JPH09502272A

JPH09502272A - 検定用キット

Info

Publication number: JPH09502272A
Application number: JP7508458A
Authority: JP
Inventors: レゲイ、フランソワ; ヴェンガー、ローランド
Original assignee: サンド・リミテッド
Priority date: 1993-09-08
Filing date: 1994-09-07
Publication date: 1997-03-04
Anticipated expiration: 2014-05-17
Also published as: EP0717850B1; CA2169162A1; NO960924L; JP2892503B2; FI961004A; NO960924D0; PL313392A1; CZ289434B6; WO1995007468A1; NZ273595A; HK1005754A1; CN1088196C; PL176727B1; CZ66296A3; CN1130425A; GR3023578T3; AU7694894A; CA2169162C; GB9318612D0; HUT73692A

Abstract

(57)【要約】イムノフィリン結合性医薬、例えばサイクロスポリン、ラパマイシンおよびＦＫ５０６化合物の新規血中濃度測定法が提供され、医薬をそのイムノフィリンから結合競合剤を使用することにより離す新規工程を含み、それにより抽出工程の必要性を除き、検定の単純さおよび正確さを上昇させる。結合競合剤および、医薬に結合するが、結合競合剤には明白に結合しない受容体、例えばモノクローナル抗体を含む検定キットがまた提供され、このような検定における結合競合剤としてのイムノフィリン結合化合物の新規使用である。

Description

【発明の詳細な説明】検定用キット本発明は、特異的結合性タンパク質の存在下、非抽出血液中の医薬物質の濃度の測定に使用する検定方法およびキットに関する。本検定は、特に、イムノフィリン結合性医薬、例えばサイクロスポリン(cyclosporins)、ラパマイシンまたはＦＫ５０６化合物の血中濃度測定に好適である。サイクロスポリンは、一般に免疫抑制、抗炎症、抗ウイルスおよび／または抗寄生虫活性を、それぞれ多かれ少なかれ有する、構造的に明確な環状、ポリ−Ｎ −メチル化ウンデカペプチドのクラスを構成する。同定された最初のサイクロスポリンは、菌代謝物、サイクロスポリンＡ、即ちシクロスポリン(Ciclosporin) であり、その構造は、メルク・インデックス第１１版；Merck&Co.,Inc.；ラーウェイ、ニュー・ジャージー、ＵＳＡ(１９８９)の２７５９として記載されている。後に同定されたサイクロスポリンは、またメルク・インデックスに２７５９として列記されているサイクロスポリンＢ、Ｃ、ＤおよびＧである。多くの合成同族体がまた知られ、代表例は、欧州特許第２９６１２３号、欧州特許第４８４２８１号およびイギリス特許第２２２２７７０号に記載されている。ラパマイシンは、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス(Streptomyces hygr oscopicus)により産生されるマクロライド系免疫抑制剤であり、多くの適応症、特に、器官移植拒絶および自己免疫疾患の処置および予防用の免疫抑制剤として医薬的に有用であることが分かった。ラパマイシンの構造は、ケッセラー・エイチら；1993；Helv.Chim.Acta；76:117に記載されている。