JPH09323937A - 新規な血小板産生因子 - Google Patents
新規な血小板産生因子Info
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- JPH09323937A JPH09323937A JP8139842A JP13984296A JPH09323937A JP H09323937 A JPH09323937 A JP H09323937A JP 8139842 A JP8139842 A JP 8139842A JP 13984296 A JP13984296 A JP 13984296A JP H09323937 A JPH09323937 A JP H09323937A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【解決手段】下記の性質を有する血小板産生因子、その
製造法、およびその医薬用途。 （ａ）巨核球胞体突起形成活性を有する。 （ｂ）インターロイキン−６及びエリスロポエチンの活
性中和抗体によっても活性が中和されない。 （ｃ）１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−
エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液条件下で、小麦
胚芽レクチンに吸着する。 （ｄ）１３６ｍＭの食塩と２．７ｍＭの塩化カリウムを
含むｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ）条件
下で、ブルー色素に吸着しない。 【効果】 上記の物質は、巨核球胞体突起形成活性を有
し、血小板を産生し得るものであって、血小板減少症の
治療及び予防に用いることのできる血小板産生剤として
有用である。
製造法、およびその医薬用途。 （ａ）巨核球胞体突起形成活性を有する。 （ｂ）インターロイキン−６及びエリスロポエチンの活
性中和抗体によっても活性が中和されない。 （ｃ）１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−
エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液条件下で、小麦
胚芽レクチンに吸着する。 （ｄ）１３６ｍＭの食塩と２．７ｍＭの塩化カリウムを
含むｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ）条件
下で、ブルー色素に吸着しない。 【効果】 上記の物質は、巨核球胞体突起形成活性を有
し、血小板を産生し得るものであって、血小板減少症の
治療及び予防に用いることのできる血小板産生剤として
有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、巨核球胞体突起形成を
促進する血小板産生因子及び該因子を含有する医薬組成
物、およびその製造方法に関する。
促進する血小板産生因子及び該因子を含有する医薬組成
物、およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】造血組織は生体内の中で最も活発に新生
と崩壊を繰り返している組織の一つである。多数の血球
成分が日々産生され、傍らでは機能を果たした血球は死
滅していく。このような激しい細胞の交換にもかかわら
ず、各血球は過不足がなく、恒常性が保たれている。こ
うした血球数の調節は、造血細胞の増殖、分化、成熟に
多数の造血因子が作用することにより行われていると考
えられる。即ち、赤血球を増加させる因子としてはエリ
スロポエチン(1) （以下、ＥＰＯと略記することがあ
る）が、白血球を増加させる因子としてはコロニー刺激
因子(2) が、血小板を増加させる因子としてはトロンボ
ポエチンが作用していると考えられている。
と崩壊を繰り返している組織の一つである。多数の血球
成分が日々産生され、傍らでは機能を果たした血球は死
滅していく。このような激しい細胞の交換にもかかわら
ず、各血球は過不足がなく、恒常性が保たれている。こ
うした血球数の調節は、造血細胞の増殖、分化、成熟に
多数の造血因子が作用することにより行われていると考
えられる。即ち、赤血球を増加させる因子としてはエリ
スロポエチン(1) （以下、ＥＰＯと略記することがあ
る）が、白血球を増加させる因子としてはコロニー刺激
因子(2) が、血小板を増加させる因子としてはトロンボ
ポエチンが作用していると考えられている。
【０００３】血小板は血液幹細胞から巨核球前駆細胞を
へて分化、成熟した巨核球より血中に放出されることは
知られているが、この血小板の産生過程において特異的
に作用する因子はこれまで知られてなかった。１９９４
年に血小板減少症動物からｍｐｌリガンドが精製され、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの検討からトロン
ボポエチン＝ｍｐｌリガンドと考えられるようになった
(3)(4)。すなわちｍｐｌリガンドは、巨核球前駆細胞数
を増加させる巨核球コロニー刺激因子（Ｍｅｇ−ＣＳ
Ｆ）活性及び巨核球を成熟させる巨核球増幅因子（Ｍｅ
ｇ−ＰＯＴ）活性を単独で有することが明らかにされ
た。しかし生体内で成熟した巨核球からの血小板の放出
にｍｐｌリガンドが直接作用しているという証拠はな
い。成熟巨核球からの血小板の放出を反映すると思われ
るｉｎ ｖｉｔｒｏの系として、精製巨核球の胞体突起
形成能を観察する方法が知られているが(5) 、ｍｐｌリ
ガンドが単独で胞体突起形成を促進するという報告はこ
れまでになく、最近ではｍｐｌリガンドは巨核球胞体突
起形成活性を有さないと考えられるようになった(6) 。
へて分化、成熟した巨核球より血中に放出されることは
知られているが、この血小板の産生過程において特異的
に作用する因子はこれまで知られてなかった。１９９４
年に血小板減少症動物からｍｐｌリガンドが精製され、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの検討からトロン
ボポエチン＝ｍｐｌリガンドと考えられるようになった
(3)(4)。すなわちｍｐｌリガンドは、巨核球前駆細胞数
を増加させる巨核球コロニー刺激因子（Ｍｅｇ−ＣＳ
Ｆ）活性及び巨核球を成熟させる巨核球増幅因子（Ｍｅ
ｇ−ＰＯＴ）活性を単独で有することが明らかにされ
た。しかし生体内で成熟した巨核球からの血小板の放出
にｍｐｌリガンドが直接作用しているという証拠はな
い。成熟巨核球からの血小板の放出を反映すると思われ
るｉｎ ｖｉｔｒｏの系として、精製巨核球の胞体突起
形成能を観察する方法が知られているが(5) 、ｍｐｌリ
ガンドが単独で胞体突起形成を促進するという報告はこ
れまでになく、最近ではｍｐｌリガンドは巨核球胞体突
起形成活性を有さないと考えられるようになった(6) 。
【０００４】従来、巨核球胞体突起形成活性を有する因
子としては、インターロイキン−６（以下、ＩＬ−６と
略記することがある）とＥＰＯが知られているが、その
活性は弱く、巨核球に特異的に作用する因子ではないこ
とが知られている(7) 。 〔（１）平嶋邦猛，臨床透析，５，８９１，１９８９
（２）Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２４１，１８２０，１９８８（３）Ｆｒｅｄ
ｅｒｉｃ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６
９，５３３，１９９４（４）Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ
Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６９，５６８，１
９９４（５）長澤俊郎，血栓止血誌，６，２７，１９９
５（６）Ｎａｇａｈｉｓａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏ
ｏｄ，８７，１３０９，１９９６（７）Ｅｍｉ，Ａｎ．
ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔ
ｏｌｏｇｙ，２２，１４９，１９９４〕
子としては、インターロイキン−６（以下、ＩＬ−６と
略記することがある）とＥＰＯが知られているが、その
活性は弱く、巨核球に特異的に作用する因子ではないこ
とが知られている(7) 。 〔（１）平嶋邦猛，臨床透析，５，８９１，１９８９
（２）Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２４１，１８２０，１９８８（３）Ｆｒｅｄ
ｅｒｉｃ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６
９，５３３，１９９４（４）Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ
Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６９，５６８，１
９９４（５）長澤俊郎，血栓止血誌，６，２７，１９９
５（６）Ｎａｇａｈｉｓａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏ
ｏｄ，８７，１３０９，１９９６（７）Ｅｍｉ，Ａｎ．
ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔ
ｏｌｏｇｙ，２２，１４９，１９９４〕
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上述したようにｍｐｌ
リガンドは巨核球の増殖及び成熟を促進するため血小板
産生剤の候補の１つとして挙げられるが、ヒトに対する
血小板産生剤としてどれほど有効であるかは不明であ
る。化学療法後あるいは骨髄移植後等の血小板減少症を
改善する良い薬剤が無い現在では、ｍｐｌリガンド以外
の新たな血小板産生を促進させる因子の開発が待ち望ま
れている。
リガンドは巨核球の増殖及び成熟を促進するため血小板
産生剤の候補の１つとして挙げられるが、ヒトに対する
血小板産生剤としてどれほど有効であるかは不明であ
る。化学療法後あるいは骨髄移植後等の血小板減少症を
改善する良い薬剤が無い現在では、ｍｐｌリガンド以外
の新たな血小板産生を促進させる因子の開発が待ち望ま
れている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】血小板産生過程は大きく
分けて、次の３段階からなることが知られている。すな
わち第１段階が巨核球前駆細胞の増殖、第２段階が巨核
球の成熟、第３段階が成熟巨核球から血小板の放出であ
る。本発明者らは血小板造血の第１段階から第２段階ま
ではｍｐｌリガンドが作用し、第３段階には血漿中の未
知の因子が作用すると予想した。そこで特異的に且つ強
力に巨核球からの血小板放出を促進する作用を有する新
規な血小板産生因子を見いだすべく鋭意研究を重ねた。
その結果、血小板産生因子に親和性を持ったアフィニテ
ィーカラムを使用することにより、微量な同因子を血小
板減少症患者の血液から精製することに成功し、次いで
血小板減少症モデル動物の血液から精製することにも成
功した。さらに健常人の血液からも同じく精製すること
が可能であることを確認した。本発明の血小板産生因子
の諸性質を検討したところ、該因子は巨核球胞体突起形
