JPH09504604A

JPH09504604A - 新規エイメリア抗体および抗原ならびにその使用方法

Info

Publication number: JPH09504604A
Application number: JP7506067A
Authority: JP
Inventors: ミラー，ティモシー・ジェイ; ストラング，ジョージ; ブレイク，デイビッド
Original assignee: ファイザー・インコーポレイテッド
Priority date: 1993-08-02
Filing date: 1994-08-02
Publication date: 1997-05-06
Also published as: NZ271219A; WO1995003813A1; CA2167533A1; EP0717629A4; BR9407557A; AU7479894A; EP0717629A1; ZA945696B

Abstract

(57)【要約】本明細書は新規段階特異的および細胞内防御エイメリア抗原を開示する。該抗原は寄生虫感染の部位で局所的に産生される抗体調製物を用いて同定可能である。抗体および抗原は、コクシジウム症を検出し、ならびに個々のニワトリ対象の免疫状態を測定するため診断試薬として有用である。抗体および抗原はまた、エイメリア感染に対する防御を提供するワクチン組成物にも有用である。

Description

【発明の詳細な説明】新規エイメリア抗体および抗原ならびにその使用方法技術分野本発明は、一般に、寄生虫学の分野に関する。より詳細には、本発明はエイメリア（Eimeria）からの新規抗体および抗原、ならびにそれらの使用および検出方法に関する。発明の背景鳥類のコクシジウム症は、原生動物のエイメリア属の一員によって引き起こされる家畜および野生の鳥類の腸の寄生虫病である。本疾病は、感染した宿主の糞便からの芽胞化卵母細胞の経口摂取によって伝染する。感染プロセスは迅速で、小腸粘膜に対して広範な損傷を引き起こす、宿主細胞における寄生虫の複製によって特徴づけられる。鳥類のエイメリアの生活環は複雑でであり、ゴミ中において起こる外因性期および宿主の腸管において起こる内因性期という２つの段階にて見られる。典型的な野外での飼育においては、新しく孵化したヒヨコは、養鶏場に到着して間もなく、混入したゴミから感染性の芽胞化卵母細胞を経口摂取する。様々な刺激物が相互作用して、腸粘膜の絨毛または表面の表皮細胞に種特異的方法で迅速に侵入する、感染力を有するスポロゾイトが腸管内へ放出される。次いで、細胞内スポロゾイトは、遺伝的にプログラムされた無性増殖またはシゾゴニー（schizogony ）を行い、限定された膜または寄生虫液胞（parasitophorous vacuole）に結合したメロゾイトを形成する。メロゾイトが出現し、付近の小腸細胞を侵略し、メロゴニー（merogony）（無性分化）を再び開始する。内因性エイメリアの生活環の各時点で、異なる段階特異的抗原が宿主の防御的ＢおよびＴ細胞免疫応答の潜在的な標的となる。かくして、活発な感染は、ある動物において自然の免疫応答を引き起こすことができる。しかしながら、個々の動物が実際に感染に対し免疫を有しているかどうかを決定する実用的方法はなく、殺した鳥の腸管を視覚的に検査することによって確認できるにすぎない。防御的な宿主免疫応答がなければ、いくつかの感染的事象および寄生虫の数の指数関数的増殖は、速やかに、表面および表面下の細胞損失、吸収不良、下痢および脱水により顕在化した臨床的コクシジウム症を引き起こす。次いで、有性のガメトゴニー（gametogony）が起こり、その結果、糞便中にて卵母細胞の連続的発散、およびさらなる感染の拡大が生じる。従って、該疾病は急性に病的状態をもたらし、その結果、家禽産業に生育低下および飼料使用といった経済的損害が生じる。コクシジウム症に対する従来の免疫方法は、不活化、弱毒化、および早発形態の寄生虫の使用からなっている。例えば、エイメリア種に由来の生卵母細胞および弱毒化卵母細胞が免疫応答を誘導する方法として使用されていた。例えば、ジョイナー・エル・ピー（Joyner,L．P.）およびノートン・シー・シー（Norton,C .C.）、パラサイトロジー（parasitology）（１９７３年）第６７巻：３３３− ３４０頁;ガルメス・エム・エム（Galmes，M．M.）ら、アン・パラサイトロ・ヒュム・コンプ（Ann．Parasitol．Hum．Comp.）（１９９１年）第６６巻：１４４ −１４８頁；ジェンキンス（Jenkins）ら、インフェクション・アンド・イムニティー（Infect．Immun.）（１９９１年）第５９巻：４０４２−４０４８頁参照。しかしながら、かかる材料を用いての効果的な免疫化は試験的であり、これらの調製物の製造および供給には問題が多いであろう。また、毒性型への変換のごとき副作用も見いだされている。免疫化の目的のため、および寄生虫の様々な発達段階の間に起こる事象を説明する努力において、抗エイメリアポリクローナルおよびモノクローナル抗体が製造されている。例えば、エイメリア種の卵母細胞に感染したニワトリから製造された粗グロブリン画分を用いた免疫化が記載されており（例えば、ローズ・エム・イー（Rose，M．E.）、パラサイトロジー（１９７４年）第６８巻：２８５− ２９２頁；ロング・ピー・エル（Long，P．L.）およびローズ・エム・イー、パラサイトロジー（１９７２年）第６５巻：４３７−４４５頁；ローズ・エム・イー、パラサイトロジー（１９７１）第６２巻：１１−２５頁；ローズ・エム・イーおよびロング・ピー・エル、パラサイトロジー（１９７１年）第６３巻：２９９− ３１３頁、参照）、およびイー・テネラ（E．tenella）メロゾイトおよびスポロゾイトに対して生成されたモノクローナル抗体を用いた受動的免疫化が示唆されている（例えば、ＥＰＡ公開第１３５,０７３号および第１３５,７１２号、各々１９８４年３月２７日、１９８５年４月３日に公開、参照）。ダンフォース・エイチ・デイ（Danforth，H．D.）、アメリカン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am.J.Vet.Res.）（１９８３年）第４４巻：１７２２−１７２７頁は、イー・テネラの発達段階およびスポロゾイト侵入および細胞内での発達に対する効果を研究するため、イー・テネラに対するモノクローナル抗体を製造した。前記した抗体調製物はすべて慣用的技術を用いて製造した。しかしながら、これまでエイメリア感染の局所部位での抗体産生は記載されたことがなく、現在、分泌免疫系および／または細胞介在免疫性関連の局所的応答が寄生虫に対する防御免疫に関与しているのは明らかである。サブユニットワクチン調製物が、前記した調製物の使用における固有の問題を解決する試みにおいて開発された。例えば、ＥＰＡ公開第４５３,０５５号（１９９１年１０月２３日公開）は、エイメリア卵母細胞由来の２５ｋＤａのイー・テネラ抗原、２６ｋＤａのイー・ネカトリックス（E．necatrix）抗原、または５５ｋＤａのイー・マキシマ（E．maxima）抗原の混合物を含有する多成分系ワクチン組成物を記載している。ＥＰＡ第２５６,５３６号（１９８８年２月２４日公開）は、イー・マキシマのマクロガメトサイトおよびマイクロガメトサイトの単離、およびガメトサイト由来の異種起源のタンパク質抽出物からなるワクチンを記載している。同様に、ＥＰＡ公開第１６７,４４３号（１９８６年１月８日公開）は、少なくとも１５のポリペプチドを含有する、スポロゾイトおよびニワトリを免疫化するためのイー・テネラの芽胞化卵母細胞からの異種起源の抽出物の使用を記載している。最後に、ＥＰＡ公開第１６４,１７６号（１９８５年１２月１１日公開）、およびオーストラリア特許公開第８７／１９９,０２７号（１９８７年６月４日公開）は、イー・テネラのスポロサイトから、各々、１７ｋＤａと８ｋＤａの分子量を有する２つのポリペプチド鎖からなる２５ｋＤａのタンパク質の単離、およびワクチン組成物におけるそれの使用を記載している。そのタンパク質をコードする遺伝子もクローン化され、配列決定されている。これらのすべてのサブユニットワクチンは、細胞外寄生虫形のエイメリア、即ち細胞外スポロゾイトおよびメロゾイト形の微生物に由来している。同様に、以前に同定されたエイメリア遺伝子は、細胞外寄生虫形態に対して形成された抗体プローブに基づいて単離され、特徴づけられている。しかしながら、後発的防御免疫は発達した無性段階に関連しており、細胞内スポロゾイトの代謝および／または初期無性発達は、免疫系によって認識される寄生虫特異的遺伝子産物の転写および翻訳のために必須であるように思われる。従って、これらの細胞内寄生虫代謝産物の同定、単離、および生化学的特徴づけは、効果的な抗コクシジウム症ワクチンの設計のために所望される。発明の開示本発明は、寄生虫感染の部位で局所的に産生される、または該部位に行き来する新規エイメリア抗体調製物の開発に基づく。そのようにして産生された抗体は、高レベルの寄生虫の生育および発育を支持する培養系を含む、生物学的試料における防御的細胞外および細胞内エイメリア抗原の発見をもたらす。細胞内抗原は、以前には、慣用的な細胞培養技術、およびポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物を用いて同定できなかった。抗原および抗体は、防御的エイメリアワクチンにおいて使用できる。寄生虫侵入の局所部位におけるＢおよびＴ細胞依存性免疫応答を測定するための診断試験ならびにバイオアッセイも本発見によって可能になる。従って、１つの具体例において、本発明は、単離され、局所的に産生されたエイメリア抗体調製物に関する。特に好ましい具体例においては、抗体調製物は盲腸リンパ球免疫産物（ＣＬＩＰ）、脾臓リンパ球免疫産物（ＳＬＩＰ）、直腸抗体試験体（ＲＡＴ）またはケージドロッピング抗体試験体（ＣＤＡＴ）からなる。もう一つ別の具体例において、本発明は、生物学的試料におけるエイメリア抗原の有無の検出方法であって、ａ）生物学的試料を局所的に産生されたエイメリア抗体調製物に、生物学的試料中に存在する抗原と抗体調製物中に存在する抗体との間に複合体を形成し得る条件下で接触させること；およびｂ）発現ラベルを用いて、形成されたいずれの複合体をも検出することからなる方法に関する。さらにもう一つ別の具体例において、本発明は、生物学的試料におけるエイメリア・テネラ（Eimeria tenera）抗原の有無の検出方法であって、ａ）生物学的試料をＣＬＩＰ、ＳＬＩＰ、ＲＡＴおよびＣＤＡＴからなる群より選択される少なくとも１つの局所的に産生されたエイメリア・テネラ抗体調製物と、生物学的試料中に存在する抗原と抗体調製物中に存在する抗体との間に複合体を形成し得る条件下で接触させること；およびｂ）発現ラベルを用いて、形成されたいずれの複合体をも検出することからなる方法に関する。もう一つ別の具体例において、本発明は、鳥類対象におけるコクシジウム症の診断方法であって、ａ）鳥類対象より生物学的試料を用意すること；ｂ）生物学的試料を局所的に産生されたエイメリア抗体調製物と、生物学的試料中に存在する抗原と抗体調製物中に存在する抗体との間に複合体を形成し得る条件下で接触させること；およびｃ）発現ラベルを用いて、形成されたいずれの複合体をも検出することからなる方法に関する。さらに別の具体例において、本発明は、局所的に産生されたエイメリア抗体調製物を用いて同定できる細胞内エイメリア抗原に関する。特に、好ましい具体例において、抗原はウエスタンイムノブロット解析によって決定されたごとく、約２８ｋＤａ、３５ｋＤａ、３８ｋＤａ、４０ｋＤａ、４３ｋＤａ、５５ｋＤａ、７０ｋＤａ、１００ｋＤａまたは１１０ｋＤａの分子量を有する。もう一つの具体例において、本発明は、生物学的試料におけるエイメリア抗体の有無の検出方法であって、ａ）生物学的試料を細胞内エイメリア抗原と、該抗原と生物学的試料中に存在する抗体との間に複合体を形成し得る条件下で接触させること；およびｃ）発現ラベルを用いて、形成されたいずれの複合体をも検出することからなる方法に関する。さらに別の具体例において、本発明は、鳥類対象におけるコクシジウム症診断キットであって、適当な容器にパッケージされた、局所的に産生されたエイメリア抗体調製物からなるキットに関する。もう一つ別の具体例において、本発明は、鳥類対象におけるコクシジウム症診断キットであって、適当な容器にパッケージされた、細胞内エイメリア抗原と反応するエイメリア・テネラのモノクローナル抗体からなるキットに関する。もう一つ別の具体例において、本発明は、生物学的試料におけるエイメリアに対する抗体の有無を検出するキットであって、適当な容器にパッケージされた、細胞内エイメリア抗原からなるキットに関する。本発明の、これら、および他の具体例は、本明細書の開示の観点において、当業者は容易に理解するであろう。詳細な記載本発明の実施には、特に示さない限り、示される分子生物学、微生物学、ウイルス学、組換えＤＮＡ技術および免疫学の慣用的技術を用い、それは当該分野の技術範囲内にある。かかる技術は文献において十分に説明されている。例えば、サムブルック（Sambrook）、フリッシュ・アンド・マニアティス（Fritsch ＆ M aniatis）、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Mol ecular Cloning: A Laboratoru Manual）第２版、（１９８９年）；ＤＮＡクローニング（DNA Cloninng）、第ＩおよびＩＩ巻、（ディー・エヌ・グロバー（D ．N．Glover）編、１９８５年）；オリゴヌクレオチド・シンセシス（origonucl eotide synthesis）（エム・ジェイ・ガイト（M．J．Gait）編、１９８４年）；ヌクレイック・アシッド・ハイブリダイゼーション（Nucleic Acid Hybridization）（ビー・ディー・ハメス（B．D．Hames）およびエス・ジェイ・ヒギンズ（S．J．Higgins）編、１９８４年）；アニマル・セル・カルチャー（Animal Cell Culture）（アール・ケイ・フレッシュニー（R.K.Freshney）編、１９８６年）；イモビライズド・セル・アンド・エンザイムズ（Immobilized Cells and Enzymes）（ＩＲＳプレス（IRL Press、１９８６年）；パーバル・ビー（Perbal，B.）、ア・プラクチカル・ガイド・ツゥ・モレキュラー・クローニング（A Practical Guide to Molecular Cloning）（１９８４年）；一連のメソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods In Enzymology）（エス・コロウィック（S．Colowick）およびエヌ・カプラン(N．Kaplan）編、アカデミック・プレス・インク（Academic Press Inc.）；および、ハンドブック・オブ・エクスペリメンタル・イムノロジー（Handbook of Experimental Immunoligy）、第Ｉ− ＩＶ巻（ディー・エム・ワイア（D．M．Weir）およびシー・シー・ブラックウェル（C．C．Blackwell）編、１９８６年、ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ（Blackwell Scientific Publications）参照。上記、下記いずれの、本明細書に引用したすべての特許、特許出願、および刊行物は、出典明示によりそれらの内容全部を本明細書の一部とする。本明細書および添付した請求の範囲に用い場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が明確に別であると示していない限り複数を包含する。Ａ．定義本発明の記載中、以下の用語が用いられ、以下に示したごとく定義される。「エイメリア抗原」は、宿主の免疫系を刺激し、分泌性、体液性、および／または細胞性の抗原特異的応答を起こす１つまたはそれ以上のエピトープを含有するエイメリア種に由来する分子をいう。本発明の目的のために、抗原は既知のいずれのエイメリア種からも誘導することができ、種の選択は宿主および治療されるべきコクシジウム症に依存する。例示として、家畜の鳥類（ガラス・ドメスティカス（Gallus domesticus）は、イー・テネラ、イー・ネカトリックス、イー・ブルネッティ（E.brunetti）、イー・マキシマ、イー・アセルブリナ（E.acervulina）、およびイー・プレコックス（E.praecox）のいずれかによって感染し得る。七面鳥（メレアグリス（Meleagris）は、イー・メラグリミティス（E.melagrimitis）、イー・ディスパーサ（E.dispersa）、イー・メレアグリディス（E.meleagridis）、イー・ガロパボニス（E.gallopavonis）、イー・アデノイデス（E.adenoides）、イー・イノカ（E.innocua）、およびイー・サブロツンダ（E.subrotunda）による感染に対して感受性がある。家畜および野生のアヒル（アナス（Anas））は、イー・アナティス（E.anatis）によって引き起こされる感染に苦しみ、ガチョウ（アンサー（Anser））は、イー・アンセリス（E .anseris）、イー・ノセンス（E.nocens）、イー・パルブラ（E.parvula）、イー・ヘルマニ（E.hermani）、イー・ストリアタ（E.striata）、およびイー・フルバ（E．