例えば、あるアシルおよびアミノアシルラパマイシン(例えば米国特許第４３１６８８５号、米国特許第４６５０８０３号および米国特許第５１５１４１３号)、２７−デスメチル− ラパマイシン(ＷＯ９２／１４７３７)、２６−ジヒドロ−ラパマイシン(米国特許第５１３８０５１号)、あるピラゾール誘導体(米国特許第５１６４３９９号) 、あるアルコキシエステル誘導体(米国特許第５２３３０３６号)および４０−Ｏ −アルキル化誘導体(ＷＯ９４／０９０１０)を含む、多くのラパマイシン誘導体が産生されている。ラパマイシンおよびその構造類似同族体および誘導体は、本明細書において集合的に「ラパマイシン」と呼ぶ。ＦＫ５０６は、ストレプトマイセス・ツクバエンシス(Streptomyces tsukubae nsis)Ｎｏ.９９９３により産生されるマクロライド系免疫抑制剤である。ＦＫ５０６の構造は、メルク・インデックスの付録に、Ａ５として記載されている。ＦＫ５０６の基本構造および免疫学的特性を残した多くの関連化合物がまた知られている。これらの化合物は、多くの文献、例えば、欧州特許第１８４１６２号、欧州特許第３１５９７３号、欧州特許第３２３０４２号、欧州特許第４２３７１４号、欧州特許第４２７６８０号、欧州特許第４６５４２６号、欧州特許第４７４１２６号、ＷＯ９１／１３８８９、ＷＯ９１／１９４９５、欧州特許第４８４９３６号、欧州特許第５３２０８８号、欧州特許第５３２０８９号、ＷＯ９３／５０５９等に記載されている。これらの化合物は、本明細書において集合的に「ＦＫ５０６化合物」と呼ぶ。その非常に有用な薬理学的特性のために、サイクロスポリン(および特にサイクロスポリンＡおよびＧ)、ラパマイシンおよびＦＫ５０６化合物は、例えば移植拒絶の予防および自己免疫疾患の処置に広く適応されている。しかしながら、これらの化合物は、高濃度で副作用があり、従ってその血中の濃度をある治療範囲内に保たなければならない。生体内利用能および代謝変換速度は患者特異的傾向があり、従って用量は患者特異的である。従って、これらの免疫抑制剤の血中の濃度を一定間隔で追跡する必要がある。高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を基本にしたある検定方法が開発されているが、扱いにくいか、充分特異的でないかいずれかである。サイクロスポリンＡおよびＦＫ５０６のために、特異的モノクローナル抗体が開発されており、検定方法は提供された抗体に基づく。しかしながら、今日まで提供された総ての検定法は、最初に、後で蒸発または希釈により除去する溶媒(メタノールのような)で抽出する、血液または血漿サンプルを必要とする。抗体を、次いでサンプルに加え、放射免疫測定(ＲＩＡ)分析を行う。特異的モノクローナル抗体を基にした検定法は充分働くが、抽出工程および続く溶媒の除去の必要性は、注意が払われなかった場合、検定の低い感受性および低い正確さをもたらすことができる。従って、検定は熟練技術者が行わなければならず、時間のかかる工程である。従って、サイクロスポリン、ラパマイシンおよびＦＫ５０６化合物の医薬としての重要性に鑑み、その血中濃度を決定するための単純で敏感な検定法が必要とされている。従って、本発明はイムノフィリン結合性医薬の血中濃度の測定用検定法を提供するものである。当該方法は、血中で医薬(免疫抑制剤)−イムノフィリン複合体から当該医薬を離す結合競合剤の添加；当該医薬に結合するが、結合競合剤には明白に結合しない受容体の添加；サンプルからの受容体−医薬複合体の分離；および医薬の量の測定を含む。血中に存在するサイクロスポリン、ラパマイシンまたはＦＫ５０６化合物の一部は、医薬−イムノフィリン複合体の形で存在することが分かった。医薬を結合競合剤を使用して複合体から離した場合、次いでメタノールを使用して血液サンプルを抽出する必要がなく、従ってメタノール抽出および除去に関する欠点は除かれる。得られる検定法は、正確な結果を提供し、単純であり、サイクロスポリン、ラパマイシンまたはＦＫ５０６化合物の検定において驚くほどの大進歩である。