JPH09271397A

JPH09271397A - 動物細胞数を迅速に測定する方法

Info

Publication number: JPH09271397A
Application number: JP8102068A
Authority: JP
Inventors: Mikio Sato; 幹夫佐藤; Asami Ito; 朝美伊藤
Original assignee: Idemitsu Kosan Co Ltd
Current assignee: Idemitsu Kosan Co Ltd
Priority date: 1996-04-02
Filing date: 1996-04-02
Publication date: 1997-10-21

Abstract

(57)【要約】【課題】染色用色素の退色や不充分な染色といった問
題点を解消し、使用する希釈染色液の調製後の経過時間
に関係なく、しかも高度な技術や専門的な知識を必要と
することなく、１段階の濾過操作で試料中の動物細胞数
を迅速、かつ、簡便に測定しうる方法を提供することを
目的とする。【解決手段】試料中の動物細胞数を測定する方法にお
いて、動物細胞をｐＨが２．５〜４．５であるメチルグ
リーンの希薄染色液で染色し、吸引濾過又は加圧濾過に
より、疎水性フィルターに染色された動物細胞を捕集し
て、動物細胞の着色度から試料中の動物細胞数を測定す
ることを特徴とする動物細胞数の迅速測定方法を提供す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、使用する希釈染色
液の調製後の経過時間に関係なく、長期間にわたり充分
な染色を行なうことができ、しかも高度な技術や専門的
な知識を必要とすることなく、１段階の濾過操作で試料
中の動物細胞数を迅速、かつ、簡便に測定しうる方法に
関する。本発明は、乳房炎診断分野、畜産分野、ハイブ
リドーマ培養関連分野（モノクローナル抗体製造関連分
野）をはじめ、広汎な分野において有効に利用すること
ができる。

【０００２】

【従来の技術】従来より、試料中の動物細胞を測定する
キット（ＰＬテスター）が市販されている。これは、ｐ
Ｈと動物細胞の凝集から判定する方法であるが、精度が
悪いという欠点がある。

【０００３】また、試料中の動物細胞を測定する機器
（ホソマチック＝蛍光光学法によるもの）が市販されて
いるが、機器が高価であり、しかも現場での使用が不可
能であるという問題がある。

【０００４】本出願人は先に、このような従来の欠点を
解消し、特別な設備や専門的な知識を必要とせず、しか
も迅速（３０秒以内に）、かつ、簡便に、試料中の動物
細胞数を測定する方法及びその測定キットを提供してい
る（特開平６−２５３８９３号公報）。この方法は、試
料中の動物細胞数を測定するにあたり、動物細胞を吸引
ろ過により疎水性フィルターに捕集して染色し、又は動
物細胞を染色したのち吸引ろ過により疎水性フィルター
に捕集し、次いで過剰の色素を洗浄により除去し、動物
細胞の着色度から試料中の動物細胞数を測定することを
特徴とするものである。

【０００５】この方法によれば、高度な技術や専門的な
知識を必要とすることなく、試料中の動物細胞数を迅
速、かつ、簡便に測定することが可能となった。しかし
ながら、この方法では、通常濃度の染色液を用いていた
ため、疎水性フィルターに捕集した後、過剰の色素を洗
浄により除去しなければならず、このため２段階の操作
を必要とするものであり、実際使用してみると、操作が
煩雑であるという問題があった。

【０００６】そこで本出願人は、上記の操作をさらに簡
便にするために鋭意検討した結果、動物細胞の染色に際
し、希薄染色液を用いた動物細胞数の測定方法及びその
測定キットを提供している（特願平６−３３２１９９
号）。