成活性を有する、すなわち血小板造血の第３段階に作用
するのに対し、ｍｐｌリガンドは第１、第２段階に作用
するものであり、本発明の血小板産生因子とは明らかに
相違することが確認された。さらに本発明の血小板産生
因子は、ＩＬ−６及びＥＰＯのそれぞれの活性中和抗体
によってもその活性が中和されないことから、これらの
因子とは免疫学的に異なることが確認された。本発明
は、これらの知見に基づいて完成されたものである。す
なわち本発明は、下記の性質を有することを特徴とする
血小板産生因子である。 （ａ）巨核球胞体突起形成活性を有する。 （ｂ）インターロイキン−６及びエリスロポエチンの活
性中和抗体によっても活性が中和されない。 （ｃ）１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−
エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液条件下で小麦胚
芽レクチンに吸着する。 （ｄ）１３６ｍＭの食塩と２．７ｍＭの塩化カリウムを
含むｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ）条件
下でブルー色素（１−ａｍｉｎｏ−４−［［４−［［４
−ｃｈｌｏｒｏ−６−［（２−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙ
ｌ）ａｍｉｎｏ］−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−
ｙｌ］ａｍｉｎｏ］−３−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ］ａ
ｍｉｎｏ］−９，１０−ｄｉｈｙｄｒｏ−９，１０−ｄ
ｉｏｘｏ−２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ
ａｃｉｄ）に吸着しない。
分けて、次の３段階からなることが知られている。すな
わち第１段階が巨核球前駆細胞の増殖、第２段階が巨核
球の成熟、第３段階が成熟巨核球から血小板の放出であ
る。本発明者らは血小板造血の第１段階から第２段階ま
ではｍｐｌリガンドが作用し、第３段階には血漿中の未
知の因子が作用すると予想した。そこで特異的に且つ強
力に巨核球からの血小板放出を促進する作用を有する新
規な血小板産生因子を見いだすべく鋭意研究を重ねた。
その結果、血小板産生因子に親和性を持ったアフィニテ
ィーカラムを使用することにより、微量な同因子を血小
板減少症患者の血液から精製することに成功し、次いで
血小板減少症モデル動物の血液から精製することにも成
功した。さらに健常人の血液からも同じく精製すること
が可能であることを確認した。本発明の血小板産生因子
の諸性質を検討したところ、該因子は巨核球胞体突起形
成活性を有する、すなわち血小板造血の第３段階に作用
するのに対し、ｍｐｌリガンドは第１、第２段階に作用
するものであり、本発明の血小板産生因子とは明らかに
相違することが確認された。さらに本発明の血小板産生
因子は、ＩＬ−６及びＥＰＯのそれぞれの活性中和抗体
によってもその活性が中和されないことから、これらの
因子とは免疫学的に異なることが確認された。本発明
は、これらの知見に基づいて完成されたものである。す
なわち本発明は、下記の性質を有することを特徴とする
血小板産生因子である。 （ａ）巨核球胞体突起形成活性を有する。 （ｂ）インターロイキン−６及びエリスロポエチンの活
性中和抗体によっても活性が中和されない。 （ｃ）１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−
エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液条件下で小麦胚
芽レクチンに吸着する。 （ｄ）１３６ｍＭの食塩と２．７ｍＭの塩化カリウムを
含むｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ）条件
下でブルー色素（１−ａｍｉｎｏ−４−［［４−［［４
−ｃｈｌｏｒｏ−６−［（２−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙ
ｌ）ａｍｉｎｏ］−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−
ｙｌ］ａｍｉｎｏ］−３−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ］ａ
ｍｉｎｏ］−９，１０−ｄｉｈｙｄｒｏ−９，１０−ｄ
ｉｏｘｏ−２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ
ａｃｉｄ）に吸着しない。
【０００７】本発明の血小板産生因子を製造するに際し
て用いる原料としては、本発明の血小板産生因子が含有
されるものであれば特に限定されないが、例えば哺乳動
物の血液、好ましくはヒト血液が挙げられる。血液とし
ては、全血であっても許容されるが、通常は、血漿また
は血清が好ましく、特に血漿が好ましい例として挙げら
れる。上記の血液を採取する哺乳動物としては、ヒトが
好ましく、血小板が減少した個体、例えば、再生不良性
貧血患者（ＡＡ）や、特発性血小板減少性紫斑病患者
（ＩＴＰ）であってもよいが、正常の個体、健常人を用
いることも好ましい。血液から公知の方法により、血漿
または血清とすることができる。
て用いる原料としては、本発明の血小板産生因子が含有
されるものであれば特に限定されないが、例えば哺乳動
物の血液、好ましくはヒト血液が挙げられる。血液とし
ては、全血であっても許容されるが、通常は、血漿また
は血清が好ましく、特に血漿が好ましい例として挙げら
れる。上記の血液を採取する哺乳動物としては、ヒトが
好ましく、血小板が減少した個体、例えば、再生不良性
貧血患者（ＡＡ）や、特発性血小板減少性紫斑病患者
（ＩＴＰ）であってもよいが、正常の個体、健常人を用
いることも好ましい。血液から公知の方法により、血漿
または血清とすることができる。
【０００８】通常前記原料は、精製の出来るだけ早い段
階において、プロテアーゼ不活化処理を行うことが好ま
しい。このプロテアーゼ不活化処理は、公知の方法にて
プロテアーゼの不活化を行えるのであれば特に限定され
ることはなく、例えば、公知の阻害剤を添加する例が挙
げられる。不活化処理の対象となるプロテアーゼとして
は、通常セリンプロテアーゼが挙げられることより、公
知のセリンプロテアーゼ阻害剤を使用することが好まし
く、例えば、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）
を使用する例が挙げられる。
階において、プロテアーゼ不活化処理を行うことが好ま
しい。このプロテアーゼ不活化処理は、公知の方法にて
プロテアーゼの不活化を行えるのであれば特に限定され
ることはなく、例えば、公知の阻害剤を添加する例が挙
げられる。不活化処理の対象となるプロテアーゼとして
は、通常セリンプロテアーゼが挙げられることより、公
知のセリンプロテアーゼ阻害剤を使用することが好まし
く、例えば、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）
を使用する例が挙げられる。
【０００９】前記原料からの本発明の因子の分離・精製
方法としては、通常は、最初に塩析を行うことが好まし
い。塩析に用いる塩としては、種々の塩が知られてお
り、通常は、硫安塩析が好ましい。使用する塩の濃度と
しては、適宜の濃度を使用できるが、例えば、硫安塩析
では、５５〜８０％の硫安を使用することができる。次
いで、精製度を上げるために特に小麦胚芽レクチン、ブ
ルー色素の少なくともいずれかを用いることが好まし
く、両方用いる場合使用する順番は問わない。これらを
用いることで他の方法に比べて特に効率良く精製するこ
とが可能である。すなわち小麦胚芽レクチンは糖鎖を有
する蛋白質やペプチドを特異的に吸着するため、糖鎖を
有すると推測できる本発明の因子を効率良く精製でき
る。またブルー色素はｍｐｌリガンドや大量に含まれる
アルブミン等に吸着するが、本発明の因子には吸着しな
いので、物質として異なることが分かるとともに、精製
において、混入してくるこれら公知の因子と本発明の因
子を効率良く分離することが可能である。
方法としては、通常は、最初に塩析を行うことが好まし
い。塩析に用いる塩としては、種々の塩が知られてお
り、通常は、硫安塩析が好ましい。使用する塩の濃度と
しては、適宜の濃度を使用できるが、例えば、硫安塩析
では、５５〜８０％の硫安を使用することができる。次
いで、精製度を上げるために特に小麦胚芽レクチン、ブ
ルー色素の少なくともいずれかを用いることが好まし
く、両方用いる場合使用する順番は問わない。これらを
用いることで他の方法に比べて特に効率良く精製するこ
とが可能である。すなわち小麦胚芽レクチンは糖鎖を有
する蛋白質やペプチドを特異的に吸着するため、糖鎖を
有すると推測できる本発明の因子を効率良く精製でき
る。またブルー色素はｍｐｌリガンドや大量に含まれる
アルブミン等に吸着するが、本発明の因子には吸着しな
いので、物質として異なることが分かるとともに、精製
において、混入してくるこれら公知の因子と本発明の因
子を効率良く分離することが可能である。
【００１０】小麦胚芽レクチンによる精製工程は、精製
原料に、通常ｐＨ６−８、好ましくはｐＨ７．０−７．
５の適当な緩衝液、さらに好ましくは、１５０ｍＭの食
塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液の条
件下で、小麦胚芽レクチンを接触せしめ、吸着物を常法
に従って適当な濃度の糖例えば２００ｍＭのＮ−アセチ
ルグルコサミンを含む同緩衝液により溶出し、採取する
方法である。
原料に、通常ｐＨ６−８、好ましくはｐＨ７．０−７．
５の適当な緩衝液、さらに好ましくは、１５０ｍＭの食
塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液の条
件下で、小麦胚芽レクチンを接触せしめ、吸着物を常法
に従って適当な濃度の糖例えば２００ｍＭのＮ−アセチ
ルグルコサミンを含む同緩衝液により溶出し、採取する
方法である。
【００１１】ブルー色素による精製工程は、精製原料
に、通常ｐＨ６−８、好ましくはｐＨ７．０−７．５の
適当な緩衝液、さらに好ましくは、ｐＨ７．４のＰＢＳ
条件下で、ブルー色素を接触せしめ、非吸着物を採取す
る方法である。小麦胚芽レクチンおよびブルー色素によ
る精製工程の好ましい例を示すと、精製原料にｐＨ７．
０−７．５の適当な緩衝液、例えば、１５０ｍＭの食塩
を含むｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液条件下
で小麦胚芽レクチンを接触せしめ、吸着物を常法に従っ
て適当な濃度の糖例えば２００ｍＭのＮ−アセチルグル
コサミンを含む同緩衝液により溶出し、さらに該画分
に、ｐＨ７．０−７．５の適当な緩衝液、例えば、ｐＨ
７．４のＰＢＳ条件下でブルー色素を接触せしめ、該非
吸着物を採取する方法である。
に、通常ｐＨ６−８、好ましくはｐＨ７．０−７．５の
適当な緩衝液、さらに好ましくは、ｐＨ７．４のＰＢＳ
条件下で、ブルー色素を接触せしめ、非吸着物を採取す
る方法である。小麦胚芽レクチンおよびブルー色素によ
る精製工程の好ましい例を示すと、精製原料にｐＨ７．
