JPH09501054A - ヒトグルカゴン様１ペプチドレセプター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒトＧＬＰ−１レセプターをクローニングし、これをｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで使用して、ヒトＧＬＰ−１レセプターに特異的に結合する化合物（例えば糖尿病の症状を軽減するのに効果的な化合物）についてスクリーニングする。本発明は、アッセイ、アッセイで使用するクローン化ヒトレセプター、他のヒトタンパク質を含まない単離ヒトＧＬＰ−１レセプター、及びヒトＧＬＰ−１レセプターと選択的に結合するこの新規なクローン化レセプターを使用して同定される化合物を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称 ヒトグルカゴン様１ペプチドレセプター図面の簡単な説明 図１．ヒトＧＬＰ−１レセプターの配列。ｃＤＮＡ配列から推定される４６３ 残基長アミノ酸配列を一文字コードで示す。変性ＰＣＲによって単離された３３ ７塩基対（ｂｐ）断片（ｈＧＬＰ−１断片１）には下線を引く。Ｎ結合グリコシ ル化の起こりうる３つのコンセンサス配列には菱形の印を付ける。 図２．ヒト及びラットのＧＬＰ−１レセプターｃＤＮＡ配列の比較。ＧＣＧ（遺 伝学コンピューター協会）提供のギャッププログラムを用いて、ヒト（ｔｏｐ） 及びラットのＧＬＰ−１レセプターを比較した。推定上の７つのトランスメンブ ランドメインは四角で囲む。 図３．［¹²⁵Ｉ］ＧＬＰ−１（７−３６）アミドと、トランスフェクトしたＣＯ Ｓ−７細胞との結合の推移。ＣＯＳ−７細胞（７×１０⁶個の細胞）を、ｐｃＤ ＮＡＩ／ｎｅｏ中のヒトＧＬＰ−１レセプターｃＤＮＡ２０μｇでトランスフェ クトし、細胞から膜を調製して凍結した。２７μｇの膜タンパク質を５０ｐＭ［¹²⁵ Ｉ］ＧＬＰ−１（７− ３６）アミド及び規定濃度のリガンドと共にインキュベートした。図示するデー タは２回の測定の平均±標準偏差であり、２回の実験を代表するものである。記 号：四角、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド；三角、グルカゴン；菱形、ガストリ ックインヒビトリーペプチド；円、セクレチン。 図４．トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞でのｃＡＭＰ蓄積。ＣＯＳ−７細胞 （７×１０⁶個の細胞）を、１００μｇのヒトＧＬＰ−１レセプターｃＤＮＡで トランスフェクトした。細胞を採取し、実施例に示すようにｃＡＭＰ蓄積を調べ た。図示するデータは１回の実験で３回測定した値の平均±標準偏差であり、３ 回の実験を代表するものである。記号、三角、ＧＬＰ−１ ７−３６アミド；四 角、グルカゴン。発明の背景 グルカゴン様１ペプチド（ＧＬＰ−１）は、グルコースによって誘発されるイ ンシュリン分泌を促進することが判明している数種のホルモンの１種である。イ ンクレチンとして知られているこのようなホルモン類は腸内で産生され、食事に 反応して放出される。このホルモンが膵臓島の特異レセプターと相互作用すると 、インシュリンがグルコース 依存的に分泌される（Ｈ．−Ｃ．Ｆｅｈｍａｎｎ，Ｊ．Ｆ．Ｈａｂｅｎｅｒ，Ｔ ｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．ａｎｄ Ｍｅｔ．３，１５８−１６ ３（１９９２））。ＧＬＰ−１は腸Ｌ細胞中のプログルカゴン遺伝子の翻訳後プ ロセッシングにより産生され、生物学的に不活性な３７アミノ酸形態［ＧＬＰ− １（１−３７）］から、２種の生物学的に活性な形態のＧＬＰ−１（７−３７） アミド及びＧＬＰ−１（７−３６）アミドとなる。これらの生物学的に活性な形 態のＧＬＰ−１は、公知のものでは最も効力のあるインクレチンであり、１０ｐ Ｍという低濃度でグルコースを媒介とするインシュリン分泌への作用が認められ る。II型糖尿病患者にＧＬＰ−１（７−３６）アミドを注入すると、グルコース 依存的にインシュリンの分泌が増す（Ｄ．Ｍ．Ｎａｔｈａｎ，Ｅ．Ｓｃｈｒｅｉ ｂｅｒ，Ｈ．Ｆｏｇｅｌ，Ｓ．Ｍｏｊｓｏｖ，Ｊ．Ｆ．