JPH09255501A - 生細胞の保存剤 - Google Patents
生細胞の保存剤Info
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- JPH09255501A JPH09255501A JP7038196A JP7038196A JPH09255501A JP H09255501 A JPH09255501 A JP H09255501A JP 7038196 A JP7038196 A JP 7038196A JP 7038196 A JP7038196 A JP 7038196A JP H09255501 A JPH09255501 A JP H09255501A
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- Japan
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- levan
- preservative
- cells
- cell
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 生細胞、特に魚類細胞の生細胞を低温で、特
に好ましくは凍結状態で長期に保存する際に用いられ、
細胞に対する毒性が無いか、有っても非常に低く、又結
晶性の低いもので、更には解凍後に培養する場合に洗浄
の必要性がなく、気軽に利用できる、保存剤を開発す
る。 【解決手段】 レバン又はレバンオリゴ糖を有効成分と
して含有する生細胞の保存剤は、前記条件を満たし、さ
らに微生物により容易に製造できるという利点を有して
いる。
に好ましくは凍結状態で長期に保存する際に用いられ、
細胞に対する毒性が無いか、有っても非常に低く、又結
晶性の低いもので、更には解凍後に培養する場合に洗浄
の必要性がなく、気軽に利用できる、保存剤を開発す
る。 【解決手段】 レバン又はレバンオリゴ糖を有効成分と
して含有する生細胞の保存剤は、前記条件を満たし、さ
らに微生物により容易に製造できるという利点を有して
いる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生細胞、特に魚類
細胞の生細胞を低温で、特に好ましくは凍結状態で長期
に保存する際に用いられる保存剤に関する。なお、以下
本発明において記載する凍結保存剤等における「凍結」
とは、「低温」を含む意である。
細胞の生細胞を低温で、特に好ましくは凍結状態で長期
に保存する際に用いられる保存剤に関する。なお、以下
本発明において記載する凍結保存剤等における「凍結」
とは、「低温」を含む意である。
【０００２】
【従来の技術】生細胞は、生活機能や生物学的活性を有
しており、多方面で利用価値があるが、一方、温度の高
い条件下では代謝あるいは変性のために経時的に変化し
て、生活機能や生物学的活性が低下ないし消失してしま
う。そこで、生細胞を凍結して保存することが必要とな
るが、生物細胞の凍結保存には従来から細胞膜透過型凍
結保存剤としてＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）、
エチレングリコ−ル、グリセロ−ルなどが用いられてお
り、また細胞非透過型凍結保存剤としてポリビニルピロ
リドン等が用いられている。
しており、多方面で利用価値があるが、一方、温度の高
い条件下では代謝あるいは変性のために経時的に変化し
て、生活機能や生物学的活性が低下ないし消失してしま
う。そこで、生細胞を凍結して保存することが必要とな
るが、生物細胞の凍結保存には従来から細胞膜透過型凍
結保存剤としてＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）、
エチレングリコ−ル、グリセロ−ルなどが用いられてお
り、また細胞非透過型凍結保存剤としてポリビニルピロ
リドン等が用いられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の凍結保存剤は合成品である為、一般に高濃度にすると
細胞に対して毒性を示すという問題がある。また培養を
行う場合には、細胞の増殖を阻害するので、予め細胞か
ら凍結保存剤を除去しておくことが必要となり煩雑とな
る。さらに細胞膜透過型の凍結保存剤を用いた場合には
解凍の際に、細胞外への排出速度が水よりも遅いので細
胞が水による希釈ショックを受けやすい欠点がある。
の凍結保存剤は合成品である為、一般に高濃度にすると
細胞に対して毒性を示すという問題がある。また培養を
行う場合には、細胞の増殖を阻害するので、予め細胞か
ら凍結保存剤を除去しておくことが必要となり煩雑とな
る。さらに細胞膜透過型の凍結保存剤を用いた場合には
解凍の際に、細胞外への排出速度が水よりも遅いので細
胞が水による希釈ショックを受けやすい欠点がある。
【０００４】一方、天然物として、３糖類であるラフィ
ノ−スを用いることが知られているが（特開平５−３８
