JPH09235298A - 梅毒トレポネマ融合抗原及び該融合抗原を用いた抗梅毒トレポネマ抗体の測定方法 - Google Patents
梅毒トレポネマ融合抗原及び該融合抗原を用いた抗梅毒トレポネマ抗体の測定方法Info
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- JPH09235298A JPH09235298A JP8355804A JP35580496A JPH09235298A JP H09235298 A JPH09235298 A JP H09235298A JP 8355804 A JP8355804 A JP 8355804A JP 35580496 A JP35580496 A JP 35580496A JP H09235298 A JPH09235298 A JP H09235298A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 複数の梅毒トレポネマ抗原を融合させた梅毒
トレポネマ融合抗原及び該融合抗原を用いた抗梅毒トレ
ポネマ抗体の測定方法。 【効果】 本発明により、抗Ｔｐ抗体との反応性の高い
Ｔｐ融合抗原が簡便な精製操作で得られ、該融合抗原を
抗Ｔｐ抗体測定方法に用いることにより、従来より高い
感度で抗Ｔｐ抗体を測定することができる。
トレポネマ融合抗原及び該融合抗原を用いた抗梅毒トレ
ポネマ抗体の測定方法。 【効果】 本発明により、抗Ｔｐ抗体との反応性の高い
Ｔｐ融合抗原が簡便な精製操作で得られ、該融合抗原を
抗Ｔｐ抗体測定方法に用いることにより、従来より高い
感度で抗Ｔｐ抗体を測定することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、梅毒トレポネマの
融合抗原及び該融合抗原を用いた抗梅毒トレポネマ抗体
の測定方法に関する。
融合抗原及び該融合抗原を用いた抗梅毒トレポネマ抗体
の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】梅毒は、梅毒トレポネマ（トレポネマ・
パリダム Treponema pallidum 、以下本明細書中ではＴ
ｐと記載することがある）により引き起こされる感染症
である。Ｔｐはスピロヘーターの一種で、Ｔｐ抗原とし
てその細胞表面上に数種の表面抗原が存在することが確
認されている（The Journal of Immunology, Vol.129,
p.833-838, 1982; The Journal of Immunology, Vol.12
9, p.1287-1291, 1982;Journal of Clinical Microbiol
ogy, Vol.21, p.82-87, 1985; Journal of Clinical Mi
crobiology, Vol.30, p.115-122, 1992）。Ｔｐに感染
すると、これらの表面抗原に対する抗体が血液中に産生
されるため、血液中の抗Ｔｐ抗体の有無を検査すること
によって梅毒の診断が行われている。
パリダム Treponema pallidum 、以下本明細書中ではＴ
ｐと記載することがある）により引き起こされる感染症
である。Ｔｐはスピロヘーターの一種で、Ｔｐ抗原とし
てその細胞表面上に数種の表面抗原が存在することが確
認されている（The Journal of Immunology, Vol.129,
p.833-838, 1982; The Journal of Immunology, Vol.12
9, p.1287-1291, 1982;Journal of Clinical Microbiol
ogy, Vol.21, p.82-87, 1985; Journal of Clinical Mi
crobiology, Vol.30, p.115-122, 1992）。Ｔｐに感染
すると、これらの表面抗原に対する抗体が血液中に産生
されるため、血液中の抗Ｔｐ抗体の有無を検査すること
によって梅毒の診断が行われている。
【０００３】抗Ｔｐ抗体の有無を調べるには、Ｔｐ抗原
と患者血液中の抗Ｔｐ抗体との抗原抗体反応を応用した
免疫測定法を用いるのが一般的であるが、抗Ｔｐ抗体の
免疫測定のためには、Ｔｐ抗原が多量に必要となる。し
かしながら、Ｔｐは生体外で大量培養できないため、従
来はＴｐをウサギ睾丸に接種し、Ｔｐに感染したウサギ
睾丸からＴｐ抗原を精製するという方法が用いられてき
た（Acta Pathol Microbiol Scand [B],Vol.83, p.157-
160, 1975 ）。この方法では、ウサギ生体内でＴｐを培