Ｈａｂｅｎｅｒ，Ｄｉａ ｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ １５，２７０−２７６（１９９２）；Ｍ．Ｇｕｔｎｉａ ｋ，Ｃ．Ｏｒｓｋｏｖ，Ｊ．Ｊ．Ｈｏｌｓｔ，Ｂ．Ａｈｒｅｎ，Ｅ．Ｓ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６，１３１６−１３２２（１９９２））。これら のデータは、ＧＬＰ−１レセプターを介し て作用する化合物がII型糖尿病の治療薬になり得ることを示唆している。 ＧＬＰ−１レセプターは、肺（Ｇ．Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｒ．Ｇｏｋｅ，Ｂ．Ｇｏ ｋｅ，Ａ．Ｒ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２６７，７８−８０（１９９０））、脂 肪（Ｃ．Ｒｕｉｚ−Ｇｒａｎｄｅ，Ｃ．Ａｌａｒｃｏｎ，Ｅ．Ｍｅｒｉｄａ，Ｉ ．Ｖａｖｅｒｄｅ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １３，１３−１６（１９９２））、脳（ Ｎ．Ｓ．Ｈｏｏｓｅｉｎ，Ｇ．Ｒ．Ｓ，ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．１７８，８３−８ ６（１９８４））、及び胃腫瘍細胞系ＨＧＴ−１（Ａ．Ｂ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｃ． Ｐ．Ｇｅｓｐａｃｈ，Ｇ．Ｅ．Ｒｏｓｓｅｌｉｎ，Ｊ．Ｊ．Ｈｏｌｓｔ，ＦＥＢ Ｓ Ｌｅｔｔ．２３６，１１９−１２２（１９８８））についても記載されてい る。最近、ＧＬＰ−１レセプターをコードするｃＤＮＡがラット膵臓島からクロ ーニングされた（Ｂ．Ｔｈｏｒｅｎｓ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９，８６４１−８６４５（１９９２））。このレセプターは７つの推定上のト ランスメンブランドメインを有し、Ｇタンパク質結合レセプターに大別される。 ＧＬＰ−１レセ プターは、グルカゴン及びセクレチン用レセプターを含む最近定義されたＧタン パク質結合レセプターの他のメンバーと極めて相同である。ＧＬＰ−１レセプタ ーは、アデニリルサイクラーゼの刺激により作用して、細胞内レベルのｃＡＭＰ を産生する（Ｆｅｈｍａｎｎ等、上掲）。 本発明は、胃腫瘍細胞系ＨＧＴ−１からのヒトＧＬＰ−１レセプターのクロー ニング、発現、及び薬理特性分析に関する。発明の要約 ヒトグルカゴン様１ペプチド（ＧＬＰ−１）をクローニングして発現し、これ をｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで使用して、レセプターに結合する化合物（例えば レセプターの活性を特異的に刺激又は阻害する化合物）についてスクリーニング する。本発明は、該アッセイ、該アッセイで使用するクローン化レセプター、単 離したヒトＧＬＰ−１レセプター、クローン化レセプターを発現する細胞、及び ヒトＧＬＰ−１レセプターに選択的に結合するクローン化ＧＬＰ−１レセプター （例えばレセプターの特異的なアゴニスト又はアンタゴニスト）を用いて同定さ れる化合物を包含する。本出願のヒトグルカゴン様１ペプチドレセプター を胃腫瘍細胞系ＨＧＴ−１からクローニングした。ｃＤＮＡクローンは４６３ア ミノ酸のタンパク質をコードする。予測される二次構造によれば、このレセプタ ーは、７つのトランスメンブランドメインのＧタンパク質結合レセプターの部類 に属する。ヒトＧＬＰ−１レセプターをＣＯＳ−７細胞内にトランスフェクトす ると、これらの細胞で［¹²⁵Ｉ］ＧＬＰ−１（７−３６）アミドとの高い親和結 合が得られる。ヒトＧＬＰ−１レセプターでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細 胞から調製した膜では、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド＞グルカゴン＞セクレチ ンの効力順で［¹²⁵Ｉ］ＧＬＰ−１（７−３６）アミドの結合が阻害される。