JPH09327300A - ペニシリン耐性肺炎球菌の検査法およびキット - Google Patents
ペニシリン耐性肺炎球菌の検査法およびキットInfo
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- JPH09327300A JPH09327300A JP15115796A JP15115796A JPH09327300A JP H09327300 A JPH09327300 A JP H09327300A JP 15115796 A JP15115796 A JP 15115796A JP 15115796 A JP15115796 A JP 15115796A JP H09327300 A JPH09327300 A JP H09327300A
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- JP
- Japan
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- gene
- streptococcus pneumoniae
- penicillin
- pbp2b
- resistant streptococcus
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 肺炎球菌のlytA遺伝子、pbp1a遺伝子お
よびpbp2b遺伝子を遺伝子増幅法により同時に検出する
ことにより、ペニシリン耐性肺炎球菌の存在および耐性
度を判定する方法。 【効果】 ペニシリン耐性肺炎球菌を検体から直接、高
精度かつ迅速に検出することができ、肺炎球菌感染症患
者に対し、早期に適切な予防・治療を行うことが可能に
なった。
よびpbp2b遺伝子を遺伝子増幅法により同時に検出する
ことにより、ペニシリン耐性肺炎球菌の存在および耐性
度を判定する方法。 【効果】 ペニシリン耐性肺炎球菌を検体から直接、高
精度かつ迅速に検出することができ、肺炎球菌感染症患
者に対し、早期に適切な予防・治療を行うことが可能に
なった。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、感染症対策上重要
なペニシリン耐性肺炎球菌の存在および耐性度を判定す
る方法ならびにこのような判定を行うためのキットに関
する。
なペニシリン耐性肺炎球菌の存在および耐性度を判定す
る方法ならびにこのような判定を行うためのキットに関
する。
【０００２】
【従来の技術】肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）
は、一般には肺炎などの気道感染症の起炎菌となる頻度
が最も高く、小児科領域では化膿性髄膜炎の起炎菌とな
る頻度が最も高いとされている。ペニシリン耐性肺炎球
菌は、海外では１９８０年代から大きな問題となってい
るが、近年わが国でも分離頻度が上昇し、臨床的にも本
菌による重篤な感染症が問題となってきつつある。
は、一般には肺炎などの気道感染症の起炎菌となる頻度
が最も高く、小児科領域では化膿性髄膜炎の起炎菌とな
る頻度が最も高いとされている。ペニシリン耐性肺炎球
菌は、海外では１９８０年代から大きな問題となってい
るが、近年わが国でも分離頻度が上昇し、臨床的にも本
菌による重篤な感染症が問題となってきつつある。
【０００３】しかし、臨床材料からの肺炎球菌の検出
は、検体採取から処理までの時間あるいは検体の保存状
況・炭酸ガス培養の有無などによって左右されることが
多く、加えて薬剤耐性の確認に２日程度を要するといっ
た状況から、迅速かつ正確なペニシリン耐性肺炎球菌の
検査法が望まれていた。
は、検体採取から処理までの時間あるいは検体の保存状
況・炭酸ガス培養の有無などによって左右されることが
多く、加えて薬剤耐性の確認に２日程度を要するといっ
た状況から、迅速かつ正確なペニシリン耐性肺炎球菌の
検査法が望まれていた。
【０００４】肺炎球菌の薬剤耐性に係わる因子として
は、ペニシリン結合蛋白質（ＰＢＰ）の変異が報告され
ており、ペニシリン耐性に関してはＰＢＰ１Ａ〔Jabes
ら,J.Infect.Dis,159 p.16-25(1989) ：Markiewiczら，
J.Clin.Microbiol.27 p.405-410(1989)〕またはＰＢＰ
２Ａ・ＰＢＰ２Ｂ〔Hakenbeckら，Antibicrob.AgentsCh
emother.17 p.364-371(1980)〕といったＰＢＰが関与す
るとされ、セフォタキシム耐性に関してはＰＢＰ２Ｘ
〔Munozら，Mol.Microbiol.6 p.2461-2465(1992)〕が関
与するとされている。
は、ペニシリン結合蛋白質（ＰＢＰ）の変異が報告され
ており、ペニシリン耐性に関してはＰＢＰ１Ａ〔Jabes
ら,J.Infect.Dis,159 p.16-25(1989) ：Markiewiczら，
J.Clin.Microbiol.27 p.405-410(1989)〕またはＰＢＰ
２Ａ・ＰＢＰ２Ｂ〔Hakenbeckら，Antibicrob.AgentsCh
emother.17 p.364-371(1980)〕といったＰＢＰが関与す
るとされ、セフォタキシム耐性に関してはＰＢＰ２Ｘ
〔Munozら，Mol.Microbiol.6 p.2461-2465(1992)〕が関
与するとされている。
【０００５】このように、肺炎球菌の耐性化に係わる遺
伝子の変異は一様ではなく、一部の変異のみを指標に耐
性肺炎球菌を検索することは困難であった。例えば、本
発明者らは、これらのＰＢＰのうち最もペニシリン耐性
へ寄与度が高いと考えられるＰＢＰ２Ｂをコードするpb
p2b遺伝子の変異〔Dowsonら,Mol.Microbiol.9 p.635-64
3(1993)〕を指標にペニシリン耐性肺炎球菌を検索する
試みを行っている〔Ubukataら,J.Clin.Microbiol.34 p.