【０００７】この方法によれば、充分な染色を可能にし
つつ、濾過後の洗浄工程を省くことが可能となった。し
かしながら、この方法では、使用する染色用色素や希薄
染色液の状態によって、染色用色素が退色したり、充分
な染色がされなかったりして、測定結果にズレが生じる
おそれがあるため、一定時間内に処理し、測定する必要
があった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来の
問題点、すなわち染色用色素の退色や不充分な染色とい
った問題点を解消し、使用する希釈染色液の調製後の経
過時間に関係なく、長期間にわたり（少なくとも３ヶ月
程度）充分な染色を行なうことができ、しかも高度な技
術や専門的な知識を必要とすることなく、１段階の濾過
操作で試料中の動物細胞数を迅速、かつ、簡便に測定し
うる方法を提供することを目的とするものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】すなわち、請求項１記載
の本発明は、試料中の動物細胞数を測定する方法におい
て、動物細胞をｐＨが２．５〜４．５であるメチルグリ
ーンの希薄染色液で染色し、吸引濾過又は加圧濾過によ
り、疎水性フィルターに染色された動物細胞を捕集し
て、動物細胞の着色度から試料中の動物細胞数を測定す
ることを特徴とする動物細胞数を迅速に測定する方法を
提供するものである。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳しく説明する。
本発明の方法は、疎水性フィルター，前記疎水性フィル
ターを装着しうる濾過具，メチルグリーン希薄染色液及
び色対照表よりなる動物細胞数の測定キットを用いるこ
とにより、容易に実施することができる。

【００１１】本発明を適用することができる試料は、そ
の中に動物細胞を含んでいるものであれば特に制限はな
い。具体的には動物の体液（血液，リンパ液など），排
泄物（尿など），生乳等を典型的なものとして挙げるこ
とができる。

【００１２】また、本発明の対象とする動物細胞は特に
制限はない。例えば、尿中の白血球や血液中の白血球，
赤血球等が対象とされる。さらに、細胞融合によって形
成される、培養液中のハイブリドーマなども、本発明の
対象とすることができる。例えば、乳牛の生乳を試料と
する場合、動物細胞としては、その生乳中に存在する乳
牛の体細胞が挙げられる。

【００１３】本発明の方法によれば、例えば、このよう
な乳牛の生乳中における乳牛の体細胞数を、使用する希
釈染色液の調製後の経過時間に関係なく充分な染色を行
なうことができ、しかも迅速、かつ簡便に測定すること
ができ、乳牛の乳房炎の診断に有効に利用することがで
きる。なお、対象とする動物細胞の大きさに合わせて疎
水性フィルターの孔径を選択すればよいので、これらの
動物細胞の大きさは特に限定はないが、本発明は、特に
直径が５〜１５μｍ程度の動物細胞の判定に有効に用い
ることができる。

【００１４】本発明では、まず試料中の動物細胞をｐＨ
が２．５〜４．５であるメチルグリーンの希薄染色液で
染色し、次いで吸引濾過又は加圧濾過により、疎水性フ
ィルターに染色された動物細胞を捕集する。

【００１５】具体的には、疎水性フィルターを備えた濾
過具を装着した濾過容器に、希薄染色液と試料とを入れ
（両者の接触と同時に試料中の動物細胞が染色され
る）、次いで吸引濾過又は加圧濾過により、疎水性フィ
ルターに染色された動物細胞を捕集する。染色法として
は、希薄染色液の中に試料を入れる方法と、試料の中に
希薄染色液を入れる方法があり、どちらでも使用できる
が、本発明における実施例では、希薄染色液の中に試料
を入れる方法により行なった。

【００１６】本発明の方法においては、動物細胞の染色
に使用可能な各種色素、例えば、メチルブルー，メチル
グリーン，フクシンなどの中から、特にメチルグリーン
を選択し、このメチルグリーンの希薄染色液を用いるこ
とが必要である。ここで、他の色素からなるものを用い
たのでは、色素の安定性に欠けたものとなってしまい、
本発明の目的を達成することができない。

【００１７】本発明の方法においては、上記メチルグリ
ーンを水又は各種緩衝液を用いて色素液（染色液）とし
たものが用いられる。染色液のｐＨは、２．５〜４．５
の範囲であることが必要であり、好ましくはｐＨ２．７
〜４．３の範囲である。染色液のｐＨが２．５〜４．５
の範囲外であると、染色及び色素が不安定となり、濾過
操作後の経過時間により正確な測定結果が得られなくな
る。