fulva）に感染し得る。従って、本発明の抗原は、上記のいずれの種から同定され、誘導されてもよい。さらには、本発明の目的のために、「エイメリア抗原」は実質的に同種起源で、対応する本来のエイメリア抗原と機能的に等価な抗原を包含する。かくして、「エイメリア抗原」という語は、本来の配列に対し、欠失、付加、および置換（一般に、自然界においては保存的）のごとき修飾体を包含する。一次アミノ酸配列のかかる修飾によって、本来の配列に比較して活性が向上または減少したタンパク質が得られる。これらの修飾は、部位定方向変異法によって多様化され、または抗原を産生する宿主の変異のごとく偶然に起こるであろう。これらのすべての修飾は、以下に定義するごとく、その分子が免疫学的応答を誘発する能力を維持し、活性が失われない限り、包含される。さらに、「エイメリア抗原」は、脂質および糖質のごとき他の生物学的物質との組み合わせによって、あるいは、コードされている一次配列の他の修飾と同様、アミノ基のアセチル化、チロシン、セリン、スレオニンまたは他のいずれの側鎖も、一般的に、本来の分子にてリン酸化されていてもまたはいなくても、これらの残基のリン酸化を包含するヒドロキシル側鎖のリン酸化またはスルフヒドリル基の酸化によって修飾されていてもよいタンパク質を示す。かくして、免疫学的活性を残している糖鎖付加および非糖鎖付加型、結合リン酸を有するかまたは有さないアミノ酸配列、および本来の配列と実質的に同一起源のアミノ酸配列は、その定義に含まれる。「細胞内抗原」は、寄生虫の発達のうち細胞内の段階、即ち、小腸粘膜の絨毛または表皮細胞内での無性発達の間に発現する上記のごときエイメリア抗原を意味する。細胞内の段階は、細胞内スポロゾイト代謝、トロフォゾイトおよび多核のシゾントまたはメロントへの無性発達を包含する。従って、これらの事象の間に産生される細胞内抗原は定義により包含される。かかる細胞内抗原の産生は、一次および連続継代細胞系を包含する、細胞内エイメリア spp.形態の成長を支持するのに適応した細胞系において見ることができる。代表的な細胞系をさらに以下に記載する。かくして、細胞内抗原を本明細書では「組織培養由来抗原」ともいう。「細胞内抗原」という語は、細胞膜、小胞体などに結合している抗原のごとき、細胞内に保持される抗原同様、寄生虫が発達している細胞培養の培地中へ分泌されるタンパク質を包含する。細胞内抗原は、可溶性または不溶性のいずれかとすることができる。「細胞外抗原」は、寄生虫の発達のうち細胞外の段階の間に、即ちゴミ中で起こるエイメリア生活環のうちの外因性期、およびその生物がまだ宿主細胞に侵略および侵入していない内因性期の間に産生されるエイメリア抗原である。かかる抗原は、その生物の細胞外スポロゾイトおよびメロゾイト形態を包含する。本発明の目的のために、エイメリア spp.の抗原を、時にそれらのキロダルトン（ｋＤａ）での分子量を参考にして以下のように同定する。例えば、約３５ｋＤａの分子量を有する抗原は本明細書ではＰ３５として同定し；約４０ｋＤａの分子量の抗原はＰ４０等として同定する。「局所的に産生された」抗体調製物は、エイメリア感染の局所部位で産生されるか、または該部位に行き来する１つまたはそれ以上の抗体を含有する組成物である。局所的に産生された抗体調製物は、例えば、盲腸または小腸のいずれの部分、および本明細書でいうところの盲腸リンパ球免疫産生物（「ＣＬＩＰ」）；感染した鳥類対象においてメモリー脾臓リンパ球が行き来することによって産生される脾臓リンパ球免疫産生物（「ＳＬＩＰ」）；感染鳥類対象の直腸の腸内消化物から単離される直腸抗体試験体（ＲＡＴ）および感染鳥類対象の鳥かごの排泄物に由来のケージドロッピング抗体試験体（「ＣＤＡＴ」）のごとき、以前にまたは現在感染している鳥類対象の腸管から直接的に、または排出後のいずれかの糞便から単離したコプランティボディ（coprantibody）調製物（即ち、糞便に由来の抗体）のごとき、以前にまたは現在感染した鳥類対象の腸管内で見られる免疫リンパ球集団に由来の抗体調製物を包含する。「単離した」抗原または抗体は、タンパク質配列が、通常、自然にて結合する生物全体（生体または死体）から分離した抗原または抗体である。かくして、無細胞抽出物に含有される抗原は、合成的にまたは組換え的に産生された抗原のごとき、「単離した」抗原を構成するであろう。同様に、「単離した」抗体調製物は、混合物が、通常、抗体が見られる生物から分離される限り、その粗混合物、血液、血清等に存在する抗体を包含する。「単離した」という語は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製物を共に包含する。さらに抗原および抗体に関する「単離した」という語は、特定の純度を暗示するものではない。かくして、粗抽出物は高度に精製された調製物と同様、その用語に包含される。「ポリペプチド」および「タンパク質」という語は、相互に交換可能に用いられ、ペプチド結合で連結されたアミノ酸のポリマー（ジペプチドまたはそれ以上）をいう。かくして、「ポリペプチド」および「タンパク質」という語は、オリゴペプチド、タンパク質断片、アナログ、ミューテイン（muteins）、融合タンパク質等を包含する。「エピトープ」という語は、特異的Ｂ細胞およびＴ細胞が応答する抗原またはハプテン上の部位をいう。その用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定基部位」で、相互に交換可能に用いられる。組成物またはワクチンに対する「免疫学的応答」は、対象の組成物またはワクチンに対する分泌性、細胞性、および／または抗体媒介免疫応答の宿主における発達である。通常、かかる応答は１つまたはそれ以上の以下の効果；免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、またはＭのごとき免疫学的クラスのいずれかの抗体産生；Ｂ細胞；ヘルパーＴ細胞；サプレッサーＴ細胞；および／または対象の組成物またはワクチンに含有される単一の抗原または複数の抗原に対して特異的に指向される細胞毒性Ｔ細胞および／またはγδ細胞を包含するが、これに限定されない。免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の産生を刺激する免疫学的応答が特に興味深い。というのは、これは、原理的には、温血動物の分泌系によって産生される免疫グロブリンだからである。特に、鳥類種は、腸管結合リンパ組織（ＧＡＬＴまたはペイエルのパッチといわれる）、気管支結合リンパ組織（ＢＡＬＴ）および眼球の前面および後中部に位置するハーダー腺（harder gland）からなる粘膜の免疫網状組織を有する。これらの組織に抗原を入れると、分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）の最終産生と共に、コミッティドＢ細胞の体内の分泌組織および腺への増殖および拡大を作動させる。ｓＩｇＡは、粘膜表面上に集落化し、次いで、それを貫通する特定の表面抗原の集落化および侵略を遮断するように作用する。「免疫原性」抗原またはタンパク質という語は、上記のごとき免疫学的応答を引き起こすアミノ酸配列を有する抗原またはタンパク質をいう。本明細書中に使用される「免疫原性」抗原またはタンパク質は、所望のエイメリアタンパク質またはそれの免疫原性断片の配列の全長を包含する。「免疫原性断片」は、１つまたはそれ以上のエピトープを含有し、かくして前記したごとき免疫学的応答を惹起させるポリペプチド断片を意味する。かかる断片は、例えば、固体支持体上で同時に多くのポリペプチド、エイメリアタンパク質分子の一部に対応するペプチドを合成し、該ペプチドを支持体に結合させたまま、該ペプチドを抗体と反応させることによって同定できる。かかる技術は当該分野において知られており、例えば、米国特許第４,７０８,８７１号；ゲイセン・エイチ・エム（Geysen,H.M. ）ら、（１９８４年）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユー・エス・エー（Proc．Natl．Acad．Sci．USA）第８１巻：３９９８−４００２頁；ゲーセン・エイチ・エム（Geysen，H．M.）ら、（１９８６年）モレク・イムノル（Molec．Immunol.）第２３巻：７０９−７１５頁に記載されており、出典明示によりその内容全体を本明細書の一部とする。かかる断片は、通常少なくとも約２アミノ酸の長さ、より好ましくは約５アミノ酸の長さ、およびもっとも好ましくは少なくとも約１０ないし１５アミノ酸の長さであろう。断片の長さには臨界的上限はなく、タンパク質配列のほとんど全長、あるいは２つまたはそれ以上のエイメリア抗原、または、例えば、細菌、真菌、ウイルスまたは原生動物タンパク質と融合した１つまたはそれ以上のエイメリア抗原の断片からなる融合タンパク質からなっていてもよい。少なくとも約６５％（好ましくは少なくとも約８０％ないし９０％、および、もっとも好ましくは少なくとも約９５％）のアミノ酸の一致が分子の一定の長さに及ぶ場合、その２つのポリペプチド配列は「実質的に同一」である。本明細書にて用いる場合、実質的同一はまた特定のポリペプチド配列に対して同一性を示す配列をいう。「鳥類対象」は、アヒルおよびガチョウのごときアンセリフォーム（Anserifo rms）目の鳥と同様、鶏、七面鳥、キジ、ヤマウズラ、ウズラ、ライチョウ、ホロホロチョウ、およびクジャクのごときガリフォーム（Galliform）目に属する動物を包含する、家畜、野生および競技用の鳥を意味する。その定義はin ovoにおけるの対象を包含する、すべての年齢の鳥を包含する。本明細書で用いる「生物学的試料」は、例えば、血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髄、胆汁、髄液、リンパ液、皮膚、呼吸器、腸、および生殖器の試料、血液細胞、器官、卵成分、およびインビトロの細胞培養成分の試料（培地中の細胞および組織の増殖により生じる調整培地、組換え細胞および細胞成分を包含するが、これに限定されない）も包含するが、これに限定されない、鳥類対象から単離された組織または体液の試料をいう。「生物学的試料」はまた、芽胞化卵母細胞、感染性スポロゾイト、細胞内スポロゾイト、メロゾイト、ガメトサイト等の試料を包含する、種々の発達段階のいずれかのエイメリア spp.から得られる試料もいう。本明細書に用いる「治療」なる語は、（ｉ）感染または再感染の防止（予防）、および（ii）コクシジウム症の徴候の減弱または除去（治療）の両方をいう。Ｂ．一般的方法本発明の中心は、寄生虫感染の部位で局所的に産生される新規抗体調製物の開発およびこれらの調製物を用いた寄生虫抗原の同定方法である。その抗体は、エイメリアの生活環の細胞内および細胞外期の間に産生される抗原を同定するためのアッセイを包含する様々なアッセイにおいて使用できる。その抗体は、感染の特定の部位と同様、感染プロセスの間の特定の期間に現れる抗原の検出および特徴付けも可能にする。その抗体は、コクシジウム症感染を検出するため、ならびに宿主の免疫レベルを決定するため；エイメリア抗原を免疫的に精製するために診断試薬として；および他の医学的に重要な種における相同遺伝子の存在を検出するためのスクリーニング試薬として使用できる。エイメリア感染に応答して産生される局在化抗体はこれまで報告されていない。さらには、細胞内抗原の同定は以前は不可能であり、かかる抗原がコクシジウム症に対して防御免疫を付与することに関与していると思われる。そのようにして同定された抗原を単離し、特徴付け、サブユニットワクチン組成物に用い、そうして従来の弱毒化および死菌ワクチン調製物に固有の問題を回避することができる。同定された抗原は、生物学的試料においてエイメリア感染を検出するため、および対象のエイメリア種に対する宿主の免疫レベルを決定するための診断具としても使用できる。寄生虫感染の局所部位で産生され、または該部位に行き来する、数種の抗体調製物が本明細書中に記載されている。特に、腸の免疫リンパ球によって産生される盲腸リンパ球免疫産物（「ＣＬＩＰ」）；およびメモリー脾臓リンパ球を行き来させることによって産生される脾臓リンパ球免疫産物（「ＳＬＩＰ」）が本明細書に記載されている。エイメリア spp.免疫鳥の腸内消化物由来のコプランチボディ調製物を含有するｓＩｇＡも開示される。これらの抗体調製物を、直腸の腸内消化物から単離された直腸抗体試験体（「ＲＡＴ」）；および鳥かごの排泄物由来のケージドロッピング抗体試験体（「ＣＤＡＴ」）と称する。より詳細には、ＣＬＩＰおよびＳＬＩＰ抗体調製物は、適当な免疫鳥対象から単離された脾臓および盲腸リンパ球から誘導することができる。特に有用な対象は、実施例に記載するような、コクシジウム症感染に対して自然免疫を刺激するように処理された屋内飼育鳥系である。脾臓および盲腸リンパ球は、各々、鳥対象および単一細胞懸濁液中でインビトロで培養された脾臓および盲腸ポウチ（pouches）から、当業者に知られている細胞単離および培養技術を用いて単離できる。一般に、リンパ球は、約５日間培養され、その後、分泌されたエイメリア spp.特異的抗体を含有する培養上清を除去し、遠心によって清澄にし、濾過し、次いで、−２０℃またはそれ以下で貯蔵する。抗体を含有する上清も、定義された免疫ＴおよびＢ細胞リンパ球サブセット、またはそれの組み合わせのインビトロでの培養から既知の技術を用いて製造できる。ＲＡＴおよびＣＤＡＴのｓＩｇＡ含有コプランチボディを、各々エイメリア s pp.免疫鳥の直腸消化物および鳥の糞便排泄物から単離する。本明細書の実施例にＲＡＴおよびＣＤＡＴの屋内飼育の自然の鳥類免疫モデルからの単離がある。鳥類のｓＩｇＡコプランチボディ試料も、ワイヤーバッテリー、フロアーおり、またはブロイラー小屋で飼育された、自然にエイメリア spp.に曝露された屋外飼育ブロイラーから得られるであろう。抗体を単離するために、湿糞便をリン酸緩衝セイライン（ＰＢＳ）のごとき適当な生理学的均衡溶液または培地中に再懸濁し、引き続いて撹拌し、プロテアーゼ阻害剤を添加し、次いで、２回または複数回、低および中速で連続遠心する。抗体含有溶液を生理的ｐＨに調整し、濾過し、次いで、少なくとも−２０℃で貯蔵する。さらなるｓＩｇＡの精製を、硫酸アンモニウム沈澱、サイズおよびアフィニティクロマトグラフィー、または当業者によく知られた他の生物生理学的方法を用いて行うことができる。さらに上記の産生された抗体調製物を特徴づけし、様々な目的に用いることができる。例えば、エイメリアのＳＬＩＰ、ＣＬＩＰ、ＲＡＴ、およびＣＤＡＴ試薬を、寄生虫中和アッセイ（ＰＮ）およびインビトロの寄生虫阻害アッセイ（ＰＩ）のごとき抗寄生虫アッセイにおいて特徴づけることができる。総じて、ＳＬＩＰ、ＣＬＩＰ、ＲＡＴ、およびＣＤＡＴ中に存在する同基準標体特異的およびエイメリアspp.特異的抗体を、当業者に知られておりさらに実施例において記載されている通常のＥＬＩＳＡを用いて定量することができる。特に興味深いことは、寄生虫の発達のうち細胞内段階の間に産生されるエイメリア spp.抗原を同定するのにＳＬＩＰ、ＣＬＩＰ、ＲＡＴおよびＣＤＡＴを使用することである。エイメリア抗原の検出は、ワクチン候補物の同定のみならず、鳥類対象におけるコクシジウム症の存在または不存在を決定するため、および対象のエイメリア種に対する宿主の免疫レベルを評価するための診断目的について有用性を見いだす。エイメリア抗原は、芽胞化卵母細胞、細胞外スポロゾイトおよびメロゾイト、細胞内スポロゾイトおよびメロゾイト等を含有する試料を包含する様々な生物学的試料中にて同定することができる。さらに、組織および糞便、例えば、鳥の脾臓、盲腸、直腸および排泄物からの試料を、感染鳥類対象またはコクシジウム症および本発明の抗体を用いて検出される抗原を有する感受性の対象から直接得ることができる。細胞内抗原は、寄生虫の生活環の細胞内段階の成長を支持する細胞培養系からの培地中にて同定できる。かくして、本発明は、類似の分子量を有するが、異なる段階の寄生虫感染の間に、および／または感染の異なる部位で産生される抗原を区別することを可能とする。例えば、本発明の使用により、免疫された鳥およびされていない鳥において曝露後、脾臓、盲腸、小腸消化物および糞便中に特異的に見られる細胞内および細胞外抗原を同定することができる。多くの既知の細胞外抗原が、エイメリアスポロゾイトおよびメロゾイトにおいて、本明細書に記載された新規抗体調製物を用い、これらの抗体が、実際、免疫原性細胞外タンパク質を選択的に同定できることを確認する、ウエスタンイムノブロットにおいて同定された。より重要なことは、本発明の抗体調製物が、初めてエイメリアの段階特異的および／または細胞内抗原を同定したことである。これらの抗原は、それらが主として生物に対する防御免疫応答に関連すると考えられるので特に興味深いものである。細胞内抗原は、これまでエイメリア免疫ニワトリにおいて産生された血清のごとき通常の抗体プローブによって認識されず、またそれらはウサギのごとき共通の動物種において産生されるポリクローナル抗体を用いて、またはエイメリアのスポロゾイトおよびメロゾイトで免疫されたマウスからのモノクローナル抗体によっても同定されなかった。