592-596(1996)〕が、この方法ではペニシリン耐性肺炎
球菌の検出率は８０％程度であり、さらに精度の高い判
定方法が望まれていた。
伝子の変異は一様ではなく、一部の変異のみを指標に耐
性肺炎球菌を検索することは困難であった。例えば、本
発明者らは、これらのＰＢＰのうち最もペニシリン耐性
へ寄与度が高いと考えられるＰＢＰ２Ｂをコードするpb
p2b遺伝子の変異〔Dowsonら,Mol.Microbiol.9 p.635-64
3(1993)〕を指標にペニシリン耐性肺炎球菌を検索する
試みを行っている〔Ubukataら,J.Clin.Microbiol.34 p.
592-596(1996)〕が、この方法ではペニシリン耐性肺炎
球菌の検出率は８０％程度であり、さらに精度の高い判
定方法が望まれていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、ペニシリン耐性肺炎球菌存在および耐性度を迅速か
つ正確に判定する方法ならびにこれらの判定用キットを
提供することにある。
は、ペニシリン耐性肺炎球菌存在および耐性度を迅速か
つ正確に判定する方法ならびにこれらの判定用キットを
提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】かかる実状において、本
発明者らは種々の検討を行い、いずれも変異を起こして
いないpbp1a遺伝子とpbp2b遺伝子を遺伝子増幅法により
同時に増幅し、ペニシリン耐性肺炎球菌の検出精度を高
める方法を見出した。この方法によれば、変異を起こし
ていない正常な遺伝子を肺炎球菌が保有していれば遺伝
子の増幅が認められ、何らかの変異を起こした遺伝子を
保有していたときには遺伝子の増幅が認められない。
発明者らは種々の検討を行い、いずれも変異を起こして
いないpbp1a遺伝子とpbp2b遺伝子を遺伝子増幅法により
同時に増幅し、ペニシリン耐性肺炎球菌の検出精度を高
める方法を見出した。この方法によれば、変異を起こし
ていない正常な遺伝子を肺炎球菌が保有していれば遺伝
子の増幅が認められ、何らかの変異を起こした遺伝子を
保有していたときには遺伝子の増幅が認められない。
【０００８】従って、pbp1a遺伝子とpbp2b遺伝子のいず
れもが変異を起こしていた場合にはこれら２種類の遺伝
子ともに増幅が認められないことになり、検査材料中に
肺炎球菌が存在しない場合と同じ結果となる。
れもが変異を起こしていた場合にはこれら２種類の遺伝
子ともに増幅が認められないことになり、検査材料中に
肺炎球菌が存在しない場合と同じ結果となる。
【０００９】そこで、本発明者らは、検査材料中の肺炎
球菌の存在を確認するため、肺炎球菌特異的な自己融解
酵素autolysin をコードするlytA遺伝子〔Rudolphら，
J.Clin.Microbiol.31 p.2661-2666〕をpbp1a遺伝子とpb
p2b遺伝子に加え、これらの３種類の遺伝子を同時に増
幅する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
球菌の存在を確認するため、肺炎球菌特異的な自己融解
酵素autolysin をコードするlytA遺伝子〔Rudolphら，
J.Clin.Microbiol.31 p.2661-2666〕をpbp1a遺伝子とpb
p2b遺伝子に加え、これらの３種類の遺伝子を同時に増
幅する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】すなわち、本発明は、肺炎球菌のlytA遺伝
子、pbp1a遺伝子およびpbp2b遺伝子を遺伝子増幅法によ
り同時に検出することを特徴とする、肺炎球菌の存在お
よび耐性度を判定する方法を提供するものである。
子、pbp1a遺伝子およびpbp2b遺伝子を遺伝子増幅法によ
り同時に検出することを特徴とする、肺炎球菌の存在お
よび耐性度を判定する方法を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明の検査法において、肺炎球
菌のlytA遺伝子としてはlytA遺伝子の６９４番目から９
６６番目に相当するＤＮＡが好ましく、pbp1a遺伝子と
してはpbp1a遺伝子の２２５６番目から２６８５番目に
相当するＤＮＡが好ましく、pbp2b遺伝子としてはpbp2b
遺伝子の１６３６番目から１７１２番目に相当するＤＮ
Ａが好ましい。
菌のlytA遺伝子としてはlytA遺伝子の６９４番目から９
６６番目に相当するＤＮＡが好ましく、pbp1a遺伝子と
してはpbp1a遺伝子の２２５６番目から２６８５番目に
相当するＤＮＡが好ましく、pbp2b遺伝子としてはpbp2b
遺伝子の１６３６番目から１７１２番目に相当するＤＮ
Ａが好ましい。
【００１２】本発明で用いる遺伝子増幅法においては下
記の３組のプライマーを使用する。すなわち、（１）肺
炎球菌のlytA遺伝子を特異的に増幅できるもの、（２）
変異のないpbp1a遺伝子を変異のあるpbp1a遺伝子と区別
して特異的に増幅できるもの、および（３）変異のない
pbp2b遺伝子を変異のあるpbp2b遺伝子と区別して特異的
に増幅できるものである。