こ れは、ＧＬＰ−１レセプターの特徴である。ＣＯＳ−７細胞中に発現されるヒト ＧＬＰ−１レセプターを機能的に結合させて、細胞内ｃＡＭＰを増加させる。ヒ トＧＬＰ−１レセプターを発現するＣＯＳ−７細胞をＧＬＰ−１（７−３６）ア ミドと共にインキュベートすると、基礎レベルに比べて環状ＡＭＰが４倍に増加 し、ＥＣ₅₀は２５ｐＭである。発現されたヒトレセプターでのアゴニストとして のＧＬＰ−１の効力に比べると、グルカゴンのそれは２００分の１である。発明の詳細な説明 本発明者らは、細胞培養物でヒトグルカゴン様１ペプチドレセプター（ＧＬＰ −１）を同定、クローニングし、発現した。ポリメラーゼ連鎖反応技術（ＰＣＲ ）により、このレセプターの部分コード領域を作成した。ラットＧＬＰ−１レセ プター中に存在するアミノ酸をコードする変性オリゴヌクレオチドを使用し、ヒ トＨＧＴ−１ ｃＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ反応を開始させた。予測され た寸法の生成物をクローニングして配列決定した。増幅したｃＤＮＡを解析する と、ラットＧＬＰ−１レセプターと約９１％相同なタンパク質をコードする開放 読み枠が得られた。この部分配列を使用して、ヒトＨＧＴ−１ライブラリーから より大きなｃＤＮＡクローンを得た。ＰＣＲ−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌ ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）手順（Ｍ．Ａ．Ｆｒｏｈｍａ ｎ，Ｍ．Ｋ．Ｄｕｓｈ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５，８９９８−９００２（１９８８））の改変手法に より、残りのレセプターｃＤＮＡを得た。実施例に記載するようにＨＧＴ−１ ｃＤＮＡやプラスミドｐｃＤＮＡ ＩからｃＤＮＡライブラリ ーを作成した。ヒトＧＬＰ−１レセプター及びｐｃＤＮＡ Ｉ両方の部分断片に 対するプライマーやＨＧＴ−１ライブラリーを用いてＰＣＲを実施した。一連の 重複ｃＤＮＡ断片が得られ、これを配列決定した。 ＰＣＲ反応でＨＧＴ−１ ｃＤＮＡライブラリー並びにプライマー５’ＴＧＧ ＴＧＧＡＴＴＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣ３’（配列番号３）及び５’ＣＣＴＧＴＧＧ ＴＴＴＣＡＣＡＡＧＡＡＧＣ３’（配列番号４）を使用して、完全レセプター配 列を作成した（図１）。この配列に含まれる開放読み枠は、ラットＧＬＰ−１レ セプター配列（図２）と約９１％同一の４６３アミノ酸タンパク質をコードする 。 哺乳動物細胞系（限定はされないが、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ又はＬ細胞が含まれ る）で発現されたときのクローン化ヒトＧＬＰ−１レセプターを使用して、レセ プターと結合してその機能を変化させるか又は刺激するリガンドを発見する。更 には、クローン化ＧＬＰ−１レセプターでは、ＲＮａｓｅ保護アッセイによって 、ヒト組織（例えば膵臓系及び胃腸系）のｍＲＮＡレベルを定量することができ る。これらの目的のために、レセプターの完全コード配列を提供する。 ＧＬＰ−１レセプターとの親和性を示す各化合物の結合特異性は、クローン化 ＧＬＰ−１レセプターでトランスフェクトした細胞から得られた膜及びＧＬＰ− １レセプターを発現することが知られている組織からの膜と化合物との親和性を 測定することにより示される。クローン化ＧＬＰ−１レセプターの発現、放射性 標識ＧＬＰ−１（７−３６）アミドの結合を阻害する化合物又は上記細胞でｃＡ ＭＰ産生を刺激する化合物のスクリーニングは、化合物の選択や予測可能な薬理 活性を有する新規化合物の発見に有用である。 一旦ヒトレセプターをＣＯＳ−７細胞又はＣＨＯ細胞のような非ヒト細胞系で クローニングして発現すると、その組換えＧＬＰ−１レセプターは他のヒトタン パク質をもたない。次いで、ヒトＧＬＰ−１レセプターを発現する組換え細胞か らの膜を当業界でよく知られた方法に従って単離し、これを種々の膜会合レセプ ター結合アッセイで使用することができる。