例えば、検定法は、０.７ng(サイクロスポリンＡ)／ml(全血)ほど低い濃度を、３０％以下の変動係数で検出可能である。これは、商業的に入手可能なサイクロスポリンＡ検定よりかなり優れている。イムノフィリンは、サイクロスポリン、ラパマイシンまたはＦＫ５０６化合物に結合する細胞内結合性タンパク質の一群である。イムノフィリンの２つの異なる群が現在知られている；サイクロスポリンに結合するサイクロフィリンおよびラパマシンとＦＫ５０６化合物に結合するマクロフィリン。あるイムノフィリンの構造は、ワルキンショウら；1992；Transplantation Proceedings,24,4(2),8 −13に記載されている。具体的な例はサイクロフィリンＡおよびマクロフィリン１２(しばしばＦＫＢＰ−１２としても既知)である。イムノフィリン−医薬複合体から医薬を離すのに使用するための結合競合剤の量は、医薬毎および結合競合剤毎に変化するようである。しかしながら、いずれの場合も、最適な範囲を、医薬の(ブランクを含む)幾つかの濃度および結合競合剤の幾つかの濃度で検定法を行うことにより容易に決定し得る。次いで、サンプルを２または３倍に希釈し、再び各希釈において方法を行う。次いで、試験の感受性を比較し、感受性の減少を提供する結合競合剤の濃度を除く。医薬を認識結合する受容体は、既知の検定に使用されているような任意の特異的結合性化合物、例えばポリクローナル、モノクローナルまたは組換え抗体、抗体フラグメントまたは(例えば、ブラタキスら、(1993)Nature,361:645に記載のような)分子痕跡ポリマー、好ましくはモノクローナル抗体であり得る。一度医薬が医薬−イムノフィリン複合体から離れたら、受容体に結合する医薬の量を、任意の検定法、好ましくはモノクローナル抗体基本検定、例えば、医薬の抗体または受容体への結合の競合の能力を測定する競合検定または非競合検定を使用して測定し得る。競合検定は、試験サンプルの存在下または非存在下、例えば抗体の競合剤としての標識医薬(トレーサー)を好ましくは使用する。トレーサーは、好適な読み取りを提供できる標識、例えば当分野で慣用の放射活性、蛍光、発光、または色素読み取りで標識し得る。あるいは、受容体の競合剤は、例えば酵素架橋免疫吸着剤検定(ＥＬＩＳＡ)または、医薬に対する抗体がそれ自身標識されている系における、試験チャンバーの表面をコートした非標識医薬(所望により医薬−タンパク質免疫源性接合体が、抗体を発生させるために使用される)であり得る。抗体または受容体は、使用する検定系に依存して、試験溶液内で遊離されているか、または試験チャンバーの壁をコートしている。競合検定において、読み取り(例えば、抗体または受容体に結合するトレーサーの量)は、試験サンプル中の医薬の量と逆比例している。既知の濃度の医薬を含む標準溶液は、慣用のように検定を標準化するのに使用し得る。我々が、医薬に結合するが、結合競合剤には明白に結合しない受容体と呼ぶ場合、我々は医薬および結合競合剤間の受容体の交差反応性の程度が検定の感受性に明白に影響を与えるには不十分であることを意味する。容認できる結合競合剤と医薬の間の交差反応性の正確な量は、医薬と比較した結合競合剤のイムノフィリンに対する相対的親和性に基づいて、もちろんある程度変化する：親和性が高ければ、医薬を置換するのに必要な濃度は低く、したがって高い受容体交差反応性が、検定の正確さに影響を与えず、容認できる。実際問題として、交差反応性の明白さは、異なった量の結合競合剤を使用した標準曲線の比較により最もよく測定される；一度、医薬を離すための結合競合剤の最低濃度に到達したら、標準曲線は、この検定で使用するために予期される最も高い濃度に上昇した結合競合剤濃度のように明白に変化せず、それにより抗体との交差反応性は、この検定の本質にほとんど影響ないことが証明される(抗体との交差反応性のある場合、結合競合剤の高濃度の存在は、検定が医薬＋結合競合剤を測定しているため、医薬濃度の観察される測定値を膨張させる傾向にある)。