JPH05252996A - 動物細胞数の迅速測定方法及び測定キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 試料中の動物細胞数を測定するにあたり、動
物細胞を染色して疎水性フィルターに捕集し、又は疎水
性フィルターに捕集した後に動物細胞を染色し、次いで
過剰の色素を洗浄により除去し、動物細胞の着色度から
試料中の動物細胞数を測定することを特徴とする動物細
胞数の迅速測定方法、並びに疎水性フィルター３，該フ
ィルターを装着しうる注射筒１，色素液，洗浄液及び色
対照表よりなる動物細胞数の測定キットを提供する。 【効果】 本発明の方法によれば、専門的な技術や知
識、さらには特別な機器を必要とせず、迅速かつ簡便に
試料中の動物細胞数を測定することができる。本発明の
方法によれば、通常、５分間以内に測定可能である。ま
た、本発明の測定キットは、極めて簡単かつ安価なもの
であって、どのような現場においても使用することがで
きる。従って、本発明は、尿検査分野（診断分野）をは
じめ、各種治療に利用されるモノクローナル抗体を製造
するのに有効なハイブリドーマの培養状況の判定など
に、広く利用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、試料中の動物細胞数を
迅速、かつ、簡便に測定する方法及びその測定キットに
関し、詳しくは尿検査分野（診断分野）、ハイブリドー
マ培養関連分野（モノクローナル抗体製造関連分野）等
をはじめ、広汎な分野において適用が可能な動物細胞数
の迅速測定方法及びその際に用いる測定キットに関す
る。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】従来よ
り、尿検査分野やハイブリドーマ培養関連分野では、炎
症の発見やハイブリドーマの培養状況等を判定するため
に、試料中の白血球数の測定やハイブリドーマ数の測定
が行なわれている。例えば、尿中に白血球（白血球の１
種である好中球が主）が多数存在する場合には膿尿と診
断され、尿路に炎症があることが暗示されるが、このよ
うな場合には、従来は尿中の白血球数の測定は尿沈渣で
行なわれている（「尿検査の見方・考え方」、医歯薬出
版、１９８６年４月２０日発行）。この方法では、尿を
遠心分離器にかけ、通常は、例えば約１５００回転で５
分間程度遠心分離器にかけ、濃縮してから、染色液を添
加した後、顕微鏡下で細胞数を測定している。

【０００３】この方法は、白血球のみならず他の各種細
胞の観察が可能であり、また膿尿以外の診断にも役立つ
という利点を有するものの、操作が煩雑であり、しかも
顕微鏡観察には熟練した技術と経験に基づく高度の知識
や設備が必要であるという問題があった。また、この方
法は、遠心分離器と顕微鏡がない場所では測定すること
が出来ないなどの問題があった。さらに、この方法は、
設備の整った大病院でのみ実施が可能であり、我が国で
大多数を占める小規模な病院或いは診療所では実際上実
施することが困難であった。しかも判定に２０分前後の
時間が必要であった。また、ハイブリドーマの培養状況
の測定も顕微鏡下で、その数を計数することにより行な
われており、同様に特殊な技能が必要であるばかりでな
く、顕微鏡がない場所では測定できない等の問題点があ
った。

【０００４】本発明は、このような従来の欠点を解消
し、特別な設備や専門的な知識を必要とせず、しかも迅
速、かつ、簡便に、試料中の動物細胞数を測定しうる方
法及びその測定キットを提供することを目的とするもの
である。

【０００５】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、試料
中の動物細胞数を測定するにあたり、動物細胞を染色し
て疎水性フィルターに捕集し、又は疎水性フィルターに
捕集した後に動物細胞を染色し、次いで過剰の色素を洗
浄により除去し、動物細胞の着色度から試料中の動物細
胞数を測定することを特徴とする動物細胞数の迅速測定
方法を提供するものである。

【０００６】このような本発明の方法は、疎水性フィル
ター，該フィルターを装着しうる注射筒，色素液，洗浄
液及び色対照表よりなる動物細胞数の測定キットを用い
ることにより、容易に実施することができる。