エイメリア細胞内抗原の同定は、現在、スポロゾイトから卵母細胞までのエイメリアの全生活環、特に細胞内期の発達の間、エイメリアの発達を支持することができる連続継代細胞系において成長した鳥類エイメリア spp.からの培地をアッセイする本発明の抗体調製物を用いて可能である。かかる細胞系は、国際公開第ＷＯ９３／０１２７６（１９９３年１月２１日公開）に記載され、クローン細胞ＳＢ−ＣＥＶ−１／Ｐ（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１０４９７）、ＳＢ−ＣＥＶ−１／Ｆ７（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１０４９５）、およびＳＢ−ＣＥＶ−１／Ｇ７（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１０４９６）を包含する。しかしながら、細胞内段階の無性発達の間でエイメリアの成長を支持するいずれの細胞系もまた、これらの段階特異的抗原を同定することに用途が見いだされるであろう。代表的な細胞内エイメリア抗原が、上記抗体を用いてＳＢ−ＣＥＶ−１／Ｆ７（ＡＴＣＣ受託第ＣＲＬ１０４９５）細胞系において生育されたエイメリアspp. から同定された。この細胞系は、最適には、１９９培地（ギブコ・ラボラトリーズ（Gibco Laboratories）、グランド・アイランド（Grand Island）、ＮＹ）中、５％ＣＯ₂および４０.５℃のインキュベーション条件下で培養される。ウシ胎児血清、抗生物質および抗真菌剤も、当業者によって容易に決定される割合で添加することができる。さらにＳＢ−ＣＥＶ−１／Ｆ７の培養条件は、国際公開第ＷＯ９３／０１２７６（１９９３年１月２１日公開）に詳細に述べられている。特に、各々、２８ｋＤａ、３５ｋＤａ、３８ｋＤａ、４０ｋＤａ、４３ｋＤａ、５５ｋＤａ、７０ｋＤａ、１００ｋＤａおよび１１０ｋＤａの分子量を有する抗原を包含する、多くの細胞内抗原が、ＳＢ−ＣＥＶ−１／Ｆ７からのイー・テネラ由来の硫酸アンモニウム処理の組織培養上清において、自然曝露した屋内飼育のニワトリから調製された高免疫血清と同様に、本発明の抗体を用いて同定された。３５、３８、４３、５５および７０ｋＤａの抗原は、ＳＬＩＰ、ＣＬＩＰ、ＲＡＴおよび免疫血清によって；４０ｋＤａの抗原は、ＣＬＩＰ、ＲＡＴおよび免疫血清によって；１００ｋＤａの抗原は、ＳＬＩＰ、ＲＡＴおよび免疫血清によって；１００ｋＤａの抗原は、ＳＬＩＰおよびＲＡＴによって；２８ｋＤａの抗原は、ＣＬＩＰ、およびＲＡＴによって；５５および７０ｋＤａの抗原は、ＳＬＩＰ、ＣＬＩＰおよびＲＡＴによって認識される。さらに、以下の実施例にて示されるように、抗原は感染プロセスの間の異なる時点に現れる。加えて、３５、３８、４０、４３および７０ｋＤａの抗原は、試験したイー・テネラおよびイー・マキシマ株の両方に存在し、３８および４３ｋＤａの抗原は、イー・テネラおよびイー・アセルブリナの両方に同定できる。最後に３８、４０および４３ｋＤａの抗原は、試験したいくつかのイー・テネラ株に存在し、上記抗体を用いた免疫優勢反応種であるのは明らかである。従って、これらの３つの抗原は、エイメリア感染の存在を示すエイメリアの抗体の検出のためのイムノアッセイにおける診断試薬としての使用と同様に、様々なコクシジウム症が引き起こす因子に対して予防を提供するために、特に重要である。これらおよび他の重要なエイメリア抗原を、上記抗体およびいくつかの標準的同定技術を用いて生物学的試料中に同定することができる。例えば、抗体と反応するタンパク質の存在を、標準的電気泳動および免疫診断技術を用いて検出することができる。抗体は、競合、直接反応またはサンドイッチ型アッセイのごとき、抗体との複合体を形成することによってタンパク質の有無を同定するためのイムノアッセイにおいて使用できる。かかるアッセイは、ウエスタンブロット、凝集試験、ＥＬＩＳＡのごとき酵素ラベルおよび媒介イムノアッセイ、ビオチン／アビジン型アッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫電気泳動、免疫沈降等を包含するか、これらに限定されない。反応は、一般に、蛍光、化学発光、放射活性または酵素ラベルのごとき発現ラベル、または染色分子、または生物学的試料中に存在する抗原および抗体または抗原と反応する抗体との間の複合体の形成を検出する他の方法を包含する。典型的には、１つまたはそれ以上のエイメリアタンパク質を検出するためのイムノアッセイは、試料を選択および調製し、次いで、それを１つまたはそれ以上のＳＬＩＰ、ＣＬＩＰ、ＲＡＴおよびＣＤＡＴと、タンパク質抗体結合体が形成され得る条件下で反応させることからなる。膜またはマイクロタイターウエル形態のニトロセルロース；シートまたはマイクロタイターウエルのポリビニルクロリド；ビーズまたはマイクロタイタープレートのポリスチレンラテックス；ポリビニリジンフルオリド；ジアゾ化紙；ナイロン膜；活性化ビーズ等のごとき固体の支持体を用いることができる。典型的には、固体支持体を最初に生物学的試料と反応させ、洗浄し、次いで、抗体を適用する。サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイのごときサンドイッチ型フォーマットが望ましい場合、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはウレアーゼのごとき検出可能なラベルに接合させた、市販の抗免疫グロブリン（即ち、抗ウサギ免疫グロブリン）を添加できる。次いで、適当な基質を用いて色素反応を発色させる。本発明の抗体を用いて抗原を同定し特徴づけるのに特に都合のよい方法は、イムノブロット解析を包含する。簡単には、寄生虫抗原を調製し、次いで、ＳＤＳポリアクリルアミド分取用ミニゲル上で分離する。分離されたタンパク質を膜上に電気的にブロットし、切片に切断し、次いで、膜上に残っているタンパク質結合部位を、脱脂乳、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または熱不活化正常ウシ血清（ＮＢＳ）のごとき適当な試薬で遮断する。試験試料を純物で適用し、またはより頻繁には、通常、乳、ＢＳＡまたはＮＢＳのごとき少量のタンパク質を含有する緩衝液で希釈することができる。特異的結合が起こるのに十分な時間インキュベートした後、膜を洗浄して非結合試料を除去し、次いで、接合抗ニワトリ免疫グロブリン（全抗体）（即ち、ＩｇＡ＋ＩｇＧ＋ＩｇＭ）または単一ラベル化抗ニワトリ免疫グロブリン（同基準標体抗体）（即ち、ＩｇＡ）の組み合わせと一緒にインキュベートする。再び特異的結合を生じさせるのに十分な時間インキュベートし、膜を洗浄して未結合の接合体を除去し、該酵素に対する基質を添加する。発色させ、次いで、適当な溶液ですすぐことにより反応を停止させる。別法として、「２抗体サンドイッチ」アッセイを、本発明タンパク質を検出するために使用することができる。この方法では、固体支持体を、まず１つまたはそれ以上の本発明の抗体と反応させ、洗浄し、次いで、試験試料に曝露する。抗体を再び添加し、次いで、反応を直接色素反応か、またはホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはウレアーゼでラベルされた抗免疫グロブリンのごとき、ラベル化された別の抗体を用いて視覚化する。エイメリアタンパク質および抗体が沈澱条件下で複合体を形成するように、溶液中でアッセイを行うこともできる。次いで、沈澱した複合体を、例えば、遠心によって試料から分離できる。いったん同定され、単離された抗原を、さらに液体クロマトグラフィー、順相または逆相ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等；アフィニティクロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；固定化金属キレートクロマトグラフィー；ゲル電気泳動等を包含する様々な通常の方法を用いて精製することができる。精製された抗原のアミノ酸配列は、エドマン分解の繰り返しサイクル、続いてアミノ酸分析のごとき当該分野によく知られた技術を用いて決定できる。精製抗原は、遺伝学的に屋内にて飼育した動物におけるＭＨＣ制限応答プロフィールのごとき標準的技術を用いて免疫学的に特徴付けできる。これらの測定法は、ウエスタンブロット、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／染色のごとき標準的方法を用いた分子量決定、Ｔ細胞認識アッセイ、および細胞、タンパク質または抗体の養子移入による免疫防御または免疫疾病を阻止するアッセイを包含するが、これに限定されない。目的の抗原をコードする遺伝子を、遺伝子ライブラリーを構築し、得られたクローンを適当な宿主細胞を形質転換するために用い、本発明の抗体、所望の抗原に対するポリクローナル血清またはモノクローナル抗体を用いて個々のコロニーをプールし、スクリーニングすることによって同定することができる。別法として、いったん目的の抗原のアミノ酸配列を決定し、決定されたアミノ酸配列の一部の遺伝暗号を含有するオリゴヌクレオチドプローブを調製し、目的のタンパク質をコードする遺伝子についてのＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。例えば、ＤＮＡクローニング：第Ｉ巻、前掲；ヌクレイック・アシッド・ハイブリダイゼーション、前掲；オリゴヌクレオチド・シンセシス、前掲；ティー・マニアティスら、前掲参照。関連するタンパク質をコードする合成ＤＮＡ配列も、既知の技術を用いて決定された配列に基づいて調製できる。例えば、エッジ（Edge）（１９８１年）ネイチャー（Nature）第２９２巻：７５６頁；ナンバイア（Nambair）ら、（１９８４年）サイエンス（Science）、第２２３巻：１２９９頁；ジャイ（Jay）ら、（１９８４年）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem）、第２５９巻：６３１１頁参照。コードしている配列を適当なベクターまたはレプリコン中にクローン化できる。多くのクローニングベクターが当業者に知られており、適当なクローニングベクターの選択は選定の問題である。一般に、ＤＮＡクローニング：第Ｉ巻およびＩＩ巻、前掲；ティー・マニアティスら、前掲；ビー・パーバル、前掲参照。その遺伝子は、プロモーター、リボソーム結合部位（細菌の発現用）、および所望によりオペレーター（正確には本明細書では「制御」因子という）の制御下に置くことができ、その結果、所望のタンパク質をコードしているＤＮＡ配列は、この構築物を含有するベクターによって形質転換された宿主細胞中のＲＮＡに転写される。コードしている配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列を含有していてもしていなくてもよい。そうであるならば、そのタンパク質は本来の配列と共に、またはそれなしに発現され得る。別法として、異種のシグナル配列が使用できる。リーダー配列は、細菌宿主の翻訳後プロセッシングにより除去され得る。例えば、米国特許第４,４３１,７３９号；第４,４２５,４３７号；第４,３３８,３９７号参照のこと。宿主細胞の成長に関連したタンパク質配列の発現を制御することができる他の調節配列がまた望ましいかもしれない。調節配列は当業者に知られており、例えば、制御化合物の存在を含む、化学的または物理学的刺激物に応答して、遺伝子の発現を開始または停止させるものを包含する。他の型の調節配列、例えば、エンハンサー配列がベクター中に存在してもよい。制御配列および他の調節配列は、上記のクローニングベクターのごときベクター中への挿入の前に、コードしている配列に連結されてもよい。また、コードしている配列をすでに制御配列および適当な制限部位を含有する発現ベクター中に直接クローン化することができる。いくつかの場合には、コードしている配列を制御配列に適当な配置で；即ち、好ましい読み枠を維持するように接続するように、コードしている配列を修飾することが必要である。関連するエイメリア抗原の変異株またはアナログを産生することもまた望ましい。変異株またはアナログは、抗原をコードしている配列の一部の欠失、配列の挿入、および／またはその配列中の１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換によって調製されてもよい。部位特異的変異法のごときヌクレオチド配列を修飾する技術は、例えば、サムブルックら、前掲；ＤＮＡクローニング、第ＩおよびＩＩ巻、前掲；ヌクレイック・アシッド・ハイブリダイゼーション、前掲に記載されている。次いで、発現ベクターを適当な宿主細胞を形質転換するために使用する。形質転換された宿主細胞を対象の抗原の発現を提供するような条件下で培養する。次いで、抗原を宿主細胞から単離し、精製する。その発現系がタンパク質を生育培地中に分泌する場合、タンパク質は培地から直接精製できる。タンパク質が分泌されない場合、細胞溶解物から単離される。適当な成長条件および回収方法の選択は、当業者の理解するところである。本発明抗原は、既知のアミノ酸配列または関連の遺伝子のＤＮＡ配列由来のアミノ酸配列を用いて、固相ペプチド合成のごとき化学合成によって製造されてもよい。かかる方法は当業者に知られている。問題の抗原の小さな断片が関連の対象において免疫応答を引き起こす能力がある場合には、ペプチドの化学合成が好ましい。単離された組換え的または合成的に製造されたエイメリア抗原は、生物学的試料中のエイメリア抗体の存在を検出するための上記のごとき競合、直接反応またはサンドイッチ型アッセイのごときイムノアッセイにおいて使用することができる。このようにして、コクシジウム症の診断のみならず、宿主の免疫レベルを決定することができる。例えば、天然の抗エイメリアspp.抗体は感染したニワトリの糞便中に産生される。これらの抗体の存在は、糞便の試料を、本発明の１つまたはそれ以上のエイメリア抗原と反応させることによって決定できる。糞便中に存在する抗体は抗原と抗体抗原複合体を形成する。上記の免疫診断法のごとき多くの標準的方法のうちのいくつかを用いて反応混合物を解析して、これらの抗体抗原複合体の存在または不存在を決定することができる。例えば、単離された抗原は、前記した支持体のごとき固体支持体に接合させ、次いで、糞便試料をその接合物と一緒にインキュベートし、反応混合物を解析して抗体の存在を決定することができる。他の有用なアッセイ方法は、フィルターカップおよびデイップスティックを包含する。前者のアッセイでは、本発明抗原を小さなカップの開口部に焼成ガラスフィルターに固定化する。糞便を希釈剤中に再懸濁し、次いで、フィルターを通過させる。抗体が存在すれば、それはフィルターに結合し、次いで、別の抗体の検出剤で視覚化される。デイップスティックアッセイは、抗原をフィルターに固定化し、次いで、再懸濁された糞便に浸し、乾燥し、検出分子と一緒にスクリーニングすることを包含する。本発明のエイメリアタンパク質またはそれらの断片も、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を製造するために使用できる。ポリクローナル抗体が望ましい場合、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）を本発明抗原またはその断片または変異抗原で免疫する。免疫された動物からの血清を集め、次いで、既知の方法に従って処理する。ポリクローナル抗体を含有する血清を使用する場合、そのポリクローナル抗体は既知の方法を用いてイムノアフィニティクロマトグラフィーによって精製することができる。本発明のエイメリア抗原およびその断片に対するモノクローナル抗体も当業者によって容易に製造できる。イー・テネラ感染ＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７組織培養上清に対して生成されたいくつかのモノクローナル抗体の製造が実施例に記載されている。本明細書において防御的であると同定された４０ｋＤａ細胞内タンパク質と反応するＭＡｂ１−２−６が特に有用である。エイメリアモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて製造される。特に、不死の抗体産生細胞系を、Ｂリンパ球の発癌ＤＮＡによる直接形質転換またはエプスタイン−バールウイルスによるトランスフェクションのごとき他の技術と同様、細胞融合によって形成することができる。例えば、エム・シュライアー（M．Schreiner）ら、ハイブリドーマ・テクニークス（Hybridoma Techniques）（１９８０年）；ハマーリング（Hammerling）ら、モノクローナル・アンチボディーズ・アンド・Ｔ−セル・ハイブリドーマズ（Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas）（１９８１年）；ケネット（Kennett）ら、モノクローナル・アンチボディーズ（１９８０年）参照；米国特許第４,３４１,７６１号；第４,３９９,１２１号、第４,４２７,７８３号、第４,４４４,８８７号、第４,４５２,５７０号、第４,４６６,９１７号、第４,４７２,５００号、第４,４９１,６３２号、および第４,４９３,８９０号も参照。