JPH09505033A

JPH09505033A - ホスホイノシチド特異的ホスホリパーゼｃの阻害剤

Info

Publication number: JPH09505033A
Application number: JP7511980A
Authority: JP
Inventors: ギブス，ジヤクソン・ビー; コブラン，ケネス・エス; マクラウド，アンガス・エム; マーチヤント，ケビン・ジエイ
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1993-10-15
Filing date: 1994-10-11
Publication date: 1997-05-20
Also published as: AU696622B2; EP0746323A1; US5519163A; AU7973894A; WO1995010286A1; CA2173456A1; EP0746323A4

Abstract

(57)【要約】本発明は哺乳動物ホスホイノシチド特異的ホスホリパーゼＣを阻害する新規α−ヒドロキシホスホン酸化合物に関する。該化合物は強力な抗炎症及び鎮痛剤であり、癌の治療に有用であり得る。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称ホスホイノシチド特異的ホスホリパーゼＣの阻害剤発明の背景ホスホリパーゼＣ（ＥＣ３．１．４．３）は膜リン脂質中のｓｎ−３ホスホジエステル結合を加水分解し、ジアシルグリセロールと極性のリン酸化頭部基を生じる酵素群の一員である。哺乳動物ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）酵素は加水分解されるホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトールなどの極性頭部基に対して特異性を示す。最近、アゴニストによる受容体占有に応答してホスホイノシチド脂質を選択的に加水分解する、これらＰＬＣ酵素に大きな関心が寄せられている。ホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸を加水分解すると２種の第２のメッセンジャー分子、即ちタンパク質キナーゼＣの活性化に必要な補因子であるジアシルグリセロールと、ミトコンドリア以外の細胞内に貯蔵されたカルシウムの放出を促進する第２の可溶性メッセンジャー分子であるイノシトール１，４，５− 三リン酸を生じる（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，Ａｎｎ．ｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６：１５９−１９３，１９８７）。放出されたジアシルグリセロールは、ジグリセロールリパーゼとモノグリセロールリパーゼの逐次作用により更に代謝され、遊離アラキドン酸を生じ得る。従って、ホスホリパーゼＣは第２のメッセンジャー分子の生成における重要な酵素であるのみならず、選択組織におけるエイコサノイド生合成にアラキドン酸を使用可能にするのに重要な役割を果たし得る。哺乳動物組織は複数の異なる形態のホスホイノシチド特異的ＰＬＣを含む（ＣｒｏｏｋｅとＢｅｎｎｅｔｔ，ＣｅｌｌＣａｌｃｉｕｍ，１０：３０９−３２３，１９８９；Ｒｈｅｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：５４６−５５０，１９８９）。これら酵素の各々が異なるクラスの細胞表面受容体と結合することが報告されており、即ちＰＬＣ−βはＧｑα又はＧ₁₁αを介してトロンボキサンＡ₂ 、ブラジキニン、アンギオテンシン及びムスカリン受容体と結合し（Ｓｈｅｎｋｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：９３０９−９３１２（１９９１）；Ｇｕｔｏｗｓｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：２０５１９ −２０５２４（１９９１）；Ｂｅｒｓｔｅｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：８０８１−８０８８（１９９２））、ＰＬＣ−γは増殖因子受容体などと結合する（Ａｉｙａｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２６１：６３−７０，１９８９；ＣｒｏｏｋｅとＢｅｎｎｅｔｔ，前掲；Ｍａｒｇｏｌｉｓら，Ｃｅｌｌ，５７：１１０１−１１０７，１９８９；Ｗａｈｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１５６８−１５７２，１９８９）。これらからの配列を整理すると、最も保存されている残基はそれぞれＸ及びＹ領域と呼ばれる２つの異なる領域（〜１７０アミノ酸の領域と〜２６０アミノ酸の領域）に大別される。ＰＬＣ−γ₁はｓｒｃ相同領域（ＳＨ２とＳＨ３）も含み、これらの領域は上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体などのチロシンキナーゼ活性をもつ受容体と酵素との相互作用を媒介するらしい（Ｓｔａｈｌら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：２６９−２７２（１９８８）；Ｋａｔａｎら，Ｃｅｌｌ，５４：１７１− １７７（１９８８））。ＰＬＣアイソザイムは特異的細胞表面受容体の刺激に応答して種々のメカニズムにより活性化される。ＰＬＣ−δ と特異的受容体又は下流エフェクターとの結合は報告されていないが、このアイソザイムは血管平滑筋の緊張を調節するメカニズムに関連するらしい。ＰＬＣ− βの活性化はＧｑクラスのグアニンヌクレオチド結合タンパク質によって達せられる。今日までに６種の異なるＰＩ−ＰＬＣ酵素のｃＤＮＡがクローニングされている。酵素の寸法は５０４アミノ酸〜１２５０アミノ酸長であり、類似の生化学的性質を示す割には著しく分散している。５種の酵素のうちの４種（ＰＬＣ−β、ＰＬＣ−δ₁、ＰＬＣ−δ₂及びＰＬＣ−γ₁）は５０〜８０％の配列類似性を示す約２５０アミノ酸長の２つのドメインを含む。ＰＩ−ＰＬＣ酵素毎にＤＮＡ配列が著しく異なるため、アンチセンス技術を使用して他の酵素に影響を与えることなく１種のＰＩ−ＰＬＣ酵素を選択的に捕らえることができる。ヒトｃＤＮＡクローンが報告されているのはＰＬＣ−δ₂（Ｏｈｔａら，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，２４２：３１−３５，１９８８）とＰＬＣ−γ₁（Ｂｕｒｇｅｓｓら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０：４７７０−４７７７（１９９０））である。その他はラットｃＤＮＡクローンである。ゲノムクローンはどのＰＩ−ＰＬＣ酵素についても報告されていない。試験された哺乳動物組織は、全て１種以上のＰＩ−ＰＬＣ酵素を示す。一般に、単一の哺乳動物細胞型に２種以上の酵素が存在する。ＰＩ−ＰＬＣ酵素はその分布において組織選択性を示す。ＰＬＣ−βは主に神経組織に存在し、脳における主要酵素である。ＰＬＣ−γ₁は脳と多数の末梢組織に存在する。ＰＬＣ−δ₂ は免疫細胞に存在し、ＰＬＣ−δ₁は主に末梢組織に存在するらしい。炎症細胞のみに存在するＰＩ−ＰＬＣ酵素はまだ報告されていない。自発性高血圧症ラットゲノムでＰＬＣ−δ₁の点突然変異が確認されている（Ｙａｇｉｓａｗａら，Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．９：９９７−１００４（１９９１））。生化学研究によって自発性高血圧症ラットでＰＬＣ−δ₁の活性化（５倍）が立証されている（Ｋａｔｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：６４８３−６４８７（１９９２））。触媒ドメインと推定される位置での点突然変異は、ＰＬＣ−δ₁活性化の直接結果である異常カルシウム恒常性の高血圧関連現象の主原因であると思われる。ＰＩ−ＰＬＣ−δ₂は免疫担当細胞における重要な酵素であるらしい（Ｅｍｏｒｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：２１８８５−２１８９０）。このタンパク質はサイトゾルタンパク質全体の０．１〜０．０５％に相当する並の量のタンパク質である。ＰＩ−ＰＬＣ酵素の遺伝子調節、ｍＲＮＡ又はタンパク安定性については全く情報が得られない。マクロファージでアラキドン酸からプロスタグランジン（ＰＧ）が迅速に合成されると、通常は炎症刺激を伴うことが認められている。従って、マクロファージからのアラキドン酸の放出を抑制すれば、ＰＧ合成を有効に制御し、ひいては炎症症状を制御することができよう。最近、ホスホリパーゼＣはホスファチジルイノシトール−アラキドン酸−プロスタグランジン生合成経路に関与する酵素であることが立証された。この知見を裏付けるものとして、ホスホリパーゼＣはマクロファージからのアラキドン酸及び血小板からのプロスタグランジンの刺激放出を抑制するとして知られている化合物であるフェノチアジンにより阻害されるという所見が報告されている。Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ／ＣＤ３）の活性化は、免疫応答から炎症までの複雑な生物応答の原因となる一連の生化学プロセスを誘発する。ＰＬＣ−γ₁の活性化は白血球で非受容体タンパク質チロシンキナーゼが所定の細胞表面受容体（ＴＣＲ）に応答して作用することによっても達せられ得る（Ｐａｒｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：５４５３−５４５６（１９９１））。ＰＬＣ−γ₁の活性化はＢリンパ球におけるＩｇＭ連結、好塩基球性白血病細胞におけるＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）連結及び単球細胞におけるＩｇＧ受容体（ＦｃγＲＩ及びＦｃ７ＲII）連結によっても生じる（Ｌｉａｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：３６５９−３６６３（１９９２））。従って、ＰＬＣ−γ活性の阻害は炎症症状の治療に有用であると思われる。ＰＬＣ−γは活性化チロシンキナーゼ増殖因子受容体によりリン酸化される唯一のアイソザイムである（Ｒｏｔｉｎら，ＥＭＢＯＪ．，１１：５５９−５６７（１９９２）；Ｍｏｈａｍｍａｄｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：５０６８−５０７８（１９９２）；Ｋｉｍら，Ｃｅｌｌ，６５：４３５− ４４１（１９９１））。増殖因子刺激後、サイトゾルＰＬＣ−γはｉｎｖｉｖｏで広範且つ迅速にリン酸化される（ＰＬＣ−γ分子の５０〜７０％が５分以内に修飾される）。このリン酸化によってＰＬＣ−γは血漿膜に転移し、より良好にそのリン脂質基質と相互作用できると予想される。細胞から予め免疫沈降させておいた酵素を用いるｉｎｖｉｔｒｏ試験によると、ＰＬＣ−γ₁のリン酸化形態の触媒活性は非リン酸化形態よりも高いと思われるが、この効果はアッセイ条件によっても異なる。これらの結果によると、ＰＬＣ−γ はマイトジェンシグナル変換の重要な成分であると思われる。更に、改変ＰＬＣ −γ活性はある種の疾患状態に相関し得る。例えば、同様にＥＧＦ受容体を過剰発現する原発ヒト乳癌に由来する細胞でＰＬＣ−γの濃度の増加が立証されている（Ａｒｔｅａｇａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：１０４３５−１０４３９(１９９１)）。従って、特に活性化形態のＰＬＣ−γ活性の阻害は、乳癌の治療に有用であると思われる。更に、ＰＬＣ−γ₁は乾癬、脂漏性角化症及び尖端線維性軟疣などの種々の過剰増殖皮膚症状からの上皮の多数の層を通してｉｎｖｉｖｏ（免疫組織化学）定位されている（Ｎａｎｎｅｙら，ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈａｎｄＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，３：２３３−２３９(１９９２)）。従って、ＰＬＣ−γ活性の阻害は良性上皮過形成の治療に有用であると思われる。Ｇｑサブファミリーの特定の構成員は種々のＰＬＣ−βアイソザイムを活性化できる（例えばＧｑαはＰＬＣ−β₁を活性化する）ことが最近立証され（Ｓｍｒｃｋａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１：８０４−８０７（１９９１）；Ｔａｙｌｏｒら，ＦＥＢＳ２８６：２１４−２１６（１９９１））、ＰＬＣ−βと多数のトランスメンブランシグナル変換経路との関係が提示されている。Ｇｑαの活性化突然変異体でトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞は完全に形質転換された表現型を示し、無胸腺症ヌードマウスで高度に腫瘍形成性であり（Ｋａｌｉｎｅｃら，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１２：４６８７−４６９３（１９９２））、非常に高いホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ−β）活性を示す（ＤｅＶｉｖｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１８２６３−１８２６６（１９９２））。ある種のヘテロ三量体Ｇタンパク質のαサブユニットに関して遺伝子中の他の突然変異も報告され（Ｌｙｏｎｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：６５５−６５９（１９９０）；Ｖａｌｌａｒら，Ｎａｔｕｒｅ３３０：５５６−５５８（１９８７））、所定のヒト内分泌腫瘍と関連付けられており、活性化Ｇタンパク質は発癌遺伝プロセスに役割を果たすと予想される。従って、ＰＬＣ−γに加えてＰＬＣ−βもヒト癌に関連し得る。従って、本発明の目的は慢性関節リウマチ、気腫、気管支炎症、骨関節炎、脊椎炎、狼瘡、乾癬、急性呼吸障害症候群、痛風、発熱及び疼痛を含む炎症症状の治療に有用な、強力な抗炎症及び鎮痛剤であり得るホスホリパーゼＣの特異的且つ選択的な阻害剤を提供することである。本発明の目的は、乳癌を含む所定の形態の癌、及び他の上皮過剰増殖疾患状態の治療に有用な薬剤である、ホスホリパーゼＣの阻害剤を提供することでもある。本発明の別の目的は、新規ホスホリパーゼＣ阻害剤の投与に使用する医薬組成物を提供することである。本発明の更に別の目的は、炎症及び疼痛の治療を必要とする哺乳動物種に有効量の本発明の化合物を投与することにより、炎症及び疼痛を緩和及び治療する方法を提供することである。図面の簡単な説明図１プラスミドｐＴ５Ｔ−ＰＬＣ４プラスミドｐＴ５Ｔ−ＰＬＣ４の構築の概略図を示す。図２ＰＬＣ−γ₁アミノ酸配列及びｃＤＮＡコーディング配列ＰＬＣ−γ₁をコードするヌクレオチド配列と、ｃＤＮＡ配列の下にＰＬＣ− γ₁の対応するアミノ酸を示す。２８３３〜２８３８位のコドンは天然のＡＧＧＡＧＧタンデムからＣＧＧＣＧＧに改変されている（ｃＤＮＡ：配列番号１、アミノ酸：配列番号２）。図３エピトープタグを含むｃＤＮＡコーディング配列ＰＬＣ−γ₁の発現と精製に用いたヌクレオチド配列（１〜３８７９）と隣接ＢａｍII制限部位を示す。最長開放読み枠（１２９１ａａ）のアミノ酸配列を対応するヌクレオチドの下に示す（ｃＤＮＡ：配列番号３、アミノ酸：配列番号２）。発明の詳細な説明本発明は構造式Ｉ：［式中、Ｒ¹及びＲ²は独立してａ）水素、及びｂ）から選択され、但しＲ¹が水素の場合にはＲ²は置換基ｂ）であり、Ｒ²が水素の場合にはＲ¹は置換基ｂ）であり、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶はａ）水素、ｂ）ハロゲン、ｃ）Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、ｄ）Ｃ₁−Ｃ₄アルコキシ、及びｅ）ヒドロキシから構成される群から独立して選択され、但しＲ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶のうちの少なくとも１個は水素以外の置換基であるか、又はＲ³とＲ⁴又はＲ⁴とＲ⁵は一緒になって−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂−ジラジカルを形成する］の新規α−ホスホン酸化合物又は医薬的に許容可能なその塩もしくはエステルに関する。本発明の１態様は式Ｉ中、置換基Ｒ¹及びＲ²が上記の通りであり且つ置換基Ｒ³ 、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶が上記の通りであり、但しＲ⁵が水素の場合にはＲ³とＲ⁴はいずれもメチル以外のものであり、Ｒ³とＲ⁴又はＲ⁴とＲ⁵は一緒になって−ＣＨ₂ ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂−ジラジカルを形成していない化合物である。上記アルキル置換基はメチル、エチル、イソプロピル、イソブチル等の特定長の直鎖及び分枝鎖炭化水素を表す。アルコキシ置換基は酸素橋を介して結合した上記のようなアルキル基を表す。「ハロゲン」なる用語は、ヨウ素、塩素、臭素及びフッ素から選択される置換基を表す。本発明の特定化合物は式：式中、を有する化合物を含む。本発明の他の化合物は式：式中、を有する化合物を含む。本発明の更に他の化合物は下記化合物を含む。本発明の新規化合物は一般に、適当なハロゲン化ベンズアルデヒドを適当に置換したフェノールで処理し、式IIのフェノキシベンズアルデヒドを提供する方法（図式１に示す）により製造される。その後、このベンズアルデヒドを適切な亜リン酸ジアルキルと反応させ、ホスホン酸部分を鹸化すると式Ｉの化合物が得られる。上記方法の出発材料は市販品又は文献から公知である。本発明の化合物は、同様に本発明の範囲に含まれる種々の無機及び有機の酸及び塩基と共に塩を形成する。このような塩はアンモニウム塩、ナトリウム及びカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム及びマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、有機塩基との塩（例えばジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル− Ｄ−グルカミン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸との塩）を含む。