養するため、ウサギの個体差や精製不純物の混入等の問
題があり、再現性よく大量にＴｐ抗原を入手するのは大
変困難であった。
と患者血液中の抗Ｔｐ抗体との抗原抗体反応を応用した
免疫測定法を用いるのが一般的であるが、抗Ｔｐ抗体の
免疫測定のためには、Ｔｐ抗原が多量に必要となる。し
かしながら、Ｔｐは生体外で大量培養できないため、従
来はＴｐをウサギ睾丸に接種し、Ｔｐに感染したウサギ
睾丸からＴｐ抗原を精製するという方法が用いられてき
た（Acta Pathol Microbiol Scand [B],Vol.83, p.157-
160, 1975 ）。この方法では、ウサギ生体内でＴｐを培
養するため、ウサギの個体差や精製不純物の混入等の問
題があり、再現性よく大量にＴｐ抗原を入手するのは大
変困難であった。
【０００４】近年、遺伝子工学技術の進歩により、Ｔｐ
の表面抗原をコードする遺伝子をクローニングし、人工
的にＴｐ抗原を大量生産する技術が進歩してきた（Scie
nce,Vol.216, p.522-523, 1982; Infection and Immuni
ty, Vol.36, p.1238-1241,1982; Infection and Immuni
ty, Vol.41, p.709-721, 1983; Infection and Immunit
y, Vol.42, p.435-445, 1983; Infection and Immunit
y, Vol.42, p.187-196, 1983; Journal of Bacteriolog
y, Vol.162, p1227-1237, 1985; Infection and Immuni
ty, Vol.54, p.500-506, 1986; Infection and Immunit
y, Vol.56, p.71-78, 1988; Infection and Immunity,
Vol.57, p.2612-2623, 1989; Infection and Immunity,
Vol.57, p.3708-3714, 1989; Molecular Microbiolog
y, Vol.4, p.1371-1379,1990; Infection and Immunit
y, Vol.58, p.1697-1704, 1990; Infection and Immuni
ty, Vol.61, p.1202-1210, 1993; 特表平２−５００４
０３）。このような遺伝子工学技術を用いれば、生きた
動物を用いることなくＴｐ抗原を大量生産することがで
きるが、Ｔｐの表面抗原の種類によっては、その抗原を
コードする遺伝子だけではほとんど抗原を発現しないも
のがある。そこで、このような、目的物質をコードする
遺伝子のみでは発現しにくい物質を用いる場合は、大腸
菌由来のチオレドキシン（以下本明細書中ではＴＲＸと
記載することがある）や日本住血吸虫由来のグルタチオ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下本明細書中ではＧＳ
Ｔと記載することがある）等の遺伝子と目的物質の遺伝
子とを融合させた融合遺伝子で目的物質を発現させる方
法が提案され（特表平５−５０７２０９、特表平１−５
０３４４１）、Ｔｐの表面抗原の一つである１７ｋＤａ
抗原や１５ｋＤａ抗原にＧＳＴを融合したＧＳＴ１５ｋ
Ｄａ抗原やＧＳＴ１７ｋＤａ抗原は、抗Ｔｐ抗体の測定
に用いると高い感度を示すことも見いだされた（特願平
７−６３３６５）。
の表面抗原をコードする遺伝子をクローニングし、人工
的にＴｐ抗原を大量生産する技術が進歩してきた（Scie
nce,Vol.216, p.522-523, 1982; Infection and Immuni
ty, Vol.36, p.1238-1241,1982; Infection and Immuni
ty, Vol.41, p.709-721, 1983; Infection and Immunit
y, Vol.42, p.435-445, 1983; Infection and Immunit
y, Vol.42, p.187-196, 1983; Journal of Bacteriolog
y, Vol.162, p1227-1237, 1985; Infection and Immuni
ty, Vol.54, p.500-506, 1986; Infection and Immunit
y, Vol.56, p.71-78, 1988; Infection and Immunity,
