JPH09500001A - Ｃｄ４０リガンド遺伝子の突然変異の検出および治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＣＤ４０リガンド遺伝子の突然変異を検出する方法であって、個体から核酸を単離し、ＣＤ４０リガンド遺伝子に由来する核酸を選択的に増幅させ、増幅された核酸を分析して、ＣＤ４０リガンド遺伝子に１種類（または複数）の突然変異が存在するかどうか決定することを含む上記方法を開示する。遺伝子から発現されたＣＤ４０リガンドタンパク質の能力を決定することができる。高濃度の血清ＩｇＭおよび低濃度の免疫グロブリンの他のイソタイプ全部を生じる症候群を治療する方法を更に開示する。更に、遺伝子標的技術の結果として機能性ＣＤ４０リガンドを欠いている非ヒト動物を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＣＤ４０リガンド遺伝子の突然変異の検出および治療 発明の技術分野 本発明は、細胞表面抗原ＣＤ４０のリガンドであるＣＤ４０リガンド（ＣＤ４ ０Ｌ）に関する。更に詳しくは、本発明は、ＣＤ４０Ｌ遺伝子における突然変異 を検出する方法、および血清ＩｇＭ濃度を増加させ且つ免疫グロブリンの他のイ ソタイプ全部の濃度を減少させる症候群の治療法に関する。 発明の背景 ヒトＸ連鎖高ＩｇＭ症候群は、高濃度の血清ＩｇＭおよび低（実際的に検出不 能な）濃度の免疫グロブリンの他のイソタイプを特徴とする。男性患者は、通常 、生後１年以内に反復感染の開始を経験している。臨床経過としては、間欠性好 中球減少症およびニューモシスティス（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）肺炎、並び に低ガンマグロブリン血症を一層代表する感染、例えば、細菌性耳炎、静脈洞炎 および肺炎がありうる。この症状は医学的介入の不存在下において致命的である が；しかしながら、患者は、特に、誕生後すぐに治療を開始した場合、典型的に 、静脈内ガンマグロブリンから成る持続療法に対して十分に反応する。 男性患者は、正常な数の循環性ＢおよびＴリンパ球を有するが、胚中心の不存 在によるリンパ節増殖症は共通している（ノタランジェロ（Ｎｏｔａｒａｎｇｅ ｌｏ）ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２１５，１９９２）。こ のような患者からのＢ細胞は、正常なＢ細胞培養においてクラスを変化させるこ とが知られているＴ細胞系と一緒にインビトロで循環された場合にイソタイプを 変化させることができ、それらは正常であると考えられる（ヘンドリックス（Ｈ ｅｎｄｒｉｃｋｓ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：２６０３，１９９ １；メーヤー（Ｍａｙｅｒ）ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１４：４０９， １９８６）。 高濃度の血清ＩｇＭは、複合可変免疫欠乏症（ＣＶＩＤ）および後先天性風疹 を含む他の症候群で生じる。一次遺伝免疫欠乏症の結果としてかまたは後天性Ｃ Ｄ４＋Ｔ細胞異常（例えば、ＡＩＤＳ）の結果としてのＴ細胞の活性化の変化は 、ＣＤ４０Ｌに誘導されたＢ細胞活性化シグナルを減少させることもあり、した がって、これらの状態で見られるＢ細胞機能の二次異常を部分的に説明すること ができる。 ＣＤ４０細胞表面抗原は、Ｂ細胞増殖および分化においてある重要な役割を果 たすことが示された。Ｂ細胞の表面上に存在する細胞表面抗原であるヒトＣＤ４ ０タンパク質（ＣＤ４０）は、２７７アミノ酸を有する分子量３０，６０００の ペプチドであり、１９アミノ酸分泌シグナルペプチドは主として疎水性アミノ酸 を含む。ヒトＣＤ４０をコードしているｃＤＮＡは、バーキットリンパ腫細胞系 ラジ（Ｒａｊｉ）から製造されたｃＤＮＡライブラリーから単離された（スタメ ンコビック（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．８：１４０３，１９ ８９）。 活性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４０のリガンド（ＣＤ４０Ｌ）を高レベルで発現 する。膜に結合した糖タンパク質であるヒトＣＤ４０Ｌは、最近、本明細書中に 参考として開示が包含されているスプリッグス（Ｓｐｒｉｇｇｓ）ら、Ｊ．Ｅｘ ｐ．Ｍｅｄ． １７６：１５４３（１９９２）および１９９２年１０月２３日出願 の米国特許出願第０７／９６９，７０３号明細書に記載されたように、末梢血Ｔ 細胞からクローン化された。ネズミＣＤ４０Ｌのクローニングは、アーミタージ （Ａｒｍｉｔａｇｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５７：８０，１９９２に記載されて いる。ＣＤ４０Ｌは、いずれの補助刺激剤も不存在下においてＢ細胞増殖および 各種免疫グロブリンイソタイプ（ＩｇＥ以外）の分泌を誘導するし、更に、サイ トカイン存在下においてＩｇＥを生産することができる。 したがって、ＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４０＋Ｔヘルパー細胞とＢ細胞との間の同族 相互作用において重要な役割を果たすと考えられる。Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群およ びその関連症候群の患者についての更に詳細な分析は、体液性免疫反応に関与す るＴ細胞−Ｂ細胞相互作用についての貴重な情報を提供する。Ｘ連鎖高ＩｇＭ症 候群およびその関連症候群の初期検出は、適切な治療の開始を促すことができる 。したがって、当該技術分野において、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群並びにＣＤ４０お よびＣＤ４０Ｌがある役割を果たしているＢ細胞−Ｔ細胞相互作用の他の異常を 検出するおよび確認する方法を開発する必要がある。このような症候群の別の治 療法も必要とされている。 発明の概要 本発明は、ＣＤ４０Ｌ遺伝子の１種類または複数の突然変異を検出する方法で あって、個体から核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を単離し、ＣＤ４０リガンド遺伝 子に由来する核酸を選択的に増幅させ、そして増幅された核酸を分析して、ＣＤ ４０Ｌ遺伝子に１種類の（または複数の）突然変異が存在するかどうかを決定す ることを含む上記方法に関する。この遺伝子の突然変異は、ＣＤ４０ＬおよびＣ Ｄ４０の相互作用の異常を引き起こし、その結果、Ｔ細胞およびＢ細胞の相互作 用に変化が生じる。このようなＴ細胞−Ｂ細胞相互作用の変化は、ヒトのＸ連鎖 高ＩｇＭ症候群においてある役割を果たしているし、しかも他の症候群を引き起 こすこともある。 本発明は、更に、Ｔ細胞およびＢ細胞の相互作用が影響を受けている症候群（ 例えば、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群）の個体を治療する方法であって、有効量の可溶 性ＣＤ４０Ｌを投与することを含む上記方法を提供する。可溶性の形のＣＤ４０ ＬはＣＤ４０Ｌの細胞外部分を含み、例えば、ＣＤ４０Ｌの細胞外部分およびヒ ト免疫グロブリンのＦｃ部分を含む融合タンパク質並びにＣＤ４０Ｌの細胞外部 分に対してマルチマー生成ペプチドを加えることによって生成されたＣＤ４０Ｌ マチルマーがある。 本発明は、更に、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群およびＣＤ４０Ｌ遺伝子が生物学的に 活性なＣＤ４０Ｌをコードしていない他の症候群を矯正するために遺伝子療法を 用いる方法を提供する。このような症候群を矯正する遺伝子療法は、罹患した個 体からＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、単離されたＴ細胞を、生物学的に活性なＣＤ４ ０Ｌを発現するトランスフェクションベクターによってトランスフェクトし、そ して生物学的に活性なＣＤ４０Ｌを発現するトランスフェクトされたＴ細胞を該 個体に対して投与することを含む。 更に、胚幹細胞を用いる遺伝子を標的とする技術によって、インビボで非機能 性ＣＤ４０−Ｌを発現する動物を提供する。このような動物はノックアウト動物 と称され、インビボでＴおよびＢ細胞の同族相互作用を研究する場合に有用な非 ヒトモデルを提供する。 図面の簡単な説明 図１は、ＣＤ４０−Ｌノックアウトマウスを生じさせるのに用いられた標的に 到達するベクターの構築を表わすフローチャートである。エクソンは、ＣＤ４０ −Ｌ遺伝子地図上で黒一色の箱形で表わされ、左から右へ１〜５までの番号を付 けられている。黒一色の矢印はＰＧＫ−Ｎｅｏ遺伝子を表わし；大型の塗りつぶ されていない矢印はＨＳＶ ＴＫ遺伝子を表わす。 図２は、ｐＨＲＶ−ＭＣＤ４０Ｌ＃３のための遺伝子を標的とするスキームを 図示する。 図３は、遺伝子型決定のためのＰＣＲスキームを示す。