２８４号公報）、この糖はビ−ト等から抽出されるので
製造に制約がある他、結晶性が高いため細胞を痛める恐
れがあるという問題もある。また、同公報において、１
−ケスト−スを生細胞保存剤として用いることが提案さ
れているが、これも未だ価格が高いので気軽に利用出来
ないという難点がある。
ノ−スを用いることが知られているが（特開平５−３８
２８４号公報）、この糖はビ−ト等から抽出されるので
製造に制約がある他、結晶性が高いため細胞を痛める恐
れがあるという問題もある。また、同公報において、１
−ケスト−スを生細胞保存剤として用いることが提案さ
れているが、これも未だ価格が高いので気軽に利用出来
ないという難点がある。
【０００５】このため生細胞の保存剤として、細胞に対
する毒性が無いか、有っても非常に低く、又結晶性の低
いものが望ましく、更には解凍後に培養する場合に洗浄
の必要性がなく、気軽に利用できるものが求められてい
た。
する毒性が無いか、有っても非常に低く、又結晶性の低
いものが望ましく、更には解凍後に培養する場合に洗浄
の必要性がなく、気軽に利用できるものが求められてい
た。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記問題
点を解決するため鋭意研究した結果、本発明を完成する
に至った。
点を解決するため鋭意研究した結果、本発明を完成する
に至った。
【０００７】すなわち、本発明はレバン又はレバンオリ
ゴ糖を有効成分として含有する生細胞の保存剤に関す
る。本発明において用いられるレバンまたはレバンオリ
ゴ糖は前記条件を満たし、さらに微生物により容易に製
造できるという利点を有している。本発明において用い
られるレバンオリゴ糖としては、特にレバンビオ−スお
よびレバンオクタオ−スが好ましい。
ゴ糖を有効成分として含有する生細胞の保存剤に関す
る。本発明において用いられるレバンまたはレバンオリ
ゴ糖は前記条件を満たし、さらに微生物により容易に製
造できるという利点を有している。本発明において用い
られるレバンオリゴ糖としては、特にレバンビオ−スお
よびレバンオクタオ−スが好ましい。
【０００８】レバンは、水に良く溶ける、フルクトフラ
ノ−スのβ−２、６−結合による連鎖からなる多糖類の
一種であり、従来は代用血液の中に加えて用いられてい
た。レバンの構造式は次のようなものである。
ノ−スのβ−２、６−結合による連鎖からなる多糖類の
一種であり、従来は代用血液の中に加えて用いられてい
た。レバンの構造式は次のようなものである。
【０００９】
【化１】
【００１０】本発明に用いられるレバンまたはレバンオ
リゴ糖の製造方法については特に制限はないが、例え
ば、レバンの製造方法としては、本出願人が出願したＳ
ｅｒｒａｔｉａ属に属する微生物、及びＡｃｅｔｏｂａ
ｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属、等に
属する微生物を用いて生産する方法（特開平３−２１９
８８９号公報）が挙げられる。レバンからのレバンオク
タオ−スの製造方法としては、同じく本出願人が出願し
たＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物を用いて
生産する方法（特開平７−１１５９８６号公報）を挙げ
ることができる。レバンからのレバンビオ−スの製造方
法としては、本出願人が出願したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ属に属する微生物を用いて生産する方法（特開平５
−２４４９７４号公報、特開平８−２７９号公報）を挙
げることができる。
リゴ糖の製造方法については特に制限はないが、例え
ば、レバンの製造方法としては、本出願人が出願したＳ
ｅｒｒａｔｉａ属に属する微生物、及びＡｃｅｔｏｂａ
ｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属、等に
属する微生物を用いて生産する方法（特開平３−２１９
８８９号公報）が挙げられる。レバンからのレバンオク
タオ−スの製造方法としては、同じく本出願人が出願し
たＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物を用いて
生産する方法（特開平７−１１５９８６号公報）を挙げ
ることができる。レバンからのレバンビオ−スの製造方
法としては、本出願人が出願したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ属に属する微生物を用いて生産する方法（特開平５
−２４４９７４号公報、特開平８−２７９号公報）を挙
げることができる。
【００１１】本発明の生細胞保存剤は通常水溶液として
使用することができ、使用濃度について特に制限はな
い。しかし、生細胞保存剤として優れた効果を発揮させ
るためには、通常レバンまたはレバンオリゴ糖の濃度を
０．１〜２０ｗｔ％、好ましくは１〜１０ｗｔ％の範囲