【００１８】また、染色液には、必要に応じて、エタノ
ール等の防腐剤や界面活性剤等を添加することもでき
る。上記の染色液に防腐剤としてエタノールを添加する
場合には、１〜２０％（ｖ／ｖ）添加すればよく、ま
た、界面活性剤を添加する場合には、界面活性剤を０．
０００１〜１．０％（ｗ／ｖ）の割合で添加すればよ
い。

【００１９】ここで使用する染色液の濃度は、一般に染
色に用いられる濃度よりも希薄であり、通常、０．００
０４〜０．００３％、好ましくは０．０００５〜０．０
０２％とする。ここで染色液の濃度が、０．０００４％
未満であると、色素濃度が薄すぎて、染色が不充分とな
る。一方、染色液の濃度が０．００３％を超えると、過
剰な色素の除去に１回の洗浄操作では不充分となり、数
回の洗浄操作が必要となるため、好ましくない。

【００２０】また、試料液量当たりの色素液量比は１以
上、好ましくは２以上とする。ここで試料液量当たりの
色素液量比が１未満であると、着色が不充分となってし
まい好ましくない。なお、本発明における実施例では、
試料液量当たりの色素液量比は、２にて実施した。

【００２１】上記のようにして、試料中の動物細胞をｐ
Ｈが２．５〜４．５であるメチルグリーンの希薄染色液
で染色した後、吸引濾過又は加圧濾過により、疎水性フ
ィルターに染色された動物細胞を捕集する。具体的に
は、疎水性フィルターを備えた濾過具を装着した濾過容
器に、希薄染色液と試料とを入れて試料中の動物細胞を
染色した後、吸引濾過又は加圧濾過により、疎水性フィ
ルターに染色された動物細胞を捕集する。

【００２２】本発明では動物細胞捕集用のフィルターと
して、疎水性フィルターを用いる。疎水性フィルターと
しては、例えばナイロン系、ポリテトラフルオロエチレ
ン（四フッ化エチレン樹脂）等のフッ素系、ポリプロピ
レンなどのポリオレフィン系などの疎水性フィルターが
挙げられる。これらのフィルターの中でも特にポリテト
ラフルオロエチレンやポリプロピレンを材料とする疎水
性フィルターが、検体中の細菌や蛋白質等を通過させる
ため好ましい。親水性フィルターは、細菌や蛋白質が吸
着されるので好ましくない。但し、親水性の材料、例え
ばニトロセルロース系フィルターを表面処理により疎水
性にすれば、疎水性フィルターとして使用することがで
きる。ここで表面処理としてはコーティングなどであ
り、コーティングに用いる材料として、前記ナイロン
系，フッ素系，ポリオレフィン系の材料などを用いるこ
とができる。

【００２３】この疎水性フィルターの濾過孔径は、対象
とする動物細胞の種類に応じて適宜選定すればよいが、
通常、３〜２０μｍ、好ましくは５〜１５μｍである。
例えば、乳牛の生乳中の体細胞（５〜２０μｍ程度）を
前記疎水性材料で捕集する場合には、５〜１５μｍの濾
過孔径のものを用いることが好ましい。

【００２４】また、疎水性フィルターの吸引又は加圧濾
過面積（着色域の面積）の大きさは、見やすければ特に
制限はない。吸引又は加圧濾過される部分の形は特に問
わないが、見やすさの点で円形が望ましく、その口径
（直径）が２〜７ｍｍ程度の円形のものが好ましい。こ
の疎水性フィルター全体の大きさは特に制限はない。ま
た、この疎水性フィルター全体の形状は見やすさの点で
円形が好ましく、その口径（直径）は任意に選択するこ
とができるが、１３〜２５ｍｍ程度のものが特に好まし
い。

【００２５】この疎水性フィルターの色としては、用い
る色素（メチルグリーン）の色を考慮し、判定容易な色
を定めればよい。着色の程度を容易に判定するために
は、白色の疎水性フィルターが好ましい。また、透明，
半透明の疎水性フィルターも用いることができ、白色用
紙の上に疎水性フィルターを載せて判定すると、判定が
容易となる。