ＰＣＲプライマー３は 配列番号：１３に対応し；ＰＣＲプライマー４は配列番号：１４に対応し；ＰＣ Ｒプライマー１は配列番号：１５に対応し、そしてＰＣＲプライマー２は配列番 号：１６に対応する。 発明の詳細な説明 本発明は、ＣＤ４０の膜結合リガンドをコードしている遺伝子の欠乏によって Ｔ細胞およびＢ細胞間の相互作用が異常である症候群または症状に関する。ＴＮ Ｆ受容体超系列のメンバーであるＣＤ４０は、Ｂリンパ球、上皮細胞およびある 種の癌腫細胞系で発現されることが分かった膜結合受容体タンパク質である。Ｃ Ｄ４０に対して向けられた単クローン性抗体は、相同接着性；加した細胞寸法； 抗ＩｇＭ、抗ＣＤ２０単クローン性抗体（ｍＡｂ）、ホルボールエステルまたは インターロイキン−４（ＩＬ−４）と組合わされたホルボールエステルによって 活性化されたＢ細胞の増殖；並びにＩＬ−４で刺激されたＴ細胞減少培養からの ＩｇＥおよびＩｇＭの生産を含むヒトＢ細胞の各種機能的作用を媒介する。これ らの結果は、Ｂ細胞の増殖および分化におけるＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌの重要 性を示唆している。 ＣＤ４０Ｌは、そのＣ末端にある細胞外部分、トランスメンブラン部分および Ｎ末端にある細胞内部分を有する膜結合ポリペプチドである。ＣＤ４０Ｌの可溶 性変種は、細胞外部分またはそのフラグメントから製造することができる。ＣＤ ４０Ｌの生物学的活性はＣＤ４０に対して結合することによって媒介され、Ｂ細 胞の増殖および活性Ｂ細胞からの免疫グロブリン分泌の誘導を含む。ＣＤ４０Ｌ （可溶性オリゴマーの形、更には膜に結合した形を含む）は、活性を媒介するＩ Ｌ−４および架橋を必要とする抗ＣＤ４０抗体とは対照的に、加えられたＩＬ− ４の存在を必要とすることなくＢ細胞増殖および免疫グロブリン分泌（ＩｇＥ以 外）をもたらすことができる。ＣＤ４０Ｌのクローニングおよびその各種活性の いくつかは、１９９２年１０月２３日出願の米国特許出願第０７／９６９，７０ ３号明細書に記載されている。 ＣＤ４０Ｌの遺伝子は、Ｈｐｒｔ遺伝子座に連鎖したネズミＸ染色体の近位部 分に地図で表わされた。プローブされたヒトＣＤ４０Ｌ ｃＤＮＡを用いるヒト 中期染色体のｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成実験は、ヒトにおいて同様の位置 を確証しており、最大数の木目模様はバンドｑ２６に地図で表わされた。ＣＤ４ ０Ｌの染色体位置と一緒にその機能についてのインビトロの生物学的データは、 この遺伝子がＸ連鎖免疫欠乏症においてある役割を果たしうることを示唆した。 特に、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群の患者の表現型およびこの症候群の連鎖地図位置は 、機能性ＣＤ４０Ｌの発現の欠損と最も一致していた。Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群は 、ＨＰＲＴに近いＸｐ２６に地図で表わされた（パタヤチー（Ｐａｄａｙａｃｈ ｅｅ）ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４：５５１，１９９２年；メンシンク（Ｍｅｎ ｓｉｎｋ）ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７６：９６，１９８７年）。 ＣＤ４０Ｌ遺伝子の発現は、一次Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群の患者において、フィ コル・ハイパクーでの分離によって精製された後にＣＤ３に対して免疫感作され た単クローン性抗体によって活性化された末梢血Ｔ細胞を用いて実験された。可 溶性ＣＤ４０タンパク質（ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合したヒトＣＤ４０の細 胞外ドメインを含む融合タンパク質；本明細書中においてＣＤ４０．Ｆｃと称さ れ、ＵＳＳＮ０７／９６９，７０３号明細書およびファンスロー（Ｆａｎｓｌｏ ｗ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：６５５，１９９２年に記載された）を用 いて、刺激されたＴ細胞を蛍光活性細胞選別（ＦＡＣＳ）によって分析した。対 照細胞（正常な成人ドナーおよび／または無関係のＸ連鎖免疫欠乏症と診断され た患者から精製されたＴ細胞）を同様に分析した。Ｘ連鎖高Ｉｇ Ｍ患者からのＴ細胞は、ＣＤ３抗体による活性化によって何等かの検出可能なＣ Ｄ４０Ｌを発現することができなかったが（いくつかの実験において、一人の患 者からの活性Ｔ細胞はＣＤ４０にして弱く結合すると考えられたが）、ＩＬ−２ 受容体（Ｔ細胞表面活性化マーカー）のα鎖を、対照ドナーからのＴ細胞につい て見られたのと同様のレベルで発現した。高ＩｇＭ患者からのＴ細胞は、更に、 ＰＨＡまたはＣＤ３ ｍＡｂおよびＩＬ−７に対する正常な増殖反応を示した。 ＲＮＡは、前記のように刺激された患者およびドナー細胞から抽出され、そし てＰＣＲ反応のための鋳型として役立つｃＤＮＡを生じさせるのに用いられた。 得られたｃＤＮＡのヌクレオチド配列分析は、４人の高ＩｇＭ患者の内の３人の ＣＤ４０Ｌにおいて単点突然変異が引き起こされたことを示した。それぞれのヌ クレオチド変化は独特であって、いずれもＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインで生じた 。四人目の患者から生じたＣＤ４０Ｌ ｃＤＮＡは、コーディング領域中に何等 かのヌクレオチド変化を含むとは考えられず、おそらくは５′または３′非コー ディング配列を必要とする別の機序が、この患者からのＴ細胞上のＣＤ４０Ｌの 不存在の原因であるに違いないことが示された。 これらの突然変異が全く天然に存在しない遺伝子多形性ではなかったことを確 かめるために、見出されたヌクレオチド変化の内の２種類を、ヒトＣＤ４０Ｌの 完全なコーディング領域を含む哺乳動物発現ベクター中に、特定部位の突然変異 誘発を用いて別個に導入した。細胞を、野生型かまたは突然変異誘発ＣＤ４０Ｌ を有するベクターによってトランスフェクトし、代謝的に放射性標識し、そして ヒトＣＤ４０Ｌを発現するＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞に対して向けられた多クローン 性血清とのまたはＣＤ４０．Ｆｃとの沈降によってＣＤ４０Ｌタンパク質の発現 について試験した。野生型ＣＤ４０Ｌによってトランスフェクトされた細胞は、 ＣＤ４０．Ｆｃを用いて検出された３３ｋＤタンパク質を発現した。対照的に、 ＣＤ４０Ｌのそれぞれの突然変異型によってトランスフェクトされた細胞は、Ｃ Ｄ４０．Ｆｃによって認識されたタンパク質を発現しなかった。多クローン性抗 血清を用いる同一の溶解産物の免疫沈降の結果として、突然変異体および野生型 の両方でトランスフェクトされた細胞からの、ＣＤ４０．Ｆｃによって認識され たＣＤ４０Ｌタンパク質と一緒に共移動した３３ｋＤタンパク質が認識された。 ノーザンブロット分析は、野生型および突然変異体両方でトランスフェクトされ た細胞において同様のレベルのＣＤ４０Ｌ特異的ＲＮＡを示した。更に、ＣＤ４ ０Ｌのそれぞれの突然変異型によってトランスフェクトされた細胞は、ＣＤ４０ ．Ｆｃ結合について完全に負であったが、野生型ＣＤ４０Ｌを発現する細胞は強 いＣＤ４０．Ｆｃ結合を示した。それぞれの形の突然変異誘発ＣＤ４０Ｌを発現 する細胞は、更に、Ｂ細胞増殖またはＩｇＥ分泌を誘導することができず、それ らの細胞表面上の機能性ＣＤ４０Ｌの不存在が確証された。 Ｘ連鎖高ＩｇＭ患者からのＴ細胞減少末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ；Ｂ細胞に富 む集団）は、対照ドナーからの同様に精製されたＰＢＭＣについて見られたのと 同様のＣＤ４０Ｌに対する増殖反応を示した。正常ドナーからのＰＢＭＣは、Ｉ Ｌ−４と一緒に培養された場合、測定しうる量のＩｇＥを生産したが、同様の条 件下で培養されたいずれの高ＩｇＭ患者の細胞においてもＩｇＥ生産は検出され なかった。高ＩｇＭ患者のＰＢＭＣを含む培養に対する組換え体ＣＤ４０Ｌまた はＣＤ４０ｍＡｂの添加は、４人の患者の内３人からのＰＢＭＣのＩｇＥを分泌 する能力を回復した。 これらの実験の結果は、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞およびＢ細胞間の同族相互作 用においてＣＤ４０Ｌが果たすと考えられる重要な役割を例証している。この相 互作用は、大部分の抗原に対して体液性免疫応答がうまく機能する主要な要件の 一つである。高ＩｇＭ症候群および関連症候群の更に別の研究は、ＣＤ４０およ びＣＤ４０Ｌの構造的／機能的関係について並びに体液性免疫応答に関与する種 々の細胞の相互作用についての貴重な情報を提供する。ＣＤ４０Ｌの異常を検出 する方法は、高ＩｇＭ症候群、更にはＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌがある役割を果 たしているＢ細胞−Ｔ細胞相互作用の他の異常についての様々な推定上の形（常 染色体劣性、常染色体優性）を説明する。 