結合競合剤存在下および非存在下の標準曲線の任意の変化の有意さを、標準統計法、例えばｔ−検定を使用して評価できる。しかしながら、ガイドラインのように、通常結合競合剤が、試験サンプル中、医薬より高濃度で存在するため、医薬と結合競合剤の間の受容体交差反応性は、通常、緩衝液中の競合検定で測定して、１％より低い、好ましくは０.１％より低いべきである。本発明の一つの態様において、医薬はサイクロスポリンおよび結合競合剤は、サイクロフィリンに結合するサイクロスポリン同族体である。好ましくは、結合競合剤は、欧州特許第２９６１２３号に記載の[Ｔhr²,Ｌeu⁵,Ｄ−Ｈiv⁸,Ｌeu¹⁰] −シクロスポリンであり、それはサイクロフィリンＡに競合的に結合する。好ましくは、受容体は、例えばＷＯ８６／２０８０に記載のような、サイクロスポリン特異的、モノクローナル抗体である。サイクロスポリンの例は、免疫抑制剤サイクロスポリンＡおよびサイクロスポリンＧ、および、欧州特許第４８４２８４１号に記載の抗ＨＩＶ複製化合物[ＭeＩle⁴]−シクロスポリンである。サイクロスポリンを測定するために、競合検定を使用する場合、受容体の競合剤は、試験チャンバーの壁に結合したサイクロスポリン(例えばＷＯ８６／２０８０に記載のサイクロスポリン−タンパク質接合体)か、または標識サイクロスポリン(トレーサー)、例えば(ｉ)放射標識サイクロスポリン、例えばトリチル化ジヒドロサイクロスポリンＡまたは(ii)[Ｔhr²]−シクロスポリン、[(Ｄ)Ｌys⁸] −シクロスポリンまたは[Ｏ−２−ヒドロキシエチル(Ｄ)Ｓer⁸]−シクロスポリンの標識誘導体、例えば、蛍光、発光または色素信号の提供可能な標識を有する誘導体、例えばダンシルまたはビオチニル誘導体、例えば[ε−Ｎ−ビオニチル( Ｄ)Ｌys⁸]−シクロスポリンまたは[Ｏ−(２−ビオチノイルオキシエチル)Ｔhr²] −シクロスポリンであり得る。このような標識サイクロスポリンは、一般的にＷＯ８６／２０８０に記載のように、または、例えばＳigmaまたはＡmershamから商業的に入手可能な標識化合物のための多くのキットの一つを使用して製造する。シクロスポリン濃度の測定に特に好ましい方法は、試験チャンバー(例えば、マイクロタイタープレート)の壁をシクロスポリン特異的モノクローナル抗体でコート(例えば、チャンバーをヤギ抗マウス抗体でコートすることにより、次いでシクロスポリン特異的モノクローナル抗体のＦc領域をヤギ抗マウス抗体に結合させ、シクロスポリン抗体の結合領域を遊離させる)することを含む。試験すべきサンプル(例えば、患者からの血液)、結合競合剤(例えば[Ｔhr²,Ｌeu⁵,Ｄ− Ｈiv⁸,Ｌeu¹⁰]−シクロスポリン)および標識(例えば、ビオチン標識)サイクロスポリントレーサー(例えば[Ｏ−(２−ビオチノイルオキシエチル)Ｔhr²]−シクロスポリン)を、次いで試験チャンバー内で合わせ、一定時間インキュベーションする。インキュベーション時間は、抗体が医薬およびトレーサーに結合するのに充分な時間、例えば少なくとも１時間、好ましくは少なくとも２時間である。次いで、試験チャンバーを濯ぐ。結合トレーサーの濃度を使用した標識の型に依存して慣用の方法で測定する；ビオチン標識は、例えば、酵素、例えば蛍光、発光または色素読み取りを与えるために、基質を開裂するセイヨウワサビペルオキシダーゼに結合したストレプタビジン(ビオチンに高親和性を有する細菌タンパク質)による商業的検定の使用が認識されよう。本発明の他の態様において、医薬はＦＫ５０６化合物、例えば、ＦＫ５０６および結合競合剤はマクロフィリン１２に結合する化合物である。ＦＫ５０６化合物を離すことができる任意の好適なマクロフィリン１２結合性化合物が使用し得る。