【００２６】通常、上記の如き疎水性フィルターを備え
た濾過具を装着した濾過容器に、希薄染色液と試料とを
入れて試料中の動物細胞を染色する。濾過具としては、
疎水性フィルターを装着しうる構造を持ってれば良く、
特に制限はないが、例えば図１に示す如き形状を有する
ものが用いられる。図１は、本発明の方法に用いられる
濾過具の一態様を示す正面図であり、図２はその平面図
である。

【００２７】図中、符合１が濾過具であり、符号１Ａが
濾過具の上面側であって、符号１Ｂが濾過具の下面側で
ある。符号２は、濾過具の上面側１Ａに設けられている
装着部であり、別途、この装着部に濾過容器（例えば、
加圧濾過しうる注射器や吸引濾過しうる吸引濾過具な
ど）の先端が装着される。このようにして濾過容器（図
では注射器）Ａを装着した状態が図３に示されている。

【００２８】なお、濾過具１は、通常、プラスチックや
ガラスなどで作製されており、その形状には特に制限は
なく、図示したような四角形状（平面からみたときの形
状）をはじめ、円形状のものなど各種形状のものを用い
ることができる。濾過具の上面側１Ａと下面側１Ｂと
は、通常、図示したように略同様の形状を有している。
濾過具の上面側１Ａには、装着部２を通して貫通孔３が
設けられている。

【００２９】また、符号４は、濾過具の下面側１Ｂに設
けられている排出又は吸引部であって、加圧濾過の場合
には排出部となり、吸引濾過の場合には吸引部となる。
濾過具１の下面側にも、排出又は吸引部４を通して貫通
孔５が設けられている。さらに、符号６はシート（シリ
コンシート又はポリエチレンシート）であり、符号７は
疎水性フィルターであって、濾過具１の上面側１Ａと下
面側１Ｂとの間に、シート６に開けられた孔８を塞ぐよ
うに入れられており、ダブルクリップ等で留めて使用さ
れる。この結果、濾過具の上面側１Ａの装着部２にある
貫通孔３から、濾過具の下面側１Ｂの排出又は吸引部４
にある貫通孔５までにわたって、染色液や試料の通り道
が形成される。

【００３０】本発明の方法においては、上記したように
希薄染色液を用いているため、色素が過剰とならず、通
常行なわれる洗浄操作を行なわなくとも、試料中の動物
細胞を効果的に染色し、試料中の動物細胞数を測定する
ことが可能である。吸引濾過又は加圧濾過にあたって
は、希薄染色液と動物細胞試料との混合液を攪拌した後
に行なうと良い。なお、濾過方式は、加圧濾過であって
も良いし、或いは吸引濾過であっても良い。注射器によ
れば、加圧濾過と吸引濾過のいずれを行なうことも可能
である。

【００３１】加圧濾過の場合は、例えば図３に示すよう
に、疎水性フィルターを備えた濾過具１を装着した濾過
容器（例えば、注射器）に、希薄染色液と試料とを入
れ、試料中の動物細胞を染色した後、洗浄操作を行なう
ことなく、加圧濾過する。これにより、疎水性フィルタ
ーに染色された動物細胞が捕集されることになる。

【００３２】一方、吸引濾過の場合、試料と希薄染色液
を入れた容器を、疎水性フィルター７を備えた濾過具１
の上面側１Ａに装着し、濾過具１の下面側１Ｂに、濾過
容器（例えば、注射器）を装着して吸引濾過を行ない、
疎水性フィルターへの染色された動物細胞の捕集を行な
う。

【００３３】ここで注射器により吸引濾過を行なう場
合、注射器として、ピストン逆行阻止機構を有する注射
器を用いれば、操作性においてさらに簡便に行なうこと
ができる。