このようなアッセイの一例はＳｔｒ ａｄｅｒ等が記載している（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，４３８４−４３８８，１９８７）。一般に、問題の化合物を使用して、既 知で定量可能なＧＬ Ｐ−１レセプターリガンドの結合と競合させる。かくして、この目的のために、 放射性標識した［¹²⁵Ｉ］ＧＬＰ（７−３６）アミド又は［³Ｈ］−ＧＬＰを使用 することができる。¹²⁵Ｉ検出は簡単なので、この目的のためには［¹²⁵Ｉ］ＧＬ Ｐ（７−３６）アミドが好ましい。非標識試験化合物の量を増すと、標識化合物 がレセプターから追い出される。これらの実験から、各試験化合物及びレセプタ ーサブタイプのＩＣ₅₀値を調べる。 更には、添加化合物がＣＯＳ−７又はＣＨＯ細胞で発現されたレセプターを媒 介とするｃＡＭＰ産生を増加させる能力を測定することによって、レセプターを 活性化するアゴニストリガンドを検出してもよい。ラジオイムノアッセイによっ て、又は当業界でよく知られた方法により細胞から調製した膜でアデニリルサイ クラーゼを刺激することにより（Ｓａｌｏｍｏｎ，Ｙ．，Ｌａｎｄｏｓ，Ｃ．及 びＲｏｄｂｅｌｌ，Ｍ．１９７４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５８ 巻，５４１−５４８）直接ｃＡＭＰを測定することができる。 従って、本発明によれば、 ａ． ヒトグルカゴン様１ペプチド（ＧＬＰ−１）レセプ ターをクローニングし、 ｂ． クローン化ＧＬＰ−１レセプターを発現ベクター中にスプライシングして 、ＧＬＰ−１レセプターが、原核又は真核細胞内に構築物を導入してレセプター の発現を誘発するのに十分な転写及び翻訳シグナルと機能的に接続されているよ うな構築物を産生し、 ｃ． 構築物を導入しなければヒトＧＬＰ−１レセプターを発現しない原核又は 真核細胞内に構築物を導入し、 ｄ． 段階ｃで生成した細胞又はその細胞から単離した膜を、ヒトＧＬＰ−１レ セプターに結合することが知られている定量可能な化合物と共にインキュベート し、その後、レセプターに対して定量可能な化合物と競合するような濃度範囲の 試験化合物を添加して、試験化合物のＩＣ₅₀を、定量可能な化合物の５０％がレ セプターから離れる試験化合物濃度として計算し、 ｅ． 段階ｃで生成した細胞又はその細胞に由来する膜を、試験化合物のＥＤ₅₀ が得られるような濃度範囲の試験化合物と共にインキュベートする（ＥＤ₅₀は、 細胞内環状ＡＭＰを、試験化合物とヒトＧＬＰ−１レ セプターとの相互作用によって生成されるｃＡＭＰの最大量の５０％まで増加さ せる化合物濃度であると定義する） 段階を含む、ヒトＧＬＰ−１レセプターに特異的な化合物の同定方法を提供する 。 ＧＬＰ−１が糖尿病患者でインシュリンの分泌を増加させることが判明したの で、上述の方法で発見されたヒトＧＬＰ−１レセプターのアゴニストは糖尿病治 療に有用であろう。 以下の実施例で本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例の記 載事項に限定されるものではない。 実施例１ ＨＧＴ−１及びＣＯＳ−７細胞の培養 Ｄｒ．Ｃ．Ｌ．ＬａｂｏｉｓｓｅからＨＧＴ−１細胞（細胞系Ｃ１．１９Ａ、 ヒト胃ガン細胞系）を入手して、（Ｌａｂｏｉｓｓｅ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ ４２，１５４１−１５２８（１９８２））に記載の方法で培養した 。ＣＯＳ−７細胞をＨＧＴ−１細胞と同様に培養した。 実施例２ 部分ｃＤＮＡヒトＧＬＰ−１レセプタークローンのクローニング Ｆａｓｔ−Ｔｒａｃｋシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ポリＡ⁺ ＲＮＡをＨＧＴ−１細胞から単離した。Ｒｉｂｏｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ合成シス テム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたランダムヘキサヌクレオチド及びオリゴｄＴプ ライマーによる同時プライミングにより、５μｇのＨＧＴ−１ポリＡ⁺ＲＮＡか らｃＤＮＡを調製した。