ＣＤ４０Ｌにおける突然変異は、個体から核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を単離し、 ＣＤ４０Ｌ遺伝子に由来する核酸を選択的に増幅させ、そして増幅された核酸を 分析して、ＣＤ４０Ｌ遺伝子に１種類または複数の突然変異が存在するかどうか を決定することによって検出することができる。核酸は、末梢血細胞、または羊 水穿刺若しくは絨毛膜絨毛試料採取によって得られた胎児細胞などの細胞から単 離することができる。他の核酸源としては、生検組織および核酸が存在する他の 組織試料があった。 核酸は、ＣＤ４０Ｌ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いて、 ＣＤ４０Ｌ遺伝子に由来するこれら核酸に対して選択的にハイブリッド形成させ 且つそれらを増幅させるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させるこ とができる。ＣＤ４０Ｌ遺伝子に由来するＲＮＡを増幅させるのに有用であるオ リゴヌクレオチドプローブとしては、配列番号：１〜４によって定義されたプロ ーブがある。ＣＤ４０Ｌ遺伝子の配列に由来する更に別のオリゴヌクレオチドプ ローブは、核酸の５′および３′非コーディング領域並びにｍＲＮＡに転写され ないＣＤ４０Ｌ遺伝子に存在する任意のイントロンの配列を分析するのに用いる ことができるが、機能性ＣＤ４０Ｌ遺伝子生産物の発現に影響を及ぼすことがあ る。 ヌクレオチド配列分析を行なうことによって核酸を分析して、遺伝子に１種類 または複数の突然変異が存在するかどうかを決定することができる。ヌクレオチ ド配列分析は、例えば、ジデオキシアナログチェインターミネーター法によって 手動で行なうことができる。或いは、自動シークエンサーを用いてヌクレオチド 配列分析を行なうことができる。増幅された核酸のヌクレオチド配列は、参考と して開示が包含されたＵＳＳＮ０７／９６９，７０３号明細書、およびスプリッ グスら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１５４３（１９９２）にも開示されてい るＣＤ４０Ｌの公表された配列（配列番号：７）と比較される。 増幅された核酸とＣＤ４０Ｌの公開された配列との間のヌクレオチド配列の相 違は、核酸から発現されたＣＤ４０Ｌペプチドの突然変異をもたらすことがある 。このような突然変異としては、ＣＤ４０Ｌペプチド中の１種類（または複数） の異なるアミノ酸の置換、ＣＤ４０Ｌペプチドからの１種類またはそれ以上のア ミノ酸の欠失、ＣＤ４０Ｌペプチドの未成熟終結およびＣＤ４０Ｌペプチドに対 するアミノ酸の付加がある。他の種類の突然変異は、エクソンの不適当なスプラ イシング、読取りできない（ナンセンス）核酸コドンを生じるフレームシフトを 引き起こすことがあるし、または生物学的に活性なＣＤ４０Ｌの転写および翻訳 に必要な他の要素に影響を及ぼすことがある。したがって、突然変異は、ＣＤ４ ０Ｌ遺伝子のコーディング領域かまたはＣＤ４０Ｌの非コーディング領域にあり うる。 生物学的に活性なＣＤ４０Ｌの発現に対する１種類または複数の突然変異の影 響は、生物学的に活性なＣＤ４０Ｌをコードする発現ベクター中に１種類または 複数の突然変異を導入することによって評価することができる。ｈＣＤ４０−Ｌ と称するヒトＣＤ４０Ｌ配列を含むクローニングベクターは、１９９１年１２月 ６日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ロックビル、ＭＤ（ＡＴＣ Ｃ）に受託番号６８８７３で寄託された。突然変異体は、例えば、オーバーラッ プエクステンション（ＳＯＥｉｎｇ）法（ホートン（Ｈｏｒｔｏｎ）ら、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８：５２８，１９９０年）によるまたは当該技術分野に おいて知られている他の方法による遺伝子スプライシングを用いることによって 構築することができる。次に、突然変異体発現ベクターを細胞中で発現させ、そ して突然変異体によってコードされたＣＤ４０Ｌの生物学的活性を、本明細書中 並びにＵＳＳＮ０７／９６９，７０３号明細書、アーミタージら、Ｎａｔｕｒｅ ３５７：８０，１９９２年、ファンスローら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９： ６５５，１９９２年およびスプリッグスら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１５ ４３（１９９２）に記載された１種類またはそれ以上の生物学的活性検定を用い て決定する。 正常なＢ細胞機能が、外因性の生物学的活性ＣＤ４０Ｌの添加によって回復さ れうるという知見は、この分子の治療的使用を支持する。この種の療法は、精製 されたＣＤ４０Ｌを、適当な希釈剤または担体中に有効量のＣＤ４０Ｌを含む治 療用組成物で投与することを含むことがありうる。治療的使用のために、精製さ れたＣＤ４０Ｌまたはその生物学的活性類似体は、指示に適した方法での治療用 に患者に投与される。ＣＤ４０Ｌ薬剤組成物は（例えば、マルチマー可溶性細胞 外ドメインまたはそのフラグメントの形で）、ボーラス注射、連続注入、植込み 物からの徐放または他の適当な技法によって与えることができる。 典型的に、ＣＤ４０Ｌ治療薬は、精製ＣＤ４０Ｌポリペプチドを生理学的に許 容しうる担体、賦形剤または希釈剤と一緒に含む薬剤組成物の形で投与される。 このような担体は、用いられる用量および濃度において患者に対して無毒性であ る。通常、このような組成物の製法は、ＣＤ４０Ｌポリペプチドと、緩衝剤；ア スコルビン酸などの酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タ ンパク質；アミノ酸；グルコース、スクロース若しくはデキストランを含む炭水 化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；グルタチオンおよび他の安定剤；並びに賦 形剤とを混合することを伴う。中性に緩衝された食塩水または同種血清アルブミ ンと混合された食塩水は、典型的な適当な希釈剤である。 生物学的に活性なＣＤ４０Ｌをコードしている遺伝子は、更に、遺伝子転移技 術を用いて、異常なまたは欠陥ＣＤ４０Ｌを有する個体から得られたＴ細胞（好 ましくは、ＣＤ４＋Ｔ細胞）中に導入することができる。Ｔ細胞を単離し、そし て生物学的活性ＣＤ４０Ｌによってトランスフェクトし；引続き、それらを個体 に再投与した後、生物学的活性ＣＤ４０Ｌを生産することによって症候群の症状 を矯正する。 外因性遺伝子を、例えば、トランスフェクションによってまたは感染によって 哺乳動物細胞中に導入するための多数の方法が開発されてきた。これらの形質導 入法は物理的性質の方法であってもよく、またはそれらは、ＲＮＡに転写され、 感染ウイルス粒子中に包装され、そして標的細胞を感染させることによって望ま しい遺伝物質を与えるのに用いることができる組換えレトロウイルスベクターを コードしているＤＮＡの使用に頼ることができる。 多数の異なる種類の哺乳動物遺伝子転移および発現ベクターが開発された（ミ ラー（Ｍｉｌｌｅｒ）およびカロス（Ｃａｌｏｓ）監修、「哺乳動物細胞のため の遺伝子転移ベクター（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌs）」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐ ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），ニューヨーク，１９８７年 を参照されたい）。裸のＤＮＡは、制限されないが、リン酸カルシウムトランス フェクション（ベルマン（Ｂｅｒｍａｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４ ８１：７１７６，１９８４年）ＤＥＡＥ−デキストラン トランスフェクション、プロトプラスト融合（ディーンス （Ｄｅａｎｓ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４ ８ １：１２９２，１９８４年）、エレクトロポレーション（ポター（Ｐｏｔｔｅｒ ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４ ８１：７１６１ ，１９８４年）、リポフェクション（フェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら、Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４ ：７４１３，１９８７年）、 ポリブレントランスフェクション（カワイ（Ｋａｗａｉ）およびニシザワ（Ｎｉ ｓｈｚａｗａ）、Ｍｏｌｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ４：１１７２，１９８４年 ）および細胞膜のレーザー微小穿刺による直接遺伝子転移（タオ（Ｔａｏ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４ ８４：４１８０，１９ ８７年）がある多数の技術のいずれか一つを用いるトランスフェクションによっ て哺乳動物細胞中に物理的に導入することができる。 