関連のエイメリア抗原またはそれの断片に対して産生されたモノクローナル抗体のパネルを、様々な性質について、即ち同基準標体、エピトープ、アフィニティ等についてスクリーニングできる。モノクローナル抗体は、イムノアフィニティ技術を用い、その抗体に定方向性の個々の抗原の精製にて有用である。抗体は、コクシジウム症感染の診断においても有用であり、例えば、鳥類対象の受動免疫化のための治療組成物と同様、上記のごときイムノアッセイにおいて使用できる。種々の細胞内抗原、その抗原に対して形成されたポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ＣＬＩＰ、ＳＬＩＰ、ＲＡＴおよびＣＤＡＴを包含する上記抗原および抗体は、適当な道具および必要な他の試薬を有する、前記したイムノアッセイを行うためのキットにて提供することができる。例えば、抗体、エイメリア抗原、またはその両方が、コクシジウム症感染の検出用、または鳥類対象のコクシジウム症に対する免疫状態を試験するための診断的イムノアッセイ試験キットにて提供することができる。そのキットは、使用される個々のイムノアッセイに依存して、適当なラベルおよび他の梱包試薬および材料（即ち、洗浄緩衝液等）も包含することができる。前記した標準的イムノアッセイは、これらのキットを用いて行うことができる。抗原（精製物、部分精製物、またはそれらの粗混合物のいずれか）、抗原の免疫原性断片、同じ抗原からなるキメラタンパク質、および前記抗体も、コクシジウム症に対する免疫を提供するためのサブユニットワクチン組成物中に処方されるであろう。本発明の抗原および抗体は、単独で、または、同じかまたは異なる種のエイメリアからの他の抗原および抗体と共に使用できる。例えば、細胞内エイメリア抗原は、細胞外スポロゾイトおよびメロゾイトにおいて存在するタンパク質のごとき細胞外エイメリアタンパク質と組み合わされてもよい。かかる組み合わせにおいて、抗原は融合タンパク質またはより大きな多量体タンパク質の形態で提供されてもよい。これらの融合タンパク質または多量体タンパク質は、例えば、米国特許第４,３３６,２４６号に記載されたごとく組換え的に製造されるか、または化学的に合成されてもよい。さらに、本発明の抗原は、種々の鳥類の疾病に対する広範囲な予防を提供するために、他の鳥類病原体からの抗原と組み合わせて使用してもよい。加えて、細胞内形態のエイメリアspp.の成長を支持する培地の、硫酸アンモニウム沈澱物由来の部分精製された細胞内抗原の混合物のごとき抗原の粗混合物を、さらに精製することなくワクチン組成物に使用することができる。例えば、かかる粗抽出物がイー・テネラ曝露に対して防御的であることを例示する実施例参照のこと。ワクチン組成物は、一般に、医薬上許容される担体または賦形剤と共に処方される。例えば、適当な担体は、水、セイライン、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組み合わせである。さらに所望される場合には、担体は、湿潤剤またはエマルジョン試薬のごとき微量の補助物質およびpＨ緩衝試薬を含有していてもよい。チメロサール、フェノールおよび他のフェノール性化合物のごとき当該分野に知られている保存料も、抗菌剤と同様、本発明のワクチン組成物に添加することができる。適当なワクチン担体および添加物は当業者に知られているか、または明らかであろう。例えば、レミングトンズ・ファーマシューティカル・サイエンシーズ（Rmington's Pharmaceutical Sciences）、マック・パブリッシング・カンパニー（Mack Publishing Company）、イーストン（Easton）、ペンシルバニア（Pennsylvania）、第１８版、１９９０年参照のこと。ワクチンの効果を増強するアジュバントも、処方に添加されてもよい。アジュバントは、例えば、ムラミルジペプチド、アブリジン、水酸化アルミニウム、油、水中油エマルジョン、サポニン、サイトカイン、および他の当該分野に知られている物質を包含してもよい。タンパク質は、それの免疫原性を増加させるために担体に結合していてもよい。適切な担体は、血清タンパク質、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、卵白アルブミン、および当業者によく知られている他のタンパク質を包含する、徐々に代謝される大きな高分子；セファロース、アガロース、セルロースビーズ等のごとき多糖類；ポリグルタミン酸、ポリリジン等のごときアミノ酸のポリマー；アミノ酸のコポリマー；および不活性のウイルス粒子を包含する。エイメリア抗原はその天然形態で使用するか、または官能基をこれらの担体結合用に修飾してもよい。前記にて説明したごとく、鳥類種は、ＧＡＬＴまたはパイエルのパッチと呼ばれる腸結合リンパ組織、気管支結合リンパ組織（ＢＡＬＴ）、および眼球の前面および後中部に位置するハーダー腺からなる粘膜性免疫ネットワークを有する。これれらの組織に抗原を与えることによって、分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）の最終的な産生と共に、体内の分泌組織および腺へのコミッティドＢ細胞の増殖および撒布を誘発する。ｓＩｇＡは、粘膜表面に集落形成し、次いで、これを貫通する特異的表面抗原の集落形成および侵入を遮断するように働く。腸のｓＩｇＡ系は、エイメリアに対する防御免疫応答において本質的な役割を果たしているように思われる。デイビス・ピー・ジェイ（Davis，P．J.）ら、イムノロジー（Immuno logy）（１９７８年）第３４巻：８７９−８８８頁。従って、本発明のエイメリア抗原をＧＡＬＴおよびＢＡＬＴの細胞内に侵入し増殖し得る無毒の担体微生物を用いて投与してもよい。かかる薬剤デリバリーは、体液性および細胞性免疫応答同様、全身的な分泌性免疫応答を可能にする。例えば、エイメリア抗原に関する遺伝子を含有する組換えプラスミドを、抗原を鳥類対象に送達するように設計されたいくつかの無毒の細菌株のうちの１つに導入することができる。かかる無毒の生物は、一般に、長期間生存するのに必要な遺伝子中に変異を有しており、サルモネラ(Salmonella）、イー・コリ（E．coli）およびイー・コリ、サルモネラハイブリッドの変異誘導体を包含する。かかる変異体は、例えば、カーティス・アール・ＩＩＩ（Curtiss，R．III）ら、インフェクト・イミュン（Infedct． Immun.）（１９８７年）第５５巻：３０５３−３０４３頁および米国特許第４, ９６８,６１９号；４,８８８,１７０号ならびに４,１９０,４９５号に記載されており、出典明示によりこれら内容全体を本明細書の一部とする。さらに、タンパク質を、天然または塩のいずれかの形態としてワクチン組成物中に処方してもよい。医薬上許容される塩は、酸付加塩（活性ポリペプチドの遊離アミノ基で形成）を包含し、それらは、例えば、塩酸もしくはリン酸のごとき無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等のごとき有機酸で形成される。遊離カルボキシル基から形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニム、水酸化カルシウムまたは水酸化鉄のごとき無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から誘導してもよい。有効量の前記した１つまたはそれ以上の抗原を混合することによりワクチン処方を調製することができ、その正確な量は当業者により容易に決定される。本発明の目的に関して、抗原性ワクチン組成物の「有効量」は、コクシジウム症疾病の徴候を阻止または減少させるために十分な量の循環性抗体を産生させるのに必要な量である。エイメリア抗原の有効量は、投与方法、標的とするエイメリアの個々の種、必要とする防御の程度および治療すべき対象の年齢ならびに健康状態に依存して変化する。しかしながら、かかる量は実施例を用いて当業者によって容易に決定され、例えば、非経口的に投与される組成物については、一般に、約０.５ないし約１０ｍｌ、好ましくは約１ｍｌないし３ｍｌ中、約１０μｇないし約１ｍｇの間、より好ましくは約２５μｇないし約２００μｇの間、最も好ましくは、約５０μｇないし約１００μｇの間の量が抗原の有効量となる。本発明のワクチン組成物を、非経口的に、例えば、筋肉内、皮下、静脈内、または腹腔内注射により投与することができる。ＧＡＬＴまたはＢＡＬＴの好ましい応答を刺激するために、エア・サック（air sac）および気管内投与と同様、経口投与、経鼻内投与、胃挿管による投与もしくはエアロゾル投与のようなワクチン組成物を胃または気管支に直接導入することもまた望ましい。例えば、経口投与を行うために、簡単には、ワクチンを鳥類対象に与える水中に直接入れることができる。本発明ワクチンの他の適当な投与方法は、例えば、結膜を経由してハーダー腺に導入するか、または孵化前に鳥類の卵に接種することによるインオボ投与である。これらの投与経路の組み合わせも使用することができる。例えば、最初の投与を非経口投与にて行い、その後の追加免疫を経口投与してもよい。少なくとも１回の投与、好ましくは２回またはそれ以上の投与でワクチン処方を投与することにより鳥類対象を免疫する。しかしながら、コクシジウム症に対する免疫状態を維持するために必要な回数だけ動物に投与してもよい。例えば、追加免疫を通常の間隔、即ち、６ヶ月毎または１年毎に行って、有効なレベルの免疫を維持することができる。Ｃ．実験以下は、本発明を実施するための具体例である。実施例は説明のためにのみ示されるのであって、本発明の範囲を限定することを意図とするものではない。使用した数値（例えば、量、温度等）について正確さを保証するための努力を行ったが、いくつかの実験誤差および偏差はもちろん許容されるべきである。エイメリア spp.の抗原を、時に、それらのキロダルトン（ｋＤａ）での分子量を引用して実施例において同定している。かくして、約３５ｋＤａの分子量を有する抗原は以下にＰ３５として同定され；約４０ｋＤａの分子量の抗原はＰ４０として同定される等である。以下の頭字語が実施例において用い、次のように定義される。ＵＩ／ＵＣ、非免疫化、非感染（感受性）ＵＩ／Ｃ、非免疫化、感染ＮＥ／ＵＣ、自然曝露、非感染（「トリックルフェッド（tricklefed）」ともいう）ＮＥ／Ｃ、自然曝露、感染ＳＬＩＰ、脾臓リンパ球免疫産物ＣＬＩＰ、盲腸リンパ球免疫産物ＲＡＴ、直腸抗体試験体ＣＤＡＴ、ケージドロッピング抗体試験体ＭＡｂ、モノクローナル抗体ｓｐｚ、細胞外スポロゾイトｍｒｚ、細胞外メロゾイト実施例１屋内飼育の自然曝露（ＮＥ）モデルの確立および試験血清学的にタイプ分けし、前もってＭＨＣ部位（Ｂ複合体）で異なることが決定されているニワトリ（Ｂ¹⁹Ｂ¹⁹、Ｂ²⁴Ｂ²⁴およびＢ³⁰Ｂ³⁰、ニューハンプシャー・ポートリー・リサーチ・センター（New Hampshire Poultry Research Cente r））をワイヤーケージの中で飼育した。ニワトリに薬剤無添加初発／成長用の飼料および水を適宜与えた。生後１日目のニワトリの群（ＮＥ／Ｃ）を、Ｌ．Ｓ .６５株（ニューハンプシャー大学のディー・ストラウト（D．Strout）から提供された）から得た５００個のイー・テネラ卵母細胞で経口的に５日間連続して免疫した。特記しない限り、すべてのトリックル（Trickle）免疫および曝露感染は、イー・テネラＬ.Ｓ.６５株で行った。同様に、対象群（ＵＩ／Ｃ）を蒸留水で免疫した。寄生虫に曝露した最終日から６、８、１１または１５日目に鳥の体重を測定し、３.５ｘ１０⁴個のイー・テネラ卵母細胞に感染させた。体重増加の平均および盲腸傷害を感染６日後に調べた。トリックル免疫されたニワトリにおける同種感染に対する免疫期間は少なくとも２週間であることがわかった。３種すべてのハプロタイプ由来のＮＥ／Ｃの鳥は、試験時点におけるその対応するＵＩ／Ｃよりも有意に体重増加が大きく、病変が少なく、このトリックル免疫方法が同種の寄生虫の感染に対して防御を与えるという考えを支持する。したがって、感染後の種々の時点でＮＥ／ＵＣ、ＮＥ／ＣおよびＵＩ／Ｃの鳥から得られた試薬は、以下の寄生虫感染後に存在する異なるレベルの免疫性を表す。実施例２屋内飼育のＮＥモデルからのＳＬＩＰおよびＣＬＩＰ試料の調製ＳＬＩＰ試料の調製のために、所望の時点において脾臓を摘出し（典型的には一群当たり４〜６個）、標準的なヒストパーク（Histopaque）１０７７遠心機（ミズーリ州セントルイスのシグマ社（Sigma））を用いて単球細胞を単離した。生細胞をトリパンブルーおよび血球計数板を用いて計数し、無血清改変ＬＭ−ｈａｌｎ培地（ＬＭＨ）（カルネック（Calnek）ら、インフェクション・アンド・イミュニティー（Infect．Immun.）（１９８１年第３４巻：４８３−４９１頁）中５ｘ１０⁶細胞／ｍｌの密度で５日間（４０.５℃、５％ＣＯ₂）培養した。上清を集め、遠心（８００ｘｇ、１０分、４℃）し、無細胞上清を集めた。ナトリウムアジドを最終濃度０.１％（ｖ／ｖ）まで添加し、試料を濾過（０.２μＭ）した。ＳＬＩＰ試料を４℃で２週間まで保存するか、またはアリコートを調製し、使用するまで凍結した。ＣＬＩＰ試料の調製のために、所望の時点で一羽の鳥から両方の盲腸ポウチをとり（典型的には、一群当たり４〜６羽）、標準的方法により腸リンパ球を単離した。簡単には、盲腸ポウチを回腸盲腸接合部位において切断し、遠位末端を切り出し、次いで、盲腸内容物を押し出した。組織をｃＨＢＳＳ（２ｘ抗生物質／アンチマイコティック（antimycotic）、２５ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４を含有し、Ｃａ²⁺およびＭｇ²⁺を含有しないＨＢＳＳ）を含有する試験管中に入れ、さらなる操作を行うまで氷上に置いた。さらに腸内容物を除去するために、試験管を１０秒間激しく振盪し、次いで、組織を重力で沈降させた後Ｓ／Ｎを捨てた。盲腸組織をペトリ皿中に置き、次いで、各々の盲腸を水平に開いた。粘膜表面を静かにこすって、糞便内容物のすべての残存クランプを除去し、次いで、組織を１−２ｃｍの切片に切り刻んだ。組織断片を１０−２０ｍｌのｃＨＢＳＳの入った５０ｍｌの試験管に入れ、次いで、試料を手で激しく１０−２０秒間振盪し、次いで、低速で遠心分離（７０ｘｇ、１分、室温）した。Ｓ／Ｎを捨て、次いで、１０−２０ｍｌの新鮮なｃＨＢＳＳを組織に添加した。振盪／遠心分離工程をさらに２回繰り返し、次いで、試料あたり１０−２０ｍｌのｃＨＢＳＳ／ＤＴＴ（１０ｍＭＤＴＴ、１ｘゲンチシンおよび硫酸ポリミキシンＢ）を添加した。組織のペレット化を防止するために試験管を軽く振盪し、プラットホームシェイカー上で水平位置にして２０分間（１５０ｒｐｍ、室温）インキュベートし、次いで、上記のごとく低速で遠心した。Ｓ／Ｎを捨て、次いで、残存するＤＴＴを除去するためにさらに２回組織を低速遠心で洗浄した。新たに調製した約１０ｍｌのｃＨＢＳＳ／ＥＳ（１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（クロストリジオペプチダーゼＡ、タイプＶＩＩ、シグマ社を含有するｃＨＢＳＳ）を添加し、次いで、挽いた組織溶液をスタラーバーを入れたガラスフラスコに入れた。試料を複数のマグネティックスタープレートで６０分間（３７℃）緩やかに撹拌（４００−５００ｒｐｍ）し、次いで、溶液を５０ｍｌ容試験管に移し、次いで、低速遠心してすべての移された組織断片をペレット化させた。次いで、所望細胞を含有するＳ／Ｎを注意深く注ぎ出し、次いで、さらなる操作を行うまで氷上に保存した。ｃＨＢＳＳ／ＥＳ処理をさらに１回繰り返し、次いで、２回目のインキュベーションから得た所望細胞を最初の酵素処理をした細胞と共に貯留した。細胞をペレット化させ（４５０ｘｇ、１０分、４℃）、次いで、４０％等張パーコール／ｃＨＢＳＳ中に均質に再懸濁した。再懸濁体積は、細胞ペレットのサイズに依存した。典型的には、１０⁸個の細胞あたり９ｍｌの４０％パーコールを用いた。４０％細胞懸濁液約３ｍｌを１５ｍｌの試験管中の同体積の７０％等張パーコール上に静かに重層し、遠心（６００ｘｇ、２０分、４℃）し、次いで、４０／７０細胞界面を集めた。この方法を用いて、上皮細胞中および基底膜の両方の盲腸腸リンパ球を、４０／７０細胞界面中において一緒に単離した。細胞をｃＨＢＳＳ中で３−４回洗浄し（４５０ｘｇ、１０分、４℃）、生細胞数を調べ、次いで、脾臓リンパ球に関して上記したごとく５日間培養した。ＣＬＩＰ試料を調製し、次いで、ＳＬＩＰ試料について上記したごとく貯蔵した。実施例３腸消化物からのＲＡＴおよびカゴ中の新鮮な排泄物からのＣＤＡＴの調製ＲＡＴについては、回腸盲腸接合部から総排泄腔までの糞便（典型的には、一群当たり４〜６羽）を集め、次いで、あらかじめ秤量しておいた５０ｍｌコニカルチューブに入れた。ＣＤＡＴについては、カゴ中の新鮮な排泄物をゴミ皿から集め、次いで、あらかじめ秤量しておいた５０ｍｌコニカルチューブに入れた。試料の正味の重量を計り、次いで、１ｇの糞便につき３ｍｌのダルベッコのリン酸緩衝化セイライン（ＤＰＢＳ）を添加した。試料を中速で１５−２０秒間ボルテックス撹拌し、糞便を再懸濁した。試料を遠心し（２７５０ｘｇ、４℃、１５分）、次いで、糞便のペレット上の上清を３０ｍｌのソーバルＧＳＡ−６００ローターチューブに移した。