０−７．５の適当な緩衝液、例えば、１５０ｍＭの食塩
を含むｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液条件下
で小麦胚芽レクチンを接触せしめ、吸着物を常法に従っ
て適当な濃度の糖例えば２００ｍＭのＮ−アセチルグル
コサミンを含む同緩衝液により溶出し、さらに該画分
に、ｐＨ７．０−７．５の適当な緩衝液、例えば、ｐＨ
７．４のＰＢＳ条件下でブルー色素を接触せしめ、該非
吸着物を採取する方法である。
【００１２】小麦胚芽レクチンは、通常に市販されてお
り、例えば生化学工業社製の製品を用いることが好まし
い。ブルー色素としてはシグマ社１９９４年度試薬カタ
ログに記載のシバクロンブルー３ＧＡが好ましい。小麦
胚芽レクチンまたはシバクロンブルー３ＧＡの使用に当
たっては、ハロゲン化シアンやエポキシドを作用させて
活性化した適当な担体例えば、活性化セルロース、活性
化アガロース、活性化デキストラン等に固定化して用い
ると好適である。その固定化方法は、特に限定されない
が、例えば小麦胚芽レクチンをハロゲン化シアン活性化
担体に固定化する場合は、ｐＨ１１〜１２に調製した担
体懸濁液に臭化シアンを添加することにより担体を活性
化した後、適当な固定化反応用緩衝液、好ましくは０．
５Ｍの食塩を含むｐＨ８．３の０．１Ｍ炭酸水素ナトリ
ウム緩衝液中で活性化担体と小麦胚芽レクチンを反応さ
せることにより固定化できる。また、小麦胚芽レクチン
固定化担体としては、ウィートジャームレクチン（ＷＧ
Ｌ）セファロース６ＭＢ（スウェーデン、ファルマシア
社）が、シバクロンブルー３ＧＡ固定化担体としては、
ブルーセファロース・ファーストフロー（ファルマシア
社）が市販されており、これを利用することが簡便であ
る。それぞれカラムクロマトグラフィーとなして用いる
と、特に操作、効率において好ましく、本発明品は小麦
胚芽レクチンカラムの吸着画分、ブルー色素カラムの非
吸着画分に回収される。
り、例えば生化学工業社製の製品を用いることが好まし
い。ブルー色素としてはシグマ社１９９４年度試薬カタ
ログに記載のシバクロンブルー３ＧＡが好ましい。小麦
胚芽レクチンまたはシバクロンブルー３ＧＡの使用に当
たっては、ハロゲン化シアンやエポキシドを作用させて
活性化した適当な担体例えば、活性化セルロース、活性
化アガロース、活性化デキストラン等に固定化して用い
ると好適である。その固定化方法は、特に限定されない
が、例えば小麦胚芽レクチンをハロゲン化シアン活性化
担体に固定化する場合は、ｐＨ１１〜１２に調製した担
体懸濁液に臭化シアンを添加することにより担体を活性
化した後、適当な固定化反応用緩衝液、好ましくは０．
５Ｍの食塩を含むｐＨ８．３の０．１Ｍ炭酸水素ナトリ
ウム緩衝液中で活性化担体と小麦胚芽レクチンを反応さ
せることにより固定化できる。また、小麦胚芽レクチン
固定化担体としては、ウィートジャームレクチン（ＷＧ
Ｌ）セファロース６ＭＢ（スウェーデン、ファルマシア
社）が、シバクロンブルー３ＧＡ固定化担体としては、
ブルーセファロース・ファーストフロー（ファルマシア
社）が市販されており、これを利用することが簡便であ
る。それぞれカラムクロマトグラフィーとなして用いる
と、特に操作、効率において好ましく、本発明品は小麦
胚芽レクチンカラムの吸着画分、ブルー色素カラムの非
吸着画分に回収される。
【００１３】試料の緩衝液組成を変える場合は、透析法
を用いるが、使用する透析膜は再生セルロースやセルロ
ースエステル等一般に用いられる材質が好ましい。さら
に、分画分子量は１００００以下の物を使用するのが好
ましい。透析に際しては、透析する試料の１００倍以上
の透析外液に対して８時間以上透析することが好まし
く、透析外液は最低１回は変えるほうが良い。透析外液
は、適当な緩衝液を用いることが通常であって、変えよ
うとする組成の緩衝液を使用すればよい。
を用いるが、使用する透析膜は再生セルロースやセルロ
ースエステル等一般に用いられる材質が好ましい。さら
に、分画分子量は１００００以下の物を使用するのが好
ましい。透析に際しては、透析する試料の１００倍以上
の透析外液に対して８時間以上透析することが好まし
く、透析外液は最低１回は変えるほうが良い。透析外液
は、適当な緩衝液を用いることが通常であって、変えよ
うとする組成の緩衝液を使用すればよい。
【００１４】試料の濃縮には低分子塩類を除去できる限
外濾過膜等を用いることができるが、その材質はポリス
ルホンやポリアクリロニトリル等一般に蛋白の濃縮に用
いられる材質が好ましい。さらに、分画分子量は１００
００以下の物を使用するのが好ましい。また本発明の製
造方法においては、通常使用される方法、例えば、担体
による吸着法、塩析法、電気泳動法、およびイオン交
換、ゲル濾過、適当なリガンドへのアフィニティーを応
用した各種のクロマトグラフィー法等を単独で、または
組み合わせて使用できる。クロマトグラフィー法とし
て、好ましくは、カルボキシメチル（ＣＭ）基を結合さ
せた担体を用いるＣＭカラムクロマトグラフィー、第４
級アミノエチル基（Ｑ）を結合させた担体を用いるＱカ
ラムクロマトグラフィー、架橋したデキストランゲル等
の粒子を用いるゲル濾過カラムクロマトグラフィー、フ
ェニル基やブチル基を結合させた担体を用いる疎水性カ
ラムクロマトグラフィー、銅イオンやニッケルイオンを
結合させたキレーティングカラムクロマトグラフィー、
色素やレクチン等の該因子に親和性がある物質を結合さ
せた担体を用いるアフィニティーカラムクロマトグラフ
ィーを使用できる。
外濾過膜等を用いることができるが、その材質はポリス
ルホンやポリアクリロニトリル等一般に蛋白の濃縮に用
いられる材質が好ましい。さらに、分画分子量は１００
００以下の物を使用するのが好ましい。また本発明の製
造方法においては、通常使用される方法、例えば、担体
による吸着法、塩析法、電気泳動法、およびイオン交
換、ゲル濾過、適当なリガンドへのアフィニティーを応
用した各種のクロマトグラフィー法等を単独で、または
組み合わせて使用できる。クロマトグラフィー法とし
て、好ましくは、カルボキシメチル（ＣＭ）基を結合さ
せた担体を用いるＣＭカラムクロマトグラフィー、第４
級アミノエチル基（Ｑ）を結合させた担体を用いるＱカ
ラムクロマトグラフィー、架橋したデキストランゲル等
の粒子を用いるゲル濾過カラムクロマトグラフィー、フ
ェニル基やブチル基を結合させた担体を用いる疎水性カ
ラムクロマトグラフィー、銅イオンやニッケルイオンを
結合させたキレーティングカラムクロマトグラフィー、
色素やレクチン等の該因子に親和性がある物質を結合さ
せた担体を用いるアフィニティーカラムクロマトグラフ
ィーを使用できる。
【００１５】本発明の製造方法においては、上記の精製
工程の順番は特に限定されないが、特に好ましい具体的
な製造例を挙げると以下の通りである。原料として血
漿、好ましくはヒトの血漿を用い、ジイソプロピルフル
オロリン酸（ＤＦＰ）処理により、内在性のセリンプロ
テアーゼを失活させ、５５〜８０％の硫酸アンモニウム
（硫安）塩析により分画する。血小板産生活性を有する
画分をｐＨ７．０−７．５の適当な緩衝液、例えばＨＥ
ＰＥＳ緩衝液にて透析する。次に同緩衝液で平衡化した
適当なレクチンアフィニティーカラム例えば小麦胚芽レ
クチン固定化担体、好ましくはウィートジャームレクチ
ン（ＷＧＬ）セファロース６ＭＢ（スウェーデン、ファ
ルマシア社）にアプライし、十分にカラムを洗浄して非
吸着物を除く。吸着物は、常法に従って適当な糖例えば
Ｎ−アセチルグルコサミンを含む緩衝液により溶出す
る。溶出液を限外濾過膜等により適当な濃度、好ましく
は２−５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、ｐＨ７．０−７．５の
適当な緩衝液、例えばＰＢＳで予め平衡化したシバクロ
ンブルー３ＧＡ固定化担体、好ましくはブルーセファロ
ース・ファーストフロー（ファルマシア社）カラムにア
プライし、同緩衝液で十分にカラムを洗浄して非吸着画
分を得る。非吸着画分を限外濾過膜等により適当な濃
度、好ましくは２−１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、ｐＨ
７．０−７．５の適当な緩衝液、例えばＨＥＰＥＳ緩衝
液に透析する。
工程の順番は特に限定されないが、特に好ましい具体的
な製造例を挙げると以下の通りである。原料として血
漿、好ましくはヒトの血漿を用い、ジイソプロピルフル
オロリン酸（ＤＦＰ）処理により、内在性のセリンプロ
テアーゼを失活させ、５５〜８０％の硫酸アンモニウム
（硫安）塩析により分画する。血小板産生活性を有する
画分をｐＨ７．０−７．５の適当な緩衝液、例えばＨＥ
ＰＥＳ緩衝液にて透析する。次に同緩衝液で平衡化した
適当なレクチンアフィニティーカラム例えば小麦胚芽レ
クチン固定化担体、好ましくはウィートジャームレクチ
ン（ＷＧＬ）セファロース６ＭＢ（スウェーデン、ファ
ルマシア社）にアプライし、十分にカラムを洗浄して非
吸着物を除く。吸着物は、常法に従って適当な糖例えば
Ｎ−アセチルグルコサミンを含む緩衝液により溶出す
る。溶出液を限外濾過膜等により適当な濃度、好ましく
は２−５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、ｐＨ７．０−７．５の
適当な緩衝液、例えばＰＢＳで予め平衡化したシバクロ
ンブルー３ＧＡ固定化担体、好ましくはブルーセファロ
ース・ファーストフロー（ファルマシア社）カラムにア
プライし、同緩衝液で十分にカラムを洗浄して非吸着画
分を得る。非吸着画分を限外濾過膜等により適当な濃
度、好ましくは２−１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、ｐＨ
７．０−７．５の適当な緩衝液、例えばＨＥＰＥＳ緩衝
液に透析する。
【００１６】このようにして得られる新規な血小板産生
因子は、巨核球胞体突起形成活性を有し、血小板を産生
することのできるものである。生体に由来することから
判断できる通り、本発明の因子は、毒性が少ないことが
確認される。本発明の血小板産生因子は、巨核球の胞体
突起形成を促進する研究用試薬として、また該因子単独
で、あるいは有効量の該因子に、薬学上許容される担
体、例えば希釈液、賦形剤、増粘剤、ｐＨ調製剤等を添
加して適当な剤形とし、医薬組成物として使用すること
ができる。すなわち本発明は有効量の前記血小板産生因
子、及び薬学上許容される担体を含有することを特徴と
する医薬組成物である。
因子は、巨核球胞体突起形成活性を有し、血小板を産生
することのできるものである。生体に由来することから
判断できる通り、本発明の因子は、毒性が少ないことが
確認される。本発明の血小板産生因子は、巨核球の胞体
突起形成を促進する研究用試薬として、また該因子単独
で、あるいは有効量の該因子に、薬学上許容される担
体、例えば希釈液、賦形剤、増粘剤、ｐＨ調製剤等を添
加して適当な剤形とし、医薬組成物として使用すること
ができる。すなわち本発明は有効量の前記血小板産生因
子、及び薬学上許容される担体を含有することを特徴と
する医薬組成物である。
【００１７】本発明の医薬組成物は、例えば、血小板産
生剤として有用である。すなわち、ある種の血小板減少
症、例えば抗癌剤投与後の血小板減少症、放射線治療後
の血小板減少症、造血因子欠損による血小板減少症、再
生不良性貧血の血小板減少症、骨髄異形成症侯群の血小
板減少症、自己免疫疾患の血小板減少症の治療及び予防