【００３４】ここでピストン逆行阻止機構を有する注射
器とは、特願平７−２４８３４１号明細書に記載されて
いるように、ピストンを引いて吸引濾過を行なう際、そ
の一端を押さえながら、吸引濾過を行なうことにより、
ピストンの他端を注射器の内径以上に自動的に外側に開
くようにしたピストン逆行阻止機構を有する注射器を指
し、このピストン逆行阻止具が注射器のピストンをロッ
クし、ピストンの逆行を阻止することができる。

【００３５】このようなピストン逆行阻止機構を有する
注射器を用いることにより、注射筒内の減圧状態を維持
するために、ピストンを引いたまま保持しておく必要が
なく、力の弱い女性などでも容易に吸引濾過操作を行う
なうことができる。

【００３６】また、吸引濾過具としては、上記した如き
注射器の他に、動物細胞捕集用の疎水性フィルターを装
着して主に濾過を受け持つ濾過具と、主に吸引を受け持
つ吸引具とからなるものがあり、例えば動物細胞捕集用
の疎水性フィルターを装着しうるロート型濾過器など
と、吸引ポンプとを組み合わせたものを用いることがで
きる。また、吸引ポンプの代わりに真空ラインを使用し
てもよい。

【００３７】このようにして疎水性フィルターに捕集さ
れ、かつ染色された試料中の動物細胞の着色度から、試
料中の動物細胞数を測定する。この動物細胞数の測定
は、（１）色の対照表を用いて、目視により比較するの
が一番簡便であるが、（２）光学密度（Ｏ．Ｄ．）測定
による比色定量法により行なうこともできる。目視判定
の場合には、疎水性フィルターの表側の面のみならず、
裏側の面の着色度より、測定することもできる。これら
の場合には、それぞれ用の色対照表や、吸光度と動物細
胞数の検量線を作成すればよい。

【００３８】上記（１）の目視による動物細胞数の測定
は、具体的には疎水性フィルター上に存在する動物細胞
の着色度、すなわち色の強度を、既知量の動物細胞数の
試料を用いて予め作成しておいた色の対照表と比較する
ことにより行なえばよい。色の対照表は、動物細胞数が
既知の試料を用い、本発明の方法で染色した疎水性フィ
ルターをカラー写真に撮ることにより、又は、この染色
された疎水性フィルターと同程度に濾紙等を着色した
り、或いは同程度の色を紙に印刷することにより、作成
することができる。色の対照表は、動物細胞数によっ
て、色の強度が異なるようにしたものである。例えば、
生乳中の動物細胞を測定する場合には、次のようにして
色の対照表を作成する。

【００３９】すなわち、例えば乳房炎乳牛の生乳をホソ
マチックを用いて測定し、これを正常乳牛の生乳で希釈
して、それぞれ細胞数が、１０万個／ｍｌ程度、３
０万個／ｍｌ程度、５０万個／ｍｌ程度、７５万個
／ｍｌ程度及び１００万個／ｍｌ程度となるように調
製し、例えば５種類の標準試料を調製すればよい。

【００４０】この他、例えばハイブリドーマのフラスコ
培養液（ＧＩＴ培地で３日間培養）の細胞数を血球計数
板法（「組織培養の技術」第２版、第２５頁、朝倉書
店、１９８８年発行）により算出し、遠心分離後、１０
ｍｌの牛乳を加えたときに、それぞれ細胞数が１０万
個／ｍｌ程度、３０万個／ｍｌ程度、５０万個／ｍ
ｌ程度、７５万個／ｍｌ程度及び１００万個／ｍｌ
程度となるように培養液を遠心管に分注し、１５００ｒ
ｐｍ、５分間遠心分離を行ない、次いで上澄を捨てて、
遠心管を振って細胞をほぐした後、それぞれの遠心管に
牛乳１０ｍｌを加えて、例えば３種類の標準試料を調製
してもよい。