ラパマイシンは、マクロフィリン１２への結合でＦＫ５０６と競合し、好ましくは結合競合剤として使用する。好適なＦＫ５０６化合物抗体が、検出用に使用し得る；好ましくは、欧州特許第Ａ０２９３８９２号に記載のような特異的抗体。競合検定を使用する場合、抗体の競合剤は、検定プレートに結合したＦＫ５０６化合物または好ましくはＦＫ５０６の標識誘導体、例えば放射標識誘導体、例えばトリチル化ＦＫ５０６、または他の標識誘導体、例えばＰＯＤ−ＦＫ５０６(欧州特許第Ａ０２９３８９２号に、ＰＯＤ標識ＦＲ−９００５０６として記載)であり得る。本発明の第３の態様において、医薬はラパマイシン、例えばラパマイシンまたはＷＯ９４／０９０１０の４０−Ｏ−ヒドロキシエチル−ラパマイシンおよび結合競合剤は、マクロフィリン１２に結合する化合物である。ラパマイシンを離すことができる任意のマクロフィリン１２結合性化合物が使用し得る。ＦＫ５０６はマクロフィリン１２への結合でラパマイシンと競合し、好ましくは結合競合剤として使用する。受容体は、好ましくはラパマイシン特異的モノクローナル抗体である。[注：ラパマイシン選択的モノクローナル抗体は、文献に記載されていない。しかしながら、我々は、抗原がラパマシンの免疫源性接合体、例えばラパマイシンの水酸基の一つ(好ましくは水酸基は、ラパマイシンのシクロヘキシル部位(ラパマイシンの４０位)に位置するかまたはラパマイシンの２８位の水酸基に対応する)を経由して免疫源性タンパク質に結合したラパマイシンである、標準ケーラー−ミルスタイン技術を使用して、高選択性抗体を製造した。ラパマイシンは、第１に活性結合基を有するラパマイシンを形成し、次いで活性化ラパマイシンをタンパク質を結合させることにより、タンパク質と結合する。活性化結合基は、タンパク質との直接反応が可能な基であり、タンパク質との反応を可能にし、遂行し、または促進する結合剤(例えば、カルボジイミド試薬)の使用を必要とせず共有結合を形成する。例えば、４０−Ｏ−活性化ラパマイシンは、ＤＭＡＰおよびピリジンの存在下、無水コハク酸を使用してＯ−アシル化し、ラパマイシンヘミコハク酸(４０−Ｏ−(３−カルボキシ)プロパノイル−ラパマイシン) を形成する；それは、次いで、ＥＤＣおよびＥt₃ＮおよびＣＨ₂Ｃl₂存在下、Ｎ −ヒドロキシサクシンイミドと反応し、サクシンイミドオキシサクシニルラパマイシン(４０−Ｏ−(３−カルボキシ)プロパノイル−ラパマイシンＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル)を形成する。２８−Ｏ−活性化ラパマイシンは、４０−ヒドロキシの前保護を使用して、同様に製造し、次いでタンパク質と結合し、２８−Ｏ−結合性免疫源性接合体を製造し、４０−Ｏ−架橋接合体を使用して得られるのと異なった特異性、例えば、ラパマイシンのシクロヘキシル領域の差異に高い感受性を有する抗体の製造に使用できる。]競合検定を使用する場合、抗体の競合剤は、検定プレートに結合したラパマイシンまたは好ましくは標識ラパマイシン、例えば、上記の活性化ラパマイシンを標識群、例えばビオチンまたはダンシルと反応させて製造した、例えば蛍光標識ラパマイシン、またはラパマイシンの放射標識、例えばラパマイシンのトリチル化により製造したラパマイシンであり得る。本発明の検定法は、標準生物検定装置を使用して早く単純に行い、正確で再現性のある結果が得られ得るため、有利である。また、全血が、抽出の必要なく使用し得る。本発明はまた、血液中のイムノフィリン結合性医薬の量の検出に好適な検定キットを提供し、そのキットは、血液中で医薬を医薬−イムノフィリン複合体から離す結合競合剤；および医薬に結合するが、結合競合剤には明白に結合しない抗体を含む。好ましくは、抗体は医薬に特異的なモノクローナル抗体である。