記の３組のプライマーを使用する。すなわち、（１）肺
炎球菌のlytA遺伝子を特異的に増幅できるもの、（２）
変異のないpbp1a遺伝子を変異のあるpbp1a遺伝子と区別
して特異的に増幅できるもの、および（３）変異のない
pbp2b遺伝子を変異のあるpbp2b遺伝子と区別して特異的
に増幅できるものである。
【００１３】このようなプライマーのうち、lytA遺伝子
の６９４番目から９６６番目に相当するＤＮＡを増幅す
ることができるプライマーは、次のプライマー（１）と
（２）の組であり、pbp1a遺伝子の２２５６番目から２
６８５番目に相当するＤＮＡを増幅することができるプ
ライマーは、次のプライマー（３）と（４）の組であ
り、pbp2b遺伝子の１６３６番目から１７１２番目に相
当するＤＮＡを増幅することができるプライマーは、次
のプライマー（５）と（６）の組である。
の６９４番目から９６６番目に相当するＤＮＡを増幅す
ることができるプライマーは、次のプライマー（１）と
（２）の組であり、pbp1a遺伝子の２２５６番目から２
６８５番目に相当するＤＮＡを増幅することができるプ
ライマーは、次のプライマー（３）と（４）の組であ
り、pbp2b遺伝子の１６３６番目から１７１２番目に相
当するＤＮＡを増幅することができるプライマーは、次
のプライマー（５）と（６）の組である。
【００１４】 5'TGAAGCGGATTATCACTGGC3'・・・・・（１） 5'GCTAAACTCCCTGTATCAAGCG3' ・・・（２） 5'AAACAAGGTCGGACTCAACC3'・・・・・（３） 5'AGGTGCTACAAATTGAGAGG3'・・・・・（４） 5'CAATCTAGAGTCTGCTATGGA3' ・・・・（５） 5'GGTCAATTCCTGTCGCAGTA3'・・・・・（６）
【００１５】これらのプライマー（１）〜（６）は、例
えばＤＮＡ自動合成機などを用いて化学的に合成するこ
とにより調製することができる。
えばＤＮＡ自動合成機などを用いて化学的に合成するこ
とにより調製することができる。
【００１６】前記プライマー（１）〜（６）は、前記Ｄ
ＮＡを増幅できるものであれば、これらの標識体であっ
てもよい。プライマーの標識体は、上記プライマーに検
出可能な標識物を結合させたものが挙げられる。ここで
標識物としては、非放射性、放射性物質のどちらを用い
てもよいが、好ましくは非放射性物質である。非放射性
の標識物としては、直接測定可能なものとして蛍光物質
〔例えばフルオレッセインおよびその誘導体（フルオレ
ッセインイソチオシアネート等）、ローダミンおよびそ
の誘導体（テトラメチルローダミンイソチオシアネー
ト、テキサスレッド等）〕、化学発光物質（例えばアク
リジン等）や遅延蛍光を発する物質（ＤＴＴＡ：ファル
マシア社製）などが挙げられる。
ＮＡを増幅できるものであれば、これらの標識体であっ
てもよい。プライマーの標識体は、上記プライマーに検
出可能な標識物を結合させたものが挙げられる。ここで
標識物としては、非放射性、放射性物質のどちらを用い
てもよいが、好ましくは非放射性物質である。非放射性
の標識物としては、直接測定可能なものとして蛍光物質
〔例えばフルオレッセインおよびその誘導体（フルオレ
ッセインイソチオシアネート等）、ローダミンおよびそ
の誘導体（テトラメチルローダミンイソチオシアネー
ト、テキサスレッド等）〕、化学発光物質（例えばアク
リジン等）や遅延蛍光を発する物質（ＤＴＴＡ：ファル
マシア社製）などが挙げられる。
【００１７】なお、これらの標識物を検出するにあたっ
ては、標識物と特異的に、結合する物質を利用すれば、
間接的に標識物を検出することができる。こうした場合
の標識物としては、ビオチンあるいはハプテン等が挙げ
られ、ビオチンの場合は、これに特異的に結合するアビ
ジンあるいはストレプトアビジンが、ハプテンの場合
は、これに特異的に結合する抗体が利用できる。ハプテ
ンとしては２，４−ジニトロフェニル基を有する化合
物、ジゴキシゲニンを使うことができ、さらにはビチオ
ンあるいは蛍光物質などもハプテンとして使用すること
ができる。これらの標識物はいずれも単独または必要で
あれば複数種の組合わせで公知手段（特開昭５９−９３
０９８号、特開昭５９−９３０９９号各公報参照）によ
り、プライマーに導入することができる。
ては、標識物と特異的に、結合する物質を利用すれば、
間接的に標識物を検出することができる。こうした場合
の標識物としては、ビオチンあるいはハプテン等が挙げ
られ、ビオチンの場合は、これに特異的に結合するアビ
ジンあるいはストレプトアビジンが、ハプテンの場合
は、これに特異的に結合する抗体が利用できる。ハプテ
ンとしては２，４−ジニトロフェニル基を有する化合
物、ジゴキシゲニンを使うことができ、さらにはビチオ
ンあるいは蛍光物質などもハプテンとして使用すること
ができる。これらの標識物はいずれも単独または必要で
あれば複数種の組合わせで公知手段（特開昭５９−９３
０９８号、特開昭５９−９３０９９号各公報参照）によ
り、プライマーに導入することができる。
【００１８】以下、本発明の検出法の操作を詳細に説明
する。 （１）検体の標準および前処理 まず、目的のペニシリン耐性肺炎球菌の存在の有無およ