試料を遠心し（３２,５７１ｘｇ、４℃、２０分）、次いで、ペレット上の上清をきれいな試験管に移した。試料ｐＨを調べ、次いで、必要ならばｐＨ６.５ないし７.０に調整した。プロテアーゼ阻害剤（１ｍＭ、１,１０−フェナンスロリン、１ｍＭベンツアミジン塩酸水和物、１０μｇ／ｍｌペプスタチン、０.５ｍＭＰＭＳＦ（すべて最終濃度））を添加し、次いで、アジ化ナトリウム（最終濃度０.１％）を添加した。使用まで、試料を−２０℃で保存した。実施例４インビトロ寄生虫中和アッセイＣＬＩＰ中に存在する細胞外スポロゾイトに対するＢ細胞由来の抗体を測定するために、対照およびトリックル免疫されたＢ²⁴Ｂ²⁴ならびにＢ³⁰Ｂ³⁰の鳥を実施例１に記載のごとく調製した。最後の寄生虫曝露後１３日目に、３.５ｘ１０⁴ 個の卵母細胞に鳥を感染させ、次いで、実施例２記載のごとく感染後１、３および５日目にＣＬＩＰ試料を調製した。ロッカープラットホーム上で１ｍｌの試料を同体積の新たに採取したＬ.Ｓ.６５イー・テネラ・スポロゾイト（５ｘ１０⁵ 個／ｍｌ）と共にインキュベーションした（１時間、４０.５℃）。次いで、混合物を前もって２４時間プレートしておいた（１９９培地／５％ＦＢＳ）１ｘ１０⁵個／ウェルのＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１０４９５）を含有するマイクロタイターウェル中に４系にして直接添加した。２時間後（４０.５℃５％ＣＯ₂）、細胞外スポロゾイトを洗浄により除去し、次いで、ウェルあたり１μＣｉの力価決定済みのウラシル（アマシャム社（Amersham）、５ｍｃｉ／ｍｍｏｌ）を添加した。２４時間インキュベーション後（４０.５℃、５％ＣＯ₂）、細胞をガラスファイバーマット（ＭＡＣＨハーベスター、トムテック（TomTech）オレンジ（Orange）、コン（Conn.））上に集め、次いで、放射活性の取り込みを測定した（マトリックス９６、バージニア州スターリング、パッカード・インスツルメント・カンパニー（Pacchard Instrument Co.））。阻害のパーセント値を、試料の処理ウェルの１分間あたりの平均カウント（ｃｐｍ）を無処理ウェルの１００％時間におけるｃｐｍ値で割った値（平均ｃｐｍ値は、極端な値を除外するためにディクソンズ・アウトライヤー・テスト（Dicksons O utlier Test）（ディクソン・ダブリュ・ジェイ（Dickson，W．J.）、バイオメトリックス（Biometrics）（１９５３年）第９巻：７４−８９頁）を用いて求めた４系の平均値に等しい）として計算した。ＣＬＩＰスポロゾイト中和活性の反応動力学は、感受性および感染免疫された鳥の間で異なる。感染１日後には、両方のＮＥ／ＣハプロタイプからのＣＬＩＰはＵＩ／Ｃグループ由来のＣＬＩＰと比較すると、有意に高い寄生虫中和活性を有していた。感染３日後には、Ｂ²⁴Ｂ²⁴ ハプロタイプ由来のＮＥ／ＣのＣＬＩＰのみが高い寄生虫中和活性を有していた。感染５日後には、いずれのハプロタイプにおいても感受性および免疫グループ間の測定可能な活性の相違は観察されなかった。これらの結果は、ＮＥ／Ｃの鳥からのＣＬＩＰの抗寄生虫活性は、寄生虫感染後、感受性の鳥に対して免疫された鳥においてより早く出現することを示す。特定の分子量の細胞外スポロゾイト抗原がこれらの抗体含有ＣＬＩＰ試料により認識されるかどうかを調べるために、種々の程度の中和活性を示す試料を、イー・テネラｓｐｚ抗原に対するウエスタンブロットによりスクリーニングした（実施例７参照）。結果は、分子量４３ｋＤａ、４０ｋＤａ、３８ｋＤａおよび２６ｋＤａのスポロゾイト抗原に対する強力なＩｇＧ反応性を有するＣＬＩＰ試料は、高レベルの抗スポロゾイト中和活性を有することを示した。これらの結果は、これらの抗原が寄生虫複製部位において盲腸リンパ球により産生されたＩｇＧにより認識されることを示す。最終的にこれらの結果は、免疫されたＣＬＩＰにおける抗原特異的ＩｇＧがＴ細胞依存性免疫機構により産生されることを明確に示す。実施例５インビトロ寄生虫阻害アッセイＣＬＩＰ中に存在する可溶性のＴ細胞由来の抗寄生虫因子を測定するために、実施例４においてＵＩ／ＣおよびＮＥ／ＣのＢ²⁴Ｂ²⁴およびＢ³⁰Ｂ³⁰鳥から得られた同じＣＬＩＰ試料をアッセイに用いた。アヒル・胚（ＤＥ）細胞系（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ１４１）を１ｘ１０⁴細胞／ウェルで平らな９６穴マイクロタイタープレート（１９９培地／５％ＦＢＳ中）に撒いて一晩おいた（４０.５℃ 、５％ＣＯ₂）。次いで、細胞を２系にした、０.２ｍｌ／ウェルのＣＬＩＰ試料の１０²倍希釈物で前処理した。細胞の一方の列を培地のみで処理した（対照）。２４時間インキュベーション後（４０.５℃、５％ＣＯ₂）、試験ＣＬＩＰの新鮮な希釈物、１ｘ１０⁵個／ウェルの新たに採取した細胞外イー・テネラ・スポロゾイト（実施例７に記載したようにして得た）、およびウェルあたり１μＣｉの力価決定済みのウラシルを添加した。２４時間インキュベーション後（４０.５ ℃、５％ＣＯ₂）、細胞をガラスファイバーマット上に集め、次いで、放射活性の取り込みを調べた。阻害のパーセント値を、実施例４記載の方法と同様の方法で、即ち、試料処理ウェルの平均ｃｐｍ値を１００％時間における培地対照ウェルのｃｐｍ値で割ることにより計算した。ＣＬＩＰ寄生虫阻害の反応動力学は、感受性および免疫感染鳥との間で異なっていた。感染１日目には、両方のＮＥ／Ｃハプロタイプ由来のＣＬＩＰは、ＵＩ／Ｃ群由来のＣＬＩＰと比較すると、有意に高い寄生虫中和活性を有していた。感染３日目には、Ｂ²⁴Ｂ²⁴ハプロタイプ由来のＮＥ／ＣのＣＬＩＰのみが、より高い寄生虫阻害活性を有していた。感染５日目には、いずれのハプロタイプにおいても感受性および免疫群との間において阻害活性の有為な相違は観察されなかった。これらの結果は、細胞内寄生虫形態に対して指向された、ＣＬＩＰにおける抗寄生虫活性が、寄生虫感染後の感受性の鳥に対して免疫された鳥においてより速やかに出現することを示す。これらのＮＥ／ＣのＴ細胞由来のサイトカインのピークの阻害活性は、実施例４において得られたＮＥ／ＣのＢ細胞由来の抗体のピークの阻害活性に対応している。ＮＥ／Ｃの鳥において感染後２４時間までには、盲腸内面に局在する抗原特異的Ｔ_H２細胞は、抗体産生および細胞外スポロゾイト中和を促進する特異的サイトカイン（ＩＬ５およびＩＬ６がその可能性がもっとも高いが）を産生する。しかし、おそらく、抗原特異的Ｔ_H１細胞の誘導および細胞内で複製している寄生虫に直接影響を及ぼす抗寄生虫サイトカイン、おそらくインターフェロン− ガンマおよび腫瘍壊死因子ベータの分泌が同時にあることがより重要であろう。従って、同じＣＬＩＰ試料を、抗体および細胞により媒介される免疫エフェクター分子の両方を測定するために使用することができる。実施例６ＲＡＴにおける全ＩｇＡおよびスポロゾイト特異的ＩｇＡの定量ＲＡＴ試料中の全ＩｇＡの定量のために、マウス・抗ニワトリＩｇＡＭＡｂ（ニューヨーク州イサカのコーネル大学のエス・ナキ（S．Naqi）博士から、腹水として手にいれたＭＡｂ6.2.3-1）、またはＭＡｂＪ126.189.96（ジャンセン・バイオケミカ（Janssen Biochemica）社）を、５０ｍＭホウ酸ナトリウム（p Ｈ９.５）に１：５００で希釈した。ウェルあたり１００マイクロリットルをＥＬＩＳＡマルチウェルプレート（ヌンク・イムノプレート・マキシソルブ・Ｆ９６（Nunc ImmunoPlate Maxisorb）、デンマークのヌンク社製）に添加し、次いで、４０℃で（２時間）または４℃で（一晩）インキュベートした。プレートを３ＸのＰＢＳＴ（リン酸緩衝セイライン／０.０５％ツイン（Tween））で洗浄し、次いで、ＰＢＳＴ／５％スキムミルク（ディフコ（Difco）００３２−０１− １）で２時間（４０℃）または一晩（４℃）遮断した。次いで、プレートを３ＸＰＢＳＴで洗浄した。試験ＲＡＴ試料を最初にＰＢＳＴ／５％ミルクで１：１００に希釈し、次いで、連続的な２倍希釈物を２系にしてウェルに添加した（１００μｌ／ウェル）。ＩｇＡを含有する対照血清（ベシル・ラボ（Bethyl Labs ）ＲＳ１０−１０２−１）の連続的な２倍希釈物（最初の濃度４.０μｌ／ｍｌ）を、同様にして各々のプレートに調製した。プレートを４℃で一晩インキュベートした。最初のＲＡＴ抗体インキュベーションは試料の内在性プロテアーゼ活性を減じるために４℃で行った。プレートを３ＸＰＢＳＴで洗浄し、次いで、１００μｌ／ウェルの１：５００希釈（ＰＢＳＴ／５％ミルク）のヤギ・抗ニワトリＩｇＡ接合ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ベシル・ラボ（Bethyl L abs）、Ａ３０−１０３Ｐ−３）を１時間（４０℃）添加した。プレートを３ＸＰＢＳＴで洗浄し、１００μｌ／ウェルのＴＭＢペルオキシダーゼ基質／ペルオキシダーゼ溶液（キルケガード・アンド・ペリー（Kirkegarrd & Perry））の添加によって発色させた。５−３０分後、反応を１０μｌ／ウェルの１ＮＮaＯＨの添加により停止した。４５０ｎｍの吸光度をＶＭＡＸＥＬＩＳＡプレートリーダー（モレキュラー・デバイシーズ（Molecular Devices）で測定した。ＶＭＡＸプログラムをＩｇＡ対照標準曲線に基づいた未知の濃度を計算するために使用した。スポロゾイト特異的ＩｇＡＲＡＴ試料の定量用には、プレートを１００μｌ／ウェルの超音波処理したイー・テネラ抗原（３μｇ／ｍｌ）で２時間（４０℃ ）または一晩（４℃）被覆したことを除いて、同様の手順が行われた。対照血清の捕獲のために、２列を上記のごとく抗ニワトリＩｇＡＭＡｂで被覆した。アッセイの残りは、ＲＡＴ試料を最初に１：１希釈で試験した以外は、全ＩｇＡＥＬＩＳＡについて上記したようにして行った。実施例７イムノブロット以下の方法を以下のいくつかの実施例のために使用した。イムノブロットは、以前に公開された方法（ジェイ・ティー・ローリッヒ（J．T．Roehrig）ら、ビロロジー（Virology）、（１９８５年）第１４２巻：３４７−３５６頁およびエイチ・トウビン（H．Towbin）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンシーズ・ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．USA）（１９７９年）第７６巻：４３５０−４３５４頁）を変形した。イー・テネラ（Ｌ.Ｓ.６５）卵母細胞を産生し、次いで、ニワトリに感染させて維持した。純粋な卵母細胞およびスポロゾイトを、本質的に、前にシュルツ・ディー・エム（Schultz，D． M.）らによってジャーナル・オブ・プロトゾロジー（J．Protozol.）（１９８４年）第３１巻：１８１−１８３頁に記載されたようにして得た。スポロゾイトおよびメロゾイト抗原は、スポロゾイトおよびインビトロメロゾイトを０.５ｍＭフェニルメチルフルホニルフルオリド（カリフォルニア州ラジョラのカルバイオケム−ベーリング社）含有ＰＢＳに再懸濁することによって得られた。溶液をドライアイス上で３回凍結融解を行い、次いで、氷上で１分間１／２パルス、８０％デューティー・サイクルを用いて超音波処理した。各々１分間の５サイクルの後、試料をマイクロ遠心チューブに移し、次いで、４℃で１０,０００ｘｇ、１０分間遠心した。ペレット上の可溶性物質を集め、次いで、標準的方法を用いてタンパク質濃度を決定した。超音波処理した寄生虫調製物は、無血清培地１９９で１ｍｇ／ｍｌになるようにし、一部取って、さらなる使用のために−２０℃で貯蔵した。イー・テネラの超音波処理したスポロゾイトまたはメロゾイト、および非感染またはイー・テネラＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７の３０％および４５％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ４４−７２時間組織培養タンパク質（１０μｇ／レーン）を、１０％、１２.５％、または４−２０％ポリアクリルアミド調製用ミニゲル（ユー・ケイ・レムリ（U．K．Laemmli）、ネイチャー（１９７０年）第２７７巻：６８０−６８５頁）（ＭＡハイドパークのインテグレイティド・セパレイションズ・システムズ（ Integrated Separation Systems）社、ダイイチ・ゲルズ（Daiichi gels）)上で、高および低分子染色済みバイオラッド（BioRad）マーカー（バージニア州リッチモンドのバイオラッド社）を標準として用いて分離した。ブロモフェノールのマーカーが分離ゲルの底辺に移動して溶出し始めた時点でゲルを停止した。分子量決定は平均ゲル移動度（ｎ＝５）に基づいた。タンパク質をイモビロン−Ｐ（Immobilon-P）（０.４５μＭ、マサチューセッツ州ベッドフォード（Bedford）のミリポア・コーポレーション（Millipore Cor p.））膜上にイムノブロット（一晩、４０ｍＡ、４℃）した。必要ならば、その後の操作に先だって、膜を所望の大きさの断片に切断した。膜または膜断片をＴＴＢＳ（洗浄緩衝液、トリス（Tris）緩衝セイライン／０.０１％ツイン２０）で３回洗浄した。以下のすべてのインキュベーション工程の間で、膜を洗浄緩衝液ですすいだ。ＳＬＩＰ、ＣＬＩＰおよび血清抗体インキュベーションに用いるブロットは、ＴＴＢＳ／２％スキムミルク／１％ゼラチンで最低２時間（室温）遮断し；ＲＡＴインキュベーションに用いるブロットは、ＴＴＢＳ／３％ＢＳＡで最低６時間遮断した。いくつかの例において、ブロットは一晩（室温）遮断された。最初のＳＬＩＰ、ＣＬＩＰおよび血清抗体インキュベーションでは、試料をＴＴＢＳ／１％ゼラチン／０.１％ＮａＮ₃で、各々１／２、１／２、および１／５００に希釈し；最初のＲＡＴインキュベーションでは、試料をＴＴＢＳ／３％ＢＳＡ／１０％ＦＢＳで１／５に希釈した。すべての一次抗体インキュベーションは一晩（室温）行った。ＳＬＩＰ、ＣＬＩＰおよび血清試料からの結合したニワトリＩｇＧの検出には、ヤギ・ホスファターゼでラベルされた抗ニワトリＩｇＧ（キルケガード・アンド・ペリー）を１／１０００希釈（ＴＴＢＳ／０.１％ＢＳＡ）で用いた。ウサギ・血清からの結合したウサギＩｇＧの検出には、マウス・ホスファターゼラベル・抗ウサギＩｇＧ（キルケガード・アンド・ペリー）を１／１０００希釈（ＴＴＢＳ／０.１％ＢＳＡ）で用いた。ＣＬＩＰおよびＲＡＴ試料からの結合したニワトリＩｇＡの検出には、ヤギ・抗ニワトリＩｇＡ（テキサス州モントゴメリーのベシー・ラボ（Bethy Labz）社）を１／５００希釈（ＴＴＢＳ／３％ＢＳＡ／１０％ＦＢＳ）で用い、最低２時間（室温）インキュベーションし、その後、ホスファターゼラベル・ウサギ・抗ヤギＩｇＧ（キルケガード・アンド・ペリー）を１／１０００希釈（ＴＴＢＳ／３％ＢＳＡ／１０％ＦＢＳ）でインキュベーションした。すべてのホスファターゼのインキュベーションは１時間（室温）行った。免疫検出には、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ１コンポーネント・サブストレイト・システム（component substrate system）（キルケガード・アンド・ペリー）を推奨される濃度で使用した。ブロットは５ないし１５分間発色させ、次いで、水ですすぐことにより反応を停止した。実施例８屋内飼育ＮＥモデルＲＡＴ試料における全ＩｇＡレベルおよびスポロゾイト特異的ＩｇＡレベルの決定および疾病の防御との相関ＲＡＴ試料を、異なる休息期間後のＮＥ／ＵＣおよびＮＥ／ＣのＢ¹⁹Ｂ¹⁹鳥から調製した。生後１日目のヒヨコを５００個のイー・テネラ卵母細胞で５日間連続してトリックル免疫した。次いで、最後の寄生虫曝露の後１０、１７および２４日目に１０羽／群の体重を測定し、次いで、偽の感染または３.５Ｘ１０⁴の均質な卵母細胞で感染させた。年齢を一致させた感受性の鳥の群も体重を測定し、次いで、感染させた（ＵＩ／Ｃ）。感染後２日目に１群あたり５羽の鳥からＲＡＴ試料を調製した。感染後６日目に、残りの鳥の体重を測定し、次いで、ＵＩ／Ｃ鳥に比較してＮＥ／Ｃ鳥の体重増加を測定した。ＲＡＴ試料を全ＩｇＡおよびスポロゾイト特異的ＩｇＡ濃度の両方についてアッセイした。寄生虫の感染後、全ＩｇＡレベルの実質的な増加が観察された。その増加は、調べた休息期間に依存していた。１０または１７日間の休息期間の後の感染後２日目に、ＮＥ／ＵＣ鳥に比較してＮＥ／Ｃ鳥において全ＩｇＡレベルが上昇しており、このことは寄生虫感染が結果としてＩｇＡ記憶応答を刺激することを示した。寄生虫曝露後２４日後には、全ＩｇＡにおける顕著な増加は検出されず、このことは記憶応答が衰え始めたことを示した。ｓｐｚ特異的ＩｇＡの結果は、２４日間ではなく１０および１７日間の休息後の寄生虫感染後のＩｇＡ濃度が増加したことに似ている。２４日間の休息後には抗体増加が見られないが、１０または１７日間の休息後の寄生虫曝露後の全ＩｇＡおよびｓｐｚ特異的ＩｇＡレベルにおける増加は、得られた体重増加のデータに矛盾しない。ＮＥ／Ｃ群における体重減少に対する顕著な防御が、１０および１７日間休息後に観察されたが、２４時間休息後では見られなかった。これ、またはＥＬＩＳＡ由来の同様の方法を用いて、鳥のＲＡＴ中の全ＩｇＡおよびｓｐｚ特異的ＩｇＡの濃度を決定できる。