医薬がサイクロスポリンであれば、結合競合剤は、サイクロフィリンに結合するサイクロスポリン同族体である。好ましくは結合競合剤は[Ｔhr²,Ｌeu⁵,Ｄ− Ｈiv⁸,Ｌeu¹⁰]−シクロスポリンである。好ましくは抗体は、ＷＯ８６／２０８０に記載のようなシクロスポリン特異的モノクローナル抗体である。医薬がＦＫ５０６化合物またはラパマイシンである場合、結合競合剤は、それぞれラパマイシンまたはＦＫ５０６もしくはマクロフィリン１２に結合するそれらの同族体であり得る。ＦＫ５０６化合物またはラパマイシン化合物に対する任意の好適な抗体が使用し得る；好ましくは、例えば、ラパマイシンについて上記したように製造した、または欧州特許第Ａ０２９３８９２号に記載の特異的抗体である。キットは、更に好適な標識トレーサー、標準および使用説明書を含み得る。トレーサーの標識は、好適な標識、例えば放射活性、蛍光または色素標識であり得る。簡便な場合、キットの成分は凍結乾燥形であり得る。最後に、更なる態様において、本発明は、他のイムノフィリン結合性化合物の血中濃度測定のための検定キットまたは方法におけるイムノフィリン結合競合剤としてのイムノフィリン結合性化合物の新規使用を提供する；例えば、サイクロスポリンの血中濃度測定のための検定キットまたは方法における[Ｔhr²,Ｌeu⁵, Ｄ−Ｈiv⁸,Ｌeu¹⁰]−シクロスポリンの使用；ＦＫ５０６化合物の血中濃度測定のための検定キットまたは方法におけるラパマイシンの使用；およびラパマイシンの血中濃度測定のための検定キットまたは方法におけるＦＫ５０６の使用。本発明の実施例を、説明として、限定的でなく、ここに記載する。変化が検定毎に一定している限り、正確な濃度範囲および反応条件の変化を容認し得ることは、当分野の技術者には明白であろう。医薬をイムノフィリン−医薬複合体から離すために結合競合剤を使用する他の検定系は、本発明の範囲内であると見なされる；一度医薬がイムノフィリン−医薬結合性複合体から離れたら、もちろん任意の既知の方法で測定し得る。実施例１：サイクロスポリンＡ検定目盛りサンプル：サイクロスポリンＡ１６μgを、７０％v／v水性エタノールに加え、４℃で貯蔵する。サイクロスポリンＡ溶液５０ｐlを、人血(Blutspende zentrum Baselから入手)１mlで希釈し、８００ng／mlのサイクロスポリンＡ濃度を得る。次いで、４００ng／ml、２００ng／ml、１００ng／ml、５０ng／ml、２５ng／ml、１２.５ng／ml、６.２ng／ml、３.１ng／ml、１.６ng／ml、０.８ng ／mlおよび０.４ng／mlの濃度の目盛りサンプルを、サイクロスポリンＡ５００ μl溶液を人血１mlに連続して希釈することにより調製する。サイクロスポリン無しの血液サンプルをブランクとして調製する。調整マイクロタイタープレート：数個の９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルを、リン酸緩衝化生理食塩水(ＰＢＳ)で１０μg／mlまで希釈したヤギ抗マウス抗体(ＧaＭＩgＧＦc非接合、Pierce31170)１００μlでコートする。マイクロタイタープレートを、一晩４℃でインキュベーションする。ヤギ抗マウス抗体を廃棄し、ブロッキング溶液(ＰＢＳ１００mlに溶解したウシ血清アルブミン２ｇ)２００μlを各ウェルに加える。マイクロタイタープレートを３７℃で２時間インキュベーションし、次いで３×３００μlのＰＢＳ／トゥイン２０溶液(ＰＢＳ１リットル中トゥイン２００.５ｇ)を使用したプレート洗浄機で洗浄する。調整マイクロタイタープレートを４℃で貯蔵する。抗体プレート：ＰＢＳ／トゥイン２０溶液１mlを、凍結乾燥形のサイクロスポリンＡ特異的モノクローナル抗体のバイアルに加える。抗体は、ＷＯ８６／２０８０に記載され、商業的に入手可能なサンディミュン(商標)−キットの一部を成す。