に有用である。本発明の医薬組成物は、特に好ましくは
注射剤として用いることができる。例えば、注射用蒸留
水、ブドウ糖、ショ糖、グリセリン、食塩、リン酸ナト
リウム等の希釈液、増粘剤、等張剤、ｐＨ調整剤等を加
えることができる。
生剤として有用である。すなわち、ある種の血小板減少
症、例えば抗癌剤投与後の血小板減少症、放射線治療後
の血小板減少症、造血因子欠損による血小板減少症、再
生不良性貧血の血小板減少症、骨髄異形成症侯群の血小
板減少症、自己免疫疾患の血小板減少症の治療及び予防
に有用である。本発明の医薬組成物は、特に好ましくは
注射剤として用いることができる。例えば、注射用蒸留
水、ブドウ糖、ショ糖、グリセリン、食塩、リン酸ナト
リウム等の希釈液、増粘剤、等張剤、ｐＨ調整剤等を加
えることができる。
【００１８】本発明の血小板産生因子の成人１回当りの
投与量は、年齢、性別、体重、症状などによって異なる
が、一般に約０．１μｇ〜１００ｍｇであり、１日当り
１回または必要に応じて数回投与することができる。本
発明をより詳細に記述するために、参考例及び実施例に
より説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定
されるものではない。
投与量は、年齢、性別、体重、症状などによって異なる
が、一般に約０．１μｇ〜１００ｍｇであり、１日当り
１回または必要に応じて数回投与することができる。本
発明をより詳細に記述するために、参考例及び実施例に
より説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定
されるものではない。
【００１９】
【参考例】マウス骨髄細胞をｍｐｌリガンド存在下で培
養することにより誘導した巨核球を用いて、巨核球から
の血小板放出を反映すると考えられる胞体突起形成活性
を測定した。 〔ＩＭＤＭ液（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｅｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｄａｌｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｅｄｉｕ
ｍ）〕；粉末ＩＭＤＭ（１リットル用）（米国、ギブコ
社製）に重曹３．０２４ｇを加え、ｐＨを７．１に調整
した後、１リットルにメスアップし、更に５０ＩＵ／ｍ
ｌペニシリン及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン
（いずれも米国、フローラボラトリーズ社製）を加えて
調製したものである。 〔巨核球誘導培地〕；１０μｇ／ｍｌのウシ由来インシ
ュリン（ギブコ社製）、５μｇ／ｍｌのウシ由来ホロタ
イプトランスフェリン（ギブコ社製）、０．３ｎｇ／ｍ
ｌのｍｐｌリガンド（英国、ペプロテック社製）を含む
ＩＭＤＭ液を用いた。 〔巨核球胞体突起形成培地〕；１０μｇ／ｍｌのウシ由
来インシュリン（ギブコ社製）、５μｇ／ｍｌのウシ由
来ホロタイプトランスフェリン（ギブコ社製）を含むＩ
ＭＤＭ液を用いた。 〔巨核球分散液の調製〕；６〜１０週齢のｄｄＹマウス
（雄）８匹の大腿骨を採取し、その両端を切断し、１ｍ
Ｍエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ）を
含むカルシウム、マグネシウム不含ハンクス液（米国、
シグマ社製；ｐＨ７．４）２０ｍｌをいれたプラスチッ
ク注射器（２２Ｇ針）を用いて、１００ｍｍプラスチッ
クディッシュ中に、骨髄を押し出した。ピペッティング
により細胞を分散した後、１５ｍｌのチューブに移し、
１００ｇで２０分間遠心した。沈殿性の細胞を１０ｍｌ
のＩＭＤＭに分散し、３５０ｇで５分間遠心し、再び、
沈殿性の細胞を１０ｍｌのＩＭＤＭに分散し、３５０
ｇ、５分間遠心した。沈殿性の細胞を５×１０6 ／ｍｌ
になるように巨核球誘導培地に分散して、約４０ｍｌの
骨髄細胞分散液を取得した。
養することにより誘導した巨核球を用いて、巨核球から
の血小板放出を反映すると考えられる胞体突起形成活性
を測定した。 〔ＩＭＤＭ液（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｅｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｄａｌｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｅｄｉｕ
ｍ）〕；粉末ＩＭＤＭ（１リットル用）（米国、ギブコ
社製）に重曹３．０２４ｇを加え、ｐＨを７．１に調整
した後、１リットルにメスアップし、更に５０ＩＵ／ｍ
ｌペニシリン及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン
（いずれも米国、フローラボラトリーズ社製）を加えて
調製したものである。 〔巨核球誘導培地〕；１０μｇ／ｍｌのウシ由来インシ
ュリン（ギブコ社製）、５μｇ／ｍｌのウシ由来ホロタ
イプトランスフェリン（ギブコ社製）、０．３ｎｇ／ｍ
ｌのｍｐｌリガンド（英国、ペプロテック社製）を含む
ＩＭＤＭ液を用いた。 〔巨核球胞体突起形成培地〕；１０μｇ／ｍｌのウシ由
来インシュリン（ギブコ社製）、５μｇ／ｍｌのウシ由
来ホロタイプトランスフェリン（ギブコ社製）を含むＩ
ＭＤＭ液を用いた。 〔巨核球分散液の調製〕；６〜１０週齢のｄｄＹマウス
（雄）８匹の大腿骨を採取し、その両端を切断し、１ｍ
Ｍエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ）を
含むカルシウム、マグネシウム不含ハンクス液（米国、
シグマ社製；ｐＨ７．４）２０ｍｌをいれたプラスチッ
ク注射器（２２Ｇ針）を用いて、１００ｍｍプラスチッ
クディッシュ中に、骨髄を押し出した。ピペッティング
により細胞を分散した後、１５ｍｌのチューブに移し、
１００ｇで２０分間遠心した。沈殿性の細胞を１０ｍｌ
のＩＭＤＭに分散し、３５０ｇで５分間遠心し、再び、
沈殿性の細胞を１０ｍｌのＩＭＤＭに分散し、３５０
ｇ、５分間遠心した。沈殿性の細胞を５×１０6 ／ｍｌ
になるように巨核球誘導培地に分散して、約４０ｍｌの
骨髄細胞分散液を取得した。
【００２０】８個の２５ｃｍ2 培養用フラスコ（米国、
ベクトンディッキンソン社製）に、前記骨髄細胞分散液
５ｍｌずつを分注し、３７℃、５％ＣＯ2 の条件下で２
日間培養し、巨核球を誘導せしめた。培養後、巨核球を
含むこの培養細胞を、数回のピペッティングにより分散
した後、４本の１５ｍｌチューブに１０ｍｌずつ分注
し、１時間静置した。４本のチューブのそれぞれから、
上部の８．５ｍｌを吸い出して除去し、沈降性の細胞を
含む下部の１．５ｍｌを集め、数回のピペッティングに
より、細胞を分散し、４本のチューブをあわせて６ｍｌ
の細胞分散液を取得した。
ベクトンディッキンソン社製）に、前記骨髄細胞分散液
５ｍｌずつを分注し、３７℃、５％ＣＯ2 の条件下で２
日間培養し、巨核球を誘導せしめた。培養後、巨核球を
含むこの培養細胞を、数回のピペッティングにより分散
した後、４本の１５ｍｌチューブに１０ｍｌずつ分注
し、１時間静置した。４本のチューブのそれぞれから、
上部の８．５ｍｌを吸い出して除去し、沈降性の細胞を
含む下部の１．５ｍｌを集め、数回のピペッティングに
より、細胞を分散し、４本のチューブをあわせて６ｍｌ
の細胞分散液を取得した。
【００２１】２本の１５ｍｌチューブに、下から１．５
ｍｌの１６％ＢＳＡを含むカルシウム、マグネシウム不
含ハンクス液（シグマ社製）、続いて、３ｍｌの４％Ｂ
ＳＡを含むカルシウム、マグネシウム不含ハンクス液、
さらに続いて、１．５ｍｌの２％ＢＳＡを含むカルシウ
ム、マグネシウム不含ハンクス液を重層し、さらにその
上に、前記にて調製された細胞分散液３ｍｌを重層し、
１時間静置した。巨核球は、最下部に分画されることか
ら、上部７ｍｌを吸い出して除去し、下部２ｍｌを取得
した。
ｍｌの１６％ＢＳＡを含むカルシウム、マグネシウム不
含ハンクス液（シグマ社製）、続いて、３ｍｌの４％Ｂ
ＳＡを含むカルシウム、マグネシウム不含ハンクス液、
さらに続いて、１．５ｍｌの２％ＢＳＡを含むカルシウ
ム、マグネシウム不含ハンクス液を重層し、さらにその
上に、前記にて調製された細胞分散液３ｍｌを重層し、
１時間静置した。巨核球は、最下部に分画されることか
ら、上部７ｍｌを吸い出して除去し、下部２ｍｌを取得
した。
【００２２】これに８ｍｌのＩＭＤＭを加え、６０ｇで
５分間の遠心を行い、細胞を洗浄した。顕微鏡観察によ
り２０μｍ以上の大きさを持つ細胞を巨核球として、沈
殿中の巨核球数を測定し、３０００巨核球／ｍｌになる
ように胞体突起形成培地に分散し、これを巨核球分散液
とした。 〔胞体突起形成活性の測定〕；培養用９６穴プレート
（日本国、住友ベークライト社製）に、前記巨核球分散
液を１００μｌずつ分注し、被験体１０μｌを添加し
た。また、陰性対照として、被験体無添加試験群を設け
た。
５分間の遠心を行い、細胞を洗浄した。顕微鏡観察によ
り２０μｍ以上の大きさを持つ細胞を巨核球として、沈
殿中の巨核球数を測定し、３０００巨核球／ｍｌになる
ように胞体突起形成培地に分散し、これを巨核球分散液
とした。 〔胞体突起形成活性の測定〕；培養用９６穴プレート
（日本国、住友ベークライト社製）に、前記巨核球分散
液を１００μｌずつ分注し、被験体１０μｌを添加し
た。また、陰性対照として、被験体無添加試験群を設け
た。
【００２３】このプレートを２日間培養し、培養後、プ
レートの各穴の巨核球を顕微鏡下で観察して、胞体突起
形成を起こした巨核球数を測定し、陰性対照の胞体突起
形成を起こした巨核球数と、被験体を添加したときの胞
体突起形成を起こした巨核球数とを比較し、被験体の胞
体突起形成能を測定した。活性の強さは、陰性対照での
胞体突起形成巨核球数を１００％としてその比率で表し
た。
レートの各穴の巨核球を顕微鏡下で観察して、胞体突起
形成を起こした巨核球数を測定し、陰性対照の胞体突起
形成を起こした巨核球数と、被験体を添加したときの胞
体突起形成を起こした巨核球数とを比較し、被験体の胞
体突起形成能を測定した。活性の強さは、陰性対照での
胞体突起形成巨核球数を１００％としてその比率で表し
た。
【００２４】
［実施例１］ 再生不良性貧血患者（ＡＡ）血漿からの
血小板産生因子の精製 血小板数約２万／μｌの再生不良性貧血患者（ＡＡ）か
ら得た血液に１０分の１量の３．８％クエン酸ナトリウ
ム水溶液を加え、１，０００ｇで２０分間遠心した後に
得られた上清を血漿とした。血漿３５ｍｌに１ｍＭのジ
イソプロピルフルオロリン酸を加え、４℃で２時間撹拌
して内在性のセリンプロテアーゼを失活させた後、アン
モニア水でｐＨが酸性にならないように調整しながら５
５％飽和となるように硫安を添加し、４℃で約１時間撹
拌した。５５％飽和硫安溶液を４℃、１０，０００ｇで
３０分間遠心後、その上清にさらに８０％飽和となるよ
うに硫安を添加し、４℃で約１時間撹拌した。８０％飽
和硫安溶液を４℃、１０，０００ｇで３０分間遠心後、
得られた沈殿を１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１
０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し、同緩衝液に対して
透析したものを粗精製品１とした。
血小板産生因子の精製 血小板数約２万／μｌの再生不良性貧血患者（ＡＡ）か