び耐性度を判定しようとする検体を用意する。検体とし
ては、各種臨床検査材料、喀痰、咽頭拭い液、髄液、血
液など、あるいはそれらから得られた細菌培養液、単離
・培養された細菌コロニーなどが挙げられる。検査には
これらの材料から遺伝子増幅法の試料となる肺炎球菌の
核酸成分を抽出することが必要であるが、そのための方
法としては、アルカリや界面活性剤を用いる方法、プロ
テイナーゼＫなどの蛋白質分解酵素を用いる方法が利用
できる。これらの核酸抽出溶液はその一部をそのまま遺
伝子増幅法に供することもできるが、核酸の精製や濃縮
の操作を加えることにより遺伝子増幅法の感度を上げる
こともできる。精製や濃縮のための方法としては、フェ
ノールなどの有機溶媒を蛋白質の変成剤として用いる方
法、その他の特異的な蛋白質変成剤を用いる方法〔Beut
lerら, Bio Techniques 9,p.166(1990)〕などが挙げら
れる。
する。 （１）検体の標準および前処理 まず、目的のペニシリン耐性肺炎球菌の存在の有無およ
び耐性度を判定しようとする検体を用意する。検体とし
ては、各種臨床検査材料、喀痰、咽頭拭い液、髄液、血
液など、あるいはそれらから得られた細菌培養液、単離
・培養された細菌コロニーなどが挙げられる。検査には
これらの材料から遺伝子増幅法の試料となる肺炎球菌の
核酸成分を抽出することが必要であるが、そのための方
法としては、アルカリや界面活性剤を用いる方法、プロ
テイナーゼＫなどの蛋白質分解酵素を用いる方法が利用
できる。これらの核酸抽出溶液はその一部をそのまま遺
伝子増幅法に供することもできるが、核酸の精製や濃縮
の操作を加えることにより遺伝子増幅法の感度を上げる
こともできる。精製や濃縮のための方法としては、フェ
ノールなどの有機溶媒を蛋白質の変成剤として用いる方
法、その他の特異的な蛋白質変成剤を用いる方法〔Beut
lerら, Bio Techniques 9,p.166(1990)〕などが挙げら
れる。
【００１９】（２）遺伝子増幅反応 上記検体に前記プライマー（１）〜（６）を加えること
により、検体中に目的とするペニシリン耐性肺炎球菌が
存在すれば、プライマーの伸長反応に基づく遺伝子増幅
反応を行うことができる。本発明における遺伝子増幅法
としては、公知のＰＣＲ（Polymerase Chain Reactio
n）法、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）法、３ＳＲ
（Self-sustained Sequence Replication）法、ＳＤＡ
（Straind Displacement Amplification）法等が用いら
れ、（Manak,ＤＮＡ Probes 2nd Edition p255-291,Sto
ckton Press(1993))、特にＰＣＲ法が好ましい。ＰＣＲ
法はプライマーのほか耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとＤＮ
Ａ合成の基質となる核酸を用い、通常の方法で実施する
ことができる。
により、検体中に目的とするペニシリン耐性肺炎球菌が
存在すれば、プライマーの伸長反応に基づく遺伝子増幅
反応を行うことができる。本発明における遺伝子増幅法
としては、公知のＰＣＲ（Polymerase Chain Reactio
n）法、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）法、３ＳＲ
（Self-sustained Sequence Replication）法、ＳＤＡ
（Straind Displacement Amplification）法等が用いら
れ、（Manak,ＤＮＡ Probes 2nd Edition p255-291,Sto
ckton Press(1993))、特にＰＣＲ法が好ましい。ＰＣＲ
法はプライマーのほか耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとＤＮ
Ａ合成の基質となる核酸を用い、通常の方法で実施する
ことができる。
【００２０】（３）検出 プライマー伸長反応により生成した目的遺伝子と検出プ
ライマーとの結合物を検出すれば、被検体中のペニシリ
ン耐性肺炎球菌を検出することができる。本発明におけ
る遺伝子増幅法によるＤＮＡ増幅の判定は、生成した増
幅ＤＮＡのサイズを電気泳動で確認する方法や、ニトロ
セルロース膜などに反応物を固定し目的の増幅ＤＮＡの
配列に相補的な配列を持つ標識プローブとハイブリダイ
ゼーションを行わせる方法、あるいは識別可能な標識を
施したプライマーを用いた遺伝子増幅を行った増幅ＤＮ
Ａをそれと相補的な配列を持つプローブを固定した固相
担体に捕獲して増幅ＤＮＡの標識で識別する方法〔特開
平１−２５２３００号公報、Anal.biochem.209 p.63-69
(19)〕などにより行うことができる。
ライマーとの結合物を検出すれば、被検体中のペニシリ
ン耐性肺炎球菌を検出することができる。本発明におけ
る遺伝子増幅法によるＤＮＡ増幅の判定は、生成した増
幅ＤＮＡのサイズを電気泳動で確認する方法や、ニトロ