次いで、抗体溶液をＰＢＳ／トゥイン２０溶液で１：１０に希釈し、１００ μlを、調整マイクロタイタープレートの選択したウェルにピペットで移す。ＰＢＳ／トゥイン２０溶液１００μlを、残ったウェルにピペットで移す。マイクロタイタープレートを一晩４℃でインキュベーションする。サイクロスポリントレーサー：９６％v／v水性エタノール中の放射活性二水素添加サイクロスポリンＡ１mlを含むバイアルを、商業的に入手可能なサンディミュン(商標)−キットから得る。競合剤溶液：欧州特許第２９６１２３号に記載のように製造した[Ｔhr²,Ｌeu⁵ ,Ｄ−Ｈiv⁸,Ｌeu¹⁰]−シクロスポリン４.２mgをメタノール１mlに溶解し、４℃ で貯蔵する。各々の目盛りサンプル(ブランクを含む)１２５μlを、非調整マイクロタイタープレートのウェルにピペットで移す。試験すべき血液サンプル１２５μlを、残ったウェルのそれぞれにピペットで移す。ＰＢＳ／トゥイン２０溶液１００μ lおよびサイクロスポリントレーサー２５μlを各ウェルに加える。マイクロタイタープレートを、５分間振盪し、次いで室温で１５分間インキュベーションする。競合剤溶液３μlを各ウェルに加え、マイクロタイタープレートを５分間振盪し、処理目盛りサンプルおよび処理血液サンプルを一晩４℃でインキュベーションする。抗体プレートをＰＢＳ／トゥイン２０溶液３００μlで３×洗浄し、処理目盛りサンプルまたは処理血液サンプル１００μlを各ウェルに加える。マイクロタイタープレートを３時間４℃でインキュベーションし、次いでＰＢＳ／トゥイン２０溶液３００μlで３×洗浄する。水１００mlに溶解したドデシル硫酸ナトリウム１ｇの１００μlを、各々のウェルに加え、マイクロタイタープレートを５分室温で振盪し、次いで１５分間３７℃でインキュベーションする。各々のウェルの１００μlの溶液を、Packard2000ＣＡ液体シンチレーション分析機で分析する。目盛り曲線は、目盛りサンプルから得られた結果から作成する。曲線は、サイクロスポリンＡの濃度の対数に対するブランクと比較した抗体−トレーサー結合のパーセントとして表す。結果の変化の係数は、０.７ngサイクロスポリンＡ／血液mlから４００ngサイクロスポリンＡ／血液mlの範囲で３０％より少ない。高い正確性を示唆するこの作業範囲は、非常に低い濃度でさえ、得られる。検定の一貫性は、反復により確認する。１００ngおよび４００ngのサイクロスポリンＡは、それぞれ人血１mlで再構成し、１００ng／mlおよび４００ng／mlの濃度を得る。各サンプルを、実施例１に記載の方法を使用して、４回分析し、濃度を測定する。結果は、表１に示す。１００ng／mlについて、全体の平均は、平均分散２.４％の９７.６ng／mlである。４００ng／mlについて、全体の平均は、平均分散４.４％の４１７.６ng／ml である。結果は、高い割合の正確さが、常に得られることを示唆する。実施例２：ＦＫ５０６検定マイクロタイタープレート調製：各々のウェルを、リン酸緩衝化生理食塩水( ＰＢＳ)中のヤギ抗ウサギ抗体１００μg／mlでコートする。マイクロタイタープレートを、一晩４℃でインキュベーションする。ヤギ抗ウサギ抗体を廃棄し、ブロッキング溶液(ＰＢＳ１００mlに溶解したウシ血清アルブミン２ｇ)２００μl を各ウェルに加える。マイクロタイタープレートを２時間３７℃でインキュベーションし、次いで３×３００μlのＰＢＳ／トゥイン２０溶液(ＰＢＳ１リットル中トゥイン２００.５ｇ)を使用したプレート洗浄機で洗浄する。マイクロタイタープレートを４℃で貯蔵する。ＰＢＳ／トゥィン２０溶液で１０００倍に希釈したウサギ抗ＦＫ５０６抗体１００μlを、各ウェルに加える。マイクロタイタープレートを一晩４℃でインキュベーションする。目盛りサンプル：ＦＫ５０６を、人全血かまたはＰＢＳ／トゥイン２０で、２００ng／ml、２０ng／mlおよび２ng／mlに希釈する。