ＨＧＴ−１ ｃＤＮＡ及びラットｃＤＮＡ配列に基づく 変性プライマー（Ｂ．Ｔｈｏｒｅｎｓ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９，８６４１−８６４５（１９９２））をＰＣＲ反応物中に混合して、ヒトＧ ＬＰ−１レセプターｃＤＮＡの部分断片（図１、下線）を増幅させた。手順を以 下に記載する： 変性ＰＣＲ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ＢＭＢ ）製の１０×ＰＣＲ緩衝液５μｌ ２．５μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰストック各々４μｌ ＨＧＴ−１ ｃＤＮＡ ２μｌ ２０μＭプライマー［５’ＡＴＧＣＡ（ＡＧ）ＴＡ（ＣＴ）ＴＧ（ＣＴ）ＧＴＮ ＧＣ３’；配列番号５］１μｌ ２０μＭプライマー［５’ＡＴ（ＡＧ）ＴＣＮＧＴ（ＡＣ）ＴＴ（ＡＧ）ＣＡＣ ＡＴ３’；配列番号６］１μｌ Ａｍｐｌｉｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ）０．２５μｌ（２単位） 水３６．７５μｌ 反応条件：９５℃で１分間、４５℃で０．５分間、７２℃で１分間を４０サイク ル。 ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、優性ＰＣＲ生成 物である３３７塩基対（ｂｐ）ＤＮＡ断片（ｈＧＬＰ−断片１）をプラスミドｐ ＣＲ II中にクローニングし、大腸菌ＩＮＶαＦ’中に形質転換した。プラスミ ドＤＮＡを単離し、ジデオキシ鎖終結法によりＤＮＡ配列を決定した。 実施例３ 完全ヒトＧＬＰ−１レセプターをコードするｃＤＮＡのＰＣＲ増幅、クローニン グ及び配列決定 Ｆａｓｔ−Ｔｒａｃｋシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） を用いて、ＨＧＴ−１細胞からポリＡ⁺ＲＮＡを単離した。Ｒｉｂｏｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ合成システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたランダムヘキサヌクレオチ ド及びオリゴｄＴプライマーによる同時プライミングにより、５μｇのＨＧＴ− １ポリＡ⁺ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。 ｃＤＮＡを非パリンドローム性ＢＳＴ ＸＩリンカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ）と連結した。ｃＤＮＡサイジングカラム（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）によるゲル濾 過により、過剰リンカーを除去した。ＰＣＲ−ＲＡＣＥ手順の関係で、ＢＳＴ ＸＩで制限した後に、ｃＤＮＡをプラスミドｐｃＤＮＡ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ ｅｎ）内に連結した。ｈＧＬＰ断片１（実施例２）及びｐｃＤＮＡ Ｉの配列に 対する一連のプライマーを作成した。ＰＣＲは以下のように実施した： １０×ＰＣＲ緩衝液（ＢＭＢ）５μｌ ２．５μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰストック各々４μｌ ＨＧＴ−１ ｃＤＮＡ ２μｌ ｈＧＬＰ断片１由来の２０μＭプライマー１μｌ ｐｃＤＮＡ １由来の２０μＭプライマー１μｌ Ａｍｐｌｉｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ０．２５μｌ（２単位） 水３６．７５μｌ 反応条件：９５℃で１分間、５５℃で０．５分間、７２℃で１分間を３５サイク ル。 ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＰＣＲ反応物の 一部をプラスミドｐＣＲ II中にクローニングし、大腸菌ＩＮＶαＦ’中に形質 転換した。