で用いるのが望ましい。濃度が低すぎると効果が弱くな
り、また高濃度になると水に不溶となりやすい。なお、
レバン又はレバンオリゴ糖は、他の凍結保存剤と共に使
用することも可能である。
使用することができ、使用濃度について特に制限はな
い。しかし、生細胞保存剤として優れた効果を発揮させ
るためには、通常レバンまたはレバンオリゴ糖の濃度を
０．１〜２０ｗｔ％、好ましくは１〜１０ｗｔ％の範囲
で用いるのが望ましい。濃度が低すぎると効果が弱くな
り、また高濃度になると水に不溶となりやすい。なお、
レバン又はレバンオリゴ糖は、他の凍結保存剤と共に使
用することも可能である。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下に実施例を挙げ本発明を説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１３】実施例１ 凍結保存剤としてレバン、レバンオクタオ−ス、レバン
ビオ−ス、ＤＭＳＯ及びグリセロ−ルを用いてそれぞれ
ＭＥＭ10−Ｔｒｉｓ（市販の液体培地）に１０％の濃度
で溶解し、凍結媒液とした。培養５日目のマスノスケの
胚由来細胞ＣＨＳＥ−２１４細胞をトリプシン（ＥＤＴ
Ａを含む）で処理し細胞懸濁液を作成し一度Ｈａｎｋ’
ｓ ＢＳＳ（市販の液体培地）で洗浄した後、前記の凍
結媒液を１０％の割合でＦＢＳ（市販の血清）に加えた
液に細胞の濃度が３．５×１０5／ｍｌとなるように懸
濁した。ポリプロピレン製チュ−ブに分注し、簡易断熱
ボックスに納め超低温槽（−８０℃）に１ケ月保存し
た。その後超低温槽からチュ−ブを取り出し直ちに流水
（約１５℃）中で融解後、１０ｍｌのＨａｎｋ’ｓ Ｂ
ＳＳを加え１回洗浄し、５ｍｌの培地（ＭＥＭ10−Ｔｒ
ｉｓ）に再懸濁した。
ビオ−ス、ＤＭＳＯ及びグリセロ−ルを用いてそれぞれ
ＭＥＭ10−Ｔｒｉｓ（市販の液体培地）に１０％の濃度
で溶解し、凍結媒液とした。培養５日目のマスノスケの
胚由来細胞ＣＨＳＥ−２１４細胞をトリプシン（ＥＤＴ
Ａを含む）で処理し細胞懸濁液を作成し一度Ｈａｎｋ’
ｓ ＢＳＳ（市販の液体培地）で洗浄した後、前記の凍
結媒液を１０％の割合でＦＢＳ（市販の血清）に加えた
液に細胞の濃度が３．５×１０5／ｍｌとなるように懸
濁した。ポリプロピレン製チュ−ブに分注し、簡易断熱
ボックスに納め超低温槽（−８０℃）に１ケ月保存し
た。その後超低温槽からチュ−ブを取り出し直ちに流水
（約１５℃）中で融解後、１０ｍｌのＨａｎｋ’ｓ Ｂ
ＳＳを加え１回洗浄し、５ｍｌの培地（ＭＥＭ10−Ｔｒ
ｉｓ）に再懸濁した。
【００１４】生存率の測定はＨａｎｋ’ｓ ＢＳＳで洗
浄した細胞の一部を再度Ｈａｎｋ’ｓ ＢＳＳに懸濁し
細胞懸濁液１ｍｌに４％トリパンブル−液を１滴（５０
μｌ）加え、１分後に青染細胞（死細胞）と染まらない
細胞（生細胞）の数を血球計数盤を使用して測定し、８
視野の平均から生存率を測定した。なお、２５ｃｍ3容
培養フラスコに上記細胞懸濁液を５ｍｌ播き、細胞が器
壁に付着するまで約２時間１５℃で静置後インキュベ−
タ−（１５℃）に納め、その後の発育状態を観察し、生
存性を確認した。
浄した細胞の一部を再度Ｈａｎｋ’ｓ ＢＳＳに懸濁し
細胞懸濁液１ｍｌに４％トリパンブル−液を１滴（５０
μｌ）加え、１分後に青染細胞（死細胞）と染まらない
細胞（生細胞）の数を血球計数盤を使用して測定し、８
視野の平均から生存率を測定した。なお、２５ｃｍ3容
培養フラスコに上記細胞懸濁液を５ｍｌ播き、細胞が器
壁に付着するまで約２時間１５℃で静置後インキュベ−
タ−（１５℃）に納め、その後の発育状態を観察し、生
存性を確認した。
【００１５】生存率の実験結果は次の通りであった。レ
バン９６％、レバンオクタオ−ス８５％、レバンビオ−
ス８３％、ＤＭＳＯ９３％、グリセロ−ル９２％であっ
た。レバンによる生存率は、ＤＭＳＯやグリセロ−ルよ
り高く、レバンオクタオ−スやレバンビオ−スも８０％
以上の生存率で、その上、細胞に対する毒性が無く、又
結晶性が低くさらに解凍後に培養する場合に洗浄の必要
性がないという利点を有している。
バン９６％、レバンオクタオ−ス８５％、レバンビオ−
ス８３％、ＤＭＳＯ９３％、グリセロ−ル９２％であっ
た。レバンによる生存率は、ＤＭＳＯやグリセロ−ルよ
り高く、レバンオクタオ−スやレバンビオ−スも８０％
以上の生存率で、その上、細胞に対する毒性が無く、又
結晶性が低くさらに解凍後に培養する場合に洗浄の必要
性がないという利点を有している。
【００１６】実施例２ 実施例１において、マスノスケ胚由来細胞ＣＨＳＥ−２
１４に代えてファットヘッドミノ−の尾柄由来のＦＨＭ
細胞を用いる以外は実施例１と同様に実験を行った結果
を次に示す。生存率の実験結果は次の通りであった。レ
バン９４％、レバンオクタオ−ス５８％、レバンビオ−
ス５０％、ＤＭＳＯ９４％、グリセロ−ル７２％であっ
た。レバンによる生存率は、ＤＭＳＯと同じでグリセロ
−ルよりかなり高く、レバンオクタオ−スやレバンビオ