ら得た血液に１０分の１量の３．８％クエン酸ナトリウ
ム水溶液を加え、１，０００ｇで２０分間遠心した後に
得られた上清を血漿とした。血漿３５ｍｌに１ｍＭのジ
イソプロピルフルオロリン酸を加え、４℃で２時間撹拌
して内在性のセリンプロテアーゼを失活させた後、アン
モニア水でｐＨが酸性にならないように調整しながら５
５％飽和となるように硫安を添加し、４℃で約１時間撹
拌した。５５％飽和硫安溶液を４℃、１０，０００ｇで
３０分間遠心後、その上清にさらに８０％飽和となるよ
うに硫安を添加し、４℃で約１時間撹拌した。８０％飽
和硫安溶液を４℃、１０，０００ｇで３０分間遠心後、
得られた沈殿を１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１
０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し、同緩衝液に対して
透析したものを粗精製品１とした。
【００２５】粗精製品１を予め１５０ｍＭの食塩を含む
ｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で十分に平衡
化したＷＧＬセファロース６ＭＢ（ファルマシア社製）
カラム（直径５．０ｃｍ×高さ２．８ｃｍ）にアプライ
した。約２５０ｍｌの同緩衝液で非吸着物を洗浄、除去
した後、２００ｍＭのＮ−アセチルグルコサミンを含む
同緩衝液で吸着物を溶出した。操作はすべて４℃、流速
は３ｍｌ／分、検出は２８０ｎｍの吸収で行った。精製
開始後約１００分から１７０分までの溶出液、約２００
ｍｌを集め、限外濾過中空糸（旭化成工業製）で約１０
ｍｌまで濃縮し、ＰＢＳに対して透析したものを粗精製
品２とした。図１に精製２段目のＷＧＬセファロースク
ロマトグラフィーの結果の一例を示した。
ｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で十分に平衡
化したＷＧＬセファロース６ＭＢ（ファルマシア社製）
カラム（直径５．０ｃｍ×高さ２．８ｃｍ）にアプライ
した。約２５０ｍｌの同緩衝液で非吸着物を洗浄、除去
した後、２００ｍＭのＮ−アセチルグルコサミンを含む
同緩衝液で吸着物を溶出した。操作はすべて４℃、流速
は３ｍｌ／分、検出は２８０ｎｍの吸収で行った。精製
開始後約１００分から１７０分までの溶出液、約２００
ｍｌを集め、限外濾過中空糸（旭化成工業製）で約１０
ｍｌまで濃縮し、ＰＢＳに対して透析したものを粗精製
品２とした。図１に精製２段目のＷＧＬセファロースク
ロマトグラフィーの結果の一例を示した。
【００２６】粗精製品２を予めＰＢＳで十分に平衡化し
たブルーセファロース・ファーストフロー（ファルマシ
ア社製）カラム（直径２．６ｃｍ×高さ２．５ｃｍ）に
アプライし、約２０ｍｌの同緩衝液で非吸着物を洗浄、
除去した後、約３０ｍｌの１．５Ｍ食塩を含む同緩衝液
で吸着物を溶出した。操作はすべて４℃、流速は１．３
ｍｌ／分、検出は２８０ｎｍの吸収で行った。精製開始
後約５分から３５分までの洗浄液、約４０ｍｌを集め、
限外濾過中空糸（旭化成工業製）で約２ｍｌまで濃縮
し、１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭのＨ
ＥＰＥＳ緩衝液に対して透析したものを精製標品とし
た。図２に精製３段目のブルーセファロースカラムクロ
マトグラフィーの結果の一例を示した。
たブルーセファロース・ファーストフロー（ファルマシ
ア社製）カラム（直径２．６ｃｍ×高さ２．５ｃｍ）に
アプライし、約２０ｍｌの同緩衝液で非吸着物を洗浄、
除去した後、約３０ｍｌの１．５Ｍ食塩を含む同緩衝液
で吸着物を溶出した。操作はすべて４℃、流速は１．３
ｍｌ／分、検出は２８０ｎｍの吸収で行った。精製開始
後約５分から３５分までの洗浄液、約４０ｍｌを集め、
限外濾過中空糸（旭化成工業製）で約２ｍｌまで濃縮
し、１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭのＨ
ＥＰＥＳ緩衝液に対して透析したものを精製標品とし
た。図２に精製３段目のブルーセファロースカラムクロ
マトグラフィーの結果の一例を示した。
【００２７】ＡＡの血漿を原料とした各精製工程におけ
る蛋白質の回収率をそれ表１に示した。
る蛋白質の回収率をそれ表１に示した。
【００２８】
【表１】
【００２９】［実施例２］ 特発性血小板減少性紫斑病
患者（ＩＴＰ）血漿からの血小板産生因子の精製 血小板数約２万／μｌの特発性血小板減少性紫斑病患者
（ＩＴＰ）から得た血液に１０分の１量の３．８％クエ
ン酸ナトリウム水溶液を加え、１，０００ｇで２０分間
遠心した後に得られた上清を血漿とした。血漿３５ｍｌ
に１ｍＭのジイソプロピルフルオロリン酸を加え、４℃
で２時間撹拌して内在性のセリンプロテアーゼを失活さ
せた後、アンモニア水でｐＨが酸性にならないように調
整しながら５５％飽和となるように硫安を添加し、４℃
で約１時間撹拌した。５５％飽和硫安溶液を４℃、１
０，０００ｇで３０分間遠心後、その上清にさらに８０
％飽和となるように硫安を添加し、４℃で約１時間撹拌
した。８０％飽和硫安溶液を４℃、１０，０００ｇで３
０分間遠心後、得られた沈殿を１５０ｍＭの食塩を含む
ｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し、同
緩衝液に対して透析したものを粗精製品１とした。
患者（ＩＴＰ）血漿からの血小板産生因子の精製 血小板数約２万／μｌの特発性血小板減少性紫斑病患者
（ＩＴＰ）から得た血液に１０分の１量の３．８％クエ
ン酸ナトリウム水溶液を加え、１，０００ｇで２０分間
遠心した後に得られた上清を血漿とした。血漿３５ｍｌ
に１ｍＭのジイソプロピルフルオロリン酸を加え、４℃
で２時間撹拌して内在性のセリンプロテアーゼを失活さ
せた後、アンモニア水でｐＨが酸性にならないように調
整しながら５５％飽和となるように硫安を添加し、４℃
で約１時間撹拌した。５５％飽和硫安溶液を４℃、１
０，０００ｇで３０分間遠心後、その上清にさらに８０
％飽和となるように硫安を添加し、４℃で約１時間撹拌
した。８０％飽和硫安溶液を４℃、１０，０００ｇで３
０分間遠心後、得られた沈殿を１５０ｍＭの食塩を含む
ｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し、同
緩衝液に対して透析したものを粗精製品１とした。
【００３０】粗精製品１を予め１５０ｍＭの食塩を含む
ｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で十分に平衡
化したＷＧＬセファロース６ＭＢ（ファルマシア社製）
カラム（直径５．０ｃｍ×高さ２．８ｃｍ）にアプライ
した。約２５０ｍｌの同緩衝液で非吸着物を洗浄、除去
した後、２００ｍＭのＮ−アセチルグルコサミンを含む
同緩衝液で吸着物を溶出した。操作はすべて４℃、流速
は３ｍｌ／分、検出は２８０ｎｍの吸収で行った。精製
開始後約１００分から１７０分までの溶出液、約２００
ｍｌを集め、限外濾過中空糸（旭化成工業製）で約１０
ｍｌまで濃縮し、ＰＢＳに対して透析したものを粗精製
品２とした。
ｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で十分に平衡
化したＷＧＬセファロース６ＭＢ（ファルマシア社製）
カラム（直径５．０ｃｍ×高さ２．８ｃｍ）にアプライ
した。約２５０ｍｌの同緩衝液で非吸着物を洗浄、除去
した後、２００ｍＭのＮ−アセチルグルコサミンを含む
同緩衝液で吸着物を溶出した。操作はすべて４℃、流速
は３ｍｌ／分、検出は２８０ｎｍの吸収で行った。精製
開始後約１００分から１７０分までの溶出液、約２００
ｍｌを集め、限外濾過中空糸（旭化成工業製）で約１０
ｍｌまで濃縮し、ＰＢＳに対して透析したものを粗精製
品２とした。
【００３１】粗精製品２を予めＰＢＳで十分に平衡化し
たブルーセファロース・ファーストフロー（ファルマシ
ア社）カラム（直径２．６ｃｍ×高さ２．５ｃｍ）にア
プライし、約２０ｍｌの同緩衝液で非吸着物を洗浄、除
去した後、約３０ｍｌの１．５Ｍ食塩を含む同緩衝液で
吸着物を溶出した。操作はすべて４℃、流速は１．３ｍ
ｌ／分、検出は２８０ｎｍの吸収で行った。精製開始後
約５分から３５分までの洗浄液、約４０ｍｌを集め、限
外濾過中空糸（旭化成工業製）で約２ｍｌまで濃縮し、
１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰ
ＥＳ緩衝液に対して透析したものを精製標品とした。
たブルーセファロース・ファーストフロー（ファルマシ
ア社）カラム（直径２．６ｃｍ×高さ２．５ｃｍ）にア
プライし、約２０ｍｌの同緩衝液で非吸着物を洗浄、除
去した後、約３０ｍｌの１．５Ｍ食塩を含む同緩衝液で
吸着物を溶出した。操作はすべて４℃、流速は１．３ｍ
ｌ／分、検出は２８０ｎｍの吸収で行った。精製開始後
約５分から３５分までの洗浄液、約４０ｍｌを集め、限
外濾過中空糸（旭化成工業製）で約２ｍｌまで濃縮し、
１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰ
ＥＳ緩衝液に対して透析したものを精製標品とした。
【００３２】ＩＴＰの血漿を原料とした各精製工程にお
ける蛋白質の回収率を表２に示した。
ける蛋白質の回収率を表２に示した。
【００３３】
【表２】
【００３４】［実施例３］ 血小板減少症ウサギ血漿か
らの血小板産生因子の精製 ニュージーランドホワイトウサギからクエン酸ナトリウ
ムを用いて全採血後、１００ｇで２０分間遠心し、上清
の血小板を集めた。これに１．５ｍＭのエチレンジアミ
ン４酢酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ）を含むＰＢＳを当量
加え、４００ｇで１５分間遠心し、沈殿の血小板を集め
た。血小板を同緩衝液で同様にして２回洗浄した後、少
量の同緩衝液に懸濁した。血小板懸濁液にフロイント完
全アジュバンドを適量加え乳化して、ヤギの皮下または
皮内の数か所に２週間おきに接種した。一回の接種には
ウサギ２羽分の血小板を用いた。７回目の接種から２週
間後に全採血し、抗ウサギ血小板ヤギ抗血清約１０００
ｍｌを取得した。
らの血小板産生因子の精製 ニュージーランドホワイトウサギからクエン酸ナトリウ
ムを用いて全採血後、１００ｇで２０分間遠心し、上清
の血小板を集めた。これに１．５ｍＭのエチレンジアミ
ン４酢酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ）を含むＰＢＳを当量
加え、４００ｇで１５分間遠心し、沈殿の血小板を集め
た。血小板を同緩衝液で同様にして２回洗浄した後、少
量の同緩衝液に懸濁した。血小板懸濁液にフロイント完
全アジュバンドを適量加え乳化して、ヤギの皮下または
皮内の数か所に２週間おきに接種した。一回の接種には
ウサギ２羽分の血小板を用いた。７回目の接種から２週
間後に全採血し、抗ウサギ血小板ヤギ抗血清約１０００
ｍｌを取得した。
【００３５】２．５〜３．０ｋｇのニュージーランドホ
ワイトウサギに、上記により得られた抗ウサギ血小板ヤ
ギ抗血清を３ｍｌ静注することにより血小板減少症を引
き起こした。ｍｐｌリガンドは抗体投与２４時間後にそ
の血中濃度が最大になるので（Ｆ．Ｗｅｎｄｌｉｎｇ，
Ｎａｔｕｒｅ，３６９，５７１，１９９４）、ｍｐｌリ
ガンドの混入を最小限にし、かつ該因子を効率良く精製