セルロース膜などに反応物を固定し目的の増幅ＤＮＡの
配列に相補的な配列を持つ標識プローブとハイブリダイ
ゼーションを行わせる方法、あるいは識別可能な標識を
施したプライマーを用いた遺伝子増幅を行った増幅ＤＮ
Ａをそれと相補的な配列を持つプローブを固定した固相
担体に捕獲して増幅ＤＮＡの標識で識別する方法〔特開
平１−２５２３００号公報、Anal.biochem.209 p.63-69
(19)〕などにより行うことができる。
【００２１】本発明キットは、上記本発明方法を用いて
肺炎球菌の存在および耐性度を判定するもので、lytA遺
伝子の６９４番目から９６６番目に相当するＤＮＡおよ
びpbp1a遺伝子の２２５６番目から２６８５番目までに
相当するＤＮＡならびにpbp2b遺伝子１６３６番目から
１７１２番目に相当するＤＮＡを増幅することのできる
６種類のプライマー（（１）、（２）、（３）、
（４）、（５）および（６））を具備してなるもので、
必要に応じて各プライマーに検出可能な任意の標識物を
導入しておいてもよい。また、本発明キットは、必要に
応じて増幅反応試薬と合わせることもできる。以下、こ
れらの試薬類について具体的に説明する。
肺炎球菌の存在および耐性度を判定するもので、lytA遺
伝子の６９４番目から９６６番目に相当するＤＮＡおよ
びpbp1a遺伝子の２２５６番目から２６８５番目までに
相当するＤＮＡならびにpbp2b遺伝子１６３６番目から
１７１２番目に相当するＤＮＡを増幅することのできる
６種類のプライマー（（１）、（２）、（３）、
（４）、（５）および（６））を具備してなるもので、
必要に応じて各プライマーに検出可能な任意の標識物を
導入しておいてもよい。また、本発明キットは、必要に
応じて増幅反応試薬と合わせることもできる。以下、こ
れらの試薬類について具体的に説明する。
【００２２】（Ａ）遺伝子増幅反応を行うための試薬 特定の遺伝子増幅反応を行うための前記プライマー、核
酸鎖を合成（増幅）するための単位核酸および核酸伸長
酵素を含むものである。核酸伸長酵素としては、任意の
ＤＮＡポリメラーゼを用いることができるが、好ましく
は熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを用いることにより迅
速かつ特異的に遺伝子増幅反応を行うことができる。こ
れらの具体例としては、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、
ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼおよびＶｅｎｔ ＤＮＡポリ
メラーゼ等がある。
酸鎖を合成（増幅）するための単位核酸および核酸伸長
酵素を含むものである。核酸伸長酵素としては、任意の
ＤＮＡポリメラーゼを用いることができるが、好ましく
は熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを用いることにより迅
速かつ特異的に遺伝子増幅反応を行うことができる。こ
れらの具体例としては、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、
ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼおよびＶｅｎｔ ＤＮＡポリ
メラーゼ等がある。
【００２３】（Ｂ）遺伝子増幅反応生成物を固定化する
ための担体 本発明により増幅されたＤＮＡを固定可能な固相担体
で、具体的にはマイクロタイターウエル、ポリスチレン
ボール、アガロースビーズ、ポリアクリルビーズ、ラテ
ックス粒子、磁性ラテックス粒子等の固相材料が挙げら
れる。好ましくは操作性及び機械化等に優れたマイクロ
タイターウエル又は磁性ラテックス粒子である。これら
の固相担体にＤＮＡを非特異的吸着、共有結合、イオン
結合、化学結合等の任意の結合様式で固定化することが
できる。
ための担体 本発明により増幅されたＤＮＡを固定可能な固相担体
で、具体的にはマイクロタイターウエル、ポリスチレン
ボール、アガロースビーズ、ポリアクリルビーズ、ラテ
ックス粒子、磁性ラテックス粒子等の固相材料が挙げら
れる。好ましくは操作性及び機械化等に優れたマイクロ
タイターウエル又は磁性ラテックス粒子である。これら
の固相担体にＤＮＡを非特異的吸着、共有結合、イオン
結合、化学結合等の任意の結合様式で固定化することが
できる。
【００２４】（Ｃ）その他の試薬類 洗浄液は、未反応プライマー、試薬等を除去するための
洗浄液であって、本検出反応に影響が無いものであれば
特に限定されない。一般に緩衝液を用いることができ
る。標識を間接的に測定するための試薬は、プライマー
に直接検出可能な標識以外の標識を導入した場合、その
標識を間接的に測定するための試薬類を含むものであ
る。例えば、標識がハプテンである場合、ａ）ハプテン
と特異的に結合する抗体に酵素を結合させたもの、ｂ）
該酵素の基質等が挙げられる。これらの具体例として
は、酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの場合、基質とし
て２−ニトロフェノール、β−Ｄ−ガラクトシド、４−
メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド等、酵
素がペルオキシダーゼの場合、発色剤として２，２′−
アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホ
ン酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオニック
アシド、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジ
ン、１，２−フェニレンジアミン等、酵素がアルカリフ
ォスファターゼの場合、基質として４−メチルウンベリ
フェリルフォスフェート、ＮＡＤＰ、４−ニトロフェニ
ルフォスフェート等、酵素がグルコース−６−リン酸脱
水素酵素の場合、基質としてグルコース、ＮＡＤ等、ま
た酵素がアルコール脱水素酵素である場合、基質として
エタノール、ＮＡＤ等を用いることができる。
洗浄液であって、本検出反応に影響が無いものであれば
特に限定されない。一般に緩衝液を用いることができ
る。標識を間接的に測定するための試薬は、プライマー
に直接検出可能な標識以外の標識を導入した場合、その
標識を間接的に測定するための試薬類を含むものであ
る。例えば、標識がハプテンである場合、ａ）ハプテン
と特異的に結合する抗体に酵素を結合させたもの、ｂ）
該酵素の基質等が挙げられる。これらの具体例として
は、酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの場合、基質とし
て２−ニトロフェノール、β−Ｄ−ガラクトシド、４−
メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド等、酵
素がペルオキシダーゼの場合、発色剤として２，２′−
アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホ
ン酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオニック
アシド、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジ
ン、１，２−フェニレンジアミン等、酵素がアルカリフ
ォスファターゼの場合、基質として４−メチルウンベリ
フェリルフォスフェート、ＮＡＤＰ、４−ニトロフェニ
ルフォスフェート等、酵素がグルコース−６−リン酸脱
水素酵素の場合、基質としてグルコース、ＮＡＤ等、ま
た酵素がアルコール脱水素酵素である場合、基質として
エタノール、ＮＡＤ等を用いることができる。
【００２５】
【発明の効果】本発明によってペニシリン耐性肺炎球菌
を検体から直接、高精度かつ迅速に検出することがで
き、肺炎球菌感染症患者に対し、早期に適切な予防・治
療を行うことが可能になった。
を検体から直接、高精度かつ迅速に検出することがで
き、肺炎球菌感染症患者に対し、早期に適切な予防・治
療を行うことが可能になった。
【００２６】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２７】実施例１ 検体からのＤＮＡの抽出：臨床
材料（咽頭拭い液）を２mlのミューラーヒントン液体培
地に混釈し、混釈液の１．５mlを遠心分離して肺炎球菌
の菌体を集めた。遠心分離後は上清をほぼ完全に捨て
て、沈渣に１０μl の滅菌蒸留水を加えて懸濁した。次
いで懸濁液の２μl を溶菌液（１００mMトリス塩酸緩衝
液（pH８．９）、０．１％トリトンＸ−１００、２００
μg ／mlプロテイナーゼＫ、０．４５％ツイーン２０、
０．４５％ノニデットＰ−４０）２０μl に加えて６０
℃で２０分間の溶菌処理を行い、さらに９５℃で１０分
間加熱して菌体からＤＮＡを抽出させた。
材料（咽頭拭い液）を２mlのミューラーヒントン液体培
地に混釈し、混釈液の１．５mlを遠心分離して肺炎球菌
の菌体を集めた。遠心分離後は上清をほぼ完全に捨て
て、沈渣に１０μl の滅菌蒸留水を加えて懸濁した。次
いで懸濁液の２μl を溶菌液（１００mMトリス塩酸緩衝
液（pH８．９）、０．１％トリトンＸ−１００、２００
μg ／mlプロテイナーゼＫ、０．４５％ツイーン２０、
０．４５％ノニデットＰ−４０）２０μl に加えて６０
℃で２０分間の溶菌処理を行い、さらに９５℃で１０分
間加熱して菌体からＤＮＡを抽出させた。
【００２８】実施例２ ポリメラーゼ増幅反応：ＰＣＲ
は、上記のＤＮＡ溶液を２μl をＰＣＲ反応液２０μl
に加えて行った。ＰＣＲ反応液の組成は、各プライマー
（lytA遺伝子増幅用プライマー〔5'TGAAGCGGATTATCACTG
GC3'および5'GCTAAACTCCCTGTATCAAGCG3'〕とpbp1a遺伝
子増幅用プライマー〔5'AAACAAGGTCGGACTCAACC3'および
5'AGGTGCTACAAATTGAGAGG3'〕、pbp2b遺伝子増幅用プラ
イマー〔5'CAATCTAGAGTCTGCTATGGA3'および5'GGTCAATTC
CTGTCGCAGTA3'〕それぞれ２pmole／２０μl 、Taq ＤＮ
Ａポリメラーゼ０．５単位／２０μl 、ｄＡＴＰ・ｄＧ