【０００７】本発明を適用することができる試料は、そ
の中に動物細胞を含んでいるものであれば特に制限はな
く、例えば動物の体液（血液，リンパ液など），排泄物
（尿など）等を典型的なものとして挙げることができ
る。また、本発明の対象とする動物細胞は、特に制限は
ない。例えば、尿中の白血球や血液中の白血球，赤血
球，酵母，カビ等が対象とされる。さらに、細胞融合に
よって形成される、培養液中のハイブリドーマなども、
本発明の対象とすることができる。なお、対象とする動
物細胞の大きさに合わせて疎水性フィルターの孔径を選
択すればよいので、これらの動物細胞の大きさは特に限
定はないが、本発明は、特に直径が５〜１５ミクロン程
度のものの判定に有効に用いることができる。

【０００８】本発明では、まず試料中の動物細胞を染色
した後に疎水性フィルターに捕集するか、或いは疎水性
フィルターに捕集した後に動物細胞を染色する。すなわ
ち、動物細胞の染色の前後のいずれかの時期に、フィル
ターで捕集を行なう。操作工程の簡便さから、予め試料
と色素液とを混合し、動物細胞を染色した後に、フィル
ターに捕集する手法が好ましい。ここで動物細胞の染色
は各種色素を用い、これを色素液とし、この色素液を、
フィルターで動物細胞を捕集する前、或いは捕集した後
の試料に添加することにより行なう。染色に用いる色素
としては、動物細胞の染色に使用可能な色素であればよ
く、例えばフクシン，サフラニン，クリスタルバイオレ
ット，ビクトリアブルーなどが挙げられ、特に過剰の色
素の除去のし易さの点より、フクシン，サフラニンが好
ましい。

【０００９】上記色素は、水溶液（色素液）として使用
される。色素液とする際、必要に応じて、エタノール、
界面活性剤等を添加することもできる。色素液の濃度
は、通常、0.0005〜2.0 ％、好ましくは 0.002〜１％と
する。ここで色素液の濃度が、0.0005％未満であると着
色が不充分となり、一方、色素液の濃度が2.0 ％を超え
ると過剰の色素の除去が困難となるため、いずれも好ま
しくない。なお、必要に応じて、上記の色素液に界面活
性剤を添加する場合には、界面活性剤を0.0001〜１％の
割合で添加すればよい。上記色素液の調製にあたって
は、予め所定濃度の色素液を作製しておき、これを後述
する如き洗浄液を用いて希釈して、所望する濃度のもの
としてもよい。また、試料液量当たりの色素液量比は１
以上、好ましくは３以上とする。ここで試料液量当たり
の色素液量比が１未満であると、着色が不充分となって
しまい好ましくない。

【００１０】次に、本発明で用いる疎水性フィルターと
しては、ナイロン系、ポリテトラフルオロエチレン（四
フッ化エチレン樹脂）等のフッ素系ポリマーや、ポリオ
レフィンを材料とするものが用いられ、特にポリテトラ
フルオロエチレンやポリオレフィンを材料とするもの
が、過剰の色素の除去が容易であるため好ましい。この
疎水性フィルターの濾過孔径は、対象とする動物細胞の
種類に応じて適宜選定すればよく、例えば尿中の白血球
（５〜１５ミクロン程度）を捕集する場合には、３〜５
ミクロンの濾過孔径のものを用いることが好ましい。白
血球以外の動物細胞（３０〜４０ミクロン）が多量に共
存した場合には、２０〜３０ミクロンの濾過孔径の疎水
性フィルターで前処理すればよい。この疎水性フィルタ
ーの大きさは特に制限はない。通常、この疎水性フィル
ターは注射筒に装着して用いるので、その口径（直径）
が 13 〜 25 mm程度のものが好ましい。

【００１１】この疎水性フィルターの色としては、用い
る色素を考慮し、判定容易な色を定めればよい。着色の
程度を容易に判定するためには、白色のフィルターが好
ましい。また、透明，半透明のフィルターを用いること
ができるが、白色用紙の上にフィルターを載せて判定す
ると、判定が容易となる。