−スも５０％以上で、かつ実施例１で記したような特徴
を備えている。
１４に代えてファットヘッドミノ−の尾柄由来のＦＨＭ
細胞を用いる以外は実施例１と同様に実験を行った結果
を次に示す。生存率の実験結果は次の通りであった。レ
バン９４％、レバンオクタオ−ス５８％、レバンビオ−
ス５０％、ＤＭＳＯ９４％、グリセロ−ル７２％であっ
た。レバンによる生存率は、ＤＭＳＯと同じでグリセロ
−ルよりかなり高く、レバンオクタオ−スやレバンビオ
−スも５０％以上で、かつ実施例１で記したような特徴
を備えている。
【００１７】実施例３ 実施例１において、マスノスケ胚由来細胞ＣＨＳＥ−２
１４に代えてニジマスの卵細胞由来のＲＴＧ−２細胞を
用いる以外は実施例１と同様に実験を行った結果を次に
示す。生存率の実験結果は次の通りであつた。レバン９
１％、レバンオクタオ−ス３２％、レバンビオ−ス２８
％、ＤＭＳＯ９０％、グリセロ−ル７４％であった。実
施例２と同様にレバンによる生存率は、ＤＭＳＯやグリ
セロ−ルより高く、レバンオクタオ−スやレバンビオ−
スも３０％前後で前記利点を有している。
１４に代えてニジマスの卵細胞由来のＲＴＧ−２細胞を
用いる以外は実施例１と同様に実験を行った結果を次に
示す。生存率の実験結果は次の通りであつた。レバン９
１％、レバンオクタオ−ス３２％、レバンビオ−ス２８
％、ＤＭＳＯ９０％、グリセロ−ル７４％であった。実
施例２と同様にレバンによる生存率は、ＤＭＳＯやグリ
セロ−ルより高く、レバンオクタオ−スやレバンビオ−
スも３０％前後で前記利点を有している。
【００１８】
【発明の効果】本発明の保存剤は、細胞に対する毒性が
無くまた結晶性が低い為、生細胞を優れた効率で凍結状
態で保存できる。さらには解凍した後に培養する場合に
も洗浄を必要とせず、気軽に利用できるという効果を奏
するものである。
無くまた結晶性が低い為、生細胞を優れた効率で凍結状
態で保存できる。さらには解凍した後に培養する場合に
も洗浄を必要とせず、気軽に利用できるという効果を奏
するものである。
Claims (2)
- 【請求項１】 レバンまたはレバンオリゴ糖を有効成分
として含有する生細胞の保存剤。 - 【請求項２】 生細胞が魚類細胞である請求項１に記載
の保存剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7038196A JPH09255501A (ja) | 1996-03-26 | 1996-03-26 | 生細胞の保存剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7038196A JPH09255501A (ja) | 1996-03-26 | 1996-03-26 | 生細胞の保存剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09255501A true JPH09255501A (ja) | 1997-09-30 |
Family
ID=13429817
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7038196A Pending JPH09255501A (ja) | 1996-03-26 | 1996-03-26 | 生細胞の保存剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09255501A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7476660B2 (en) * | 2002-03-28 | 2009-01-13 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Composition and method for organ preservation |
| JP2012235728A (ja) * | 2011-05-11 | 2012-12-06 | Univ Of Fukui | 細胞の凍結保存液および凍結保存方法 |
-
1996
- 1996-03-26 JP JP7038196A patent/JPH09255501A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7476660B2 (en) * | 2002-03-28 | 2009-01-13 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Composition and method for organ preservation |
| JP2012235728A (ja) * | 2011-05-11 | 2012-12-06 | Univ Of Fukui | 細胞の凍結保存液および凍結保存方法 |
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