生理的に許容可能な非毒性塩が好適であるが、例えば生成物を単離又は精製するには他の塩も有用である。塩は、該塩が不溶性の溶媒もしくは媒体中又は後で減圧もしくは凍結乾燥により除去する水などの溶媒中で生成物の遊離酸形態を１当量以上の適当な塩基と反応させるか、あるいは適切なイオン交換樹脂上で存在する塩のカチオンを別のカチオンに交換するなどの慣用手段により形成することができる。官能基を介して本発明の一般式Ｉの化合物を誘導体化し、親化合物にｉｎｖｉｖｏ逆変換可能なプロドラッグ誘導体を提供し得ることも理解されよう。プロドラッグ投与の概念は文献に広く記載されている（例えばＡ．Ａ．Ｓｉｎｋｕｌａ，ＡｎｎｕａｌＲｅｐｏｒｔｓｉｎＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０巻，Ｒ．Ｖ．Ｈｅｉｎｚｅｌｍａｎ編，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ−Ｌｏｎｄｏｎ，１９７５，３１章，ｐｐ．３０６−３２６；Ｈ．Ｆｅｒｒｅｓ，ＤｒｕｇｓｏｆＴｏｄａｙ，１９：４９９−５３８（１９８３）及びＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１８：１７２（１９７５））。投与方法及び医薬組成物本発明の式Ｉの化合物は種々の形態のホスホリパーゼＣの酵素活性を阻害することができるので、慢性関節リウマチ、気腫、気管支炎症、骨関節炎、脊椎炎、狼瘡、乾癬、急性呼吸障害症候群、痛風、リウマチ熱などの疾患で炎症を緩和し、疼痛を軽減するために使用することができる。更に、該化合物は癌、特に原発ヒト乳癌などのようにホスホリパーゼＣに関連する所定の形態の癌を治療するために使用することができる。式Ｉの化合物をｉｎｖｉｖｏで使用する場合には、医薬的に許容可能な慣用非毒性キャリヤーを含有する投与単位製剤としてこのような化合物を経口、局所、非経口、吸入スプレー又は直腸投与することができる。従って、本発明は医薬的に許容可能なキャリヤーと共に式Ｉの化合物を含有する医薬組成物も提供する。本明細書中で使用する非経口なる用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射又は注入法を包含する。本発明の化合物はマウス、ラット、ウマ、イヌ、ネコなどの哺乳動物の治療に加え、ヒトの治療にも有効である。本発明の医薬組成物は式Ｉの化合物と投与経路に適した医薬キャリヤーとを含有する。この型の医薬組成物の標準調製方法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載されている。活性成分を含有する医薬組成物は錠剤、トローチ剤、甘味入り錠剤、水性もしくは油性懸濁液、分散性散剤もしくは粒剤、エマルジョン、硬質もしくは軟質カプセル、又はシロップもしくはエリキシル剤などの経口用に適した剤形であり得る。経口用組成物は当業者に公知の任意の医薬組成物製造方法により製造することができ、このような組成物は医薬的にエレガントで美味な製剤を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤及び保存剤から構成される群から選択される１種以上の添加剤を含有し得る。経口用製剤の１例は、医薬的に許容可能な非毒性賦形剤との混合物として活性成分を含有する錠剤である。これらの賦形剤は例えば不活性希釈剤（例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウム）、造粒剤及び崩壊剤（例えばトウモロコシ澱粉又はアルギン酸）、結合剤（例えば澱粉、ゼラチン又はアラビアゴム）、並びに潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルク）であり得る。錠剤はコーティングしなくてもよいし、公知技術によりコーティングし、胃腸管内での崩壊及び吸収を遅らせ、長時間持続作用を提供するようにしてもよい。例えば、グリセリルモノステアレート又はグリセリルジステアレートなどの時間遅延剤を使用することができる。経口用製剤は更に、活性成分を例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリンなどの不活性固体希釈剤と混合した硬質ゼラチンカプセルの形態でもよいし、活性成分を水又は例えば落花生油、液体パラフィンもしくはオリーブ油などの油性媒体と混合した軟質ゼラチンカプセルの形態でもよい。典型的錠剤又はカプセルは下記成分を含有し得る。本発明の医薬組成物は水中油エマルジョンの形態でもよい。油相は例えばオリーブ油又は落花生油などの植物油でもよいし、例えば液体パラフィンなどの鉱油でもよいし、その混合物でもよい。適切な乳化剤は天然産ガム（例えばアラビアゴム又はトラガカントゴム）、天然産ホスファチド（例えば大豆レシチン）、及び脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導される部分エステル（例えばソルビタンモノオレエート）や、前記部分エステルとエチレンオキシドの縮合産物（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）を含むエステルであり得る。エマルジョンは甘味剤や香味剤も含有し得る。シロップ及びエリキシル剤には例えばグリセロール、ソルビトール又はスクロースなどの甘味剤を配合し得る。このような製剤は粘滑剤、保存剤、香味剤及び着色剤も含有し得る。医薬組成物は注射可能な滅菌水性又は油性懸濁液の形態でもよい。この懸濁液は、適切な上記分散剤、湿潤剤及び懸濁剤を用いて公知技術により調製することができる。非経口組成物は慣用懸濁液、溶液、エマルジョン又は再構成用固体形態として調製される。適切なキャリヤーは水、食塩水、デキストロース、ハンク液、リンゲル液、グリセロールなどである。非経口投与は通常は皮下、筋肉内又は静脈内注射により行われる。注射可能な滅菌製剤は非経口投与用として許容可能な非毒性希釈剤又は溶剤中の注射可能な滅菌溶液又は懸濁液であり得る。使用し得る許容可能なベヒクル及び溶剤としては、水、１，３−ブタンジオール、リンゲル液及び等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。この他に、滅菌不揮発油も溶剤又は懸濁媒体として一般に使用されている。この目的では合成モノ又はジグリセリドを含む任意の無刺激性不揮発油を使用し得る。オレイン酸などの脂肪酸も注射可能製剤の調製に使用される。式Ｉの化合物は薬剤を直腸投与するために坐剤形態で投与することもできる。これらの組成物は、常温では固体であるが直腸温度で液体であり、従って直腸中で融解して薬剤を放出する適切な非刺激性賦形剤（例えばココアバターやポリエチレングリコール）と薬剤を混合することにより調製することができる。式Ｉの化合物をｉｎｖｉｖｏで使用する場合には、約０．２ｍｇ〜約３００ｍｇ、好ましくは約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日程度の用量レベルが有用である。水性懸濁液は通常は適当な賦形剤との混合物として活性物質を含有する。このような賦形剤は懸濁剤（例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアラビアゴム）、分散剤又は湿潤剤（例えばレシチンなどの天然産ホスファチド）、アルキレンオキシドと脂肪酸化物の縮合産物（例えばポリオキシエチレンステアレート）、エチレンオキシドと長鎖脂肪アルコールの縮合産物（例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール）、脂肪酸及びヘキシトールから誘導される部分エステルとエチレンオキシドの縮合産物（例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、又は脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとエチレンオキシドの縮合産物（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）である。水性懸濁液は更に１種以上の保存剤（例えばエチル、ｎ−プロピル又はｐ−ヒドロキシベンゾエート）、１種以上の着色剤、１種以上の香味剤及び１種以上の甘味剤（例えばスクロース又はサッカンリン）を含有し得る。油性懸濁液は、活性成分を植物油（例えば落花生油、オリーブ油、ゴマ油又はヤシ油）又は鉱油（例えば液体パラフィン）に懸濁することにより調製することができる。油性懸濁液は例えば蜜ろう、硬質パラフィン又はセチルアルコールなどの増粘剤も含有し得る。美味な経口製剤を提供するために上記のような甘味剤及び香味剤も添加し得る。これらの組成物はアスコルビン酸などの酸化防止剤を添加して保存処理し得る。水を加えて水性懸濁液を調製するのに適した分散性散剤及び粒剤は、活性成分と分散剤又は湿潤剤、懸濁剤及び１種以上の保存剤の混合物を提供する。適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤の具体例は上記の通りである。例えば甘味剤、香味剤及び着色剤などの付加的賦形剤も配合し得る。