［³²Ｐ］標識ｈＧＬＰ断片１をプローブとして用いたフィルターハイ ブリダイゼーションにより、ヒトＧＬＰ−１レセプター特異断片を同定した。以 下のハイブリダイゼーション条件を使用した： ５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナ トリウム） ５×Ｄｅｎｈａｒｔｓ溶液（１％Ｆｉｃｏｌｌ、１％ポリビニルピロリドン） １００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ ５０％ホルムアミド ４２℃で一晩ハイブリダイズする。 フィルターを１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中にて室温で １０分間ずつ２度洗浄し、それぞれその後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中 で２０分間ずつ２度洗浄した。陽性クローンをオートラジオグラフィーで同定し た。陽性クローンのＤＮＡ配列がジデオキシ鎖終結法で得られた。この手順を用 いて、５’又は３’非翻訳領域に由来するＤＮＡ配列を含むクローンを得た。 ポリメラーゼ連鎖反応を用いた増幅により、完全ｈＧＬＰ−１レセプター配列 をコードする単一分子が得られた。以下の条件を使用した： １０×ＰＣＲ Ｐｆｕポリメラーゼ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）５μｌ ２．５μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰストック各々４μｌ ＨＧＴ−１ ｃＤＮＡ ２μｌ ２０μＭプライマー５’ＴＧＧＴＧＧＡＴＴＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣ３’；配列番 号７ １μｌ ２０μＭプライマー５’ＣＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＡＣＡＡＧＡＡＧＣ３’；配列 番号８ １μｌ Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）１μｌ（５単位） ジメチルスルホキシド５μｌ 水２９μｌ 反応混合物を９６℃で５分間加熱し、次いで９５℃で１分間、５５℃で０．５分 間、７２℃で２分間の加熱サイクルを３５回実施した。 ＰＣＲ反応物の一部をプラスミドｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ⁺（Ｓｔｒａｔ ａｇｅｎｅ）中に平滑末端でクローニングし、大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ中に形 質転換した。［³²Ｐ］標識ｈＧＬＰ断片１をプローブとして用いたフィルターハ イブリダイゼーションにより、ヒトＧＬＰ−１レセプター特異断片を同定した。 使用したハイブリダイゼーション条件は実施例３に記載した通りである。 フィルターを１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中にて室温で１０分間ずつ２度洗浄 し、それぞれその後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で２０分間ずつ２度洗 浄した。陽性クローンをオートラジオグラフィーで同定した。陽性クローンのＤ ＮＡ配列がジデオキシ鎖終結法で得られた。得られた配列は図１に示す。 実施例４ クローン化ヒトＧＬＰ−１レセプターの発現 エレクトロポレーションにより、ＣＯＳ−７細胞を、真核生物発現ベクターｐ ｃＤＮＡ Ｉ／ｎｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にサブクローニングしたヒト ＧＬＰ−１レセプターｃＤＮＡでトランスフェクトした。６０〜７２時間後に細 胞を採取した。文献に記載の方法（Ｃ．Ｄ．Ｓｔｒａｄｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａ ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，４３８４−４３８８（１９８７） ）で、発現したレセプタータンパク質を含む膜を調製した。