するために、抗血小板抗体を投与して約６時間後の血漿
を精製原料として用いた。抗血清投与約６時間後に心臓
採血して得た血液に、直ちに、１０分の１量の７７ｍＭ
のＥＤＴＡ水溶液（ただし１ＮのＮａＯＨ水溶液でｐＨ
７．４に調整）を加え、１，０００ｇで２０分間遠心し
て得た上清を血漿とした。血漿７６ｍｌに１ｍＭのジイ
ソプロピルフルオロリン酸を加え、４℃で２時間撹拌し
て内在性のセリンプロテアーゼを失活させた後、アンモ
ニア水でｐＨが酸性にならないように調整しながら５５
％飽和となるように硫安を添加し、４℃で約１時間撹拌
した。５５％飽和硫安溶液を４℃、１０，０００ｇで３
０分間遠心後、その上清にさらに８０％飽和となるよう
に硫安を添加し、４℃で約１時間撹拌した。８０％飽和
硫安溶液を４℃、１０，０００ｇで３０分間遠心後、得
られた沈殿を１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０
ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し、同緩衝液に対して透
析したものを粗精製品１とした。
ワイトウサギに、上記により得られた抗ウサギ血小板ヤ
ギ抗血清を３ｍｌ静注することにより血小板減少症を引
き起こした。ｍｐｌリガンドは抗体投与２４時間後にそ
の血中濃度が最大になるので（Ｆ．Ｗｅｎｄｌｉｎｇ，
Ｎａｔｕｒｅ，３６９，５７１，１９９４）、ｍｐｌリ
ガンドの混入を最小限にし、かつ該因子を効率良く精製
するために、抗血小板抗体を投与して約６時間後の血漿
を精製原料として用いた。抗血清投与約６時間後に心臓
採血して得た血液に、直ちに、１０分の１量の７７ｍＭ
のＥＤＴＡ水溶液（ただし１ＮのＮａＯＨ水溶液でｐＨ
７．４に調整）を加え、１，０００ｇで２０分間遠心し
て得た上清を血漿とした。血漿７６ｍｌに１ｍＭのジイ
ソプロピルフルオロリン酸を加え、４℃で２時間撹拌し
て内在性のセリンプロテアーゼを失活させた後、アンモ
ニア水でｐＨが酸性にならないように調整しながら５５
％飽和となるように硫安を添加し、４℃で約１時間撹拌
した。５５％飽和硫安溶液を４℃、１０，０００ｇで３
０分間遠心後、その上清にさらに８０％飽和となるよう
に硫安を添加し、４℃で約１時間撹拌した。８０％飽和
硫安溶液を４℃、１０，０００ｇで３０分間遠心後、得
られた沈殿を１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０
ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し、同緩衝液に対して透
析したものを粗精製品１とした。
【００３６】粗精製品１を予め１５０ｍＭの食塩を含む
ｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で十分に平衡
化したＷＧＬセファロース６ＭＢ（ファルマシア社製）
カラム（直径５．０ｃｍ×高さ５．５ｃｍ）にアプライ
した。約４５０ｍｌの同緩衝液で非吸着物を洗浄、除去
した後、２００ｍＭのＮ-アセチルグルコサミンを含む
同緩衝液で吸着物を溶出した。操作はすべて４℃、流速
は３ｍｌ／分、検出は２８０ｎｍの吸収で行った。精製
開始後約１８０分から３１０分までの溶出液、約４００
ｍｌを集め、限外濾過中空糸（旭化成工業製）で約１５
ｍｌまで濃縮し、ＰＢＳに対して透析したものを粗精製
品２とした。
ｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で十分に平衡
化したＷＧＬセファロース６ＭＢ（ファルマシア社製）
カラム（直径５．０ｃｍ×高さ５．５ｃｍ）にアプライ
した。約４５０ｍｌの同緩衝液で非吸着物を洗浄、除去
した後、２００ｍＭのＮ-アセチルグルコサミンを含む
同緩衝液で吸着物を溶出した。操作はすべて４℃、流速
は３ｍｌ／分、検出は２８０ｎｍの吸収で行った。精製
開始後約１８０分から３１０分までの溶出液、約４００
ｍｌを集め、限外濾過中空糸（旭化成工業製）で約１５
ｍｌまで濃縮し、ＰＢＳに対して透析したものを粗精製
品２とした。
【００３７】粗精製品２を予めＰＢＳで十分に平衡化し
たブルーセファロース・ファーストフロー（ファルマシ
ア社製）カラム（直径２．６ｃｍ×高さ２．８ｃｍ）に
アプライし、約２５ｍｌの同緩衝液で非吸着物を洗浄、
除去した後、約３５ｍｌの１．５Ｍ食塩を含む同緩衝液
で吸着物を溶出した。操作はすべて４℃、流速は１．３
ｍｌ／分、検出は２８０ｎｍの吸収で行った。精製開始
後約５分から４０分までの洗浄液、約４５ｍｌを集め、
限外濾過中空糸（旭化成工業製）で約２ｍｌまで濃縮
し、１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭのＨ
ＥＰＥＳ緩衝液に対して透析したものを精製標品とし
た。
たブルーセファロース・ファーストフロー（ファルマシ
ア社製）カラム（直径２．６ｃｍ×高さ２．８ｃｍ）に
アプライし、約２５ｍｌの同緩衝液で非吸着物を洗浄、
除去した後、約３５ｍｌの１．５Ｍ食塩を含む同緩衝液
で吸着物を溶出した。操作はすべて４℃、流速は１．３
ｍｌ／分、検出は２８０ｎｍの吸収で行った。精製開始
後約５分から４０分までの洗浄液、約４５ｍｌを集め、
限外濾過中空糸（旭化成工業製）で約２ｍｌまで濃縮
し、１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭのＨ
ＥＰＥＳ緩衝液に対して透析したものを精製標品とし
た。
【００３８】ウサギの血漿を原料とした各精製工程にお
ける蛋白質の回収率を表３に示した。
ける蛋白質の回収率を表３に示した。
【００３９】
【表３】
【００４０】［実施例４］ 健常人血漿からの血小板産
生因子の精製 健常人（Ｎ）から得た血液に１０分の１量の３．８％ク
エン酸ナトリウム水溶液を加え、１，０００ｇで２０分
間遠心した後に得られた上清を血漿とした。血漿８６ｍ
ｌに１ｍＭのジイソプロピルフルオロリン酸を加え、４
℃で２時間撹拌して内在性のセリンプロテアーゼを失活
させた後、アンモニア水でｐＨが酸性にならないように
調整しながら５５％飽和となるように硫安を添加し、４
℃で約１時間撹拌した。５５％飽和硫安溶液を４℃、１
０，０００ｇで３０分間遠心後、その上清にさらに８０
％飽和となるように硫安を添加し、４℃で約１時間撹拌
した。８０％飽和硫安溶液を４℃、１０，０００ｇで３
０分間遠心後、得られた沈殿を１５０ｍＭの食塩を含む
ｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し、同
緩衝液に対して透析したものを粗精製品１とした。
生因子の精製 健常人（Ｎ）から得た血液に１０分の１量の３．８％ク
エン酸ナトリウム水溶液を加え、１，０００ｇで２０分
間遠心した後に得られた上清を血漿とした。血漿８６ｍ
ｌに１ｍＭのジイソプロピルフルオロリン酸を加え、４
℃で２時間撹拌して内在性のセリンプロテアーゼを失活
させた後、アンモニア水でｐＨが酸性にならないように
調整しながら５５％飽和となるように硫安を添加し、４
℃で約１時間撹拌した。５５％飽和硫安溶液を４℃、１
０，０００ｇで３０分間遠心後、その上清にさらに８０
％飽和となるように硫安を添加し、４℃で約１時間撹拌
した。８０％飽和硫安溶液を４℃、１０，０００ｇで３
０分間遠心後、得られた沈殿を１５０ｍＭの食塩を含む
ｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し、同
緩衝液に対して透析したものを粗精製品１とした。
【００４１】粗精製品１を予め１５０ｍＭの食塩を含む
ｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で十分に平衡
化したＷＧＬセファロース６ＭＢ（ファルマシア社製）
カラム（直径５．０ｃｍ×高さ５．５ｃｍ）にアプライ
した。約４５０ｍｌの同緩衝液で非吸着物を洗浄、除去
した後、２００ｍＭのＮ-アセチルグルコサミンを含む
同緩衝液で吸着物を溶出した。操作はすべて４℃、流速
は３ｍｌ／分、検出は２８０ｎｍの吸収で行った。精製
開始後約１８０分から３１０分までの溶出液、約４００
ｍｌを集め、限外濾過中空糸（旭化成工業製）で約２８
ｍｌまで濃縮し、ＰＢＳに対して透析したものを粗精製
品２とした。
ｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で十分に平衡
化したＷＧＬセファロース６ＭＢ（ファルマシア社製）
カラム（直径５．０ｃｍ×高さ５．５ｃｍ）にアプライ
した。約４５０ｍｌの同緩衝液で非吸着物を洗浄、除去
した後、２００ｍＭのＮ-アセチルグルコサミンを含む
同緩衝液で吸着物を溶出した。操作はすべて４℃、流速
は３ｍｌ／分、検出は２８０ｎｍの吸収で行った。精製
開始後約１８０分から３１０分までの溶出液、約４００
ｍｌを集め、限外濾過中空糸（旭化成工業製）で約２８
ｍｌまで濃縮し、ＰＢＳに対して透析したものを粗精製
品２とした。
【００４２】粗精製品２を予めＰＢＳで十分に平衡化し
たブルーセファロース・ファーストフロー（ファルマシ
ア社製）カラム（直径２．６ｃｍ×高さ２．８ｃｍ）に
アプライし、約２５ｍｌの同緩衝液で非吸着物を洗浄、
除去した後、約３５ｍｌの１．５Ｍ食塩を含む同緩衝液
で吸着物を溶出した。操作はすべて４℃、流速は１．３
ｍｌ／分、検出は２８０ｎｍの吸収で行った。精製開始
後約５分から５０分までの洗浄液、約６０ｍｌを集め、
限外濾過中空糸（旭化成工業製）で約３．５ｍｌまで濃
縮し、１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
ＨＥＰＥＳ緩衝液に対して透析したものを精製標品とし
た。
たブルーセファロース・ファーストフロー（ファルマシ
ア社製）カラム（直径２．６ｃｍ×高さ２．８ｃｍ）に
アプライし、約２５ｍｌの同緩衝液で非吸着物を洗浄、
除去した後、約３５ｍｌの１．５Ｍ食塩を含む同緩衝液
で吸着物を溶出した。操作はすべて４℃、流速は１．３
ｍｌ／分、検出は２８０ｎｍの吸収で行った。精製開始
後約５分から５０分までの洗浄液、約６０ｍｌを集め、
限外濾過中空糸（旭化成工業製）で約３．５ｍｌまで濃
縮し、１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
ＨＥＰＥＳ緩衝液に対して透析したものを精製標品とし
た。
【００４３】Ｎの血漿を原料とした各精製工程における
蛋白質の回収率を表４に示した。
蛋白質の回収率を表４に示した。
【００４４】
【表４】
【００４５】［実施例５］ 本発明の血小板産生因子の
巨核球胞体突起形成活性 該因子精製標品について、巨核球胞体突起形成活性を参
考例に示した方法で検討した結果を図３に示した。Ａ
Ａ、ＩＴＰ、Ｎ及びウサギの血漿から精製した該因子は
コントロールに比べ濃度依存的に巨核球の胞体突起形成
を促進し、その活性の強さは最大３００％を越えた。一
方巨核球胞体突起形成活性を有する既知因子のヒト組換
え型ＩＬ−６（米国、アップステートバイオテクノロジ
ー社製）およびヒト組換え型ＥＰＯ（独国、ベーリンガ
ーマンハイム社製）は最大でもその活性は２００％以下
であり、該因子よりも弱かった。ヒト組換え型ｍｐｌリ
ガンドには、巨核球胞体突起形成活性は認められなかっ
た。
巨核球胞体突起形成活性 該因子精製標品について、巨核球胞体突起形成活性を参
考例に示した方法で検討した結果を図３に示した。Ａ
Ａ、ＩＴＰ、Ｎ及びウサギの血漿から精製した該因子は
コントロールに比べ濃度依存的に巨核球の胞体突起形成