局所投与用医薬組成物はロウ膏、クリーム、軟膏、スプレー、散剤などの形態であり得る。このような組成物には標準医薬キャリヤーを使用し得る。好ましくは、局所投与用組成物は０．０５〜５％の活性成分を含有する。典型的な局所クリーム製剤は下記成分を含有し得る。典型的な軟膏製剤は下記成分を含有し得る。本発明の化合物は、本明細書中に記載する医薬組成物及び方法でステロイド又は非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）などの他の公知抗炎症／免疫抑制剤と併用することができる。上記症状の治療には０．２ｍｇ〜１４０ｍｇ／ｋｇ体重／日（１０ｍｇ〜７ｇ／患者／日）のオーダーの用量レベルが有用である。例えば化合物約０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重／日（２５ｍｇ〜３．５ｇ／患者／日）を投与すると炎症が有効に治療され、抗発熱及び鎮痛作用が発現される。好ましくは、約２ｍｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日（５０ｍｇ〜１ｇ／患者／日）の用量を使用すると、有効な結果が得られる。同様に、所定の形態の癌の治療には約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日を投与する。単一投与形態を製造するためにキャリヤー材料と組み合わせ得る活性成分の量は治療する宿主及び特定の投与方法により異なる。例えばヒトに経口投与するための製剤は、組成物全体の約５〜９５％に相当し得る適当な量のキャリヤー材料に５ｍｇ〜５ｇの活性物質を配合し得る。投与単位形態は一般に約２５ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を含有する。任意の特定患者の特定用量レベルは通常は処方医師によって決定され、使用する特定化合物の活性、年齢、体重、一般健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄頻度、併用薬剤及び治療する特定疾患の重篤度を含む種々の因子によって異なる。実験手順実施例１１−ヒドロキシ−１−（３−（３−クロロフェノキシ）フェニル）メチルホスホン酸ステップＡ：３−（３−クロロフェノキシ）ベンズアルデヒド３−ブロモベンズアルデヒド（６．０ｇ）、３−クロロフェノール（４．８ｇ）、水素化ナトリウム（油中８０％懸濁液１．３ｇ）及び塩化第１銅（１ｇ）の混合物を窒素ガス雰囲気下にピリジン（１２５ｍｌ）中で１６時間加熱還流した。混合物を冷却し、水で希釈し、塩酸で酸性化し、ジエチルエーテルで抽出した。エーテル抽出物を脱水（Ｎａ₂ＳＯ₄）し、濃縮し、酢酸エチル−石油エーテル（１：９）を溶離剤としてシリカゲル上でクロマトグラフィーにより精製し、標記化合物を無色油状物として得た。ステップＢ：１−ヒドロキシ−１−（３−（３−クロロフェノキシ）フェニル）メチルホスホン酸ジメチル上記アルデヒド（１．５ｇ）をトリエチルアミン（０．９ｍｌ）と亜リン酸ジメチル（０．８９ｍｌ）の混合物中で２４時間撹拌した。混合物を減圧蒸発させ、酢酸エチルから結晶させ、標記化合物を白色固体として得た。ステップＣ：１−ヒドロキシ−１−（３−（３−クロロフェノキシ）フェニル）メチルホスホン酸ステップＢのホスホン酸エステル（０．５ｇ）を臭化トリメチルシリル（０．９６ｍｌ）で１６時間処理した後、混合物を減圧蒸発させ、残渣をメタノール（５ｍｌ）に１０分間溶解した。溶液を濃縮し、残渣を水に溶解し、凍結乾燥して標記化合物を白色固体として得た。¹ＨＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ｄ６ＤＭＳＯ）δ４．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４Ｈｚ），６．９１− ６．９７（２Ｈ，ｍ），７．０２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．２Ｈｚ），７．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），７．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），７．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．３２−７．４０（２Ｈ，ｍ）。適当に置換したフェノールを用いて実施例１の方法により実施例２〜７の化合物を調製した。実施例２１−ヒドロキシ−１−（３−フェノキシフェニル）メチルホスホン酸 ¹ＨＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ）δ４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ），７．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．０８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ），７．２０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．３８−７．４５（３Ｈ，ｍ）。実施例３１−ヒドロキシ−１−（３−（３，４−ジクロロフェノキシ）フェニル）メチルホスホン酸 ¹ＨＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ｄ₆ＤＭＳＯ）δ４．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ），６．９４−７．０１（２Ｈ，ｍ），７．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），７．２３−７．２５（２Ｈ，ｍ），７．３５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ）。実施例４１−ヒドロキシ−１−（３−（４−クロロフェノキシ）フェニル）メチルホスホン酸 ¹ＨＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ｄ₆ＤＭＳＯ）δ４．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ），６．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），７．００−７．０２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．１及び８．９Ｈｚ），７．０９（１Ｈ，ｓ），７．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），７．３１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），７．３９−７．４２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．１及び８．９Ｈｚ）。実施例５１−ヒドロキシ−１−（３−（２−クロロフェノキシ）フェニル）メチルホスホン酸 ¹ＨＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ｄ₆ＤＭＳＯ）δ４．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ），６．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．０３−７．０６（２Ｈ，ｍ），７．１７−７．２１（２Ｈ，ｍ），７．２７−７．３６（２Ｈ，ｍ），７．５８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０及び１．６Ｈｚ）。実施例６１−ヒドロキシ−１−（３−（４−メトキシフェノキシ）フェニル）メチルホスホン酸 ¹ＨＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ｄ₆ＤＭＳＯ）δ３．７４（３Ｈ，ｓ），４．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ），６．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．９３−７．０２（５Ｈ，ｍ），７．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．２３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）。実施例７１−ヒドロキシ−１−（３−（４−メチルフェノキシ）フェニル）メチルホスホン酸 ¹ＨＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ｄ₆ＤＭＳＯ）δ２．２８（３Ｈ，ｓ），４．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ），６．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），６．９０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），７．