【００４１】このように色の対照表を用いる場合には、
これに前記した疎水性フィルター、前記疎水性フィルタ
ーを装着しうる濾過具、メチルグリーンの希薄染色液、
色対照表、必要に応じてさらに試料採取ピペットを組み
合わせて、試料中の動物細胞数を迅速、かつ、簡便に測
定しうる測定キットとすることができる。なお、濾過具
は、疎水性フィルターと組み合わせて濾過できるもので
あればよく、特に制限はない。また、その材質は、ガラ
ス製，プラスチック製のいずれも使用することができ
る。さらに、疎水性フィルターと、この濾過具とを一体
化することもできる。

【００４２】また、上記（２）の光学密度（Ｏ．Ｄ．）
測定による比色定量は、疎水性フィルター上に存在する
動物細胞を着色した色素を、有機溶剤を用いて溶出さ
せ、溶出液の着色度を吸光度により測定し、予め作成し
た光学密度（Ｏ．Ｄ．）と動物細胞数との検量線に当て
はめて定量すればよい。ここで有機溶剤としては、各種
アルコール類を使用することができるが、特にエタノー
ルが好ましい。

【００４３】なお、検量線の作成は、例えば次のように
して行なえばよい。即ち、メチルグリーンを各種の濃度
に希釈した試料の着色度を、マイクロプレートリーダー
を用いて、着色度を６３２ｎｍの光学密度（Ｏ．Ｄ．）
により測定しておき、一方、各種の濃度に希釈した試料
と同一試料の試料溶液中の動物細胞数を、前述のホソマ
チックを用いて測定したり、或いは血球計数板法により
算出しておき、両者の結果から動物細胞数と光学密度の
検量線を作成すればよい。

【００４４】叙上の如く、本発明の方法は簡単なもので
あるので、測定を自動化することも容易である。具体的
には例えば、放射性同位元素で標識した細胞を濾紙に集
めるセルハーベスターを使用することができ、放射性同
位元素で標識する代わりに色素で染色すること以外は、
ほぼ同様な操作で濾紙に着色された細胞を集めることが
できる。９６穴プレートを使用すれば、１度に９６個の
検体の処理も可能である。

【００４５】また、光学密度で測定する場合も自動化は
可能である。すなわち、マイクロプレートリーダー等で
光学密度の測定，記録を自動化すれば、個人差による誤
差が少なくなり、管理にも便利である。さらに、多数の
サンプルについて測定しようとする場合には、従来ある
ドットブロッターを用い、親水性フィルターを疎水性フ
ィルターに変えることにより、測定が可能となる。

【００４６】

【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。

【００４７】実施例１（１）色の対照表の作成２５０万個／ｍｌの体細胞を含む乳房炎乳牛の生乳を、
体細胞が１万個／ｍｌ以下の正常乳牛の生乳で希釈し
て、それぞれ細胞数が、１０万個／ｍｌ程度、３０
万個／ｍｌ程度、５０万個／ｍｌ程度、７５万個／
ｍｌ程度、及び１００万個／ｍｌ程度になるように調
製し、５種類の標準試料を調製した。なお、細胞数の測
定はホソマチックを用いて行なった。

【００４８】図１〜３に示す濾過具と疎水性フィルター
７とを用いて、体細胞の染色と、捕集を行なった。すな
わち、プラスチック製濾過器（濾過具１）に、直径３ｍ
ｍの円形の孔８を開けた１辺２ｃｍの正方形のシリコン
製ゴムシート（シート６）を図に示すように上下に張
り、その間に直径１３ｍｍのポリプロピレン製フィルタ
ー（濾過孔径７μｍ）（疎水性フィルター７）を前記孔
８を塞ぐように入れ、ダブルクリップで留めた。

【００４９】注射器装着部分（装着部２）に、注射器
（濾過容器Ａ）を取付けた後、色素濃度０．００１％の
メチルグリーン染色液１ｍｌと、前記標準試料０．５ｍ
ｌとを注射器（濾過容器Ａ）に入れ、軽く攪拌した後、
注射器（濾過容器Ａ）のシリンジを押し（加圧し）、水
溶液を試料排出部分（排出又は吸引部３）より押し出
し、染色された体細胞を疎水性フィルター７へ捕集し
た。疎水性フィルター７をプラスチック製濾過器（濾過
具１）から取り出し、着色度を目視によって観察した結
果、次の第１表の通りであった。