を促進し、その活性の強さは最大３００％を越えた。一
方巨核球胞体突起形成活性を有する既知因子のヒト組換
え型ＩＬ−６（米国、アップステートバイオテクノロジ
ー社製）およびヒト組換え型ＥＰＯ（独国、ベーリンガ
ーマンハイム社製）は最大でもその活性は２００％以下
であり、該因子よりも弱かった。ヒト組換え型ｍｐｌリ
ガンドには、巨核球胞体突起形成活性は認められなかっ
た。
【００４６】本発明の因子は、コントロールに比べた巨
核球胞体突起形成活性が少なくとも２００％以上、好ま
しくは３００％以上の数値となりえる物質であると判断
される。以上纏めると、本発明の因子は、明らかに巨核
球胞体突起形成活性を有することが確認された。また、
１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰ
ＥＳ緩衝液条件下で小麦胚芽レクチンを接触せしめ、該
小麦胚芽レクチンに吸着する画分を採取し、さらに該画
分に、ｐＨ７．４のＰＢＳ条件下でブルー色素を接触せ
しめ、該ブルー色素に吸着しない画分を採取することに
より取得された精製標品に、巨核球胞体突起形成活性が
確認できたことから、（ｃ）１５０ｍＭの食塩を含むｐ
Ｈ７．４の１０ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピ
ペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）
緩衝液条件下で小麦胚芽レクチンに吸着する性質と、
（ｄ）ｐＨ７．４のＰＢＳ条件下でブルー色素（１−ａ
ｍｉｎｏ−４−［［４−［［４−ｃｈｌｏｒｏ−６−
［（２−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］−１，
３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−ｙｌ］ａｍｉｎｏ］−３
−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］−９，１０−
ｄｉｈｙｄｒｏ−９，１０−ｄｉｏｘｏ−２−ａｎｔ
ｈｒａｃｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）に吸着し
ない性質が確認された。 ［実施例６］ 本発明の血小板産生因子の他の物質との
免疫学的な区別 実施例１、２、４のそれぞれの精製標品について、ヒト
ＩＬ−６ ＥＬＩＳＡシステム（英国、アマシャム社
製）を用いてＩＬ−６抗原量を測定した。すなわち、キ
ットとして添付された抗ヒトＩＬ−６抗体がコートされ
た９６穴プレートに、実施例１、２、４のそれぞれの精
製標品と、ビオチン標識した抗ヒトＩＬ−６抗体を添加
し、洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識スト
レプトアビジンを添加した。各穴を洗浄後、テトラメチ
ルベンシジンを添加し、発色させた。硫酸添加により酵
素反応を止め、４５０ｎｍの吸光度を測定した。既知量
のＩＬ−６標準品による吸光度と比較することにより、
実施例１、２、４のそれぞれの精製標品中のＩＬ−６量
を測定した。
核球胞体突起形成活性が少なくとも２００％以上、好ま
しくは３００％以上の数値となりえる物質であると判断
される。以上纏めると、本発明の因子は、明らかに巨核
球胞体突起形成活性を有することが確認された。また、
１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰ
ＥＳ緩衝液条件下で小麦胚芽レクチンを接触せしめ、該
小麦胚芽レクチンに吸着する画分を採取し、さらに該画
分に、ｐＨ７．４のＰＢＳ条件下でブルー色素を接触せ
しめ、該ブルー色素に吸着しない画分を採取することに
より取得された精製標品に、巨核球胞体突起形成活性が
確認できたことから、（ｃ）１５０ｍＭの食塩を含むｐ
Ｈ７．４の１０ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピ
ペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）
緩衝液条件下で小麦胚芽レクチンに吸着する性質と、
（ｄ）ｐＨ７．４のＰＢＳ条件下でブルー色素（１−ａ
ｍｉｎｏ−４−［［４−［［４−ｃｈｌｏｒｏ−６−
［（２−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］−１，
３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−ｙｌ］ａｍｉｎｏ］−３
−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］−９，１０−
ｄｉｈｙｄｒｏ−９，１０−ｄｉｏｘｏ−２−ａｎｔ
ｈｒａｃｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）に吸着し
ない性質が確認された。 ［実施例６］ 本発明の血小板産生因子の他の物質との
免疫学的な区別 実施例１、２、４のそれぞれの精製標品について、ヒト
ＩＬ−６ ＥＬＩＳＡシステム（英国、アマシャム社
製）を用いてＩＬ−６抗原量を測定した。すなわち、キ
ットとして添付された抗ヒトＩＬ−６抗体がコートされ
た９６穴プレートに、実施例１、２、４のそれぞれの精
製標品と、ビオチン標識した抗ヒトＩＬ−６抗体を添加
し、洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識スト
レプトアビジンを添加した。各穴を洗浄後、テトラメチ
ルベンシジンを添加し、発色させた。硫酸添加により酵
素反応を止め、４５０ｎｍの吸光度を測定した。既知量
のＩＬ−６標準品による吸光度と比較することにより、
実施例１、２、４のそれぞれの精製標品中のＩＬ−６量
を測定した。
【００４７】その結果ヒト血漿から調製した実施例１、
２、４のそれぞれの精製標品中のＩＬ−６混入量は１ｐ
ｇ／ｍｌ以下であり、ＩＬ−６の混入がないか、または
あっても極めて微量であることが確認された。さらに別
の方法により以下の確認を行った。即ち、該因子精製標
品の巨核球胞体突起形成活性がＩＬ−６及びＥＰＯが混
入していることによる活性ではないこと、およびＩＬ−
６及びＥＰＯのそれぞれの活性中和抗体によっても活性
が中和されない性質を、本発明の因子が有することを確
かめるために、抗ヒトＩＬ−６抗体及び抗ヒトＥＰＯ抗
体を用い、該因子精製標品の活性中和実験を行なった。
なお抗ヒトＩＬ−６抗体及び抗ヒトＥＰＯ抗体は、米国
のジェンザイム社製のウサギ抗血清を、カラムに充填し
て調製したプロセップＡ（英国、バイオプロセッシング
社製）カラムにより精製したものを用いた。すなわち１
ｍｌの抗血清（米国ジェンザイム社製）に、ＰＢＳを９
ｍｌ添加して、ＰＢＳで平衡化した１ｍｌのプロセップ
Ａカラムにアプライした。５ｍｌの同緩衝液でカラムを
洗浄した後に５ｍｌのｐＨ３．０の０．１Ｍグリシンー
塩酸緩衝液で吸着している抗体を溶出した。溶出液を直
ちに中和した後、１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の
１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に透析した。ポリスルホン
中空糸（旭化成社製）で約１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した
ものを以下の活性中和実験に用いた。０．３％のＡＡ、
ＩＴＰ及びＮの精製標品に精製抗体を添加し、４℃で３
０分間反応させた後、その残存活性を参考例に示した方
法で測定した。ＡＡの精製標品の抗体中和後の残存活性
を図４に、ＩＴＰの精製標品の抗体中和後の残存活性を
図５に、Ｎの精製標品の抗体中和後の残存活性を図６に
示した。添加する抗体の量を増加させても、すなわち１
〜１００ｎｇ／ｍｌまでのＩＬ−６と０．０５〜５Ｕ／
ｍｌまでのＥＰＯを完全に中和する量の抗体を添加して
も巨核球胞体突起形成活性の低下傾向は全く認められな
いことから、該因子は免疫学的にＩＬ−６及びＥＰＯと
区別できることが確認された。
２、４のそれぞれの精製標品中のＩＬ−６混入量は１ｐ
ｇ／ｍｌ以下であり、ＩＬ−６の混入がないか、または
あっても極めて微量であることが確認された。さらに別
の方法により以下の確認を行った。即ち、該因子精製標
品の巨核球胞体突起形成活性がＩＬ−６及びＥＰＯが混
入していることによる活性ではないこと、およびＩＬ−
６及びＥＰＯのそれぞれの活性中和抗体によっても活性
が中和されない性質を、本発明の因子が有することを確
かめるために、抗ヒトＩＬ−６抗体及び抗ヒトＥＰＯ抗
体を用い、該因子精製標品の活性中和実験を行なった。
なお抗ヒトＩＬ−６抗体及び抗ヒトＥＰＯ抗体は、米国
のジェンザイム社製のウサギ抗血清を、カラムに充填し
て調製したプロセップＡ（英国、バイオプロセッシング
社製）カラムにより精製したものを用いた。すなわち１
ｍｌの抗血清（米国ジェンザイム社製）に、ＰＢＳを９
ｍｌ添加して、ＰＢＳで平衡化した１ｍｌのプロセップ
Ａカラムにアプライした。５ｍｌの同緩衝液でカラムを
洗浄した後に５ｍｌのｐＨ３．０の０．１Ｍグリシンー
塩酸緩衝液で吸着している抗体を溶出した。溶出液を直
ちに中和した後、１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の
１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に透析した。ポリスルホン
中空糸（旭化成社製）で約１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した
ものを以下の活性中和実験に用いた。０．３％のＡＡ、
ＩＴＰ及びＮの精製標品に精製抗体を添加し、４℃で３
０分間反応させた後、その残存活性を参考例に示した方
法で測定した。ＡＡの精製標品の抗体中和後の残存活性
を図４に、ＩＴＰの精製標品の抗体中和後の残存活性を
図５に、Ｎの精製標品の抗体中和後の残存活性を図６に
示した。添加する抗体の量を増加させても、すなわち１
〜１００ｎｇ／ｍｌまでのＩＬ−６と０．０５〜５Ｕ／
ｍｌまでのＥＰＯを完全に中和する量の抗体を添加して
も巨核球胞体突起形成活性の低下傾向は全く認められな
いことから、該因子は免疫学的にＩＬ−６及びＥＰＯと
区別できることが確認された。
【００４８】即ち、本発明の因子は、インターロイキン
−６（ＩＬ−６）及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）のそ
れぞれの活性中和抗体によっても活性が中和されない性
質が確認された。
−６（ＩＬ−６）及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）のそ
れぞれの活性中和抗体によっても活性が中和されない性
質が確認された。
【図１】 硫安塩析により得られた血小板産生因子粗
製製品１のＷＧＬセファロースカラムクロマトグラムで
ある。
製製品１のＷＧＬセファロースカラムクロマトグラムで
ある。
【図２】 ＷＧＬセファロースカラムクロマトグラフ
ィーにより得られた血小板産生因子粗製製品２のブルー
セファロースカラムクロマトグラムである。
ィーにより得られた血小板産生因子粗製製品２のブルー
セファロースカラムクロマトグラムである。