その結果を、均質な寄生虫感染に対する防御に必要とされる最低の全ＩｇＡおよびｓｐｚ特異的ＩｇＡ力価を決定するために使用することができる。結果は、群れの免疫性をよりよく評価するためにも使用できる。実施例９屋外飼育ブロイラーから調製されたＲＡＴ試料における全ＩｇＡおよびスポロゾイト特異的ＩｇＡレベルの決定ワイヤーのカゴで飼育された家禽産業用ブロイラー系からのニワトリを本研究に使用した。生後１６日目の鳥を５００個のイー・テネラＬ.Ｓ.６５またはＬ. Ｓ.８０の卵母細胞で４日間連続してトリックル免疫し、２日間休息し、次いで、もう一度５００個の卵母細胞でトリックル免疫した。鳥を実質的に１４日間休息させ、均質な免疫化株の５０,０００個の卵母細胞で経口的に感染させ、再び１５日間休息させ、次いで、各々の群の一部を均質または不均質な免疫化株のいずれかで経口的に感染させた。感染後２および６日後、ＲＡＴ試料をすべての群から調製し（２−３羽／群）、次いで、全ＩｇＡおよびスポロゾイト特異的ＩｇＡ濃度をアッセイした。そのデータは、屋外飼育ブロイラーにおける全ＩｇＡおよびスポロゾイト特異的ＩｇＡレベルを、ＲＡＴＥＬＩＳＡを用いて測定することができること、およびＲＡＴレベルが免疫状態に相関していることを示している。例えば、高レベルのｓｐｚ特異的ＩｇＡが感染後６日目の免疫鳥（群６および９）において検出され、これらの値は感染後６日目の感受性の鳥（群２および３）から得られた値よりかなり高かった。その結果は、１つのイー・テネラ株に免疫された鳥（群４）は、２番目のイー・テネラ株に曝露された（群８）後のｓｐｚ特異的ＩｇＡレベルを増加させることも示した。得られた結果は、均質または不均質な種の感染に対する防御に必要とされる最低の全ＩｇＡおよびsｐｚ特異的ＩｇＡ力価を決定するために使用することができる。結果は、群れの免疫性をよりよく評価するためにも使用できる。実施例１０ＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７イー・テネラ感染４４−７２時間組織培養上清から調製された３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄抗原でワクチン免疫された感受性の屋内飼育鳥におけるイー・テネラ感染に対する防御ＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７４４−７２時間組織培養上清から調製した３０％（ＮＨ₄ ）₂ＳＯ₄抗原のインビボでの効率を３つの独立したワクチン試験において試験した。３つのすべてのバッテリー試験において、３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ４４−７２時間イー・テネラ抗原を生後４日目の屋内飼育Ｂ¹⁹Ｂ¹⁹ヒヨコを免疫するために使用した。ヒヨコの首の付け根の皮下にアンフィゲン（Amphigen）含有水中油エマルジョンでアジュバント化された抗原をワクチン注射した（全量１.０ｍｌ）。生後７日目に鳥を同じ量のワクチンで経口的に追加免疫した。年齢の一致した対照の鳥（ＵＩ／Ｃ）を免疫し、次いで、非感染Ｆ７細胞から得られたアジュバント化された組織培養培地で追加免疫した。生後１０日目にすべての鳥の体重を測定し、次いで、３.５Ｘ１０⁴個の芽胞化イー・テネラ卵母細胞で経口的に感染させた。生後１６日目に最終的な鳥の体重測定を行った。試験１において、鳥を１薬用量あたり約５０μｇ全タンパク質でワクチン化し、試験２および３においては、１薬用量あたり鳥を約１００μｇの全タンパク質でワクチン化した。非免疫化、非感染鳥（ＵＩ／ＵＣ）の群も３試験すべてにおいて使用した。最小二乗法およびＵＩ／Ｃ対照との比較値を用いて、体重増加の統計学的比較を行った。３つの屋内飼育の有効試験の結果を表１にまとめる。３つのすべてのワクチン化試験において、４４−７２３０％免疫化、感染鳥は、統計学的にＵＩ／Ｃ対照に比較して高い体重増加を示した。試験１において、ワクチン化された群もＵＩ／ＵＣ群に比較して数値的に高い体重増加を示した。これらの結果は、若い鳥におけるイー・テネラ感染に伴う体重の減少に対する防御が、イー・テネラ感染Ｆ７細胞系から調製された３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄可溶性寄生虫抗原画分によるワクチン化によって達成されることを示す。従って、この特別な抗原画分を、リード（lead）防御抗原の候補を同定するためのＳＬＩＰ、ＣＬＩＰおよびＲＡＴを包含するＮＥ／Ｃ免疫試薬のパネルを用いた広範なウェスタン解析および特徴付けのために選択した。実施例１１３つのＭＨＣハプロタイプから調製したＳＬＩＰを用いた、ＮＥモデルにおけるイー・テネラ抗原の同定ＳＬＩＰ試料をＵＩ／Ｃ、ＮＥ／ＵＣ、およびＮＥ／ＣのＢ¹⁹Ｂ¹⁹、Ｂ²⁴Ｂ²⁴ 、およびＢ³⁰Ｂ³⁰群から得た。鳥を５００個／羽のイー・テネラ卵母細胞で５日間トリックル免疫し、１３日間休息させ、次いで、３.５Ｘ１０⁴の均質な卵母細胞に経口的に感染させた。感染後１日目に、ＳＬＩＰ試料を上記のごとく調製し、次いで、イー・テネラの超音波処理したスポロゾイトおよびイー・テネラＳＢ −ＣＥＶ／Ｆ７感染細胞からの３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ４４−７２時間上清に対してのウェスタンの反応性についてアッセイした。ＳＬＩＰ試料のＩｇＧウェスタン反応性プロファイルを表２にまとめる。結果は、３つのすべてのＵＩ／Ｃハプロタイプの脾臓が、ｓｐｚ４０ｋＤａ抗原（本明細書では「Ｐ４０」という）に反応性のＩｇＧを産生することができるＢ細胞集団を含有することを示す。３つのすべてのＮＥ／ＵＣハプロタイプの脾臓が５００個の寄生虫卵母細胞での最後の曝露後１５日間、Ｐ４０に対して反応性のＢ細胞を含有するので、この抗原は免疫的優勢応答を誘導する。興味深いことに、この同じ脾臓Ｂ細胞集団は、Ｂ¹⁹Ｂ¹⁹およびＢ²⁴Ｂ²⁴ハプロタイプにおいては感染後１日目には存在せず、このことはこの集団が脾臓から移動したことを示唆する。結果は、ＮＥ／ＵＣ群が最後のトリックル免疫後１５日間これらの抗原に対して反応性のＢ細胞を含有するので、分子量１１０ｋＤａおよび７０ｋＤａ（各々「Ｐ１１０」および「Ｐ７０」という）を有するＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄抗原が免疫的優勢応答を誘導することも示す。要約すれば、これらの結果は、ｓｐｚＰ４０およびＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ Ｐ１１０およびＰ７０が、防御に重要なＭＨＣ非限定イー・テネラ抗原であることを示す。実施例１２３つのＭＨＣハプロタイプから調製されたＣＬＩＰを用いたＮＥモデルにおけるイー・テネラ抗原の同定ＣＬＩＰ試料を、上記実施例１０のごとく、感染後１および３日目にＵＩ／Ｃ、ＮＥ／ＵＣ、およびＮＥ／ＣのＢ¹⁹Ｂ¹⁹、Ｂ²⁴Ｂ²⁴、およびＢ³⁰Ｂ³⁰群から得た。これらの試料を調製し、次いで、イー・テネラの超音波処理したスポロゾイトおよびイー・テネラＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７感染細胞からの３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ４４−７２時間上清に対してのウェスタンの反応性についてアッセイした。ＣＬＩＰ試料の感染後１および３日目のＩｇＧウェスタン反応性プロファイルを各々表３および４に要約する。結果は、単一のＮＥ／Ｃハプロタイプおよび群内のＣＬＩＰ反応性プロファイルが感染後１および３日目で類似しているが明らかに異なることを示す。かくして、いくつかのＭＨＣ非限定ＮＥ／Ｃ小腸Ｂ細胞が感染後１および３日目に存在する一方（例えば、Ｐ７０およびＰ４０）、他のＭＨＣ非限定Ｂ細胞は感染後３日目まで存在しない（例えば、Ｐ４３）。さらに、ほとんど同一の１および３日目のＣＬＩＰ反応性プロファイルが３つのＮＥ／ＵＣハプロタイプで観察されたので、これらの抗原特異的Ｂ細胞の異なる存在は寄生虫感染の直接的結果である。さらに結果は、３つのすべてのＮＥ／ＵＣＭＨＣハプロタイプからの群が最後のトリックル免疫後１５日間これらの２つの抗原に対して反応性の小腸Ｂ細胞ＩｇＧを含有するので、ＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ Ｐ７０およびＰ３８抗原が、ＭＨＣ非限定免疫的優勢応答を誘導することを示す。結果は、３つのすべてのハプロタイプからのＮＥ／ＣのＣＬＩＰが、３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄物質に存在するＰ４０タンパク質を認識するが、超音波処理されたｓｐｚ調製物においては認識しないことも明らかに示す。これらの結果は、３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ Ｐ４０が、実施例１１で上記したｓｐｚＰ４０から区別されることを示唆する。さらに、感染後１および３日目の３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ プロファイルに対するｓｐｚの解析は、いくつかの免疫優勢細胞外特異的抗原（例えば、Ｐ１１０、Ｐ２８、Ｐ２６）、およびいくつかの免疫優勢細胞内特異的３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄抗原（例えば、Ｐ７０、Ｐ５５、Ｐ３８）を明らかにする。最終的に、１日目のＮＥ／ＣのＣＬＩＰプロファイルに対する１日目のＮＥ／ＣのＳＬＩＰ（実施例１１、表２）プロファイルの比較は、２つの生物学的コンパートメントの間の反応性パターンが異なることを示しており、このことはユニークで局在化した免疫応答が同じ免疫宿主内に同時に存在することを示す。実施例１３低または高卵母細胞感染後の２つのＭＨＣハプロタイプから調製したＲＡＴを用いたＮＥモデルにおけるイー・テネラ抗原の同定ＲＡＴ試料を、ＵＩ／ＣおよびＮＥ／ＣのＢ¹⁹Ｂ¹⁹、Ｂ²⁴Ｂ²⁴、およびＢ³⁰Ｂ³⁰ 群から調製した。鳥を５００個／羽のイー・テネラ卵母細胞で５日間トリックル免疫し、１６日間休息させ、次いで、あらかじめ決定した低または高用量の卵母細胞に経口的に感染させた。感染後２日目に、ＲＡＴ試料を調製し（３羽／群）、次いで、イー・テネラの超音波処理したスポロゾイトおよびイー・テネラＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７感染細胞からの３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ４４−７２時間上清に対してのウェスタンの反応性についてアッセイした。６日目の結果は、ＮＥ／Ｃ群における感染に対する防御は用量およびＭＨＣハプロタイプ依存的であったことを示す。どちらのＮＥ／Ｃハプロタイプも、低用量感染時の体重減少に対する有意な防御を示したが、Ｂ³⁰Ｂ³⁰のＮＥ／Ｃ群のみが、高用量感染時の体重減少に対して有意に防御した。しかしながら、Ｂ¹⁹Ｂ¹⁹ のＮＥ／Ｃ群は、傷害の有意な減少に基づく高用量感染に対する部分的な防御を示した。Ｂ¹⁹Ｂ¹⁹およびＢ³⁰Ｂ³⁰系の挙動が二分されることについての免疫学的基礎が、ＲＡＴ試料のＩｇＡウェスタン反応性プロファイルの調査によって研究された。ウェスタンの結果（表５および６）は、反応性プロファイルがパラメーター：感染用量、免疫状態およびＭＨＣハプロタイプの組み合わせに依存したことを示す。低用量の感染では、特異的抗原反応性が両方のＮＥ／Ｃハプロタイプで防御に相関しているように思われた。Ｂ¹⁹Ｂ¹⁹のＵＩ／ＣではなくＮＥ／Ｃ鳥がいくつかの抗原：３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ Ｐ１２０、Ｐ５５およびＰ２８、４５％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ Ｐ１２０、Ｐ５５およびＰ２８に応答した。高用量の感染では、特異的抗原反応性は、防御に相関してさらに困難であった。しかしながら、結果は明らかに、ＲＡＴプロファイルがＣＬＩＰおよびＳＬＩＰによってすでに同定されたいくつかのＭＷ抗原を同定したことを示す。実施例１４ＮＥモデルから調製された血清を用いたイー・テネラ抗原の同定血清試料をＵＩ／ＣおよびＮＥ／ＣのＢ¹⁹Ｂ¹⁹群から得た。鳥を５００個／羽のイー・テネラ卵母細胞で５日間トリックル免疫し、１４日間休息させ、次いで、３.５Ｘ１０⁴の均質な卵母細胞で経口的に感染させた。感染後１、３および５日目に、血清試料を心臓刺によって集め（５／群）、貯留し、次いで、イー・テネラの超音波処理したスポロゾイト、メロゾイトおよびイー・テネラＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７感染細胞からの３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ４４−７２時間上清に対してのウェスタンの反応性についてアッセイした。血清試料のＩｇＧウェスタン反応性プロファイルを表７に要約する。調べた感染後初期の時点から期待されたごとく、ＵＩ／Ｃ群からの血清はいずれのタンパク質も認識しなかった。感染後１ないし５日目にＵＩ／Ｃ鳥において検出可能なＩｇＧ血清免疫反応性の欠如、しかし同時点での他の生物学的コンパートメントにおけるエイメリア抗原に対する免疫反応性は（上記実施例のいくつかにおいて示されたごとく）、本発明の重大な観点の一つであることを強調し、即ち、血清のみを用いた抗体応答の解析および免疫優勢抗原の同定は、寄生虫の複製の部位で起こる局所の小腸ＢおよびＴ細胞免疫応答および細胞の交通事象を反映しない。感染後１日目に、ＮＥ／Ｃからの血清はｓｐｚおよび３０％（ＮＨ₄ ）₂ＳＯ₄ ４４−７２の両方にＰ３５が存在することを同定した。曝露後３日目には、ＮＥ／Ｃからの血清はｍｒｚ中にＰ３８が存在することを同定した。曝露後５日目には、Ｐ７０、Ｐ５５、Ｐ４３、Ｐ３８およびＰ３５のごとき多くの抗原が同定された。ＳＬＩＰ、ＣＬＩＰおよびＲＡＴを用いた本明細書の上記実施例において類似の分子量のタンパク質が記載されている。しかしながら、これらのタンパク質は一般には感染後１ないし３日目のより初期に同定された。これらのデータは、イー・テネラ抗原が初期には局所免疫応答（ＣＬＩＰ、ＲＡＴ）によって認識され、次いで、後には系統的免疫応答（血清）によって測定されるようになることを示唆する。従って、初期の局在化した記憶免疫応答の動力学的測定および特異性の決定は、防御免疫応答の誘導に重要な決定的なイー・テネラ抗原のさらに包括的で意味深い解析を提供する。実施例１５ＮＥ／ＣＣＬＩＰからのｓＩｇＡの精製１４羽のＢ¹⁹Ｂ¹⁹の鳥を、生後１０日目に５Ｘ１０⁴個のイー・テネラ卵母細胞で感染させ、次いで、生後２２および３６日目に同じ用量で感染させた。最後の感染後２日目に、ＣＬＩＰ試薬を実施例２に記載したごとく調製した。約４０ｍｌのＣＬＩＰを３５％の硫酸アンモニウムで処理した。４℃で１時間撹拌後、溶液を遠心（１６,８００ｘｇ）し、沈澱を集め、ＰＢＳに溶解し、次いで、ＰＢＳで透析した。ウェスタンブロットの結果は、ニワトリアルファ鎖に特異的なマウスＭＡｂ（コーネル、６：３−２）を用いたすべての反応性が、３５％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄沈澱中に存在し、３５％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄上清には検出可能な反応性が存在しないことを示す。次いで、ウェスタンに陽性の試料を５ｍｌのジャカリン（Jacalin）カラム（ピアス（Pierce）社）に流速０.５ｍｌ／分で適用し、次いで、吸光度（２８０ｎｍ）をモニターした。結合していないタンパク質を除去するためにカラムをＰＢＳ（３０ｍｌ）で洗浄し、次いで、画分を集め、貯留し、次いで、濃縮した。結合した物質を１００ｍＭメリビオース／ＰＢＳを用いて溶出し、次いで、最大の吸光度を有する画分を貯留した。未結合および結合貯留画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元）にかけ、次いで、銀染色およびウェスタンブロットにより解析した。銀染色は、いくつかの少量の不純物バンドと共に優勢にＰ７０種を示した。還元型アルファ重鎖の分子量は７０ｋＤａである。染色陽性画分の一部をスーパロース（Superose）６カラム（１.６ｘ５３ｃｍ）に流速０. ５ｍｌ／分で適用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色による集められた画分の解析は、主にＰ７０種を同定した。スーパロース６の分子量標準プロファイルに基づいて、分子量約１７０,０００ダルトンが示され、これはＩｇＡ単量体の存在を示す。実施例１６ＮＥ／ＣＲＡＴからのｓＩｇＡの精製ＲＡＴ試薬を集め、次いで、実施例１５で用いたのと同じ群の鳥から集めて調製し、次いで、同様の方法で精製した。ジャカリン（Jacalin）カラムからの溶出物をｓｐｚ特異的ＩｇＡＥＬＩＳＡにおける陽性を試験し、スーパーロース６カラムに適用し、個々の画分を集め、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色で解析した。