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），７．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．１７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），７．２７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ）。実施例８１−ヒドロキシ−１−（３−（４−ヒドロキシフェノキシ）フェニル）メチルホスホン酸４−メトキシフェノールを用いて実施例１Ａ）及び１Ｂ）の方法により１−ヒドロキシ−１−（３−（４−メトキシフェノキシ）フェニル）メチルホスホン酸ジメチルを調製した。この化合物（１５０ｍｇ）を窒素雰囲気下に−７８℃で無水ジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶解し、この溶液を三臭化ホウ素（ジクロロメタン中１Ｍ溶液４ｍｌ）で処理した。溶液を２０℃まで昇温させた後、減圧濃縮した。残渣を臭化トリメチルシリル（１．２ｍｌ）で３時間処理した後、濃縮してメタノールに溶解した。１０分後に溶液を減圧濃縮した。残渣を水に溶解し、凍結乾燥して標記化合物を白色固体として得た。¹ＨＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ）δ４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ），６．８８−７．０２（５Ｈ，ｍ），７．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），７．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．３７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）。実施例９１−ヒドロキシ−１−（４−（３−クロロフェノキシ）フェニル）メチルホスホン酸ステップＡ：４−（３−クロロフェノキシ）ベンズアルデヒド３−クロロフェノール（１．９ｇ）を窒素雰囲気下に１１０℃で４−フルオロベンズアルデヒド（１．８ｇ）及び水素化ナトリウム（油中８０％懸濁液０．４６ｇ）と共に１６時間撹拌した。溶液を水で希釈し、ジエチルエーテルで抽出した。エーテル抽出物を脱水（Ｎａ₂ＳＯ₄）し、濃縮し、酢酸エチル−石油エーテル（１：９）を溶離剤としてシリカゲル上でクロマトグラフィーにより精製し、標記化合物を無色油状物として得た。ステップＢ：１−ヒドロキシ−１−（４−（３−クロロフェノキシ）フェニル）メチルホスホン酸実施例１Ｂ）及び１Ｃ）の方法を使用して４−（３−クロロフェノキシ）ベンズアルデヒドから標記化合物を調製した。¹ＨＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ｄ₆ＤＭＳＯ）δ４．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ），６．９２−７．０２（４Ｈ，ｍ），７．１５−７．１８（１Ｈ，ｍ），７．３７−７．４６（３Ｈ，ｍ）。実施例１０１−ヒドロキシ−１−（４−（３−エチルフェノキシ）フェニル）メチルホスホン酸３−エチルフェノールを用いて実施例９の方法により標記化合物を調製した。¹ ＨＮＭＲ（３０ＯＭＨｚ，ｄ₄ＭｅＯＨ／ＣＤＣｌ₃）δ１．２１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．６１（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），４．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），６．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．１及び８．０Ｈｚ），６．８４（１Ｈ，ｓ），６．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），６．９７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．２２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．４６（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．８及び８．６Ｈｚ）。実施例１１１−ヒドロキシ−１−（４−（３−メトキシフェノキシ）フェニル）メチルホスホン酸３−メトキシフェノールを用いて実施例９の方法により標記化合物を調製し、メタノールと酢酸エチルの混合物中でシクロヘキシルアミンで処理し、次いで濾過及び脱水することによりビスシクロヘキシルアンモニウム塩に変換した。¹ＨＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ）δ１．１４−１．４０（１０Ｈ，ｍ），１．６３−１．６７（２Ｈ，ｍ），１．７７−１．８１（４Ｈ，ｍ），１．９６ −１．９９（４Ｈ，ｍ），３．０９−３．１６（１Ｈ，ｍ），３．８０（３Ｈ，ｓ），４．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ），６．７１−６．７３（２Ｈ，ｍ），６．７８−６．８１（１Ｈ，ｍ），７．０６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．３２−７．３７（１Ｈ，ｍ），７．４８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）。実施例１２ホスホリパーゼＣγの阻害を評価するアッセイ手順概要コンピテントＤＨ５α細胞（サブクローニング効率）はＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から入手した。コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）細胞はＮｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入した。ＰＣＲ突然変異誘発は文献手順（Ｈｉｇｕｃｈｉ，１９９０）に従って実施した。一般クローニングベクターｐＢＳII（Ｓ／Ｋ）＋はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）から入手した。ｐＴ５Ｔは文献の記載に従って構築した（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，１９９０）。ＤＮＡ配列決定はジデオキシ鎖終結法（Ｓａｎｇｅｒら，１９７７）を用いて遺伝子の該当部分の配列修飾毎に実施し、野生型ｃＤＮＡへの変異を確認した。文献に記載されているように標準ＤＮＡ操作を実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）。オリゴヌクレオチドＭｉｄｌａｎｄＣｅｒｔｉｆｉｅｄＲｅａｇｅｎｔＣｏ．（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ）から合成デオキシリボヌクレオチドを入手した。オリゴヌクレオチドの配列（５’→３’）は以下の通りである。ＰＬＣ−γコーディング配列のサブクローニングラット脳ポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型として用いて文献手順（Ｓａｎｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ）によりラット脳ｃＤＮＡを合成した。報告されているラット脳ＰＬＣ−γ₁のｃＤＮＡ配列（Ｓｕｈ，Ｐ．−Ｇ．，Ｒｙｕ，Ｓ．Ｈ．，Ｍｏｏｎ，Ｋ．Ｈ．，Ｓｕｈ，Ｈ．Ｗ．，＆Ｒｈｅｅ，Ｓ．Ｇ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５４１９−５４２３）からＰＬＣ−γ₁遺伝子の５’末端に相補的な配列の上流にＢａｍＨＩ制限部位を含むＰＣＲプライマー（プライマー０１）と、ＰＬＣ−γ遺伝子の３’末端の下流にＨｉｎｄIII部位を含むＰＣＲプライマー（プライマー０４）を合成した。上記ラット脳ｃＤＮＡと共に鋳型としてこれらのプライマー（０１及び０４）を用いてＰＣＲを実施し、５’ＢａｍＨＩ部位と３’ＨｉｎｄIII部位で挟まれた完全ラット脳ＰＬＣ−γ₁コーディング配列をもつＤＮＡフラグメントを生成する。ＰＬＣ −γのコーディング配列を含むこのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントをｐＢＳII（Ｓ／Ｋ）＋にサブクローニングし、ｐＰＬＣ１を生成した。その後の操作はＰＣＲを用いて実施し、適当なＤＮＡフラグメントを生成した。Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｐ．，Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｊ．，Ａｒｅｎｄ，Ｗ．Ｐ．，Ｖｅｒｄｅｒｂｅｒ，Ｅ．，Ｂｒｅｗｅｒ，Ｍ．Ｔ．，Ｈａｎｎｕｍ，Ｃ．Ｈ．