ヒトＧＬＰ−１レセ プターｃＤＮＡを含むベクターでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞から調製 した膜は、ＧＬＰ−１レセプターアゴニスト［¹²⁵Ｉ］ＧＬＰ−１（７−３６） アミドと特異的に結合した（図３）。ベクターだけでトランスフェクトした細胞 から調製した膜は、［¹²⁵Ｉ］ＧＬＰ−１（７−３６）アミドとは特異的に結合 せず、ヒトＧＬＰ−１レセプターの発現が証明された。図３に示すように、ＧＬ Ｐ−１（７−３６）アミドは、［¹²⁵Ｉ］ＧＬＰ−１（７−３６）アミドとレセ プターとの結合を阻害し、ＩＣ₅₀は４ｎＭである。グルカゴン、ガストリックイ ンヒビトリーペプチド及びセクレチンは［¹²⁵Ｉ］ＧＬＰ−１（７−３６）アミ ドの結合を阻害するが、効力は少なくと も１００分の１であり、この知見はＧＬＰ−１レセプターのようなレセプターの 同定結果と一致している。 以下の条件下にて、最終容量が２００μｌのＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウ ム、１ｍＭリン酸カリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウ ム、ｐＨ７．０）中で結合反応を実施した： トランスフェクトした細胞から調製したＣＯＳ−７膜１０〜２５μｇ ０．１％ウシ血清アルブミン ５０ｐＭ［¹²⁵Ｉ］ＧＬＰ−１（７−３６）アミド ０〜１μＭ ＧＬＰ−１（７−３６）アミド（又は図３の説明に記載した他の化 合物） 膜を室温で１時間振盪しながらインキュベートした。予め０．５％ポリエチレ ンイミン／０．１％ＢＳＡ中に浸漬したＧＦ／Ｃフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ） 上で膜を採取した。フィルターを氷冷ＰＢＳで３度洗浄し、γカウンターで結合 放射能を測定した。Ｉｎｐｌｏｔプログラム（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａ ｒｅ）を用いてデータ解析した。 ヒトＧＬＰ−１レセプターを、過渡トランスフェクトし たＣＯＳ−７細胞中のアデニリルシクラーゼに機能的に連結した（図４）。ヒト ＧＬＰ−１レセプターを発現するＣＯＳ−７細胞をＧＬＰ−１（７−３６）アミ ドと共にインキュベートすると、基礎レベルに比べて環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）が ４倍に増加した。同一のアッセイ条件下において、偽性トランスフェクトしたＣ ＯＳ細胞は、基礎レベルに比べてｃＡＭＰがそれほど増加しなかった。ＧＬＰ− １（７−３６）アミドはｃＡＭＰ蓄積を刺激し、ＥＣ₅₀は２５ｐＭである。グル カゴンも、ヒトＧＬＰ−１レセプターでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞中 のｃＡＭＰ蓄積を刺激するが、ＧＬＰ−１（７−３６）アミドと比較すると効力 は２００分の１に低下する（図４）。グルカゴンでのこの効力低下は、グルカゴ ンのヒトＧＬＰ−１レセプターを介した作用に対応している。ｈＧＬＰ−１レセ プターアッセイでトランスフェクトしたインタクトＣＯＳ−１細胞でのｃＡＭＰ 蓄積を、１２０μｌ容量のＡＣＣ（７５ｍＭトリスｐＨ７．４、２５０ｍＭスク ロース、１２．５ｍＭ塩化マグネシウム、１．５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ ＥＤＴＡ）、０．１ｍＭホスホジエステラーゼ阻害剤Ｒｏ−２０１７２４）中で 刺激した。この阻害剤は更に以下の成 分： ヒトＧＬＰ−１レセプター発現構築物でトランスフェクトした５０，０００個の ＣＯＳ−７細胞、及び ０〜１００μＭ ＧＬＰ−１（７−３６）アミド又はグルカゴン を含んでいる。 反応混合物を室温で４５分間振盪しながらインキュベートした。３〜５分間沸騰 させて、反応を終了させた。ｃＡＭＰをラジオイムノアッセイにより調べた。 