ＴＰ・ｄＣＴＰ・ｄＴＴＰそれぞれ１．６μg ／２０μ
l 、１．５mM塩化マグネシウム、５０mM塩化カリウム、
０．００１％ゼラチン、１０mMトリス塩酸緩衝液（pH
８．３）である。ＰＣＲは、９４℃で３０秒の変性工程
・５７℃で３０秒のアニーリング工程・７２℃で１５秒
の伸長工程という３段階の温度サイクルを３０回繰り返
して行った。
は、上記のＤＮＡ溶液を２μl をＰＣＲ反応液２０μl
に加えて行った。ＰＣＲ反応液の組成は、各プライマー
（lytA遺伝子増幅用プライマー〔5'TGAAGCGGATTATCACTG
GC3'および5'GCTAAACTCCCTGTATCAAGCG3'〕とpbp1a遺伝
子増幅用プライマー〔5'AAACAAGGTCGGACTCAACC3'および
5'AGGTGCTACAAATTGAGAGG3'〕、pbp2b遺伝子増幅用プラ
イマー〔5'CAATCTAGAGTCTGCTATGGA3'および5'GGTCAATTC
CTGTCGCAGTA3'〕それぞれ２pmole／２０μl 、Taq ＤＮ
Ａポリメラーゼ０．５単位／２０μl 、ｄＡＴＰ・ｄＧ
ＴＰ・ｄＣＴＰ・ｄＴＴＰそれぞれ１．６μg ／２０μ
l 、１．５mM塩化マグネシウム、５０mM塩化カリウム、
０．００１％ゼラチン、１０mMトリス塩酸緩衝液（pH
８．３）である。ＰＣＲは、９４℃で３０秒の変性工程
・５７℃で３０秒のアニーリング工程・７２℃で１５秒
の伸長工程という３段階の温度サイクルを３０回繰り返
して行った。
【００２９】実施例３ 増幅結果の判定：ＰＣＲによる
遺伝子増幅の判定は、ＰＣＲ後の反応液１０μl を３％
アガロースゲル上で電気泳動を行い、ＤＮＡのバンドの
有無を確認することによって行った。lytA遺伝子の増幅
物は２７３塩基対、pbp1a遺伝子の増幅物は４３０塩基
対、pbp2b遺伝子の増幅物は７７塩基対の長さとなり、
電気泳動ゲル上での判別が可能である（図１）。
遺伝子増幅の判定は、ＰＣＲ後の反応液１０μl を３％
アガロースゲル上で電気泳動を行い、ＤＮＡのバンドの
有無を確認することによって行った。lytA遺伝子の増幅
物は２７３塩基対、pbp1a遺伝子の増幅物は４３０塩基
対、pbp2b遺伝子の増幅物は７７塩基対の長さとなり、
電気泳動ゲル上での判別が可能である（図１）。
【００３０】実施例４ 肺炎球菌の耐性確認：肺炎球菌
の薬剤耐性は以下のようにして確認した。すなわち、５
％綿羊脱繊維血液を加えたミューラーヒントン寒天培地
に最終濃度が６４μg ／mlから０．００８μg ／mlまで
の２倍希釈系列濃度となるようにペニシリンＧを加えた
培地を作製し、ペニシリン耐性判定用の培地とした。被
験肺炎球菌は血液寒天培地で前培養後、Todd Hewitt培
地に釣菌して６時間培養した。この培養液５μl をペニ
シリン耐性判定用の培地にスポットし、３７℃で１８時
間培養して、寒天表面上に明らかなコロニーの発育が見
られた場合を発育（＋）、見られないものを発育（−）
として判定した。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は菌の発
育が（−）となった薬剤濃度とした。
の薬剤耐性は以下のようにして確認した。すなわち、５
％綿羊脱繊維血液を加えたミューラーヒントン寒天培地
に最終濃度が６４μg ／mlから０．００８μg ／mlまで
の２倍希釈系列濃度となるようにペニシリンＧを加えた
培地を作製し、ペニシリン耐性判定用の培地とした。被
験肺炎球菌は血液寒天培地で前培養後、Todd Hewitt培
地に釣菌して６時間培養した。この培養液５μl をペニ
シリン耐性判定用の培地にスポットし、３７℃で１８時
間培養して、寒天表面上に明らかなコロニーの発育が見
られた場合を発育（＋）、見られないものを発育（−）
として判定した。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は菌の発
育が（−）となった薬剤濃度とした。
【００３１】米国臨床検査室標準法（ＮＣＣＬＳ）によ
れば、ペニシリンに対するＭＩＣが２．０μg ／ml以上
の株を耐性株、ＭＩＣが０．１〜１．０μg ／mlの株を
低度耐性株、ＭＩＣが０．０６以下の株を感性株として
いる。臨床分離肺炎球菌株２０２０株についての結果を
表１および図２に示す。ペニシリン耐性とされるＭＩＣ
が０．１２５以上の株８８０株中pbp1a遺伝子とpbp2b遺
伝子の両方が増幅された株は７株（０．８％）であり、
また逆にＭＩＣが０．１未満の株でpbp1a遺伝子とpbp2b
遺伝子の両方ともが増幅されなかった株は４株（０．４
％）のみであった。また、臨床的にβ−ラクラム系薬剤
が効かないと考えられるＭＩＣ０．５以上の株６６９株
のうちpbp1a遺伝子とpbp2b遺伝子の両方ともが増幅され
なかった株は６３３株（９４．６％）であり、本法によ
る遺伝子検査結果は薬剤耐性と高い相関性を示してい
た。なお、何れの分離株においてもlytA遺伝子の存在が
確認できた。
れば、ペニシリンに対するＭＩＣが２．０μg ／ml以上
の株を耐性株、ＭＩＣが０．１〜１．０μg ／mlの株を
低度耐性株、ＭＩＣが０．０６以下の株を感性株として
いる。臨床分離肺炎球菌株２０２０株についての結果を