結果は、Ｐ７０種が初期および後期の画分に共に存在することを示した。ＳＭＡＲＴシステム（ファルマシア社、スーパーロース６カルム）を用いてＰ７０について陽性に染色された個々の画分の解析は、四量体ｓＩｇＡ（７００,０００ｋＤａ）が初期の画分に存在し、二量体ｓＩｇＡ（３５０,０００ｋＤａ）は後期の画分に存在することを示唆した。抗ニワトリＩｇＡプローブのみが四量体ＩｇＡに反応した。これらの結果は、ｓＩｇＡの四量体および二量体形態は共に免疫ＲＡＴに見られ、本明細書に記載の方法を用いて精製できることを示す。実施例１７ＮＥ／Ｃモデルから得られた精製ｓＩｇＡを用いたイー・テネラ抗原の同定ＣＬＩＰ二量体ｓＩｇＡを含有する画分（実施例１５）を、イー・テネラ感染ＳＢ−ＣＥＶ３０％および４５％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ４４−７２時間上清中に存在する抗原を同定するためのプローブとして使用した。ＩｇＡウェスタンの結果は、免疫優勢な３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ Ｐ１００、およびより弱い反応性を有するＰ１４０およびＰ３０を同定した。４５％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を用いて、Ｐ１４０、Ｐ１２０、Ｐ７０およびＰ３５が同定された。さらに多くのｓｐｚ抗原が検出された。免疫された鳥の防御免疫局所部位から単離され、部分的に精製されたＩｇＡを用いて同定されたこれらのイー・テネラ抗原は、コクシジウム症ワクチンの内容物になる候補である。実施例１８免疫された屋内飼育ＮＥ／Ｃモデルから調製したＲＡＴに対する抗イー・テネラ・ウサギ・ポリクーナル血清のウェスタン反応性の比較標準ＮＥ／ＣＲＡＴ試料ロットを、Ｂ¹⁹Ｂ¹⁹の鳥から調製した。ヒヨコを５００個／羽のイー・テネラ卵母細胞で５日間トリックル免疫し、１５日間休息させ、５ｘ１０⁴個の卵母細胞で感染させ、次いで、１４日後に再感染させた。７日後に、ＲＡＴ試薬を調製した。Ｒｂ１５／１６で表されるポリクローナル・ウサギ・抗イー・テネラ血清を、新鮮に採取され、アジュバント化されたイー・テネラスポロゾイトでウサギを３回免疫することによって得た。Ｒｂ１５／１６およびＲＡＴ試料を、イー・テネラｓｐｚ、ｍｒｚ、およびイー・テネラ感染ＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７３０％および４５％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ０−４４および４４− ７２上清に対しての各々ＩｇＧおよびＩｇＡについてアッセイした。Ｒｂ１５／１６およびＲＡＴ試料のウェスタン反応性プロファイルを表８にまとめる。結果は、抗イー・テネラ抗体の２つの由来源の間の抗原反応性における明かな差異を示す。もっとも印象的なのは、免疫ＲＡＴでは見られないＲｂ１５／１６によって認識される免疫優勢なＰ２６種である。さらに、Ｒｂ１５／１６は少なくとも６つの異なるメロソイト抗原を同定し、しかるにＲＡＴは限定された数のメロゾイトタンパク質、即ちＰ４０、Ｐ３５およびＰ２９と反応する。これらの結果は、ＲＡＴに存在する抗イー・テネラＩｇＡ抗体は、いくつかのユニークな細胞外およびＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７細胞内イー・テネラ抗原を同定するが、イー・テネラスポロゾイトに対して作成された通常のウサギ・抗血清によって認識されないという主張を支持する。ＮＥ／ＣＲＡＴによって認識される抗原は、新規ワクチン候補の標的を代表する。実施例１９ＮＥ／ＣＢ¹⁹Ｂ¹⁹鳥の異なる生物学的コンパートメントにおける抗エイメリア抗体応答の比較血清、ＳＬＩＰおよびＣＬＩＰ試料をＮＥ／ＣＢ¹⁹Ｂ¹⁹鳥から得た。生後１日目のヒヨコを５００個／羽のイー・テネラ卵母細胞で５日間トリックル免疫し、１５日間休息させ、５ｘ１０⁴個の均質な卵母細胞で追加免疫し、さらに１４日間休息させ、５ｘ１０⁴個の卵母細胞で感染させ、次いで、上に簡単に記載したごとく、試料を感染後２日目に調製した。試料をイー・テネラｓｐｚ、ＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７感染ならびに非感染細胞からの３０％ならびに４５％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ４４−７２時間上清、および４４−７２時間感染ならびに非感染ＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７全細胞結合抗原に対するウェスタン反応性についてアッセイした。全細胞結合抗原を、可溶性の膜および細胞質タンパク質については、細胞可溶性溶解緩衝液（プロテアーゼ阻害剤（１００ｍＭ１,１０フェナンスロリン、１００ｍＭベンツアミジン塩酸水和物、１ｍｇ／ｍｌペプスタチン、５０ｍＭＰＭＳＦ、２ｍｇ／ｍｌロイペプチン、５ｍｇ／ｍｌ大豆トリプシン阻害剤、および４ｍｇ／ｍｌアプロチニン）を含有する、０.５％ブリッジ−３５（Brij-35）、３００ｍＭＮaＣl、５０ｍＭトリス−Ｃl、pＨ７.６）を用いて、および不溶性の物質については、細胞不溶性溶解緩衝液（０.２％デオキシコール酸ナトリウム、０.２％ＳＤＳ）を用いて調製した。可溶性および不溶性調製物をウェスタン解析用に貯留した。ウェスタン反応性プロファイルの結果を表９にまとめる。感染調製物にユニークな免疫優勢タンパク質のみを挙げた。抗原反応性は、調べた免疫コンパートメントに特異的であった。例えば、３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄において、ＣＬＩＰはＰ５５のみを認識し、ＳＬＩＰはＰ１２０、Ｐ１１０、Ｐ１００およびＰ７０を同定した。対照的に、免疫ニワトリ血清は、強力な反応性の３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄種のいずれも同定できなかった。感染細胞結合物質においては、免疫血清はＰ５５を認識し、ＳＬＩＰはＰ３８およびＰ３５を同定し、およびＣＬＩＰはＰ２９のみを同定した。これらの結果は、同定された免疫優勢な抗原は使用した抗体プローブのタイプに依存するという一般的な請求の範囲を支持する。免疫宿主における感染の局所部位で産生された抗体、即ち、ＣＬＩＰおよび／またはＲＡＴは、典型的にはＳＬＩＰおよび血清と比較してより限定された一連の抗原を認識する。さらに、一定の時点、特に感染後初期には、免疫ＣＬＩＰおよび／またはＲＡＴによって認識される抗原は、ＳＬＩＰまたは血清によって認識される抗原とは異なっている。上記したごとく、本発明抗原は、ＭＨＣハプロタイプ認識、生物学的コンパートメント、応答時間および鳥の免疫状態によって特異化される。実施例２０Ｌ.Ｓ.６５イー・テネラＮＥ／Ｃ鳥から調製されたＲＡＴを用いた交叉反応性イー・テネラ株抗原の同定標準ＲＡＴ試料ロットをＮＥ／ＣＢ¹⁹Ｂ¹⁹鳥から得た。ヒヨコを５００個／羽のイー・テネラＬ.Ｓ.６５卵母細胞で５日間トリックル免疫し、１５日間休息させ、５ｘ１０⁴個の均質な卵母細胞で追加免疫し、さらに１４日間休息させ、５ｘ１０⁴個の卵母細胞で感染させ、次いで、上に簡単に記載したごとく、試料を感染後７日目に調製した。異なるイー・テネラ株の間で保存されている重要なエイメリア抗原を同定するために、イー・テネラＬ.Ｓ.６５に対して作成された免疫ＲＡＴを、２つの異なる地理学上の地域から単離された２つの異なるイー・テネラ野外株から調製した抗原に対するウェスタン反応性についてアッセイした。ＧＰ５と命名された最初の野外株は、１９９２年ミシシッピの家禽農場から単離され（リンダ・ポウト（Linda Pote）博士、ミシシッピ州）、２番目の野外株は１９９２年アーカンサスの家禽農場から単離された（フィル・デイビス（Phil D avis）博士、アーカンサス大学）。両方の野外株からの卵母細胞を精製し、次いで、標準的技術を用いてピーターソン・アーバー・アクレス・ブロイラー（Pete rson Arbor Acres Broilers）で増殖させ、次いで、ＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７細胞を感染するために使用した。イー・テネラＬ.Ｓ.６５、ＧＰ１およびＰＤ１抗原の以下のパネを以前に記載したごとく調製した：スポロゾイト、ＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７感染ならびに非感染細胞からの３０％ならびに４５％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ４４− ７２時間上清、および感染ならびに非感染ＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７全細胞結合抗原。ウェスタン反応性プロファイルの結果を表１０にまとめ、感染調製物に特異的な免疫優勢タンパク質のみを挙げた。結果は、以前に同定されたＰ４３、Ｐ４０、Ｐ３８の三重線が、調べた３つのイー・テネラ株の間で保存されていることを示す。これらの結果は、１つのイー・テネラ株にたいして作成されたイー・テネラＲＡＴＩｇＡ抗体が他のイー・テネラ株からの抗原を認識できることを示す。株交叉反応性血清抗体は以前に記載されているが、これは、感染の局所部位で産生された抗体、即ち、免疫ＲＡＴが株交叉反応性のＩｇＡ抗体を含有することが示された最初の実施例である。この方法は、他のイー・テネラおよび異なるエイメリア spp.の野外単離株におけるＰ４３、Ｐ４０およびＰ３８の保存を確認するために使用できる（以下参照）。実施例２１イー・テネラＬ.Ｓ.６５ＮＥ／Ｃ鳥から調製されたＲＡＴを用いた交叉反応性異種エイメリア spp.抗原の同定異なるエイメリアspp.の間で保存されている重要な抗原を同定するために、イー・テネラＬ.Ｓ.６５にたいして作成されたＲＡＴを、異なるエイメリアspp.：イー・アセルブリナおよびイー・マキシマから得られた細胞外およびＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７細胞内抗原を同定するために使用した。各々の種の純粋な卵母細胞培養から得られたスポロゾイトを、ＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７細胞を感染させるために使用した。スポロゾイト、ＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７感染ならびに非感染細胞からの３０％ならびに４５％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ４４−７２時間上清、および感染ならびに非感染ＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７全細胞結合抗原を調製した。いくつかの種については、限定されたＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７細胞内複製が行われ、かくして、これらの場合には、スクリーニングのためのいくつかの標準抗原調製物が入手できなかった。標準ＲＡＴ試料ロットを、ＮＥ／ＣＢ¹⁹Ｂ¹⁹鳥から得た。ウェスタンＩｇＡ反応性プロファイルの結果は、３５、３８、４０、４３および７０ｋＤａ抗原がイー・テネラおよびイー・マキシマ株の両方に存在し、３８および４３ｋＤａ抗原は、イー・テネラおよびイー・アセルブリナの両方において同定された。実施例２２４つの異なる屋外飼育商業用ブロイラー系から調製されたイー・テネラのＵＩ／Ｃ、ＮＥ／ＵＣおよびＮＥ／ＣＲＡＴを用いたイー・テネラ抗原の同定および防御の相関任意に１ないし４系と命名されたＵＩ／Ｃ、ＮＥ／ＵＣおよびＮＥ／Ｃ屋外飼育商業用ブロイラーの群は、針金の上で飼育され、ＲＡＴの原料として使用された。生後１０日の鳥を５ｘ１０⁴個のイー・テネラ卵母細胞で感染させ、１１日間休息させ、次いで、体重を測定し、次いで、同じ株、同じ用量に感染させた。各々の系からの年齢を一致させた非感染感受性の鳥の群を対照として使用した。感染後３９時間後に、２−３羽／群から盲腸および直腸の糞便を集め、次いで、貯留した。感染後６日目に残りの鳥の体重を測定し、次いで、各々の系のＵＩ／Ｃ群の体重増加をＵＩ／ＵＣの対応する群と比較した。体重増加を、ＵＩ／ＵＣ対照に比較したＵＩ／Ｃ群の体重損失のパーセントとして表した。各々の系の各々の群からの貯留ＲＡＴをイー・テネラＬ.Ｓ.６５スポロゾイトおよびＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７感染細胞からの３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ４４−７２時間上清をスクリーニングするために使用した。ＲＡＴ試料のＩｇＡウェスタン反応性プロファイルを表１１にまとめる。ｓｐｚおよび３０％抗原反応性プロファイルは、鳥の系および免疫状態に共に依存した。結果は、Ｐ３５、Ｐ３８、Ｐ４０、Ｐ５５およびＰ７０を包含するいくつかの以前に同定された抗原を確認する。さらに同定された抗原は、Ｐ２８およびＰ２１を包含する。重要なことに、これらの結果は、体重増加と、Ｐ５５、Ｐ４０およびＰ３５ｓｐｚ抗原およびＰ４０およびＰ２８３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄抗原に応答する能力との間の直接的相関を示す。系３および４からのＵＩ／Ｃ鳥は、最低の体重減少（より耐性）を示し、これらの２つの系は上記のいくつかの抗原に対するＩｇＡを産生した。系１からの鳥は、急性の曝露に対して部分的に感受性であり、中間的ＩｇＡ抗原特異的応答を示した。系２からの鳥は、感染に対してもっとも感受性であり、ほとんどＩｇＡ反応性を示さなかった。これらの観察は、各々の系からのＮＥ／Ｃ群のＩｇＡ抗原特異的応答によっても支持される。系２からのＮＥ／Ｃ鳥は、検出可能な抗原特異的反応性を示さなかった。ＲＡＴプロファイルに基づく結果は、系３および４は急性の感染に対して高い応答性を有し（より耐性）、一方、系２は応答が小さい（より感受性）ことを示唆する。最終的に、これらの結果は、３つのＭＨＣハプロタイプ系を用いたＮＥ／Ｃモデルにおいて記載されたいくつかのイー・テネラ抗原、即ち、Ｐ３５、Ｐ３８、Ｐ４０およびＰ７０も、いくつかの商業用生産系からの屋外飼育ブロイラーによって認識されることを確認した。これらの結果は、エイメリア抗原を同定するため、および最初の寄生虫感染によっておこる免疫防御の速度およびレベルのよりよい示度を提供するための屋外飼育ＲＡＴＳ／Ｎ使用の実用性も示す。実施例２３４つの異なるイー・テネラＵＩ／Ｃ屋外飼育ブロイラー系から調製されたＣＤＡＴを用いたイー・テネラ抗原の同定および防御の相関上記実施例において使用した同じ屋外飼育商業用ブロイラー系をワイヤー上で飼育し、次いで、ＣＤＡＴの原料として用いた。生後１４日目に鳥の体重を測定し、次いで、５ｘ１０⁴の卵母細胞に感染させた（ＵＩ／Ｃ）。各々の系から年齢を一致させた感受性の鳥の体重を測定し、次いで、偽の感染を行う（ＵＩ／ＵＣ）。感染後３６−４０時間後にすべての群から新鮮なかご排泄物を集め、ＣＤＡＴを調製し、次いで、イー・テネラｓｐｚ抗原に対する抗ＩｇＡを用いたウェスタンブロット解析によってスクリーニングした。ＵＩ／Ｃ鳥の感染後６日目の体重を測定し、次いで、それらの対応するＵＩ／ＵＣの体重と比較した。体重増加は、ＵＩ／ＵＣ対照に比較したＵＩ／Ｃ群の体重損失のパーセントとして表した。ＵＩ／ＵＣ対照物ではなく、ＵＩ／Ｃでのみ同定された抗原を表１２に示す。系１からのＣＤＡＴはＰ１１０を同定し、系３からのＣＤＡＴはＰ５５およびＰ３５を認識した。これらの結果は、イー・テネラで急性に感染した生後１４日目の鳥において、ＲＡＴＩｇＡのｓｐｚ特異的応答が系３においてもっとも初期に現れることを示す。この結果は、実施例２１において得られたＲＡＴの結果に一致する。さらに、系３が調べた４つのＵＩ／Ｃ系の中でもっとも小さい体重減少（−１０％）を示したので、イー・テネラｓｐｚのＰ５５およびＰ３５に対するＣＤＡＴ応答は防御応答の示度であると思われる。最終的に、この実施例は、新鮮なＣＤＡＴが対照のエイメリア種に対する群れの免疫レベルをよりよく決定するための非破壊、非侵襲性診断試験において使用できることを示す。実施例２４エイメリア spp.に感染した商業的家禽野外飼育農場から調製されたＲＡＴを用いたイー・テネラ抗原の同定通常のコクシジウム症診断スクリーニング方法で、ＲＡＴ試料を１５の異なる商業的家禽農場（４羽／農場、貯留）から定期的に集めた。試料は、ブロイラーまたはロースター（roaster）生産系のいずれかからであり、鳥の年齢は生後２ −６週間であった。ＲＡＴ試料をイー・テネラＬ.Ｓ.６５スポロゾイト抗原に対する予備的なウェスタンブロットに適用した。１５農場のうち２つが非常に強い反応性を示した。これらの同じ２つの農場は、調べた鳥においてイー・テネラ盲腸傷害の最も高い発生率を有することが、独立した研究室によって実質的に確認された。