Vol.57, p.2612-2623, 1989; Infection and Immunity,
Vol.57, p.3708-3714, 1989; Molecular Microbiolog
y, Vol.4, p.1371-1379,1990; Infection and Immunit
y, Vol.58, p.1697-1704, 1990; Infection and Immuni
ty, Vol.61, p.1202-1210, 1993; 特表平２−５００４
０３）。このような遺伝子工学技術を用いれば、生きた
動物を用いることなくＴｐ抗原を大量生産することがで
きるが、Ｔｐの表面抗原の種類によっては、その抗原を
コードする遺伝子だけではほとんど抗原を発現しないも
のがある。そこで、このような、目的物質をコードする
遺伝子のみでは発現しにくい物質を用いる場合は、大腸
菌由来のチオレドキシン（以下本明細書中ではＴＲＸと
記載することがある）や日本住血吸虫由来のグルタチオ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下本明細書中ではＧＳ
Ｔと記載することがある）等の遺伝子と目的物質の遺伝
子とを融合させた融合遺伝子で目的物質を発現させる方
法が提案され（特表平５−５０７２０９、特表平１−５
０３４４１）、Ｔｐの表面抗原の一つである１７ｋＤａ
抗原や１５ｋＤａ抗原にＧＳＴを融合したＧＳＴ１５ｋ
Ｄａ抗原やＧＳＴ１７ｋＤａ抗原は、抗Ｔｐ抗体の測定
に用いると高い感度を示すことも見いだされた（特願平
７−６３３６５）。
【０００５】しかしながら、大腸菌や日本住血吸虫はヒ
ト生体内に生息し得るため、ＴＲＸやＧＳＴに対して反
応する因子を血液中に持つヒトが少なからず存在する。
このような場合、Ｔｐに感染していなくても陽性反応が
生じてしまうため、診断に重大な影響を与えることは明
らかである。現在、梅毒は有効な抗生物質の開発により
充分治療可能となっており、その感染を出来るだけ早く
かつ正確に診断し、治療することが望まれている。その
ため、より高い感度と特異性を示すことの出来るＴｐ抗
原とＴｐ抗体の測定方法の提供が求められていた。
ト生体内に生息し得るため、ＴＲＸやＧＳＴに対して反
応する因子を血液中に持つヒトが少なからず存在する。
このような場合、Ｔｐに感染していなくても陽性反応が
生じてしまうため、診断に重大な影響を与えることは明
らかである。現在、梅毒は有効な抗生物質の開発により
充分治療可能となっており、その感染を出来るだけ早く
かつ正確に診断し、治療することが望まれている。その
ため、より高い感度と特異性を示すことの出来るＴｐ抗
原とＴｐ抗体の測定方法の提供が求められていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、従来の方法よりも高い感度と特異性を示すＴｐ抗原
と抗Ｔｐ抗体の測定方法を提供することである。
は、従来の方法よりも高い感度と特異性を示すＴｐ抗原
と抗Ｔｐ抗体の測定方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、従来の課
題を解決すべく鋭意研究した結果、融合したＴｐの表面
抗原をコードする遺伝子から、数種の表面抗原を融合さ
せた状態のＴｐ融合抗原を発現させたところ、従来より
もＴｐ抗原の発現量が増え、更に、該融合抗原を抗Ｔｐ
抗体測定方法の抗原として用いることにより表面抗原を
それぞれ単独で用いた測定系よりも抗Ｔｐ抗体を高い感
度で測定できるという驚くべき事実を見い出して、本発
明を完成した。すなわち、本発明は、Ｔｐの融合抗原及
び該融合抗原を用いた抗Ｔｐ抗体の測定方法を提供する
ものである。
題を解決すべく鋭意研究した結果、融合したＴｐの表面
抗原をコードする遺伝子から、数種の表面抗原を融合さ
せた状態のＴｐ融合抗原を発現させたところ、従来より
もＴｐ抗原の発現量が増え、更に、該融合抗原を抗Ｔｐ
抗体測定方法の抗原として用いることにより表面抗原を
それぞれ単独で用いた測定系よりも抗Ｔｐ抗体を高い感
度で測定できるという驚くべき事実を見い出して、本発
明を完成した。すなわち、本発明は、Ｔｐの融合抗原及
び該融合抗原を用いた抗Ｔｐ抗体の測定方法を提供する
ものである。
【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。Ｔｐの細
胞表面には種々の分子量の表面抗原が存在し、主なもの
として分子量１５ｋＤａ、１７ｋＤａ、４２ｋＤａ、４
７ｋＤａ等の抗原が知られている（The Journal of Imm