遺伝子供給用に組換え感染性ウイルス粒子を用いる各種感染技術が開発された 。これは、本発明に対する好ましいアプローチを表わす。この方法で用いられて きたウイルスベクターとしては、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０；カールソン （Ｋａｒｌｓｓｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８ ４ ８２：１５８，１９８５年）、アデノウイルス（カールソンら、ＥＭＢＯＪ ．５ ：２３７７，１９８６年）、アデノ関連ウイルス（ラフェイス（ＬａＦａｃ ｅ）ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６２：４８３，１９８８年）およびレトロウイル ス（コフィン（Ｃｏｆｆｉｎ）、１９８５年、ワイス（Ｗｅｉｓｓ）ら（監修） 、ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ，第二版，２巻，コールド・スプリング ・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨークの１７〜７１頁）に由来するウイルス ベクターがある。 したがって、遺伝子転移および発現法は多数であるが、本質的には、哺乳動物 細胞中において遺伝物質を導入するおよび発現するように働く。上記技術のいく つかは、造血系またはリンパ系細胞への形質導入に用いられており、リン酸カル シウムトランスフェクション（ベルマンら、上記、１９８４年）、プロトプラス ト融合（ディーンスら、上記、１９８４年）、エレクトロポレーション（カン（ Ｃａｎｎ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３：１２３，１９８８年）および組換え体ア デノウイルスによる感染（カールソンら、上記；ルーター（Ｒｕｅｔｈｅｒ） ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１２３，１９８６年）アデノ関連ウイル ス（ラフェイスら、上記）およびレトロウイルスベクター（オーヴェレル（Ｏｖ ｅｒｅｌｌ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ４：１４２５，１９８９年）がある。初代 Ｔリンパ球は、エレクトロポレーション（カンら、上記、１９８８年）によって およびレトロウイルス感染（ニシハラ（Ｎｉｓｈｉｈａｒａ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８ ：４７３０，１９８８年；カシド（Ｋａｓｉｄ）ら、上記、１９ ９０年）によってうまく形質導入された。 胚幹細胞を用いる遺伝子標的技術は、ある選択された遺伝子において特定の変 化を有する形質転換マウスを生じさせることを可能にした（ワルドマン（Ｗａｌ ｄｍａｎ）Ａ．Ｓ．１９９２年、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏ ｌ． １２（１）：４９〜６４；ホワン（Ｈｕａｎｇ）Ｍ．Ｔ．１９９３年、Ｌａ ｂ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ． ４３（２）：１５６〜１５９；コラー（Ｋｏｌｌｅｒ） およびスミシーズ（Ｓｍｉｔｈｉｅｓ）、１９９２年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍ ｍｕｎｏｌ． １０：７０５〜７３０；ジョイナー（Ｊｏｙｎｅｒ）Ａ．Ｌ．１９ ９１年、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ．１３（１２）：６４９〜６５６；スミシーズ Ｏ ．、１９９３年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．９（４）：１１２〜１１６）。例 えば、プローブを、所望の遺伝子のｃＤＮＡから製造し且つ用いて、ゲノムライ ブラリー中の実際の遺伝子を識別する。遺伝子の構造を決定し、そして所望の１ 種類（または複数）の変化を生じさせる。組換えＤＮＡ技術を用いて、相同的組 換えによる胚幹細胞の遺伝子の所望の１種類（または複数）の変化を導入するベ クターを製造する。 次に、変更された胚幹細胞（ＥＳ細胞）を胚盤胞に注入し、生殖細胞を含む全 組織種の形成に寄与させる。このような胚盤胞から発生する動物をキメラと称す る。キメラ動物を繁殖させた場合、突然変異を有する生殖細胞は、機能性遺伝子 を欠いた動物を生じる。このような動物を「ノックアウト」（ＫＯ）動物と称す る。ＫＯマウスについて多数の実施例が知られており；これらの動物の多くは、 ある種のヒト遺伝病で見られるのと同様の表現型を示し、したがって有用な動物 モデルとして役立つ。 ＣＤ４０−Ｌ ＫＯマウスは、胸腺依存性抗体反応におけるＴおよびＢ細胞間 の同族相互作用並びに免疫グロブリンイソタイプスイッチングの各種態様を研究 する科学者にとって極めて興味深いと考えられる。ヒトＸ連鎖高ＩｇＭ症候群に おけるＣＤ４０−Ｌの役割は、ＣＤ４０−Ｌ ＫＯマウスが、高ＩｇＭに可能な 治療（すなわち、可溶性組換え体リガンドの投与）を試験するための貴重な手段 になったことを示している。更に、ＣＤ４０−Ｌノックアウトマウスは、多数の 様々な種類の研究にとって興味深く、すなわち、これらの動物は、免疫応答に不 可欠な一つの特異的細胞相互作用を無力にすると予想される極めて明確な遺伝的 欠損を有する。したがって、ＣＤ４０−Ｌ ＫＯマウスは、種々の疾患および症 候群（感染性疾患を含む）におけるＴ細胞およびＢ細胞の役割を定義する場合、 そして高ＩｇＭ症候群並びにＴおよびＢ細胞の相互作用の異常に起因するまたは それに関連した他の症状の治療法を開発する場合に、ワクチン製剤または免疫応 答調節剤を試験するためのモデルとして有用であると考えられる。 以下の実施例は、特定の実施態様を例証することを目的とし、本発明の範囲を 制限するためのものではない。全ての参考文献の適切な開示は本明細書中に参考 として包含される。 実施例１：ＣＤ４０Ｌ遺伝子の地図表示 ネズミＣＤ４０Ｌ遺伝子のコーディング領域に対応するｃＤＮＡを用いて（ア ーミタージら、Ｎａｔｕｒｅ ３５７：８０，１９９２年）、ネズミＣＤ４０遺 伝子座の染色体位置を、［（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊｘマス・スプレタス（Ｍｕｓ ｓ ｐｒｅｔｕｓ））ＦＩＸＣ５７ＢＬ／６Ｊ］マウスの交配に由来する子孫を用い る種間戻し交雑分析によって決定した。この種間戻し交雑地図表示パネルは、常 染色体全部並びにＸ染色体中に適当に分布している１１００遺伝子座について知 られている（コプランド（Ｃｏｐｅｌａｎｄ）およびジェンキンス（Ｊｅｎｋｉ ｎｓ）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．７：１１３，１９９１年）。Ｃ５７ＢＬ／ ６Ｊおよびマス・スプレタスＤＮＡをいくつかの制限エンドヌクレアーゼで消化 し、そしてマウスＣＤ４０Ｌ ｃＤＮＡプローブを用いる有益な制限フラグメン ト長さ多形性（ＲＦＬＰ）についてサザンブロットハイブリッド形成によって分 析した。地図表示結果は、ＣＤ４０Ｌ遺伝子（ＣＤ４０１）が、ヒポキサンチン −グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｈｐｒｔ）、骨形 態形成タンパク質−２ｂ２（Ｂｍｐ−２ｂ２）およびコネクシン（ｃｏｎｎｅｘ ｉｎ）−３２（Ｃｎｘ−３２）に対して連鎖したネズミｘ染色体の近位部分に位 置することを示している。Ｈｐｒｔ、Ｂｍｐ−２ｂ２およびＣｎｘ−３２を含む Ｃｄ４０１に連鎖した遺伝子座についてのプローブおよびＲＦＬＰの説明は前に 報告された（Ｍ．Ｅ．ディキンソン（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ら、Ｇｅｎｏｍｉｃ ｓ ６：５０５，１９９０年；Ｊ．Ａ．ヘフリガー（Ｈａｅｆｌｉｇｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６７：２０５７，１９９２年）。組換え距離は、計 算機プログラムスプレタス・マドネス（ＳＰＲＥＴＵＳ ＭＡＤＮＥＳＳ）を用 いて（Ｅ．Ｌ．