実施例５ スクリーニングアッセイ：グルカゴン様ペプチド−１レセプターに媒介された細 胞内ｃＡＭＰの増加 組換えヒトＧＬＰ−１レセプターを発現するトランスフェクト細胞を使用して 、このレセプターに対するアゴニストである化合物を同定することができる。こ れは、細胞を試験化合物のＥＤ₅₀が得られるような濃度範囲の試験化合物と共に インキュベートすることにより実施される。ＥＤ₅₀は、細胞内環状ＡＭＰ（ｃＡ ＭＰ）を、試験化合物とヒトＧＬＰ−１レセプターとの相互作用によって生成さ れるｃＡＭＰの最大量の５０％まで増加させる化合物濃度である と定義する。これらの反応は、以下の成分： ヒトＧＬＰ−１レセプターでトランスフェクトした５０，０００個のＣＯＳ−７ 細胞、及び 様々な濃度の試験化合物 を含む１２０μｌ容量のＡＣＣ中で実施する。 反応混合物を室温で４５分間振盪しながらインキュベートした。３〜５分間沸騰 させて、反応を終了させた。ｃＡＭＰをラジオイムノアッセイにより調べた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/02 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/28 ＡＤＰ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ボルコウスキ，ドーリーン・エイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07090、ウエストフイールド、エツジウツ ド・アベニユー・237 (72)発明者 チツチ，ゲイリー・ジー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 08816、イースト・バーンズウイツク、フ ロスト・アベニユー・64 (72)発明者 ヘイ，パトリシア・ジエイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07023、フアンウツド、メアリー・レー ン・10 (72)発明者 ストラーダー，キヤサリン・デイー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07044、ベローナ、モーニングサイド・ロ ード・119

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．本質的にヒトグルカゴン様１ペプチドレセプターをコードするＤＮＡからな る単離精製したＤＮＡ分子。 ２．レセプターを原核細胞又は真核細胞中に導入して発現できるように、レセプ ターをコードするＤＮＡが調節配列に機能的に接続されている請求項１に記載の ＤＮＡ分子。 ３．請求項１に記載のＤＮＡ分子によってコードされるヒトグルカゴン様１ペプ チドレセプター。 ４．請求項１に記載のＤＮＡ分子を含み、クローン化ヒトグルカゴン様１ペプチ ドレセプターを発現する細胞。 ５．（ａ） ヒトグルカゴン様１ペプチドレセプターをクローニングし、 （ｂ） クローン化グルカゴン様１ペプチドレセプターを発現ベクター中にスプ ライシングして、グルカゴン様１ペプチドレセプターが、原核又は真核細胞内に 構築物を導入して該レセプターの発現を誘発するのに十分な転写及び翻訳シグナ ルと機能的に接続するような構築物を産生し、 （ｃ） 構築物を導入しなければヒトレセプターを発現しない原核又は真核細胞 内に構築物を導入し、 （ｄ） 段階（ｃ）で生成した細胞又はその細胞から単離した膜を、ヒトグルカ ゴン様１ペプチドレセプターに結合することが知られている定量可能な化合物と 共にインキュベートし、その後、レセプターに対して定量可能な化合物と競合す るような濃度範囲の試験化合物を添加し、 （ｅ） 試験化合物と、段階（ｄ）の細胞又は膜との相対結合度を計算する 段階を含む、ヒトグルカゴン様１ペプチドレセプターに特異的に結合する化合物 の同定方法。 ６．請求項５に記載の方法によって同定される化合物。 ７．ヒトＧＬＰ−１レセプターに特異的に結合する化合物を医薬的に効果的な量 投与することからなる非ヒト動物における糖尿病作用の軽減方法。 ８．図１に示す核酸配列を有する請求項１に記載のＤＮＡ分子。 ９．請求項８に記載のＤＮＡ分子によってコードされ、図１に示すアミノ酸配列 を有する精製ヒトグルカゴン様１ペプチドレセプター。