unology, Vol.129, p.833-838, 1982; The Journal of
Immunology, Vol.129, p.1287-1291, 1982; Journal of
Clinical Microbiology, Vol.21, p.82-87, 1985; Jou
rnal of Clinical Microbiology, Vol.30, p.115-122,1
992）。これらの抗原は、ノリス等によって各々ＴｐＮ
１５、ＴｐＮ１７、ＴｐＮ４４．５（ａ）、ＴｐＮ４７
と命名されている（Microbiological. Reviews,Vol.57,
p.750-779 ）（以下本明細書中では、ＴｐＮ４７を４
７Ｋ、ＴｐＮ１７を１７Ｋ、ＴｐＮ１５を１５Ｋと記載
することがある）。これらの表面抗原をコードする遺伝
子は既にクローニングされており、遺伝子工学的に抗原
が生産されている。また、これらのアミノ酸配列も決定
されている（Molecular Microbiology, Vol.4, p.1371-
1379, 1990; Infection and Immunity, Vol.61, p.1202
-1210, 1993; Journal of Bacteriology, Vol.162, p.1
227-1237, 1992; Infectionand Immunity, Vol.57, p.3
708-3714, 1989 ）。
胞表面には種々の分子量の表面抗原が存在し、主なもの
として分子量１５ｋＤａ、１７ｋＤａ、４２ｋＤａ、４
７ｋＤａ等の抗原が知られている（The Journal of Imm
unology, Vol.129, p.833-838, 1982; The Journal of
Immunology, Vol.129, p.1287-1291, 1982; Journal of
Clinical Microbiology, Vol.21, p.82-87, 1985; Jou
rnal of Clinical Microbiology, Vol.30, p.115-122,1
992）。これらの抗原は、ノリス等によって各々ＴｐＮ
１５、ＴｐＮ１７、ＴｐＮ４４．５（ａ）、ＴｐＮ４７
と命名されている（Microbiological. Reviews,Vol.57,
p.750-779 ）（以下本明細書中では、ＴｐＮ４７を４
７Ｋ、ＴｐＮ１７を１７Ｋ、ＴｐＮ１５を１５Ｋと記載
することがある）。これらの表面抗原をコードする遺伝
子は既にクローニングされており、遺伝子工学的に抗原
が生産されている。また、これらのアミノ酸配列も決定
されている（Molecular Microbiology, Vol.4, p.1371-
1379, 1990; Infection and Immunity, Vol.61, p.1202
-1210, 1993; Journal of Bacteriology, Vol.162, p.1
227-1237, 1992; Infectionand Immunity, Vol.57, p.3
708-3714, 1989 ）。
【０００９】本発明の融合抗原に用いるＴｐの表面抗原
は、Ｔｐの細胞表面に存在する全ての表面抗原を意味
し、例えば、４７Ｋ、１７Ｋ、１５Ｋ等の抗原を挙げる
ことができる。また本発明に用いる表面抗原は、その抗
原性を損なわない範囲内で適宜修飾して用いることがで
きる。例えば、Ｔｐの表面抗原をコードするＤＮＡ配列
のＮ末端には２０アミノ酸前後のシグナルペプチドがあ
るが、ネイティブ抗原ではシグナルペプチドは削除され
ている。これは表面抗原のＤＮＡ翻訳が終了した後、シ
グナルペプチダーゼＩＩによってシグナルペプチドが切
断されるためと考えられている（Microbial Pathogenes
is, Vol.7, p.175-188, 1989; Infectionand Immunity,
Vol.61, p.1202-1210, 1993; Molecular Microbiology,
Vol.4, p.1371-1379, 1990; Infection and Immunity,
Vol.60, p.1568-1576, 1993）。本発明の融合抗原で
は、このようなＮ末端のシグナルペプチドを含む抗原で
も、シグナルペプチドを含まない抗原でも融合抗原とし
て用いることができる。また、例えば、４７Ｋでは本体
の４３４アミノ酸のＣ末端の後ろに更に９アミノ酸が付
加している可能性が報告されている（Infection and Im
munity, Vol. 60, p1568-1576, 1992 ）。このような場