グリーン（Ｇｒｅｅｎ）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｂ ａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ ｔｓ ，オックスフォード・ユニバーシティー・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ ｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９２年，７７〜１１３頁に） 記載のように計算された。遺伝子順序は、対立遺伝子分布パターンを説明するの に必要な組換え回数を最小限にすることによって決定された。決定された組換え 頻度は、Ｃｄ４０１遺伝子をＨｐｒｔ遺伝子座から１．５＋／−１．１センチモ ルガン遠位に置く。ＨＰＲＴはヒトＸ染色体ではｑ２６部分に地図で表わされ、 ＣＤ４０Ｌのヒト相同染色体もこの部分に地図で表わされるであろうということ が示唆される。これは、ヒトＣＤ４０Ｌ ｃＤＮＡプローブを用いるヒト中期染 色体についてのｓｉｔｕハイブリッド形成実験によって確証された。ヒト中期染 色体は、二人の正常な男性ドナーのリンパ球から得られた。ハイブリッド形成は 、文献記載のように（Ｊ．Ｄ．マース（Ｍａｒｔｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７４００，１９８６年）、１Ｘ１０⁶ｃｐｍ ／μｇの比活性に対して³Ｈで標識されたヒトＣＤ４０Ｌプローブを用いて行な われた。最終プローブ濃度は、ハイブリッド形成混合物０．４ｎｇ／μｇであっ た。スライドを５〜７週間暴露した。染色体をＱ−バンド法によって識別した。 記録されたハイブリッド形成の１１５部位の内１８（１６％）は、Ｘ染色体の長 アームの遠位部分に位置した。最大数の木目模様はバンドｑ２６にあり、他のヒ ト染色体上にハイブリッド形成はほとんどなかった。 実施例２：高ＩｇＭ患者Ｔ細胞でのＣＤ４０Ｌ発現の分析 ＣＤ４０Ｌの発現を、臨床的および実験室知見が一次Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群と 一致した４人の青年期患者において実験した。これら患者の３人の症状は散在性 であり、同様の症状の男性血縁者はいなかった。４人目の患者は、高ＩｇＭ症候 群の典型的Ｘ連鎖遺伝を示す実証された３世代系図を有する家系に属した。 ＣＤ４０Ｌの発現は、４人の高ＩｇＭ患者から精製された末梢血Ｔ細胞で直接 的に調べた。休止末梢血Ｔ細胞は、検出不能なレベルのＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡお よびタンパク質両方を発現するが、しかしながら、ＣＤ３に特異的な抗体による １６時間の刺激は、ｍＲＮＡおよび細胞表面タンパク質のレベルを有意に増加さ せる（スプリッグスら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１５４３，１９９２年） 。したがって、末梢血白血球は、フィコル・ハイパクーでの分離によって患者ま たは対照ドナーのヘパリン処理された全血から精製された。Ｔ細胞を、固定化Ｃ Ｄ３ ｍＡｂによって活性化し、そして可溶性型ＣＤ４０を用いるフローサイト メトリーによって分析した。この可溶性ＣＤ４０タンパク質（ＣＤ４０．Ｆｃ） は、ＵＳＳＮ０７／９６９，７０３およびファンスローら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ． １４９：６５５，１９９２年に記載されており、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に対 して融合したヒトＣＤ４０の細胞外ドメインを含む融合タンパク質である。実験 はいずれも、正常成人ドナーから並びに患者１、３および４の場合は同年齢の非 罹患男性からの対照細胞を含んだ。患者２の対照細胞としては、無関係の免疫欠 乏症であるＸ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）と診断された同年齢、同人 種の男性が含まれた。対照ドナーからのＴ細胞とは対照的に、患者２、３および ４からのＴ細胞は、ＣＤ３抗体による活性化の際に検出可能なＣＤ４０Ｌを全く 発現できなかった。若干の実験において、患者１からの活性Ｔ細胞は、ＣＤ４０ を弱く結合すると考えられた。しかしながら、固定化ＣＤ３ ｍＡｂによる４人 の患者全部からのＴ細胞の活性化は、共通のＴ細胞表面マーカーであるＩＬ−２ 受容体（ＩＬ−２Ｒα）のα鎖の発現に関しては、対照ドナーからのＴ細胞で見 られたのと同様のレベルで引き起こした。更に、高ＩｇＭ患者からのＴ細胞は、 ＰＨＡまたはＣＤ３ ｍＡｂおよびＩＬ−７に対する正常な増殖反応を示した。 これらのデータは、高ＩｇＭ患者のＴ細胞はマイトジェンに対し てまたはそれらのＴ細胞受容体による活性に対して正常に反応するが、それらの 細胞表面上に野生型ＣＤ４０Ｌを発現しないことを示す。 実施例３：高ＩｇＭ患者からのＣＤ４０Ｌのヌクレオチド配列分析 実施例２の高ＩｇＭ患者からのｃＤＮＡのヌクレオチド配列を分析した。患者 または対照ドナーからの末梢血白血球（ＰＢＬ）をヘパリン処理された全血から フィコール・ハイパクーで精製した。次に、細胞を固定化ＣＤ３抗体またはＰＨ Ａと一緒に一晩中インキュベートすることによって刺激した。刺激されたＰＢＬ から、ＲＡＮゾル（バイオテクス（Ｂｉｏｔｅｃｘ）、ハウストン、ＴＸ）を用 いてＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ５〜１０μｇを水１０μｌで希釈し且つ６８℃ で５分間加熱した。この混合物に対して、ＲＮアシン１μｌ、１０Ｘパーキン・ エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＰＣＲ緩衝液２μｌ、２０ｍＭ ｄＮＴ Ｐ １μｌ、ランダムヘキサマープライマー（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ）、ウプサラ、スウェーデン）２μｌおよび１００Ｕ逆転写酵素を加えた。混 合物を室温で１０分間、続いて３７℃で１分間インキュベートし、そして９５℃ で５分間加熱失活させた。この反応からのｃＤＮＡを、以下の反応条件、すなわ ち、総容量５０μｌに対して１０Ｘパーキン・エルマー緩衝液５μｌ、５０μＭ ｄＮＴＰ、１μＭプライマー、ｃＤＮＡ反応２μｌおよび１．２５Ｕ Ｔａｑ ポリメラーゼ（パーキン・エルマー）を用いるＰＣＲ反応において鋳型として用 いた。混合物を９５℃で５分間変性させ、そしてＴａｑポリメラーゼを加えた後 、５５℃で１分間、７２℃で１分間および９４℃で１分間を３サイクル行なった 。ｃＤＮＡ全体にわたるようにＰＣＲ反応を２回行なった。ｃＤＮＡの５′部分 を増幅させるのに用いられたプライマーは、５′−ＣＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣＣＡ ＴＴＴＣ−３′（配列番号：１）および５′−ＡＧＣＣＣＡＣＴＧＴＡＡＣＡＣ ＡＧ−３′（配列番号：２）であった。ｃＤＮＡの３′部分のためのプライマー は、５′−ＣＡＴＧＴＣＡＴＡＡＧＴＧＡＧＧＣ−３′（配列番号：３）および ５′−ＣＡＴＡＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＴＡＧ−３′（配列番号：４）であった。 ＰＣＲフラグメントにクレノウ（ファーマシア、ウプサラ、スウェーデン）をフ ィルインし、１．５％アガロースゲル上で分離し、そして精製されたフラグメン トを配列決定のためにＳｍａｌ−カットｐＴＺ１９Ｒに連結した。二本鎖配列決 定は、シークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）キット（ＵＳＢ）クリーブランド 、ＯＨ）を用いて手動で行なわれた。自動配列決定は、アプライド・バイオシス テムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３７３Ａ型シークエンサーで 行なわれた。これらの実験において、対照細胞は、罹患していない同年齢対照に よってかまたは、いずれの場合にも少なくとも一人の正常な成人ドナーによって 提供された。更に、無関係の免疫欠乏症であるＸ連鎖リンパ増殖性障害（ＸＬＰ ）と診断された一人の青年期男性が患者１の対照として含まれた。得られたｃＤ ＮＡのヌクレオチド配列分析は、単点突然変異が４人の高ＩｇＮ患者の内の３人 のＣＤ４０Ｌに存在したことを示した。これらの変化がＰＣＲ増幅中に導入され た人工物ではなかったということを確かめるために、最初のｃＤＮＡ合成反応を 含む全ての反応を少なくとも二重反復試験で行なった。それぞれのヌクレオチド 変化は独特であり、全てＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインに存在する。これらの変化 は、以下のアミノ酸変化、すなわち、患者１における２２７位のグリシン対バリ ンの変化；患者２における１５５位のロイシン対プロリンの変化；および患者３ における２１１位のトレオニン対アスパラギンの変化を引き起こす。患者４から 生じたＣＤ４０Ｌ ｃＤＮＡは、コーディング領域中に何等かのヌクレオチド変 化を含むとは考えられなかった。