，＆Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｃ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３４３：３４１−３４６に記載されているように、ＰＬＣ−γ₁の発現物を最終的に翻訳によってｐＴ５Ｔベクターのφ１０遺伝子に結合する配列と新しいＢａｍＨＩ部位とを含むようにＰＬＣ−γ₁遺伝子の５’末端を改変した。プライマー０１及び０２を使用して５’ＢａｍＨＩ部位と３’ＥｃｏＲＩ部位を含む５０８ｂｐフラグメントを（鋳型ＤＮＡｐＰＬＣ１から）生成した。ｐＰＬＣ１の類似フラグメントをこの新しい制限フラグメントに置換え、ｐＰＬＣ２を生成した。ｐＰＬＣ２を鋳型とし、第１の当然変異体フラグメントを生成するためにプライマー０３−０５、第２の突然変異体フラグメントを生成するためにプライマー０４−０６を用いてＰＣＲによる突然変異誘発を利用して３’末端を再構築し、（モノクローナル抗体ＹＬ１／２により認識される）エピトープタグＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ（Ｋｉｌｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｖ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｂ．，＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９８２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９３：５７６− ５８２）をコードするＤＮＡ配列を付加し、アミノ酸９４４〜９４５位と１２７９〜１２８０位のタンデムＡＧＧ−ＡＧＧコドンをＣＧＧ−ＣＧＧに改変した。タンデムＡＧＧコドンは大腸菌におけるタンパク質の不良な発現に関連する（Ｂｏｎｅｋａｍｐ，Ｆ．，＆Ｊｅｎｓｅｎ，Ｋ．（１９８８）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７：３０１３−３０２４）。これらのＰＣＲの各々から単離した突然変異体フラグメントを集めて鋳型として使用し、プライマー０３−０６を用いて最終ＰＣＲを実施し、制限酵素消化後にＳｐｈＩ及びＨｉｎｄIIIフラグメントを生成し、ｐＰＬＣ２中の類似フラグメントをこれらのフラグメントに置換えた。得られたプラスミドｐＰＬＣ３はＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメント上にＰＬＣ−γ₁遺伝子のコーディング配列を含み、３’末端のＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅタグをコードする配列と改変ＡＧＧコドンを含んでいた。図３は酵素をコードする最終ｃＤＮＡ配列とそのエピトープタグを示す（配列番号３）。最後にｐＰＬＣ３からのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄII IフラグメントをｐＴ５ＴのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII部位に移入し、ｐＴ５Ｔ− ＰＬＣ４を生成した。この構築物を用いてｐＴ５Ｔベクターでｐ１０タンパク質の発現物に翻訳によって結合したＰＬＣ−γ₁（Ｃ末端にＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅエピトープタグを含む）を生成した。ＰＬＣ−γ₁の発現及び精製ＰＬＣ−γ₁を発現させるために、プラスミドｐＴ５Ｔ−ＰＬＣ４を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。５５０ｎｍにおける培養物の光学密度が０．８に等しくなるまで、形質転換した細胞をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）とテトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で２０℃で増殖させた。この形質転換細菌細胞はＡＴＣＣに寄託し、受託番号ＡＴＣＣ６９４２１を付された。次にイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（最終濃度０．５ｍＭ）を培養物に加えることによりＰＬＣ− γ₁の発現を誘発した。更に６時間増殖後、細胞を回収し、ＰＬＣ−γ₁を以下のように精製した。細胞ペレットを５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＣａＣｌ₂、１ｍＭＥＧＴＡ、５ｍＭＤＴＴ、５ｍＭ硫酸ストレプトマイシン、１ｍＭＰＭＳＦ、２μｇ／ｍｌロイペプチン、２μｇ／ｍｌアンチパイン、１０μｇ／ｍｌアプロチニンからなる標準緩衝液に再懸濁（約５ｇ湿潤充填細胞／１０ｍｌ緩衝液）することによりＰＬＣ−γを大腸菌から単離した。再懸濁した細胞を音波処理によって破壊し、細胞破片を４ ℃で３０分間３０，０００×ｇで遠心してペレット化した。可溶性フラクションを臭化シアノゲンで活性化したＳｅｐｈａｒｏｓｅに結合したモノクローナル抗体ＹＬ１／２（４ｍｇ抗体／ｍｌ樹脂）の２ｍｌカラムに約０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で加えた。エピトープタグＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅと結合するＹＬ１／２Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムは標準緩衝液で予め平衡化しておいた。タンパク質をカラムに充填後、カラムを標準緩衝液（１００ｍｌ）で洗浄し、ＰＬＣ−γを標準緩衝液中５ｍＭＡｓｐ− Ｐｈｅジペプチド（Ｓｉｇｍａ）３×５ｍｌで溶離した。カラムをリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）＋２ＭＮａＣｌで洗浄して再生した後、ＰＢＳ＋０．０２％ＮａＮ₃（ｗｔ／ｖｏｌ）に浸して保存した。出発時の総可溶性大腸菌タンパク質を基にして０．０５〜０．５％の収率で＞８０％純度のＰＬＣ−γ₁を得た。場合によってはＰＬＣ−γ₁を更に精製した。これは通常の薬剤スクリーニングには不要である。ＰＬＣ−γ₁を更に精製するために、ＹＬ１／２カラムから溶離したタンパク質を、緩衝液Ａを標準緩衝液とし且つ緩衝液Ｂを標準緩衝液＋１ＭＫＣｌとしてＭｏｎｏＱＨＲ１０−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でＨＰＬＣによりクロマトグラフィーにかけた。４０分間に０→３０％Ｂ、５０分間に３０→５０％Ｂ、７０分間に５０→１００％Ｂの勾配を用いてカラムを１ｍｌ／ｍｉｎで溶離した。ＰＬＣ−γ₁は約２５〜３０％Ｂで溶出した。精製ＰＬＣ−γ₁活性のアッセイ精製ＰＬＣ−γ₁の活性を３０℃でアッセイした。制限基質を基にして完了度が１０％を越えるまで反応が進行しないようにした。典型的反応混合物は、５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．１％デオキシコレート、３ｍＭＣａＣｌ₂、１ｍＭＥＧＴＡ、０．１ｍＭＤＴＴ及び基質としてホスファチジルイノシトール（１〜１０００μＭ）（ＰＩ）と０．０２μＣｉ［³Ｈ］ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）を含有していた。リン脂質成分を温和な窒素流下に乾燥し、アッセイ緩衝液に再懸濁した。次に基質混合物を渦形成及び音波処理（プローブ音波処理装置を用いて１０秒間）し、脂質を分散させ、ミセルを形成した。酵素の不在下でアッセイ混合物を熱によって予備平衡化後、ＰＬＣ−γ₁を加えて反応を開始した。１／４容量の１ＮＨＣｌ、５ｍＭＥＧＴＡを加えて０．２ｍｌアリコートを含む反応混合物の反応を停止し、氷浴に移した。次に反応を停止した混合物をＱセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに濾過した。Ｑセファロースカラムを調製するには、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅスラリー１ｍｌを使い捨てプラスチックカラムに加える。１０ｍＭＮＨ₄Ｈ₂ＰＯ₄（ｐＨ３．５）２０ｍｌに通じることにより樹脂を平衡化する。典型的には２００μｌの反応停止混合物をカラムに加え、１０ｍＭＮＨ₄Ｈ₂ＰＯ₄（ｐＨ３．５）３ｍｌを加え、この段階からの流出液をシンチレーションバイアルに集め、シンチレーション液１０ｍｌと混合し、ＢｅｃｋｍａｎＬＳ３８０１シンチレーションカウンターで計数する。本発明の化合物の阻害活性のアッセイ酵素を加える前に上記アッセイ混合物に既知濃度の式Ｉの化合物を加えることにより、ＰＬＣ−γ₁に対する式Ｉの化合物の阻害活性を評価した。アッセイから計算した相対阻害濃度を表１及び２に示す。実施例１３ホスホリパーゼＣ−β及びδの阻害を評価するアッセイ手順ウシ脳からのホスホリパーゼＣ−β及びδの精製ＰＬＣ−βはＳ．Ｇ．Ｒｈｅｅら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１９７：５０２ −５１１（１９９１）に記載されているようにして得られる。