１５農場のうち５つを、３つのイー・テネラｓｐｚ抗原、ｐ９２、Ｐ４０およびＰ３８に対する反応性について陽性を試験した。次いで、これらの５つのＲＡＴを、イー・テネラＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７感染細胞からの３０％（ＮＨ₄）₂ ＳＯ₄ ４４−７２時間上清抗原に対してスクリーニングした。ウェスタン反応性の要約を表１３に示し、鳥の型、年齢、および、独立した研究室によって存在することが確認された、もっとも影響が大きいエイメリア spp.を包含する。結果は、ＲＡＴによって認識される局所的な体液性免疫応答が、５つのすべての農場に共通に３つの抗原を同定したことを示す。これらの５つの農場は、発見された最も共通するエイメリア spp.において異なっていた。従って、これらの結果は、Ｐ４３、Ｐ４０、およびＰ３８抗原が交叉反応性であり、イー・テネラ、イー・マキシマ、およびイー・アセルブリナの野外単離株でもっとも保存的であることを示す。これらの３つの抗原は、もっとも経済的に重要なエイメリア種に対して防御的に設計された多価コクシジウム症ワクチン中に包含されるべき明らかな標的である。実施例２５イー・マキシマに感染した商業的家禽野外飼育農場から調製されたＲＡＴを用いたイー・テネラ抗原の同定通常のコクシジウム症診断スクリーニング方法で、ＲＡＴ試料を８つの異なる商業的家禽農場（４羽貯留／農場）から定期的に集めた。試料は、ブロイラー家禽舎からであり、鳥の年齢は生後２−５週間であった。ＲＡＴ試料を調製し、次いで、イー・テネラＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７感染細胞からのイー・テネラ３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ４４−７２時間上清抗原のスクリーニングに使用した。ＲＡＴ試料のＩｇＡウェスタン反応性プロファイルを表１４に要約する。貯留した８つの試験した試料のうち３つが、ｓｐｚおよび３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄抗原に強い反応性を示した。イー・マキシマの高い臨床的傷害性と、イー・テネラＬ.Ｓ.６５ｓｐｚ抗原Ｐ４３、Ｐ２８ならびにＰ２６、および、イー・テネラＬ.Ｓ.６５ＳＢ −ＣＥＶ／Ｆ７３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ Ｐ７０に対する反応性との間に正の相関が見られた。実施例２４において上記したごとく、最強のウェスタン反応性はイー・マキシマコクシジウム症の最も高度な傷害に直接相関した。イー・テネラコクシジウム症の臨床的傷害は、調べたいずれの農場においても見られなかった。従って、Ｐ７０、Ｐ４３、Ｐ２８およびＰ２６のイー・テネラ抗原はイー・マキシマに対して形成された野外ＲＡＴ試料と交叉反応性であり、交叉防御免疫応答の誘導に重要な抗原である。実施例２６イー・テネラに感染したＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７４４−７２時間組織培養抗原またはメロゾイトに対して作成されたモノクローナル抗体の特徴づけモノクローナル抗体が、５つの独立した融合実験から誘導した。最初のシリーズにおいて（融合＃３および４）、マウスを２週間の間隔で、完全（最初の免疫化）または不完全（追加免疫）フロイント（Freund's）アジュバントで１：１でアジュバント化された５ｘ１０⁶個のＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７培養由来イー・テネラメロゾイトの腹腔内注射で免疫した。融合の３日前に、マウスをＩＰおよびＩＶの両方で１０⁶のアジュバント化されていないメロゾイトで免疫化した。脾臓細胞をマウス・ミエローマ細胞系ＳＰ２／０と融合し、次いで、ハイブリドーマの上清を最初に、イー・テネラ・スポロゾイトおよびメロゾイト抗原に対するＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。反応性のコロニーを広げ、次いで、非感染および４４−７２時間感染ＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７上清に対してスクリーニングした。限定希釈により全部で９つのＭＡｂがクローン化され、次いで、ウェスタンブロットおよび免疫蛍光アッセイにより特徴づけられた。３−１と命名されたあるＭＡｂは、唯一Ｐ２１タンパク質と反応した。ＭＡｂ４−１、４−４および４− ７は、一連のタンパク質と反応し、このことはすべてのタンパク質に存在する共通の炭水化物部分に対する反応性を示唆する。２番目のシリーズ（融合＃１、２および５）において、マウスを上記のごとく、イー・テネラ感染４４−７２時間ＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７組織培養上清の生化学的分離によって得られた２５−３０μ ｇの部分精製されたタンパク質で免疫し、次いで、追加免疫した。ハイブリドーマコロニーを、免疫原物質に対してスクリーニングし、次いで、さらに全部で３つのクローン化したＭＡｂを上記のごとく特徴づけた。ＭＡｂ１−２−６は少なくとも４つの異なる分子量のタンパク質を認識したが、それは本明細書中で同定した防御タンパク質の１つであるＰ４０に反応性を示した。ＭＡｂ１−２−６が免疫蛍光によって分割されたシゾントと反応したという事実は、Ｐ４０が細胞内生活環の間に発現し、次いで、４４−７２時間組織培養上清中に実質的に現れることを示唆する。Ｐ４０の一部も大きな分子量の（＞２００ｋＤａ）４４−７２時間組織培養凝集物に結合しているようである。本発明で記載されたＳＬＩＰ、ＣＬＩＰおよびＲＡＴ反応性に基づいて、Ｐ４０は、鳥において防御的であることが示された（実施例１０）、３０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄組織培養ワクチンの組成物である。ＭＡｂ１−２−６および通常のｃＤＮＡライブラリースクリーニング技術を用いて、Ｐ４０のｃＤＮＡクローンを得ることは可能であろう。実施例２７Ｒｂ１５／１６、ＭＡｂ２−３およびＳＬＩＰ、ＣＬＩＰおよびＲＡＴと二重反応性の４５％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １１０／１００のＮ末端アミノ酸部分配列決定４５％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ４４−７２時間ＳＢ−ＣＥＶ／Ｆ７感染上清を、ＰＢＳ中の４ＭＧｄＳＣＮで平衡化したスーパロース６カラムに適用した。ＭＡｂ２ −３を用いたウェスタンブロットの結果は、強い反応性の９２ｋＤａ種を同定した。ＭＡｂ２−３反応性を含有する画分をひとまとめにし、ＰＢＳに透析し、次いで、透析物をＭＡｂ２−３イムノアフィニティカラムに適用した。ＭＡｂ２− ３およびＲｂ１５／１６を用いた銀染色およびウェスタンブロットの結果は、素通し画分に、強い反応性の１１０／１００二重線を同定した。非還元型ＳＤＳ− ＰＡＧＥではＭＡｂ２−３に反応性のものは検出されなかった。二重線は、Ｒｂ１５／１６に強く反応し、ＭＡｂ２−３イムノアフィニティ素通しおよび溶出画分の両方に存在する９２ｋＤａ種に関連した。免疫反応性の素通しおよび溶出画分を貯留し、次いで、アミコン・マイクロコンセントレーター（Amicon microco ncentrator）（ＭＷＣＯ１０,０００）で濃縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、次いで、マイクロシークエンシングに用いた。プロブロット（Problott）膜に電気的にブロットした後、７つのレーンの１１０／１００二重線の上のバンドを配列決定用に負荷した。二重線から得られた配列は以下のとおりである：１１０： ¹Ｘ−Ｐ−Ｌ−Ｐ−Ｙ−Ｔ−Ｙ−Ｉ−Ｐ−Ｑ¹⁰ １００： ¹Ｘ−Ｐ−Ｌ−Ｅ−Ａ−Ｖ−Ａ−Ｇ−Ｘ−Ｌ−Ｅ¹¹ 配列と一致するものはＧｅｎＥＭＢＬデータベース中に見られなかった。かくして、本発明は新規エイメリア抗体調製物および抗原、同様にそれらの製造および使用方法を開示する。本発明の好ましい具体例を詳細に記載したが、明らかな変更は、添付した請求の範囲によって記載されるごとく、発明の精神および範囲から離脱することなく行うことができることが理解される。本発明の実施に有用な菌株の寄託以下の菌株の生物学的に純粋な培養物の寄託をメリーランド州、ロックビル、パークタウン・ドライブ、１２３０１号、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに行った。生存試験に合格し、手数料を支払った後に、受け入れ番号を受け取った。該培養物へのアクセスは、３７ＣＦＲ１．１１４および３５ＵＳＣ１２２の下、そこに標記されているコミッショナーにより決定された国に特許出願が係属している間、行うことができる。公衆が該培養物を利用することに対する制限はすべて、該特許出願に基づく特許が付与された後に除去されるであろう。さらには、指定された寄託物は寄託日から３０年間、または寄託物を最後に請求した後の５年間；または米国特許の存続期間、いずれか長い期間中維持される。培養物が生育不能となるか、または不注意により不活化し、またはプラスミド含有株の場合、そのプラスミドが欠失したならば、同一の分類学上の生存培養物と取り替えられる。これらの寄託物は、単に、当業者に都合がよいように付与されるものであり、３５ＵＳＣ§１１２の下、寄託物が請求されることを容認するものではない。寄託物を産生、使用または販売するにはライセンスが必要であり、かかるライセンスはこれにより付与されるものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 16/20 9356−4ＨＣ０７Ｋ 16/20 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/577 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/012 9284−4ＣＡ６１Ｋ 39/012 39/395 9284−4Ｃ 39/395 Ｄ 9284−4ＣＱ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者ブレイク，デイビッドアメリカ合衆国ネブラスカ州68516、リンカーン、バーチ・ホロー・ドライブ4801番

Claims

【特許請求の範囲】１．局所的に産生された単離エイメリア（Eimeria）抗体調製物。２．調製物がエイメリア・テネラ（Eimeria tenella）に暴露された鳥類対象に由来する請求項１記載の抗体調製物。３．調製物が該鳥類対象の腸管に見られるリンパ球集合に由来する請求項２記載の抗体調製物。４．調製物が盲腸リンパ球免疫産物（ＣＬＩＰ）からなる請求項３記載の抗体調製物。５．調製物が脾臓リンパ球免疫産物（ＳＬＩＰ）からなる請求項２記載の抗体調製物。６．調製物がコプランティボディ調製物からなる請求項２記載の抗体調製物。７．調製物が鳥類対象の腸消化物に由来する請求項６記載の抗体調製物。８．調製物が直腸抗体試験体（ＲＡＴ）からなる請求項７記載の抗体調製物。９．調製物がケージドロッピング抗体試験体（ＣＤＡＴ）からなる請求項７記載の抗体調製物。 10．生物学的試料におけるエイメリア抗原の有無の検出方法であって、（ａ）該生物学的試料を局所的に産生されたエイメリア抗体調製物と、生物学的試料中に存在する抗原と抗体調製物中に存在する抗体との間に複合体を形成し得る条件下で接触させ；（ｂ）形成されたいずれの複合体も発現ラベルを用いて検出することからなる検出方法。 11．生物学的試料が細胞内段階の発達の間でエイメリアの増殖支持能を有する連続継代細胞株に由来する抽出物からなる請求項１０記載の方法。 12．連続継代細胞株がエイメリア・テネラの増殖を支持する請求項１１記載の方法。 13．生物学的試料が細胞外スポロゾイトまたはメロゾイトに由来する請求項１０記載の方法。 14．抗体調製物がエイメリア・テネラに暴露された鳥類対象に由来する請求項１０記載の方法。 15．抗体調製物が盲腸リンパ球免疫産物（ＣＬＩＰ）からなる請求項１０記載の方法。 16．抗体調製物が脾臓リンパ球免疫産物（ＳＬＩＰ）からなる請求項１０記載の方法。 17．調製物がコプランティボディ調製物からなる請求項１０記載の方法。 18．調製物が鳥類対象の腸消化物に由来する請求項１７記載の方法。 19．調製物が直腸抗体試験体（ＲＡＴ）からなる請求項１８記載の方法。 20．調製物がケージドロッピング抗体試験体（ＣＤＡＴ）からなる請求項１８記載の方法。 21．生物学的試料におけるエイメリア・テネラ抗原の有無の検出方法であって、（ａ）生物学的試料を、盲腸リンパ球免疫産物（ＣＬＩＰ）、脾臓リンパ球免疫産物（ＳＬＩＰ）、直腸抗体試験体（ＲＡＴ）およびケージドロッピング抗体試験体（ＣＤＡＴ）からなる群より選択される少なくとも１種の局所的に産生されたエイメリア・テネラ抗体調製物と、生物学的試料中に存在する抗原と抗体調製物中に存在する抗体との間に複合体を形成し得る条件下で接触させ；（ｂ）形成されたいずれの複合体も発現ラベルを用いて検出することからなる検出方法。 22．鳥類対象におけるコクシジウム感染症の診断方法であって、（ａ）鳥類対象より生物学的試料を用意し；（ｂ）生物学的試料を局所的に産生されたエイメリア抗体調製物と、生物学的試料中に存在する抗原と抗体調製物中に存在する抗体との間に複合体を形成し得る条件下で接触させ；（ｃ）形成されたいずれの複合体も発現ラベルを用いて検出することからなる診断方法。 23．局所的に産生されたエイメリア抗体調製物を用いて同定できる細胞内エイメリア抗原。 24．細胞内段階の発達の間でエイメリア・テネラの増殖支持能を有する連続継代細胞株の抽出物に由来する抗原と等価である請求項２３記載の抗原。 25．ウェスタンイムノブロット分析を用いて測定した場合、約２８ｋＤａの分子量を有する請求項２３記載の抗原。 26．ウェスタンイムノブロット分析を用いて測定した場合、約３５ｋＤａの分子量を有する請求項２３記載の抗原。 27．ウェスタンイムノブロット分析を用いて測定した場合、約３８ｋＤａの分子量を有する請求項２３記載の抗原。 28．ウェスタンイムノブロット分析を用いて測定した場合、約４０ｋＤａの分子量を有する請求項２３記載の抗原。 29．ウェスタンイムノブロット分析を用いて測定した場合、約４３ｋＤａの分子量を有する請求項２３記載の抗原。 30．ウェスタンイムノブロット分析を用いて測定した場合、約５５ｋＤａの分子量を有する請求項２３記載の抗原。 31．ウェスタンイムノブロット分析を用いて測定した場合、約７０ｋＤａの分子量を有する請求項２３記載の抗原。 32．ウェスタンイムノブロット分析を用いて測定した場合、約１００ｋＤａの分子量を有する請求項２３記載の抗原。 33．ウェスタンイムノブロット分析を用いて測定した場合、約１１０ｋＤａの分子量を有する請求項２３記載の抗原。 34．請求項２３に記載の抗原との反応性を有するモノクローナル抗体。 35．生物学的試料におけるエイメリア抗体の有無の検出方法であって、（ａ）生物学的試料を細胞内エイメリア抗原と、該抗原と生物学的試料中に存在する抗体との間で複合体を形成し得る条件下で接触させ；（ｃ）形成されたいずれの複合体も発現ラベルを用いて検出することからなる検出方法。 36．抗原がエイメリア・テネラ抗原である請求項３５記載の方法。 37．エイメリア・テネラ抗原が、ウェスタンイムノブロット分析を用いて測定した場合、各々、約２８ｋＤａ、３５ｋＤａ、３８ｋＤａ、４０ｋＤａ、４３ｋＤａ、５５ｋＤａ、７０ｋＤａ、１００ｋＤａおよび１１０ｋＤａの分子量を有するエイメリア・テネラ細胞内抗原の群より選択される細胞内抗原である請求項３６記載の方法。 38．生物学的試料が鳥類対象の腸消化物に由来する請求項３５記載の方法。 39．生物学的試料が鳥類対象の直腸の腸消化物からなる請求項３８記載の方法。 40．生物学的試料が鳥類対象に由来のケージドロッピングからなる請求項３８記載の方法。 41．鳥類対象におけるコクシジウム症の診断用キットであって、適当な容器にパッケージした局所的に産生されたエイメリア抗体調製物からなるキット。 42．エイメリア抗体がエイメリア・テネラに由来し、盲腸リンパ球免疫産物（ＣＬＩＰ）、脾臓リンパ球免疫産物（ＳＬＩＰ）、直腸抗体試験体（ＲＡＴ）およびケージドロッピング抗体試験体（ＣＤＡＴ）からなる群より選択される請求項４１記載のキット。 43．鳥類対象におけるコクシジウム症の診断用キットであって、適当な容器にパッケージした、細胞内エイメリア抗原と反応性を有するエイメリア・テネラモノクローナル抗体からなるキット。 44．生物学的試料におけるエイメリアに対する抗体の有無を検出するためのキットであって、適当な容器にパッケージした、細胞内エイメリア抗原からなるキット。 45．エイメリア抗原が、ウェスタンイムノブロット分析を用いて測定した場合、各々、約２８ｋＤａ、３５ｋＤａ、３８ｋＤａ、４０ｋＤａ、４３ｋＤａ、５５ｋＤａ、７０ｋＤａ、１００ｋＤａおよび１１０ｋＤａの分子量を有するエイメリア・テネラ細胞内抗原の群より選択されるエイメリア・テネラ細胞内抗原に由来する請求項４４記載のキット。