この患者について行なわれた生物学的分析は機 能性ＣＤ４０Ｌの欠損を明らかに示しているので、おそらくは５′または３′非 コーディング配列を必要とするもう一つの機序が、患者４におけるＴ細胞上のＣ Ｄ４０Ｌの不存在の原因であるにちがいない。ＸＬＰ患者を含むどの対照試料か らのＣＤ４０Ｌ ｃＤＮＡにおいてもヌクレオチド変化は見られなかった。 実施例４：ＣＤ４０Ｌ ｃＤＮＡの特定部位の突然変異誘発 実施例３で検出されたヌクレオチド変化がＣＤ４０Ｌの発現またはＣＤ４０に 対して結合するその能力に影響を及ぼすかどうかを試験するために、実施例２の 患者１および患者２で見られた２種類のヌクレオチド変化を、部位特異的変異誘 発を用いて、ヒトＣＤ４０Ｌの完全なコーディング領域を含む哺乳動物発現ベク ター中に別個に導入した。ｈＣＤ４０−Ｌと称するヒトＣＤ４０Ｌ配列を含むク ローニングベクターは、１９９１年１２月６日にアメリカン・タイプ・カルチャ ー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ ｃｔｉｏｎ）、受託番号６８８７３として寄託された。突然変異体は、オーバー ラップエクステンション（ＳＯＥｉｎｇ）法（ホートンら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉ ｑｕｅｓ ８：５２８，１９９０年）による遺伝子スプラシングを用いて構築さ れた。患者１で見出された突然変異を再現するのに用いられたプライマーは、５ ′−ＴＧＣＧＧＧＣＡＡＣＡＡＴＣＣＡＴＴＣＡＣＴＴＧＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧ ＡＡＴＴＴＧＣＡＡ（配列番号：５）であった。患者２で見出された突然変異を 再現するのに用いられたプライマーは、５′−ＣＣＡＴＧＡＧＣＡＡＣＡＡＣＴ ＴＧＧＴＡＡＣＣＣＣＧＧＡＡＡＡＴＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣ（配列番号：６）で あった。必要なプライマーの残り部分は、ＣＤ４０Ｌ配列から生成された（ＵＳ ＳＮ０７／９６９，７０３号明細書並びにアーミタージら、Ｎａｔｕｒｅ ３５ ７：８０，１９９２年およびスプリッグスら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１ ５４３，１９９２年）。得られたベクターをそれぞれミュータント１およびミュ ータント２と称した。適当なヌクレオチド変化が導入されたことは、完全なコー ディング領域の配列分析によって実際の発現ベクターにおいて確証された。ヒト 胚腎細胞系２９３を、野生型ＣＤ４０Ｌかまたは突然変異誘発を有するベクター によってトランスフェクトし、トランスフェクション後３日目に、細胞を³³Ｓト ランス標識（ＩＣＮラジオケミカルズ（Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、アー ビン、ＣＡ）によって代謝的に放射性標識した。細胞溶解産物を調製し、そして ヒトＣＤ４０Ｌを発現するＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞に対して向けられた多クローン 性血清とのまたはＣＤ４０．Ｆｃとの沈降によってＣＤ４０Ｌタンパク質の発現 について試験した。野生型ＣＤ４０Ｌによってトランスフェクトされた細胞は、 ＣＤ４０．Ｆｃを用いて容易に沈降させることができる３３ｋＤタンパク質を発 現した。対照的に、各突然変異体の形のＣＤ４０Ｌによってトランスフェクトさ れた細胞は、ＣＤ４０．Ｆｃによって認識されたタンパク質を発現しなかった。 多クローン性抗血清を用いる同一溶解産物の免疫沈降は、しかしながら、突然変 異体並びに野生型でトランスフェクトされた細胞からの３３ｋＤタンパク質を認 識した。このタンパク質は、ＣＤ４０．Ｆｃによって認識されたＣＤ４０Ｌタン パク質と共移動し、ベクターのみによ ってトランスフェクトされた溶解産物中には存在しなかった。これらの結果と一 致して、ノーザンブロット分析は、野生型および突然変異体両方でトランスフェ クトされた細胞において同様のレベルのＣＤ４０Ｌ特異的ＲＮＡを示した。 更に、トランスフェクトされた細胞をフローサイトメトリー分析によって検査 した。ＣＤ４０Ｌのどちらの突然変異体の形によってトランスフェクトされた細 胞も、ＣＤ４０．Ｆｃ結合について完全に陰性であったが、野生型ＣＤ４０Ｌを 発現する細胞は強いＣＤ４０．Ｆｃ結合を示した。突然変異ＣＤ４０Ｌタンパク 質の生物学的活性に取り組むために、野生型または突然変異誘発ＣＤ４０Ｌによ ってトランスフェクトされた細胞を、増殖およびＩＬ−４と一緒に共培養された 精製扁桃Ｂ細胞からのＩｇＥ分泌を誘導するそれらの能力について試験した。野 生型リガンド（表１）によってトランスフェクトされた細胞とは対照的に、それ ぞれの形の突然変異誘発ＣＤ４０Ｌを発現する細胞は、Ｂ細胞増殖またはＩｇＥ 分泌を誘導できず、それらの細胞表面上の機能性ＣＤ４０Ｌの不存在が確証され た。 実施例５：高ＩｇＭ患者Ｂ細胞は野生型ＣＤ４０Ｌに対して正常に反応する 野生型ＣＤ４０Ｌに反応するＸ連鎖高ＩｇＭ Ｂ細胞の能力に取り組むために 、増殖およびイソタイプ分泌検定を行なった。実施例２の４人の患者全員からの Ｔ減少末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（Ｂ細胞に富む集団）は、対照ドナーから同 様に精製されたＰＢＭＣについて見られたのと同様のＣＤ４０Ｌに対する増殖反 応を示した。対照的に、ＸＬＡ疾患は循環性成熟Ｂリンパ球の実質的不存在を特 徴とするという事実と一致して、ＸＬＡ患者から得られたＰＢＭＣのＴ細胞減少 培養においてこのような増殖反応は見られなかった。 以前行なった研究において、ＩＬ−４存在下の単一ドナーＰＢＭＣの培養が、 ＩｇＥの生産を引き起こすことを示した（Ｔ減少のための分別をしていないＰＢ ＭＣの１ｘ１０⁵個からのＩｇＥ分泌は、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を、２００ｎ ｇ／ｍｌのＧ２８−５抗体（ＣＤ４０に対する単クローン性抗体、Ｅ．Ａ．クラ ーク（Ｃｌａｒｋ）博士、ワシントン大学、シアトル、ＷＡから得られた）また はベクターのみ若しくはヒトＣＤ４０Ｌによってトランスフェクトされた１ｘ１ ０⁴個の固定したＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞と一緒に含む１０日間の培養後に決定さ れた）。ＰＢＭＣの調製および分泌されたＩｇＥ濃度の決定は、ファンスローら 、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：６５５，１９９２年に記載のように行なわれた 。結果を、三重反復試験培養の平均＋／−ＳＥＭとして表わす。正常ドナー（対 照１、３および４）からのＰＢＭＣは、ＩＬ−４と一緒に培養された場合、測定 しうる量のＩｇＥを生産した（表２）。対照的に、同様の条件下で培養された４ 人の高ＩｇＭ患者のいずれからもＩｇＥ生産は検出されなかった。重要なことに 、４つの症例の内の３つにおいて（患者１、２および４）、組換え体ＣＤ４０Ｌ またはＣＤ４０ ｍＡｂであるＧ２８−５を高ＩｇＭ患者のＰＢＭＣ含有培養物 に加えることにより、ＩｇＥを分泌するそれらの能力が回復した。同様に、試験 されたこれら３人の患者および全対照からのＴ減少ＰＢＭＣ（Ｂ細胞に富む培養 ）は、ＩＬ−４および組換え体ＣＤ４０ＬかまたはＧ２８−５抗体の存在下でＩ ｇＥを分泌した（表２）。患者３の場合、ＩＬ−４および組換え体ＣＤ４０Ｌま たはＧ２８−５抗体と一緒に培養されたＰＢＭＣにおいてＩｇＥは検出されなか った。これらの結果についての理由は不明である。追加のＰＢＭＣをこの患者か ら入手できなかったので、この応答の欠損が再現性があるかまたは実験変動によ るのかどうかを決定することはできなかった。 実施例６：ＣＤ４０Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列分析 ＣＤ４０Ｌのヌクレオチド配列を、ヒト細胞から製造されたゲノムライブラリ ーを用いて決定した。ゲノムライブラリーからのクローンを制限酵素で消化して 、電気泳動によって分離することができる制限フラグメントを生成した。電気泳 動によって分離された制限フラグメントを、ＣＤ４０Ｌのコーディング領域の各 種部分から製造された長さ３０〜４０オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド プローブを用いるサザンブロットによって分析した。オーバーラップフラグメン トを決定し且つ配列決定し、配列決定は、ＣＤ４０Ｌのコーディング領域全体を 包含するのに十分なフラグメントについて行なわれた。ＰＣＲプローブは、全エ クソンについてのイントロン−エクソン境界に隣接する部分の配列に基づいて製 造することができる。ＰＣＲプローブを実施例３に記載されたのと同様に用いて 、ＣＤ４０Ｌゲノム材料中に存在する任意の非コーディング領域の配列に異常が あるかどうかを決定した。