特にＰＬＣ−δはウシ脳のサイトゾルフラクションから精製し、ＰＬＣ−βは主に粒状フラクションから得られる。もっとも、ＰＬＣ−βの粒状形態とサイトゾル形態はアミノ酸配列が同一であるので、サイトゾルＰＬＣ−δの精製中にプールしたＰＬＣ−β を含むフラクションを粒状フラクションからのＰＬＣ−βフラクションと合わせる。合計３６個のウシ脳を精製に用いる。１２個の脳を一度に処理する。ステップ１：サイトゾルフラクションと粒状フラクションの分離１２個のウシ脳を地方の畜殺場から新たに入手し、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭＥＧＴＡ、２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）及び０．１ｍＭＤＴＴを含有する緩衝液６．６リットルを用いてＷａｒｉｎｇブレンダーで大脳（３．３ｋｇ）を均質化する。ホモジネートを３０分間１３，０００×ｇで４℃で遠心する。沈殿と上清の両者をそれぞれステップ２及び３に備えて保存する。ステップ２：粒状フラクションからの抽出物の調製ステップ１からの沈殿を同一均質化緩衝液（６．６リットル）に再懸濁し、再び均質化して細胞を完全に破壊する。ホモジネートを１３，０００×ｇで３０分間遠心する。ペレットを洗浄して均質化緩衝液中２ＭＫＣｌに懸濁し、４℃で２時間撹拌する。次に懸濁液を１３，０００×ｇで９０分間遠心する。固体塩を加えて上清を６０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄飽和にする。この懸濁液を１３，０００× ｇで３０分間遠心し、ペレットを均質化緩衝液５００ｍｌに懸濁し、懸濁液を均質化緩衝液に対して一晩透析する。透析した溶液を１３，０００×ｇで３０分間遠心して不溶性粒子を除去し、まだかなり濁っている上清を−２０℃に維持し、他の２回の同様の調製物からの透析溶液と合わせる。ステップ３：サイトゾル抽出物の調製ステップ１からの上清に１Ｍ酢酸を加えてｐＨ４．８に調節する。４℃で３０分後、遠心により沈殿を集め、均質化緩衝液１リットルに溶解する。不溶分を１３，０００×ｇで３０分間遠心してペレット化し、濁った上清を除去してステップ４に備える。ステップ４：ＤＥＡＥ−セルロース上のイオン交換クロマトグラフィー２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭＥＧＴＡ、０．１ｍＭＤＴＴで平衡化しておいたＤＥ−５２ＤＥＡＥ−セルロース（ＷｈａｔｍａｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，ＵＫ）カラム（８×４０ｃｍ）にステップ３からの上清を加える。５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭＥＧＴＡ及び０．１ｍＭＤＴＴ中０→２２５ｍＭＫＣｌの６リットル直線ＫＣｌ勾配を用いてカラムを溶離する。３個のＰＬＣ活性ピークが溶出し、これらのピークフラクションを別々にプールする。ＰＬＣ−δを含む第１のピークを次のステップで直接更に精製する。ＰＬＣ−βを含む第２のピークフラクションは約１００ｍｌまで濃縮し、ステップ２からの粒状フラクションの抽出物と合わせる。ＰＬＣ−γを含む第３のピークフラクションは廃棄する。ＰＬＣ−δの精製ステップ５：ＰＬＣ−δのヘパリン−アガロースクロマトグラフィー前ステップからプールしたＰＬＣ−δフラクション（７５０ｍｌ）を２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、０．１ｍＭＤＴＴ及び１ｍＭＥＧＴＡで平衡化したヘパリン−アガロースカラム（５×１５ｃｍ）に直接加える。平衡化緩衝液中１００→７００ｍＭＮａＣｌの１．８リットルＮａＣｌ直線勾配を用いてカラムを溶離する。ピークフラクション（２４０ｍｌ）をプールし、Ａｍｉｃｏｎ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）濾過装置で約１０ｍｌまで濃縮し、凍結保存して他の２回の同様の調製物からのＰＬＣ−δの濃縮フラクションと合わせる。ステップ６：ＴＳＫフェニル−５−ＰＷ上のＰＬＣ−δ の逆相クロマトグラフィーステップ５からの混合濃縮フラクション（３５ｍｌ）に固体ＫＣｌを加えて最終濃度を３Ｍとし、混合物を遠心して変性タンパク質を除去する。２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、３ＭＫＣｌ、１ｍＭＥＧＴＡ及び０．１ｍＭＤＴＴで平衡化した高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分取ＴＳＫフェニル−５−ＰＷカラム（２１．５×１５０ｍｍ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）に５．０ｍｌ／ｍｉｎの流速で上清を加える。１０分間に３→１．２ＭＫＣｌの減少ＫＣｌ勾配と２０分間に１．２ →０ＭＫＣｌの減少ＫＣｌ勾配を用いて５．０ｍｌ／ｍｉｎで溶離を続ける。ＰＬＣ活性を含むフラクション（２５ｍｌ）をプールし、２０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．７）、０．１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＥＧＴＡを用いてＡｍｉｃｏｎ濾過装置で洗浄し、最終的に約１０ｍｌまで濃縮する。ステップ７：ＭｏｎｏＳカラム上のＰＬＣ−δのイオン交換クロマトグラフィーステップ６からの洗浄タンパク質溶液（〜１０ｍｌ）を２０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ５．７）、０．１ｍＭＤＴＴ及び１ｍＭＥＧＴＡで平衡化したＭｏｎｏＳカラム（７０×６ｍｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に１．０ｍｌ／ｍｉｎの流速で加える。２０分間に０→３００ｍＭＮａＣｌ及び１０分間に３００ｍＭ→１ＭのＮａＣｌ勾配を用いて１．０ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶離を続ける。ピークフラクション（１．２ｍｌ）を手作業で集め、２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）２ｍｌで希釈し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎマイクロコンセントレーター（Ａｍｉｃｏｎ）で約０．５ｍｌまで濃縮し、アリコートに分離し、−２０℃で保存する。収率２〜４％で合計０．３〜０．６ｍｇの均質ＰＬＣ−δが得られる。ＰＬＣ−βの精製ステップ８：ＤＥＡＥ−セルロース上のＰＬＣ−βのイオン交換クロマトグラフィーステップ２及び３からの合計タンパク質溶液は濁っているため、ＤＥＡＥ−セルロースカラムで直接クロマトグラフィーにかけることができない。そこで、バッチ手順後にカラム段階を実施する２段階ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィーを用いる。バッチ段階では、５ｍＭＥＧＴＡと０．１ｍＭＤＴＴを含有する２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース２リットルに合計タンパク質を全て吸収させる。ＤＥＡＥ−セルローススラリーを撹拌後、４リットル容焼結ガラス（粗目）濾過用漏斗で集める。濁った脂質分と未結合タンパク質が除去されるまでＤＥＡＥ−セルロースを平衡化緩衝液で洗浄する。カラム手順のために、洗浄したＤＥＡＥ −セルロースを濾過用漏斗から取り出し、平衡化緩衝液と混合し、平衡化したＤＥＡＥ−セルロースの１０ｃｍ高ベッドを既に含むカラムに注ぐ（最終寸法８× ４５ｃｍ）。５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭＥＧＴＡ及び０．１ｍＭＤＴＴを含有する０→３００ｍＭＫＣｌ緩衝液の８リットル直線勾配を用いて８ｍｌ／ｍｉｎの流速でカラムを溶離する。活性ピークは１１０ｍＭのＫＣｌ濃度で溶出する。ピークフラクション（６００ｍｌ）をプールする。ステップ９：ＰＬＣ−βのヘパリン−アガロースクロマトグラフィー２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭＮａＣｌ、０．１ｍＭＤＴＴ及び１ｍＭＥＧＴＡで平衡化したヘパリン−アガロースカラム（５×２５ｃｍ）にステップ８からのプールしたフラクション（６００ｍｌ）を加える。平衡化緩衝液１．５リットル中１００→５００ｍＭＮａＣｌの直線勾配を用いてカラムを溶離する。ピークフラクション（３１０ｍｌ）をプールし、Ａｍｉｃｏｎフィルターで２７ｍｌまで濃縮する。ステップ１０：ＴＳＫフェニル−５−ＰＷ上のＰＬＣ− βの逆相クロマトグラフィーステップ９からの濃縮フラクションに固体ＫＣｌを加えて濃度を３Ｍとし、混合物を遠心して変性タンパク質を除去する。２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、３ＭＫＣｌ、１ｍＭＥＧＴＡ及び０．１ｍＭＤＴＴで平衡化したＨＰＬＣ分取フェニル−５−ＰＷカラム（１５０×２１５ｍｍ）に５ｍｌ／ｍｉｎの流速で上清を加える。