【図３】 各種血漿から取得した該因子精製標品の巨
核球胞体突起形成活性を比較したグラフである。
核球胞体突起形成活性を比較したグラフである。
【図４】 ＡＡ血漿から取得した該因子精製標品の抗
体中和後の残存巨核球胞体突起形成活性を示したグラフ
である。
体中和後の残存巨核球胞体突起形成活性を示したグラフ
である。
【図５】 ＩＴＰ血漿から取得した該因子精製標品の
抗体中和後の残存巨核球胞体突起形成活性を示したグラ
フである。
抗体中和後の残存巨核球胞体突起形成活性を示したグラ
フである。
【図６】 Ｎ血漿から取得した該因子精製標品の抗体
中和後の残存巨核球胞体突起形成活性を示したグラフで
ある。
中和後の残存巨核球胞体突起形成活性を示したグラフで
ある。
Claims (8)
- 【請求項１】 下記の性質を有することを特徴とする血
小板産生因子。 （ａ）巨核球胞体突起形成活性を有する。 （ｂ）インターロイキン−６及びエリスロポエチンの活
性中和抗体によっても活性が中和されない。 （ｃ）１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−
エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液条件下で小麦胚
芽レクチンに吸着する。 （ｄ）１３６ｍＭの食塩と２．７ｍＭの塩化カリウムを
含むｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ）条件
下でブルー色素（１−ａｍｉｎｏ−４−［［４−［［４
−ｃｈｌｏｒｏ−６−［（２−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙ
ｌ）ａｍｉｎｏ］−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−
ｙｌ］ａｍｉｎｏ］−３−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ］ａ
ｍｉｎｏ］−９，１０−ｄｉｈｙｄｒｏ−９，１０−ｄ
ｉｏｘｏ−２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ
ａｃｉｄ）に吸着しない。 - 【請求項２】 哺乳動物の血液を原料とし、５５％から
８０％の飽和硫酸アンモニウムで塩析される画分を採取
し、該画分に、１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１
０ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−
Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液条件
下で小麦胚芽レクチンを接触せしめ、該小麦胚芽レクチ
ンに吸着する画分を採取し、さらに該画分に、１３６ｍ
Ｍの食塩と２．７ｍＭの塩化カリウムを含むｐＨ７．４
の１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ）条件下でブルー色素
（１−ａｍｉｎｏ−４−［［４−［［４−ｃｈｌｏｒｏ
−６−［（２−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］
−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−ｙｌ］ａｍｉｎ
ｏ］−３−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］−
９，１０−ｄｉｈｙｄｒｏ−９，１０−ｄｉｏｘｏ−２
−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）
を接触せしめ、該ブルー色素に吸着しない画分を採取す
ることにより取得されえる下記の性質を有することを特
徴とする血小板産生因子。 （ａ）巨核球胞体突起形成活性を有する。 （ｂ）インターロイキン−６及びエリスロポエチンの活
性中和抗体によっても活性が中和されない。 （ｃ）１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−
エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液条件下で小麦胚
芽レクチンに吸着する。 （ｄ）１３６ｍＭの食塩と２．７ｍＭの塩化カリウムを
含むｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ）条件
下でブルー色素（１−ａｍｉｎｏ−４−［［４−［［４
−ｃｈｌｏｒｏ−６−［（２−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙ
ｌ）ａｍｉｎｏ］−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−
ｙｌ］ａｍｉｎｏ］−３−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ］ａ
ｍｉｎｏ］−９，１０−ｄｉｈｙｄｒｏ−９，１０−ｄ
ｉｏｘｏ−２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ
ａｃｉｄ）に吸着しない。 - 【請求項３】 血小板産生因子が、ヒト由来である請求
項１又は２のいずれかに記載の血小板産生因子。 - 【請求項４】 有効量の請求項１〜３のいずれかに記載
の血小板産生因子、及び薬学上許容される担体を含有す
ることを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項５】 医薬組成物が、血小板産生剤である請求
項４に記載の医薬組成物。 - 【請求項６】 小麦胚芽レクチンまたはブルー色素を用
いることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の
血小板産生因子の製造方法。 - 【請求項７】 小麦胚芽レクチンへの吸着画分を採取す
る工程及びブルー色素への非吸着画分を採取する工程を
含むことを特徴とする請求項６に記載の製造方法。 - 【請求項８】 哺乳動物の血液を原料とし、５５％から
８０％の飽和硫酸アンモニウムで塩析される画分を採取
し、該画分に、１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１
０ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−
Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液条件
下で小麦胚芽レクチンを接触せしめ、該小麦胚芽レクチ
ンに吸着する画分を採取し、さらに該画分に、１３６ｍ
Ｍの食塩と２．７ｍＭの塩化カリウムを含むｐＨ７．４
の１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ）条件下でブルー色素
（１−ａｍｉｎｏ−４−［［４−［［４−ｃｈｌｏｒｏ
−６−［（２−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］
−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−ｙｌ］ａｍｉｎ
ｏ］−３−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］−
９，１０−ｄｉｈｙｄｒｏ−９，１０−ｄｉｏｘｏ−２
−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）
を接触せしめ、該ブルー色素に吸着しない画分を採取す
ることを特徴とする下記の性質を有する血小板産生因子
の製造方法。 （ａ）巨核球胞体突起形成活性を有する。 （ｂ）インターロイキン−６及びエリスロポエチンの活
性中和抗体によっても活性が中和さない。 （ｃ）１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−
エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液条件下で小麦胚
芽レクチンに吸着する。 （ｄ）１３６ｍＭの食塩と２．７ｍＭの塩化カリウムを
含むｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ）条件
下でブルー色素（１−ａｍｉｎｏ−４−［［４−［［４
−ｃｈｌｏｒｏ−６−［（２−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙ
ｌ）ａｍｉｎｏ］−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−
ｙｌ］ａｍｉｎｏ］−３−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ］ａ
ｍｉｎｏ］−９，１０−ｄｉｈｙｄｒｏ−９，１０−ｄ
ｉｏｘｏ−２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ
ａｃｉｄ）に吸着しない。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8139842A JPH09323937A (ja) | 1996-06-03 | 1996-06-03 | 新規な血小板産生因子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8139842A JPH09323937A (ja) | 1996-06-03 | 1996-06-03 | 新規な血小板産生因子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09323937A true JPH09323937A (ja) | 1997-12-16 |
Family
ID=15254793
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8139842A Withdrawn JPH09323937A (ja) | 1996-06-03 | 1996-06-03 | 新規な血小板産生因子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09323937A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002104978A (ja) * | 2000-09-25 | 2002-04-10 | Fujirebio Inc | パルボウイルスの除去方法及び精製方法 |
-
1996
- 1996-06-03 JP JP8139842A patent/JPH09323937A/ja not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002104978A (ja) * | 2000-09-25 | 2002-04-10 | Fujirebio Inc | パルボウイルスの除去方法及び精製方法 |
| JP4706093B2 (ja) * | 2000-09-25 | 2011-06-22 | 富士レビオ株式会社 | パルボウイルスの除去方法及び精製方法 |
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