このような分析は、例えば、羊水穿刺または絨毛膜絨 毛試料採取によって胎児から得られた細胞からのゲノム材料を分析する場合に有 用である。この方法で誘導されたＰＣＲプローブは、ＣＤ４０Ｌ遺伝子のコーデ ィング領域に異常が検出されない場合に必要であるかもしれないように、ゲノム 材料を分析する場合にも有用である。 実施例７：ＣＤ４０Ｌノックアウトマウスの発生 製造されたＤＮＡ構築物の種類を、正に選択可能なマーカー（ネズミＰＧＫ− １プロモーターによって指令されたネオマイシン耐性遺伝子）が標的遺伝子（Ｃ Ｄ４０Ｌ）に対して相同な部分によって両側に隣接されている「置換型」ベクタ ーとして分類する。このようなベクターは、標的に対して相同な２か所のベクタ ー配列部分が関与する二重相互交差の結果により生じる相同的組換えによって野 生型対立遺伝子を変更された変種と置換するように設計されている。対照的に、 ランダム組込みは、分子全体を組込むと考えられる。したがって、標的に到達す る効率を上げるために、負の選択マーカー（ＨＳＶチミジンキナーゼすなわちＴ Ｋ遺伝子）を、ベクターの相同領域の一方の末端に挿入した。 標的用ベクターをＥＳ細胞中に導入した後、正−負選択（ＰＮＳ）を開始した 。ネオマイシン耐性遺伝子は、Ｇ４１８に対する耐性を与えるが、ＨＳＶ ＴＫ 遺伝子の生産物は、ガンシクロビア（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）を毒性化合物に 変化させる。したがって、理論上、相同的に組換えされた細胞のみが両方の選択 から生き残る。ベクター構築およびＰＮＳについてのこのスキームは十分に確立 されている（マンサワー（Ｍａｎｓｏｕｒ）ら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ．３ ３６：３４８〜３５２）。 ＣＤ４０Ｌのための遺伝子標的用ベクターの構築を容易にするために、１２９ ＳＶ系統（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カタログ番号９４６３０ ５）から構築されたネズミゲノムＤＮＡライブラリーを、完全なコーディング領 域を含む放射性標識されたネズミＣＤ４０Ｌ ｃＤＮＡプローブによってスクリ ーニングした（アーミタージら、１９９２年、Ｎａｔｕｒｅ．３５７：８０〜８ ２およびＵＳＳＮ０７／９６９，７０３号明細書）。６種類のクローンを単離し 、そしてλ１およびλ２と称する二つを、それらが重なり合い且つそれぞれが遺 伝子のかなり大きな部分を含んでいたという証拠に基づいて更に分析するために 選択した。制限地図並びにエクソン位置および寸法は標準法を用いて決定されて おり、図１に示されている。 λ２からの６．８Ｋｂ ＢａｍＨ１−Ｓｐｅ１フラグメントを、ＢａｍＨ１＋ Ｘｂａ１によって消化されたｐＧＥＭ１１中にサブクローン化した。得られたプ ラスミドｐλ２−６．８ＢＳをＢａｍＨ１によって消化し、そしてクレノウフラ グメントによる処理によって末端をブラントにした。ｐＰＧＫ／Ｎｅｏ（ＷＴ） Ａ−からのブラントにされた１．５Ｋｂ ＥｃｏＲ１−ＢａｍＨ１フラグメント を挿入してｐ６．８Ｎｅｏを生成した。この構築物をＸｈｏ１によって消化し、 クレノウフラグメントによってブラントにし、そしてλ１からの２．０Ｋｂのブ ラントにされたＨｉｎｄ３−Ａｓｐ７１８フラグメントを挿入した。得られたプ ラスミドｐ６．８ＮｅｏＨＡをＸｈｏ１によって消化し、ｐＴＧＸ１０５−９（ ＨＳＶ ＴＫ遺伝子含有）からの２．０Ｋｂ Ｘｈｏ１−Ｓａｌ１フラグメント を挿入してｐＨＲＶ−ｍＣＤ４０Ｌ＃１を生成した。 ｐＨＲＶ−ｍＣＤ４０Ｌ＃１は、相同的組換えによって、エクソン４のみを欠 失したＣＤ４０Ｌ対立遺伝子を生じると考えられる。更に分析することにより、 この突然変異は、ＣＤ４０−Ｌ遺伝子の機能を完全に損なわせていないらしいこ とが示された。したがって、エクソン３を以下の方法で更に欠失させた。ｐλ２ −６．８ＢＳをＳｐｅ１＋ＢａｍＨ１によって消化し、そして得られた７．７Ｋ ｂフラグメントを精製した。これを、ｐＨＲＶ−ｍＣＤ４０Ｌ＃１からの５．５ Ｋｂ ＢａｍＨ１−Ｘｂａ１フラグメントと連結して、ｐＨＲＶ−ｍＣＤ４０Ｌ ＃２を生成した。このベクターは、相同的組換えによって、エクソン３および４ を欠失した突然変異ＣＤ４０Ｌ対立遺伝子を生じるべきである。 ｐＨＲＶ−ｍＣＤ４Ｌ０＃２を胚幹細胞中に２００Ｖおよび９６０μＦでエレ クトロポレーションを行なった。細胞を、白血病阻止因子（ＬＩＦ）を発現する γ照射されたネオマイシン耐性ＳＴＯ細胞の支持層上で培養した。細胞は、１７ ５μｇ／ｍＬのＧ４１８＋２ｍＭガンシクロビア中で約１０日間選択された。次 に、クローンを単独に平板培養し、そして５つのクローンのプールでのＰＣＲに よって分析した。ＰＣＲは、ＣＤ４０Ｌ特異的プライマーＴＧＸ１０６．１９（ ５′−ＧＧＣＡＡＧＧＴＣＡＡＧＣＴＣＡＴＣＣ−３′；配列番号：９）を、ア ンチセンスネオマイシン耐性遺伝子プライマーＴＧＸ６３．２０（５′−ＧＡＴ ＡＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧＧ−３′；配列番号：１０）と連結して用い て行なわれた。全部で８００の二重耐性クローン（１２９ＳＶ誘導ＥＳ系ＡＢＩ の６８０およびＣ５７ＢＬ／６誘導ＥＳ系Ｂ２２の１２０）をこの方法で相同的 組換え結果についてスクリーニングした。正のクローンは検出されなかった。 ｐＨＲＶ−ｍＣＤ４０Ｌ＃２によるいくつかの不成功の試みの後、ＣＤ４０− Ｌ遺伝子の３′末端に対する相同の長いほうの部分を有する第三のプラスミドを 製造した。ｐＨＲＶ−ｍＣＤ４０Ｌ＃２をＸｂａ１およびＸｈｏ１によって消化 し、そして４．７ＫｂフラグメントをｐＧＥＭｌ１中にサブクローン化してｐＨ ＲＶ２−４．７ＸＸを生成した。１．９Ｋｂ Ｈｉｎｄ３−Ｓａｌ１フラグメン トを、λ２からの２．７Ｋｂ Ｈｉｎｄ３−Ｓａｌ１フラグメントによって置換 した。このプラスミドをｐＨＲＶ２−５．５ＸＳと称した。０．７Ｋｂ Ａｓｐ ７１８−Ｓａｌ１フラグメントを、λ１からの１０．３Ｋｂ Ａｓｐ７１８−Ｓ ａｌ１フラグメントによって置換してｐＨＲＶ２−１５ＸＳを生成した。このプ ラスミドを引続きＳａｌ１によって消化し、ｐＴＧＸ１０５−９（ＨＳＶ ＴＫ 遺伝し含有）からの２．０Ｋｂ Ｘｈｏ１−Ｓａｌ１フラグメントを挿入した。 この結果、ｐＨＲＶ−ｍＣＤ４０Ｌ＃３が得られ、これを、１９９３年１月１９ 日にブダペスト条約の規定に基づきアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ ョン（ＡＴＣＣ）に寄託し、そしてＡＴＣＣ受託番号 を与えられた。 ｐＨＲＶ−ｍＣＤ４０Ｌ＃３を用いる相同的組換えは、ｐＨＲＶ−ｍＣＤ４０Ｌ ＃２と同様の突然変異、すなわち、エクソン３および４の除去を引き起こす。 ｐＨＲＶ−ｍＣＤ４０Ｌ＃３のエレクトロポレーションを行ない且つ前記のよ うにＥＳ細胞を選択した。ＰＣＲスクリーニングは、ＣＤ４０Ｌ特異的プライマ −ＴＧＸ１２４．１９（５′−ＧＴＡＴＧＴＧＧＣＴＧＡＡＣＡＣＣＴＧ−３′ ；配列番号：１１）およびアンチセンスＰＧＫ／Ｎｅｏプライマ−ＴＧＸ５３． １８（５′−ＣＴＴＧＴＧＴＡＧＣＧＣＣＡＡＧＴＧ−３′；配列番号：１２） を用いて行なわれた。全部で１１９１の二重耐性クローン（ＡＢ１の７６０、Ｂ ２２の２３１、および１２９ＳＶ誘導ＥＳ系Ｄ３の２００）が得られた。いくつ か正を識別し且つ核型分析を行ない、そしてＤ３系のクローンＤ３ ＣＤ４０Ｌ ３＃９−７２は正常な核型を有することが分かった。 ＣＤ４０Ｌ遺伝子の標的突然変異は、ゲノムサザンブロット分析によって実証 された。Ｄ３ ＣＤ４０Ｌ３＃９−７２および野生型Ｄ３からのゲノムＤＮＡを Ｐｓｔ１によって消化し、アガロース中で電気泳動を行ない、ニトロセルロース に対してブロットし、そしてｐＨＲＶ−ｍＣＤ４０Ｌ＃３の５′末端のすぐ上流 にある放射性標識された４００ｂｐのＸｂａ１−Ｐｓｔ１フラグメントによって プローブした。このプローブは、野生型Ｄ３ゲノム中の９．０Ｋｂ Ｐｓｔ１フ ラグメントとハイブリッド形成した。しかしながら、遺伝子標的は、５′Ｐｓｔ １部位の新規のＰｓｔ１部位（ＰＧＫ／Ｎｅｏ中）２．２Ｋｂ ３′を導入した 。したがって、２．２Ｋｂ Ｐｓｔ１フラグメントのみが、Ｄ３ ＣＤ４０Ｌ３ ＃９−７２ゲノム中のプローブとハイブリッド形成した。 Ｄ３ ＣＤ４０Ｌ３＃９−７２細胞を、黒色外被色を有するＣ５７ＢＬ／６マ ウスから単離された３．５日目の胚盤胞中に注射した。注射された胚盤胞は、偽 妊娠スイス・ウェブスター（Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ）雌マウスにおける出 産予定日まで維持された。Ｄ３ ＣＤ４０Ｌ３＃９−７２は、黒色アグーチ（褐 色）外被色を有する１２９ＳＶ系統に由来するＥＳ細胞中で生成された。キメラ 子孫は、混合外被色（褐色および黒色）の存在によって識別された。雄のキメラ を野生型Ｃ５７ＢＬ／６の雌と交配させた。突然変異ＣＤ４０−Ｌ対立遺伝子の 生殖系列伝達は、黒色アグーチ雌子孫の存在によって識別された。