１５分間に３→１．２Ｍの減少ＫＣｌ勾配と２０分間に１．２→０Ｍの減少勾配を用いて５ｍｌ／ｍｉｎで溶離を続ける。次にＫＣｌを含まない緩衝液でカラムを洗浄する。ＰＬＣ活性の２つのピークの各々を含むフラクション（フラクションＭ１は１５ｍｌ及びフラクションＭ２は１３ｍｌ）を別々に集める。プールした溶液をＫＣｌを含まない２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）で洗浄し、Ａｍｉｃｏｎフィルター濃縮操作で５ｍｌまで濃縮する。ＳＤＳ −ポリアクリルアミドゲル上で分析すると、フラクションＭ１及びＭ２はそれぞれ１５０ｋＤａ（ＰＬＣ−β₁）及び１４０ｋＤａ（ＰＬＣ−β₂）形態のＰＬＣを含むことが判明する。この２形態は免疫的に区別できない。ＰＬＣ−β₂がＰＬＣ−β₁のタンパク分解フラグメントであるか又はスプライシングの態様が異なるｍＲＮＡの産物であるかは不明である。約１５ｍｇのＰＬＣ−β₁と８ｍｇのＰＬＣ−β₂が得られる。本発明の化合物の阻害活性のアッセイ酵素の添加前に実施例１２のＰＬＣ− γの代わりに上記のように得たＰＬＣ−βを用いた以外は実施例１２に記載したアッセイ混合物と同様のアッセイ混合物に既知濃度の式Ｉの化合物を加えることにより、ＰＬＣ−βに対する式Ｉの化合物の阻害活性を評価した。アッセイから計算した相対阻害濃度を表３及び４に示す。酵素の添加前に実施例１２のＰＬＣ−γの代わりに上記のように得たＰＬＣ− δを用いた以外は実施例１２に記載したアッセイ混合物と同様のアッセイ混合物に既知濃度の式Ｉの化合物を加えることにより、ＰＬＣ−δに対する式Ｉの化合物の阻害活性を評価する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 9/99 9152−4ＢＣ１２Ｎ 9/99 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ (72)発明者マクラウド，アンガス・エムイギリス国、ハートフオードシヤー・シー・エム・23・４・ジエイ・イー、ビシヨツプス・ストーフオード、アボツツ・ウエイ・24 (72)発明者マーチヤント，ケビン・ジエイイギリス国、ハートフオードシヤー・シー・エム・23・３・ワイ・エル、ビシヨツプス・ストーフオード、レツド・ライオン・コート・29

Claims

【特許請求の範囲】１．構造式Ｉ：［式中、Ｒ¹及びＲ²は独立してａ）水素、及びｂ）から選択され、但しＲ¹が水素の場合にはＲ²は置換基ｂ）であり、Ｒ²が水素の場合にはＲ¹は置換基ｂ）であり、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶はａ）水素、ｂ）ハロゲン、ｃ）Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、ｄ）Ｃ₁−Ｃ₄アルコキシ、及びｅ）ヒドロキシから構成される群から独立して選択され、但しＲ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶のうちの少なくとも１個は水素以外の置換基であり、Ｒ³とＲ⁴は同時にメチルとならない］の化合物、又は医薬的に許容可能なその塩もしくはエステル。２．式：式中、を有する請求項１に記載の化合物。３．式：式中、を有する請求項１に記載の化合物。４．治療的に有効な量の請求項１に記載の化合物と医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する医薬組成物。５．阻害治療を必要とする非ヒト哺乳動物におけるホスホリパーゼＣの阻害方法であって、前記治療を必要とする非ヒト哺乳動物に治療的に有効な量の構造式Ｉ：［式中、Ｒ¹及びＲ²は独立してａ）水素、及びｂ）から選択され、但しＲ¹が水素の場合にはＲ²は置換基ｂ）であり、Ｒ²が水素の場合にはＲ¹は置換基ｂ）であり、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶はａ）水素、ｂ）ハロゲン、Ｃ）Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、ｄ）Ｃ₁−Ｃ₄アルコキシ、及びｅ）ヒドロキシから構成される群から独立して選択され、但しＲ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶のうちの少なくとも１個は水素以外の置換基であるか、又はＲ³とＲ⁴又はＲ⁴とＲ⁵は一緒になって−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂−ジラジカルを形成する］の化合物又は医薬的に許容可能なその塩もしくはエステルを投与する前記方法。６．化合物が下記化合物：式中、から選択される請求項５に記載のホスホリパーゼＣの阻害方法。７．化合物が下記化合物：式中、から選択される請求項５に記載のホスホリパーゼＣの阻害方法。８．化合物が下記化合物：から選択される請求項５に記載のホスホリパーゼＣの阻害方法。９．阻害治療を必要とする非ヒト哺乳動物におけるホスホリパーゼＣの阻害方法であって、前記治療を必要とする非ヒト哺乳動物に治療的に有効な量の請求項１に記載の化合物を投与する前記方法。１０．癌の治療を必要とする非ヒト哺乳動物における癌の治療方法であって、前記治療を必要とする非ヒト哺乳動物に治療的に有効な量の構造式Ｉ：［式中、Ｒ¹及びＲ²は独立してａ）水素、及びｂ）から選択され、但しＲ¹が水素の場合にはＲ²は置換基ｂ）であり、Ｒ²が水素の場合にはＲ¹は置換基ｂ）であり、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶はａ）水素、ｂ）ハロゲン、ｃ）Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、ｄ）Ｃ₁−Ｃ₄アルコキシ、及びｅ）ヒドロキシから構成される群から独立して選択され、但しＲ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶のうちの少なくとも１個は水素以外の置換基であるか、又はＲ³とＲ⁴又はＲ⁴とＲ⁵は一緒になって−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂−ジラジカルを形成する］の化合物又は医薬的に許容可能なその塩もしくはエステルを投与する前記方法。１１．治療する癌形態が乳癌である請求項１０に記載の非ヒト哺乳動物における癌の治療方法。１２．癌の治療を必要とする非ヒト哺乳動物における癌の治療方法であって、前記治療を必要とする非ヒト哺乳動物に治療的に有効な量の請求項１に記載の化合物を投与する前記方法。１３．炎症の治療を必要とする非ヒト哺乳動物における炎症の治療方法であって、前記治療を必要とする非ヒト哺乳動物に治療的に有効な量の構造式Ｉ：［式中、Ｒ¹及びＲ²は独立してａ）水素、及びｂ）から選択され、但しＲ¹が水素の場合にはＲ²は置換基ｂ）であり、Ｒ²が水素の場合にはＲ¹は置換基ｂ）であり、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶はａ）水素、ｂ）ハロゲン、ｃ）Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、ｄ）Ｃ₁−Ｃ₄アルコキシ、及びｅ）ヒドロキシから構成される群から独立して選択され、但しＲ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶のうちの少なくとも１個は水素以外の置換基であるか、又はＲ³とＲ⁴又はＲ⁴とＲ⁵は一緒になって−ＣＨ²ＣＨ²ＣＨ²ＣＨ₂−ジラジカルを形成する］の化合物又は医薬的に許容可能なその塩もしくはエステルを投与する前記方法。１４．炎症の治療を必要とする非ヒト哺乳動物における炎症の治療方法であって、前記治療を必要とする非ヒト哺乳動物に治療的に有効な量の請求項１に記載の化合物を投与する前記方法。１５．良性上皮過形成の治療を必要とする非ヒト哺乳動物における良性上皮過形成の治療方法であって、前記治療を必要とする非ヒト哺乳動物に治療的に有効な量の構造式Ｉ：［式中、Ｒ¹及びＲ²は独立してａ）水素、及びｂ）から選択され、但しＲ¹が水素の場合にはＲ²は置換基ｂ）であり、Ｒ²が水素の場合にはＲ₁は置換基ｂ）であり、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶はａ）水素、ｂ）ハロゲン、ｃ）Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、ｄ）Ｃ₁−Ｃ₄アルコキシ、及びｅ）ヒドロキシから構成される群から独立して選択され、但しＲ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶のうちの少なくとも１個は水素以外の置換基であるか、又はＲ³とＲ⁴又はＲ⁴とＲ⁵は一緒になって−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂−ジラジカルを形成する］の化合物又は医薬的に許容可能なその塩もしくはエステルを投与する前記方法。１６．良性上皮過形成の治療を必要とする非ヒト哺乳動物における良性上皮過形成の治療方法であって、前記治療を必要とする非ヒト哺乳動物に治療的に有効な量の請求項１に記載の化合物を投与する前記方法。