【００１２】上記の如き疎水性フィルターを用いて試料
中の動物細胞を捕集する点に、本発明の最大の特徴があ
る。通常は、疎水性フィルターを注射筒に装着し、この
注射筒に、事前に染色された試料或いは染色前の試料を
入れ、加圧濾過することにより、動物細胞を捕集する。
染色前の試料を入れた場合には、濾過の後に染色する
が、事前に染色された試料を加圧濾過する方法が操作工
程が簡単で好ましいことは前述した通りである。

【００１３】このようにして染色され、かつ、疎水性フ
ィルターに捕集された試料から、過剰の色素を洗浄によ
り除去する。ここで用いる洗浄液としては、水，各種緩
衝液（ｐＨ６〜８程度のもの）を使用することができ
る。さらに、必要に応じて各種界面活性剤を添加したも
のを用いてもよい。界面活性剤は、0.0001〜1.0 ％の割
合で添加すればよい。

【００１４】洗浄液の使用量は、疎水性フィルターの口
径に依存するが、例えば疎水性フィルターの口径が１３
mmであれば、１〜５ml（ミリリットル）、好ましくは２
〜３mlとする。この場合、洗浄液の使用量が１ml未満で
あると洗浄が不充分であり、一方、洗浄液の使用量が５
mlを超えると細胞から色素が漏出する可能性がある。洗
浄液の使用量は、色の対照表や、検量線を作成する際の
使用量と、細胞数未知試料を洗浄する使用量とを等量に
することが、誤差を抑える意味で好ましい。過剰の色素
の除去は、具体的には例えば、前記の如く染色され、か
つ、疎水性フィルターに捕集された試料が入れられた注
射筒に、上記の如き洗浄液をとり、加圧濾過によって、
除去することにより行なえばよい。

【００１５】このようにして過剰の色素が除去された試
料中の細胞の着色度から、試料中の動物細胞数を測定す
る。この動物細胞数の測定は、（１）目視（色の対照
表）により、或いは（２）光学密度（Ｏ．Ｄ．）測定に
よる比色定量により、行なえばよい。

【００１６】上記（１）の目視による細胞数の測定は、
具体的には、疎水性フィルター上に存在する動物細胞の
着色度、すなわち色の強度を、既知量の動物細胞数の試
料を用いて予め作成しておいた色の対照表と比較するこ
とにより行なえばよい。色の対照表は、既知量の動物細
胞数の試料を用い、本発明の方法で染色，洗浄した疎水
性フィルターをカラー写真に撮ることにより、又は、こ
の疎水性フィルターと同程度に濾紙等を着色したり、或
いは同程度の色を紙に印刷することにより、作成するこ
とができる。例えば、尿中の白血球を測定する場合に
は、次のようにして色の対照表を作成する。すなわち、
白血球は健常人の尿中にも少数〔１ｍｌ（ミリリット
ル）当り１万個未満〕存在するが、１ｍｌ当り１０万個
以上の場合には明らかに膿尿と診断される。従って、通
常、１万個／１ｍｌ未満，数万個／１ｍｌ（１〜１０万
個／１ｍｌまで），１０万個／１ｍｌ以上の３点の色対
照表を作成すればよい。

【００１７】このように色の対照表を用いる場合には、
前記した疎水性フィルター，該フィルターに装着しうる
注射筒，色素液，洗浄液と組み合わせて、試料中の動物
細胞数を迅速、かつ、簡便に測定しうる測定キットとす
ることができる。なお、注射筒は疎水性フィルターと組
み合わせて加圧濾過できるものであればよく、特に制限
はない。また、その材質は、ガラス製，プラスチック製
のいずれも使用することができる。さらに、その容量
は、使用する洗浄液等の液量に応じて選択すればよい。

【００１８】また、上記（２）の光学密度（Ｏ．Ｄ．）
測定による比色定量は、疎水性フィルター上に存在する
動物細胞に着色した色素を、溶剤を用いて溶出させ、溶
出液の着色度を吸光度により測定し、この測定値を、予
め作成した光学密度（Ｏ．Ｄ．）と動物細胞数との検量
線を用いて定量すればよい。吸光度測定時の波長は、用
いる色素により、適宜定めればよい。ここで溶剤として
は、各種アルコール類を使用することができるが、特に
エタノールが好ましい。