【００５０】なお、予め試験管に色素濃度０．００１％
のメチルグリーン１ｍｌと標準試料０．５ｍｌとを入
れ、攪拌した後、試料吸引部分（排出又は吸引部３）か
ら注射器で吸引して行なっても（加圧濾過の代わりに吸
引濾過しても）、結果は全く同じであった。

【００５１】

【表１】

【００５２】これらのフィルターを、標準サンプルとし
てカラー写真にとり、色の対照表とした。

【００５３】（２）生乳中の動物細胞数の判定生乳１０検体について、上記（１）と同様の操作を行な
い、疎水性フィルター７上に存在する動物細胞（乳牛の
体細胞）の着色度を目視によって観察し、上記（１）で
作成した色の対照表と比較して目視による判定を行なっ
た。なお、測定時間は３０秒以内であった。ホソマチッ
クにより測定した動物細胞数と共に、結果を第２表に示
す。

【００５４】

【表２】

【００５５】第２表の結果によれば、本発明の方法によ
る判定は、ホソマチックによる正確な測定結果と比べ
て、傾向として良く似た結果を示すことが分かる。従っ
て、本発明の方法は、測定時間の短さを考慮すると、簡
便な測定方法として充分に利用価値があるものと認めら
れる。

【００５６】実施例２（色素の安定性試験）０．００１％のメチルグリーン溶液を、酸或いはアルカ
リでｐＨを２〜８の範囲に調整して保存安定性試験を実
施した。保存温度は室温であり、吸光度は、波長６３２
μｍで、分光光度計を用いて測定した。結果を第３表に
示す。

【００５７】

【表３】

【００５８】第３表の結果によれば、メチルグリーンの
ｐＨが２．５〜４．５の範囲において、１ヶ月間程度安
定して保存できることが分かる。さらに、メチルグリー
ンのｐＨが３．０〜４．０の範囲において、３ヶ月間程
度安定して保存できることが分かる。従って、３ヶ月程
度の長期保存を考えた場合、メチルグリーンの好適なｐ
Ｈは、２．７〜４．３の範囲と考えられる。

【００５９】実施例３（色素の安定性試験）ｐＨ３．０とｐＨ４．０とｐＨ５．０の０．００１％メ
チルグリーン溶液と、ｐＨ４．０とｐＨ５．０の０．０
００５％メチレンブルー溶液の長期保存安定性試験をそ
れぞれ実施した。保存温度は室温である。吸光度は波長
６３２μｍで、分光光度計を用いて測定した。その結果
を第４表に示す。

【００６０】

【表４】

【００６１】第４表の結果によれば、ｐＨが３．０と
４．０と本発明の規定する範囲内のメチルグリーン溶液
を用いた場合には３ヶ月間程度も安定して保存できるこ
とが分かる。一方、メチルグリーン溶液を用いたとして
も、ｐＨが５．０と本発明の範囲外の場合には、色素の
安定性に劣るものとなることが分かる。さらに、ｐＨが
３．０と４．０と本発明の規定する範囲内のものであっ
たとしても、メチルグリーン溶液ではなく、メチレンブ
ルー溶液を用いた場合には、色素の安定性に劣るものと
なることが分かる。勿論、ｐＨが５．０であり、しかも
メチレンブルー溶液を用いた場合には、色素の安定性に
劣るものとなることが分かる。従って、色素の安定性に
優れたものとするには、ｐＨが３．０や４．０など、本
発明の規定する範囲内であって、しかもメチルグリーン
溶液を用いることが必要であると考えられる。

【００６２】実施例４（色素の安定性試験）新たに調製したｐＨ３．０の０．０１％メチルグリーン
溶液と、３ヶ月前に調製したｐＨ３．０の０．０１％メ
チルグリーン溶液とを用い、実施例１と同様に、調製し
た体細胞を含む生乳の標準試料を染色し、着色の程度を
比較した。結果を第５表に示す。