これらの雌は ＣＤ４０−L遺伝子座でヘテロ接合している。 ヘテロ接合雌を、野生型雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに交配させた。標準的なメン デル遺伝によると、雄の子孫全体の５０％は、ＣＤ４０−Ｌ突然変異についてヘ ミ接合であると予想されるので、高ＩｇＭ表現型を示すと予想される。ヘミ接合 雄をヘテロ接合雌に交配させて、その系統を永続させる。更に、突然変異ＣＤ４ ０−Ｌ対立遺伝子を示す共通遺伝子系１２９ＳＶ系統は、例えば、ヘテロ接合雌 を野生型１２９ＳＶ雄に戻し交雑することによって発生させることができる。或 いは、突然変異ＣＤ４０−Ｌ遺伝子を効率よく伝達する雄キメラを１２９ＳＶ雌 に交配させる。突然変異Ｘ染色体の生殖系列伝達は、ヘテロ接合１２９ＳＶ雌を 生じ、これを野生型１２９ＳＶ雄に交配させて、突然変異体ＣＤ４０−Ｌを示す ヘミ接合１２９ＳＶ雄を得る。ヘミ接合雄１２９ＳＶマウスをヘテロ接合１２９ ＳＶ雌に交配させて、ホモ接合雌を生じる。 対立遺伝子の状態（すなわち、野生型対ヘテロ接合対ホモ接合突然変異体（雄 のヘミ接合突然変異体））を、実施例３に記載の簡単なＰＣＲスキームによって 決定する。組織試料（血液または耳生検試料）からのＤＮＡに、４種類のプライ マーを用いるＰＣＲ増幅を施した。ＴＧＸ１５７．２３（５′−ＣＣＣＡＡＧＴ ＧＴＡＴＧＡＧＣＡＴＧＴＧＴＧＴ−３′；配列番号：１３）およびＴＧＸ１５ ６．２３（５′−ＧＴＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＡＧＴＣＡＴＴＣＡＴＣ−３′；配 列番号：１４）は、エクソン４のちょうど３′のＣＤ４０−Ｌ遺伝子上の部分に 特異的であり、２５０ｂｐフラグメントを増幅する。Ｎｅｏ１（５′−ＧＣＣＣ ＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧ−３′；配列番号：１５）およびＮｅｏ ２（５′−ＣＡＣＧＧＧＴＡＧＣＣＡＡＣＧＣＴＡＴＧＴＣ−３′；配列番号： １６）は、ネオマイシン耐性遺伝子の３′末端に特異的である。これらのプライ マーは、突然変異対立遺伝子に特異的な５００ｂｐフラグメントを増幅する。突 然変異対立遺伝子の存在は、実質的には前記のようなサザンブロット分析によっ て決定される。 ヘテロ接合雌を入手し、そしてその対立遺伝子の状態を前記および図２に概説 されたＰＣＲスキームにしたがって分析した。それを、前記のように野生型Ｃ５ ７ＢＬ／６雄に交配させた。その潜在的ヘミ接合雄子孫１匹からの試料を前記お よび図３に概説されたように分析したが；その分析結果は、エクソン３および４ がＣＤ４０−Ｌ遺伝子に不存在であったことを示しており、そのマウスがヘミ接 合であったことが示された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ０７Ｈ 21/04 8310−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ Ｃ１２Ｎ 5/10 8310−2Ｊ 33/566 15/09 ＺＮＡ 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/50 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ 33/566 9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ファンズロー，ウィリアム・シー，ザ・サ ード アメリカ合衆国ワシントン州98023，フェ デラル・ウェイ，サウス・ウエスト・スリ ーハンドレッドアンドトゥエンティーセヴ ンス・プレース 218 (72)発明者 ウィッドマー，マイケル・ビー アメリカ合衆国ワシントン州98115，シア トル，ノース・イースト・エイティーサー ド・ストリート 2571 (72)発明者 デヴィソン，バリー・エル アメリカ合衆国ワシントン州98040，マー サー・アイランド，エイティーフォース・ プレース・サウス・イースト 5320 (72)発明者 レンショウ，ブレアー・アール アメリカ合衆国ワシントン州98119，シア トル，フィフティーンス・アベニュー・ウ エスト 3250，アパートメント３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群の危険がある個体において、ＣＤ４０リガンド遺 伝子の突然変異を検出する方法であって、 （ａ）該個体から核酸を単離し； （ｂ）ＣＤ４０リガンド遺伝子に由来する核酸を選択的に増幅させ； （ｃ）増幅された核酸を分析して、ＣＤ４０リガンド遺伝子に突然変異が存在 するかどうか決定し；そして （ｄ）ＣＤ４０リガンド遺伝子から発現されたタンパク質がＣＤ４０を結合す るかどうかを決定すること を含む上記方法。 ２． 核酸を末梢血リンパ球から単離する請求項１に記載の方法。 ３． 核酸を、羊水穿刺または絨毛膜絨毛試料採取によって得られた胎児細胞 から単離する請求項１に記載の方法。 ４． 核酸がメッセンジャーＲＮＡである請求項２に記載の方法。 ５． 核酸の分析の前に、末梢血リンパ球をマイトジェンによって刺激する請 求項４に記載の方法。 ６． 核酸がＤＮＡである請求項１に記載の方法。 ７． Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群の危険がある個体において、ＣＤ４０リガンド遺 伝子の突然変異を検出する方法であって、 （ａ）該個体からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を単離し； （ｂ）該ｍＲＮＡから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成し； （ｃ）ＣＤ４０リガンドのコーディング領域に由来するオリゴヌクレオチドプ ローブを用いて、該ｃＤＮＡについてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行なっ て、ＣＤ４０リガンド遺伝子に由来する増幅されたＤＮＡを生成し； （ｄ）増幅されたＤＮＡについてヌクレオチド配列分析を行なって、そのヌク レオチド配列を決定し； （ｅ）増幅されたＤＮＡのヌクレオチド配列を分析して、ＣＤ４０リガンド遺 伝子に突然変異が存在するかどうか決定し；そして （ｆ）ＣＤ４０リガンド遺伝子から発現されたタンパク質がＣＤ４０を結合す るかどうかを決定すること を含む上記方法。 ８． ｍＲＮＡを末梢血リンパ球から単離する請求項７に記載の方法。 ９． ｍＲＮＡを単離する前に、末梢血リンパ球をマイトジェンによって刺激 する請求項８に記載の方法。 １０．マイトジェンが、ＣＤ３と称する細胞表面抗原に対する抗体である請求 項９に記載の方法。 １１．オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号：１、配列番号：２、配列番 号：３および配列番号：４によって定義されるものである請求項１０に記載の方 法。 １２．オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号：１、配列番号：２、配列番 号：３および配列番号：４によって定義されるものである請求項９に記載の方法 。 １３．生物学的に活性なＣＤ４０リガンドの発現を妨げるＣＤ４０リガンド遺 伝子の突然変異を有する個体を治療する方法であって、 （ａ）ＣＤ４０リガンド遺伝子の突然変異を有する個体からＣＤ４＋細胞を入 手し； （ｂ）生物学的に活性なＣＤ４０リガンドをコードしている発現ベクターを該 ＣＤ４＋細胞中に挿入し；そして （ｃ）生物学的に活性なＣＤ４０リガンドを発現するＣＤ４＋細胞を該個体中 に戻して注入すること を含む上記方法。 １４．ＣＤ４０リガンド遺伝子の突然変異がＸ連鎖高ＩｇＭ症候群を引き起こ している請求項１３に記載の方法。 １５．高まった濃度の血清ＩｇＭおよび低まった濃度の免疫グロブリンの他の イソタイプを示す個体を治療する方法であって、有効量の可溶性マルチマーＣＤ ４０リガンドを投与することを含む上記方法。 １６．可溶性マルチマーＣＤ４０リガンドが、ＣＤ４０リガンドの細胞外部分 およびヒト免疫グロブリンのＦｃ部分を含む融合タンパク質、並びにＣＤ４０リ ガンドの細胞外部分に対してマルチマー生成ペプチドを加えることによって生成 されたＣＤ４０リガンドマルチマーから成る群より選択される請求項１５に記載 の方法。 １７．高まった濃度の血清ＩｇＭおよび低まった濃度の免疫グロブリンの他の イソタイプが高ＩｇＭ症候群による請求項１６に記載の方法。 １８．高まった濃度の血清ＩｇＭおよび低まった濃度の免疫グロブリンの他の イソタイプが高ＩｇＭ症候群による請求項１５に記載の方法。 １９．胚幹細胞を用いる遺伝子標的技術によって、インビボで非機能性ＣＤ４ ０リガンドを発現する非ヒト動物。 ２０．ＣＤ４０リガンド遺伝子のエクソン３および４を欠いている請求項１９ に記載の非ヒト動物。 ２１．標的用ベクターｐＨＲＶ−ｍＣＤ４０Ｌ＃３（ＡＴＣＣ受託番号）を用 いることによって得られる請求項２０に記載の非ヒト動物。