【００１９】なお、検量線の作成は、例えば次のように
して行なえばよい。即ち、色素としてフクシンを用いた
場合には、各種の濃度に希釈した試料の着色度を、マイ
クロプレートリーダーを用いて、着色度を４９２ｎｍの
光学密度（Ｏ．Ｄ．）により測定しておき、一方、各種
の濃度に希釈した試料と同一試料の試料溶液中の動物細
胞数、例えば白血球数を、血球計数板法（「組織培養の
技術」、第２版、２５頁、朝倉書店、１９８８年）によ
り算出しておき、両者の結果から動物細胞数と光学密度
の検量線を作成すればよい。

【００２０】

【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。 実施例１ （１）色の対照表の作成 フィコール−ヒパーク比重遠心法（「続生化学実験講
座」、第８卷、第６７９頁、東京化学同人発行、１９８
７年）により、ヒト末梢血から白血球を分離し、ＰＢＳ
緩衝液（ｐＨ７）に懸濁した。なお、白血球数は上記血
球計数板法により算出した。一方、健常人男子の尿を採
取し、濾過孔径が３ミクロンのポリテトラフルオロエチ
レン製フィルター（アドバンテック東洋製）で濾過し、
濾液を白血球希釈用溶液とした。この白血球希釈用溶液
と、前記白血球とを用いて、白血球数が５千個／ｍｌ
程度、５万個／ｍｌ程度、５０万個／ｍｌ程度の濃
度となるように、３種の標準試料を調製した。

【００２１】次に、フクシン染色液（濃度２０ｍｇ／１
００ｍｌ）を水で１／４に希釈して得たフクシン液２ｍ
ｌを、５ｍｌ容のチューブに採り、これに上記の如くし
て調製された標準試料０．５ｍｌを添加して、白血球を
染色した。１〜２秒間攪拌した後、濾過孔径３ミクロン
のポリテトラフルオロエチレン製フィルター（口径１３
ｍｍ，アドバンテック東洋製）を装着した５ｍｌ容の注
射筒に入れて、加圧濾過することにより、該フィルター
に白血球を捕集した（なお、捕集状態を示す参考図を図
１に示す。図中、符号１は注射筒、符号２は試料、符号
３はフィルターを示す）。次いで、該フィルターと、注
射筒を分離し、前もって洗浄液( 0.0025％ツイーン２０
添加ＰＢＳ緩衝液，ｐＨ 7.0) 3.0 ｍｌを入れておいた
５ｍｌ容の注射筒に、再度該フィルターを装着し、洗浄
液で洗浄，濾過して、過剰の色素を除去した。該フィル
ター上に存在する白血球の着色度（着色の強弱）を、目
視により観察した結果、次の通りであった。なお、尿の
代わりに、滅菌水又はＰＢＳ緩衝液を希釈液として用い
た場合もほぼ同様の結果であった。 標準試料 着色の程度 極めて弱い（淡いピンク色） 弱い（少し薄い赤色） 強い（濃い赤色） これらのフィルターを、標準サンプルとしてカラー写真
にとり、色の対照表とした。

【００２２】（２）白血球数の判定 膀胱炎患者１名（女性５０才）の尿と、健常人２名（男
性５２才，２９才）の放出尿を試料として測定した。ま
ず、上記色対照表の作成時と同様にして、尿中の白血球
を染色し、加圧濾過し、洗浄した。次いで、該フィルタ
ー上に存在する白血球の着色度を、目視により観察し、
上記（１）で作成した色の対照表と比較して目視による
判定を行なった。血球計数板法により測定した白血球数
と共に、結果を第１表に示す。なお、健常人の白血球数
は少ないため、遠心分離法（１５００ｒｐｍ，５分間）
により２０倍に濃縮した後、顕微鏡下で計数した。