【００６３】

【表５】

【００６４】第５表の結果によれば、新たに調製したｐ
Ｈ３．０の０．０１％メチルグリーン溶液を用いた場合
と、３ヶ月前に調製したｐＨ３．０の０．０１％メチル
グリーン溶液を用いた場合とで、着色の程度に差は認め
られなかった。従って、本発明の方法によれば、使用す
る希釈染色液を調製してから３ヶ月程度経過した場合で
あっても、充分な染色を行なうことができることが分か
る。

【００６５】

【発明の効果】本発明の方法においては、ｐＨが２．５
〜４．５であるメチルグリーンの希薄染色液を用いてい
るため、染色用色素の退色や不充分な染色が解消されて
いる。従って、本発明の方法によれば、メチルグリーン
溶液調製後、３ヶ月程度経過した後であっても、測定結
果にズレが生じるおそれがなく、試料中の動物細胞数を
何らの問題なく測定することができる。このように本発
明の方法によれば、使用する希釈染色液の調製後の経過
時間に関係なく、長期間にわたり（少なくとも３ヶ月程
度）充分な染色を行なうことができ、試料中の動物細胞
数を測定することができる。

【００６６】また、本発明の方法によれば、１段階の濾
過操作で試料中の動物細胞の染色と捕集を行なうことが
でき、試料中の動物細胞数を迅速、かつ、簡便に測定す
ることができる。本発明の方法によれば、通常、３０秒
以内に判定可能である。

【００６７】しかも本発明の方法によれば、専門的な技
術や知識を必要とせずに、試料中の動物細胞数を測定す
ることができる。また、本発明の方法は、疎水性フィル
ターの濾過孔径を選択することにより、全ての動物細胞
に適用できるので、応用範囲も極めて広い。さらに、本
発明の方法においては、特別な機器を必要としないの
で、小規模な病院や診療所、或いは一般の人でも測定す
ることができ、またどのような現場においても使用する
ことができるという利点がある。

【００６８】本発明の方法によれば、例えば生乳中に存
在する動物細胞を迅速、かつ簡便に測定することができ
るため、乳牛の乳房炎の診断に有効に利用することがで
き、畜産分野において有用である。

【００６９】従って、本発明は、乳房炎診断分野、畜産
分野、尿検査分野（診断分野）をはじめ、各種治療に利
用されるモノクローナル抗体を製造するのに有効なハイ
ブリドーマの培養状況の判定などに、広く利用すること
ができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、濾過具の一態様を示す正面図である。

【図２】図２は、濾過具の一態様を示す平面図である。

【図３】図３は、疎水性フィルターを備えた濾過具を装
着した濾過容器の一態様を示す説明図である。

【符号の説明】

１濾過具１Ａ濾過具の上面側１Ｂ濾過具の下面側２装着部３貫通孔４排出又は吸引部５貫通孔６シート７疎水性フィルター８シートに開けられた孔Ａ濾過容器

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中の動物細胞数を測定する方法にお
いて、動物細胞をｐＨが２．５〜４．５であるメチルグ
リーンの希薄染色液で染色し、吸引濾過又は加圧濾過に
より、疎水性フィルターに染色された動物細胞を捕集し
て、動物細胞の着色度から試料中の動物細胞数を測定す
ることを特徴とする動物細胞数を迅速に測定する方法。
【請求項２】希薄染色液中における染色用色素の濃度
が、０．０００４〜０．００３％である請求項１記載の
方法。
【請求項３】試料が生乳であり、かつ動物細胞が乳牛
の体細胞である請求項１記載の方法。
【請求項４】疎水性フィルター，前記疎水性フィルタ
ーを装着しうる濾過具，メチルグリーン希薄染色液及び
色対照表よりなる動物細胞数の測定キットを使用する請
求項１記載の方法。
【請求項５】測定キットに加えて、濾過容器としてピ
ストン逆行阻止機構を有する注射器を使用する請求項４
記載の方法。