表１および図２に示す。ペニシリン耐性とされるＭＩＣ
が０．１２５以上の株８８０株中pbp1a遺伝子とpbp2b遺
伝子の両方が増幅された株は７株（０．８％）であり、
また逆にＭＩＣが０．１未満の株でpbp1a遺伝子とpbp2b
遺伝子の両方ともが増幅されなかった株は４株（０．４
％）のみであった。また、臨床的にβ−ラクラム系薬剤
が効かないと考えられるＭＩＣ０．５以上の株６６９株
のうちpbp1a遺伝子とpbp2b遺伝子の両方ともが増幅され
なかった株は６３３株（９４．６％）であり、本法によ
る遺伝子検査結果は薬剤耐性と高い相関性を示してい
た。なお、何れの分離株においてもlytA遺伝子の存在が
確認できた。
【００３２】
【表１】
【図１】本発明の実施例における電気泳動の結果を示す
図である。
図である。
【図２】本発明の実施例における臨床分離肺炎球菌株の
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を示すグラフである。
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を示すグラフである。
Claims (5)
- 【請求項１】 肺炎球菌のlytA遺伝子、pbp1a遺伝子お
よびpbp2b遺伝子を遺伝子増幅法により同時に検出する
ことを特徴とする、ペニシリン耐性肺炎球菌の存在およ
び耐性度を判定する方法。 - 【請求項２】 lytA遺伝子がlytA遺伝子の６９４番目か
ら９６６番目に相当するＤＮＡであり、pbp1a遺伝子がp
bp1a遺伝子の２２５６番目から２６８５番目に相当する
ＤＮＡであり、pbp2b遺伝子がpbp2b遺伝子の１６３６番
目から１７１２番目に相当するＤＮＡである請求項１記
載の方法。 - 【請求項３】 遺伝子増幅法が式（１）〜（６） 5'TGAAGCGGATTATCACTGGC3'・・・・・（１） 5'GCTAAACTCCCTGTATCAAGCG3' ・・・（２） 5'AAACAAGGTCGGACTCAACC3'・・・・・（３） 5'AGGTGCTACAAATTGAGAGG3'・・・・・（４） 5'CAATCTAGAGTCTGCTATGGA3' ・・・・（５） 5'GGTCAATTCCTGTCGCAGTA3'・・・・・（６） で表される塩基配列を有するプライマーを使用するもの
である請求項１または２記載の方法。 - 【請求項４】 遺伝子増幅法がポリメラーゼ増幅反応法
である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項５】 請求項３記載のプライマー（１）〜
（６）を含むことを特徴とする、ペニシリン耐性肺炎球
菌の存在および耐性度の判定用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15115796A JPH09327300A (ja) | 1996-06-12 | 1996-06-12 | ペニシリン耐性肺炎球菌の検査法およびキット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15115796A JPH09327300A (ja) | 1996-06-12 | 1996-06-12 | ペニシリン耐性肺炎球菌の検査法およびキット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09327300A true JPH09327300A (ja) | 1997-12-22 |
Family
ID=15512603
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15115796A Pending JPH09327300A (ja) | 1996-06-12 | 1996-06-12 | ペニシリン耐性肺炎球菌の検査法およびキット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09327300A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112646903A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-04-13 | 遵义医科大学珠海校区 | 肺炎链球菌对万古霉素耐药性诊断的标志物及其应用 |
-
1996
- 1996-06-12 JP JP15115796A patent/JPH09327300A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112646903A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-04-13 | 遵义医科大学珠海校区 | 肺炎链球菌对万古霉素耐药性诊断的标志物及其应用 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060221 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060627 |