【００２３】

【表１】

【００２４】実施例２ ヒト・マウスハイブリドーマＳＨＭ−Ｄ３３株（ＡＴＣ
Ｃ ＣＲＬ−１６６８）のフラスコ培養液（ＧＩＴ培地
で４日間培養したもの）について、実施例１と同様にし
て、染色し、濾過し、洗浄した後、実施例１（１）で作
成した色の対照表と比較して、目視により細胞数の判定
を行なった。判定の結果、５０万個／ｍｌ程度であっ
た。なお、比較のために血球計数板法で求めた細胞数
は、６６万個／ｍｌであった。

【００２５】

【発明の作用・効果】本発明の方法によれば、専門的な
技術や知識を必要とせず、しかも、迅速、かつ、簡便に
試料中の動物細胞数を測定することができる。本発明の
方法によれば、通常、５分間以内に測定可能である。ま
た、本発明の方法においては、特別な機器を必要としな
いので、小規模な病院或いは診療所でも測定することが
できる。さらに、本発明の方法は、疎水性フィルターの
濾過孔径を選択することにより、全ての動物細胞に適用
できるので、応用範囲も極めて広い。また、本発明の測
定キットは、極めて簡単、かつ、安価なものであって、
特別な機器を必要としないので、どのような現場におい
ても使用することができるという利点がある。したがっ
て、本発明は、尿検査分野（診断分野）をはじめ、各種
治療に利用されるモノクローナル抗体を製造するのに有
効なハイブリドーマの培養状況の判定などに、広く利用
することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、注射筒に疎水性フィルターを装着した
図である。

【符号の説明】

符号１は注射筒、符号２は試料、符号３は疎水性フィル
ターである。

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【手続補正書】

【提出日】平成５年４月１日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項２

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１０】次に、本発明で用いる疎水性フィルターと
しては、ナイロン系、ポリテトラフルオロエチレン（四
フッ化エチレン樹脂）等のフッ素系ポリマーや、ポリオ
レフィンを材料とするものが用いられ、特にポリテトラ
フルオロエチレンやポリオレフィンを材料とするもの
が、過剰の色素の除去が容易であるため好ましい。この
疎水性フィルターの濾過孔径は、対象とする動物細胞の
種類に応じて適宜選定すればよく、例えば尿中の白血球
（５〜１５ミクロン程度）を捕集する場合には、通常３
〜１０ミクロン、特に３〜５ミクロンの濾過孔径のもの
を用いることが好ましい。白血球以外の動物細胞（３０
〜４０ミクロン）が多量に共存した場合には、２０〜３
０ミクロンの濾過孔径の疎水性フィルターで前処理すれ
ばよい。この疎水性フィルターの大きさは特に制限はな
い。通常、この疎水性フィルターは注射筒に装着して用
いるので、その口径（直径）が 13 〜 25 mm程度のもの
が好ましい。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１７】このように色の対照表を用いる場合には、
前記した疎水性フィルター，該フィルターを装着しうる
注射筒，色素液，洗浄液と組み合わせて、試料中の動物
細胞数を迅速、かつ、簡便に測定しうる測定キットとす
ることができる。なお、注射筒は疎水性フィルターと組
み合わせて加圧濾過できるものであればよく、特に制限
はない。また、その材質は、ガラス製，プラスチック製
のいずれも使用することができる。さらに、その容量
は、使用する洗浄液等の液量に応じて選択すればよい。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料中の動物細胞数を測定するにあた
   り、動物細胞を染色して疎水性フィルターに捕集し、又
   は疎水性フィルターに捕集した後に動物細胞を染色し、
   次いで過剰の色素を洗浄により除去し、動物細胞の着色
   度から試料中の動物細胞数を測定することを特徴とする
   動物細胞数の迅速測定方法。
2. 【請求項２】 動物細胞に着色した色素を、溶剤で溶出
   し、溶出液の着色度を比色定量する特許請求の範囲第１
   項記載の方法。
3. 【請求項３】 疎水性フィルター，該フィルターを装着
   しうる注射筒，色素液，洗浄液及び色対照表よりなる動
   物細胞数の測定キット。