ＦＫ５０６無しの血液サンプルをブランクとして調製する。競合剤溶液：トリチウム標識ＦＫ５０６を、２５μl中１００００cpmを有するように希釈する。検定：全血または緩衝液中の目盛りサンプル１２５μlを加え、５０、１０、ｌおよび０μg／mlのラパマイシンを含むＰＢＳ／トゥイン２０１００μlと混合する。競合剤溶液２５μlを各ウェルに加える。マイクロタイタープレートをを３時間４℃でインキュベーションし、ＰＢＳ／トゥイン２０３００μlで３回洗浄する。水１００mlに溶解したドデシル硫酸ナトリウム１ｇの１０００μl を各ウェルに加え、マイクロタイタープレートを５分間、次いで１５分間３７℃ で振盪する。各ウェルの溶液１００μlを、次いでPackard2000ＣＡ液体シンチレーション分析機を使用して分析する。結果：緩衝液中のサンプルを使用した検定は、置換剤としてのラパマイシンの異なった濃度と同様の標準曲線を提供する。この結果は、ウサギ抗ＦＫ５０６抗体が、ラパマイシンと交差反応性のないことを示す。全血中のサンプルを使用した検定では、ＦＫ５０６が、全血に含まれる結合性タンパク質と結合し、抗体と反応しないため、ラパマイシンを置換剤として使用しなかった場合、非常に低い信号を提供する。ラパマイシンをマクロフィリンの結合競合剤として添加した場合、得られる標準曲線は、緩衝液中で得られたのと同様である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．血中のイムノフィリン結合性医薬の濃度測定のための検定法であり、血中において免疫抑制剤−イムノフィリン複合体から医薬を離す結合競合剤の添加、医薬に結合するが、結合競合剤には明白に結合しない受容体の添加、サンプルからの受容体−医薬複合体の分離および医薬の量の測定を含む方法。２．イムノフィリン結合性医薬がシクロスポリン、結合競合剤が[Ｔhr²,Ｌeu⁵ ,Ｄ−Ｈiv⁸,Ｌeu¹⁰]−シクロスポリンおよび受容体がモノクローナル抗体である、請求項１記載の検定法。３．イムノフィリン結合性医薬がＦＫ５０６、結合競合剤がラパマイシンおよび受容体がモノクローナル抗体である、請求項１記載の検定法。４．イムノフィリン結合性医薬がラパマイシンまたは４０−ヒドロキシエチル −ラパマイシン、結合競合剤がＦＫ５０６および受容体がモノクローナル抗体である、請求項１記載の検定法。５．血中のイムノフィリン結合性医薬の濃度の検出に適した検定キットであり、血中において免疫抑制剤−イムノフィリン複合体から医薬を離す結合競合剤および医薬に結合するが、結合競合剤には明白に結合しない受容体を含むキット。６．イムノフィリン結合性医薬がシクロスポリン、結合競合剤が[Ｔhr²,Ｌeu⁵ ,Ｄ−Ｈiv⁸,Ｌeu¹⁰]−シクロスポリンおよび受容体がモノクローナル抗体である、請求項５記載の検定キット。７．イムノフィリン結合性医薬がＦＫ５０６、結合競合剤がラパマイシンおよび受容体がモノクローナル抗体である、請求項５記載の検定キット。８．イムノフィリン結合性医薬がラパマイシンまたは４０−ヒドロキシエチル −ラパマイシン、結合競合剤がＦＫ５０６および受容体がモノクローナル抗体である、請求項５記載の検定キット。９．他のイムノフィリン結合性化合物の血中濃度測定のための検定キットまたは方法における、イムノフィリン結合競合剤としてのイムノフィリン結合性化合物の使用。１０．サイクロスポリンの血中濃度測定のための検定キットまたは方法における、[Ｔhr²,Ｌeu⁵,Ｄ−Ｈiv⁸,Ｌeu¹⁰]−シクロスポリンの請求項９記載の方法。１１．ＦＫ５０６化合物の血中濃度測定のための検定キットまたは方法における、ラパマイシンの請求項９記載の方法。１２．ラパマイシンの血中濃度測定のための検定キットまたは方法における、ＦＫ５０６の請求項９記載の方法。