノル−Ｄ３（ＪＸ）および２２−（ｍ−ヒドロキシフェニル）− ２３，２４，２５，２６，２７−ペンタノル−Ｄ₃（ＪＹ）からなる群から選択されるビタミンＤ類似体の、１α，２５−（ＯＨ）₂ビタミンＤ₃によって仲介される少なくとも１種のゲノムまたは非ゲノムの細胞応答を測定可能なように生じさせるのに充分な量で、前記細胞を処理するステップを含んでなる方法。２．特許請求の範囲１に記載の方法であって、１α，２５−（ＯＨ）₂ビタミンＤ₃によって仲介される前記非ゲノム細胞応答がトランスカルタキアである方法。３．特許請求の範囲１に記載の方法であって、前記細胞が生体内に存在する場合である方法。４．特許請求の範囲１に記載の方法であって、前記細胞が生体外に存在する場合である方法。５．特許請求の範囲１に記載の方法であって、前記細胞が腸組織内に存在する場合である方法。６．特許請求の範囲１に記載の方法であって、前記ビタミンＤ類似体が１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃仲介前記非ゲノム細胞応答の作動薬である方法。７．特許請求の範囲１に記載の方法であって、前記ビタミンＤ類似体が１α，２５−（ＯＨ）₂ビタミンＤ₃仲介前記非ゲノム細胞応答の拮抗薬である方法。８．特許請求の範囲６に記載の方法であって、前記ビタミンＤ類似体がプレビタミンＤ₃である方法。９．特許請求の範囲７に記載の方法であって、前記ビタミンＤ類似体が１β，２５−（ＯＨ）₂ビタミンＤ₃である方法。１０．１４−エピ−１，２５−（ＯＨ）₂−Ｄ₃（ＧＥ）、１４−エピ−１，２５−（ＯＨ）₂−プレ−Ｄ₃（ＧＦ）、１α，１８，２５−（ＯＨ）₃−Ｄ₃（ＨＳ）、２３−（ｍ−（ジメチルヒドロキシメチル）フェニル）−２２−イン２４，２５，２６，２７−テトラノル−１α−ＯＨ−Ｄ₃（ＩＢ）、１α，２５−ジヒドロキシ−トランス−イソタキステロール（１，２５−トランス−イソ−Ｔ）（ＪＤ）、１α，２５−（ＯＨ）₂−７−ＤＨＣ（ＪＭ）、１α，２５−（ＯＨ）₂ −ルミステロール₃（ＪＮ）、１α，２５−（ＯＨ）₂−ピロカルシフェロール₃ （ＪＯ）、１α，２５−（ＯＨ）₂−イソピロカルシフェロール₃（ＪＰ）、１，２５−（ＯＨ）₂−７，８−シス−Ｄ₃（ＪＲ）、１，２５−（ＯＨ）₂−５，６ −トランス−７，８−シス−Ｄ₃（ＪＳ）、（１Ｓ，３Ｒ，６Ｓ）−７，１９− レトロ−１，２５−（ＯＨ）₂−Ｄ₃（ＪＶ）、（１Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）−７，１９ −レトロ−１，２５−（ＯＨ）₂−Ｄ₃（ＪＷ）、２２−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−２３，２４，２５，２６，２７−ペナノル−Ｄ３（ＪＸ）および２２−（ｍ−ヒドロキシフェニル）−２３，２４，２５，２６，２７−ペンタノル−Ｄ₃ （ＪＹ）からなる群から選択されるビタミンＤ類似体を含んでなる組成物。１１．特許請求の範囲１０に記載の組成物であって、前記類似体が１４−エピ−１，２５−（ＯＨ）₂−Ｄ₃（ＧＥ）であるもの。１２．特許請求の範囲１０に記載の組成物であって、前記類似体が１４−エピ−１，２５−（ＯＨ）₂−プレ−Ｄ₃（ＧＦ）であるもの。１３．特許請求の範囲１０に記載の組成物であって、前記類似体が１α，１８，２５−（ＯＨ）₃−Ｄ₃（ＨＳ）であるもの。１４．特許請求の範囲１０に記載の組成物であって、前記類似体が２３−（ｍ−（ジメチルヒドロキシメチル）フェニル）−２２− イン−２４，２５，２６，２７−テトラノル−１α−ＯＨ−Ｄ₃（ＩＢ）であるもの。１５．特許請求の範囲１０に記載の組成物であって、前記類似体が１α，２５−ジヒドロキシ−トランス−イソタキステロール（１，２５−トランス−イソ−Ｔ）（ＪＤ）であるもの。１６．特許請求の範囲１０に記載の組成物であって、前記類似体が１α，２５−（ＯＨ）₂−７−ＤＨＣ（ＪＭ）であるもの。１７．特許請求の範囲１０に記載の組成物であって、前記類似体が１α，２５−（ＯＨ）₂−ルミステロール₃（ＪＮ）であるもの。１８．特許請求の範囲１０に記載の組成物であって、前記類似体が１α，２５−（ＯＨ）₂−ピロカルシフェロール₃（ＪＯ）であるもの。１９．特許請求の範囲１０に記載の組成物であって、前記類似体が１α，２５−（ＯＨ）₂−イソピロカルシフェロール₃（ＪＰ）であるもの。２０．特許請求の範囲１０に記載の組成物であって、前記類似体が１，２５−（ＯＨ）₂−７，８−シス−Ｄ₃（ＪＲ）であるもの。２１．特許請求の範囲１０に記載の組成物であって、前記類似体が１，２５−（ＯＨ）₂−５，６−トランス−７，８−シス−Ｄ₃（ＪＳ）であるもの。２２．特許請求の範囲１０に記載の組成物であって、前記類似体が（１Ｓ，３Ｒ，６Ｓ）−７，１９−レトロ−１，２５−（ＯＨ）₂ −Ｄ₃（ＪＶ）であるもの。２３．特許請求の範囲１０に記載の組成物であって、前記類似体が（１Ｓ，３Ｒ，６Ｒ）−７，１９−レトロ−１，２５−（ＯＨ）₂ −Ｄ₃（ＪＷ）であるもの。２４．特許請求の範囲１０に記載の組成物であって、前記類似体が２２−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−２３，２４，２５，２６，２７−ペンタノル−Ｄ３（ＪＸ）であるもの。２５．特許請求の範囲１０に記載の組成物であって、前記類似体が２２−（ｍ−ヒドロキシフェニル）−２３，２４，２５，２６，２７−ペンタノル−Ｄ₃（ＪＹ）であるもの。