合、シグナルペプチドを含まないようにデザインされた
センスプライマーと、Ｃ末端以降の９アミノ酸に対応す
るＤＮＡ配列を加えたアンチセンスプライマーを使用す
ることにより４７ＫをコードするＤＮＡ断片を作製し、
４７Ｋとして用いることもできる。
は、Ｔｐの細胞表面に存在する全ての表面抗原を意味
し、例えば、４７Ｋ、１７Ｋ、１５Ｋ等の抗原を挙げる
ことができる。また本発明に用いる表面抗原は、その抗
原性を損なわない範囲内で適宜修飾して用いることがで
きる。例えば、Ｔｐの表面抗原をコードするＤＮＡ配列
のＮ末端には２０アミノ酸前後のシグナルペプチドがあ
るが、ネイティブ抗原ではシグナルペプチドは削除され
ている。これは表面抗原のＤＮＡ翻訳が終了した後、シ
グナルペプチダーゼＩＩによってシグナルペプチドが切
断されるためと考えられている（Microbial Pathogenes
is, Vol.7, p.175-188, 1989; Infectionand Immunity,
Vol.61, p.1202-1210, 1993; Molecular Microbiology,
Vol.4, p.1371-1379, 1990; Infection and Immunity,
Vol.60, p.1568-1576, 1993）。本発明の融合抗原で
は、このようなＮ末端のシグナルペプチドを含む抗原で
も、シグナルペプチドを含まない抗原でも融合抗原とし
て用いることができる。また、例えば、４７Ｋでは本体
の４３４アミノ酸のＣ末端の後ろに更に９アミノ酸が付
加している可能性が報告されている（Infection and Im
munity, Vol. 60, p1568-1576, 1992 ）。このような場
合、シグナルペプチドを含まないようにデザインされた
センスプライマーと、Ｃ末端以降の９アミノ酸に対応す
るＤＮＡ配列を加えたアンチセンスプライマーを使用す
ることにより４７ＫをコードするＤＮＡ断片を作製し、
４７Ｋとして用いることもできる。
【００１０】本発明のＴｐ融合抗原はこれらの表面抗原
の遺伝子を互いに融合して発現させた抗原である。Ｔｐ
表面抗原の遺伝子を融合するにあたっては、その組み合
わせはＴｐの表面抗原であればいずれの抗原でもよく、
異なる抗原同士、同じ抗原同士等、融合する組み合わせ
に制限があるものではない。
の遺伝子を互いに融合して発現させた抗原である。Ｔｐ
表面抗原の遺伝子を融合するにあたっては、その組み合
わせはＴｐの表面抗原であればいずれの抗原でもよく、
異なる抗原同士、同じ抗原同士等、融合する組み合わせ
に制限があるものではない。
【００１１】本発明の融合抗原を発現させるには、通常
の遺伝子工学技術を用いることができる。すなわち、ウ
サギ睾丸等で増やしたＴｐからジェノミックＤＮＡを抽
出し、これを鋳型とする。既知のＤＮＡ配列を元に作製
したプライマーを用いて、ＰＣＲ法によりそれぞれの表
面抗原をコードするＤＮＡ断片を得、これらのＤＮＡ断
片をリコンビナントＰＣＲ法、あるいはＤＮＡライゲー
スを用いて融合させ、融合抗原に相当するＤＮＡ断片を
得る。このＤＮＡ断片を挿入したベクターを大腸菌等の
宿主に挿入し、この菌を培養等により増やした後、融合
抗原の発現を誘導する。宿主破砕、電気泳動等の精製手
段を経て、目的の融合抗原を入手する（Molecular Clon
ing A LABORATORY MANUAL SECOND EDITION 1989 ）。
の遺伝子工学技術を用いることができる。すなわち、ウ
サギ睾丸等で増やしたＴｐからジェノミックＤＮＡを抽
出し、これを鋳型とする。既知のＤＮＡ配列を元に作製
したプライマーを用いて、ＰＣＲ法によりそれぞれの表
面抗原をコードするＤＮＡ断片を得、これらのＤＮＡ断
片をリコンビナントＰＣＲ法、あるいはＤＮＡライゲー
スを用いて融合させ、融合抗原に相当するＤＮＡ断片を
得る。このＤＮＡ断片を挿入したベクターを大腸菌等の
宿主に挿入し、この菌を培養等により増やした後、融合
抗原の発現を誘導する。宿主破砕、電気泳動等の精製手
段を経て、目的の融合抗原を入手する（Molecular Clon
ing A LABORATORY MANUAL SECOND EDITION 1989 ）。
【００１２】ＤＮＡ断片をベクターに挿入するには、例
えば、発現ベクターのマルチクローニングサイトに、Ｎ
ｄｅＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、
ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ等の制限酵素認
識部位を用いて、融合するＴｐ抗原のＤＮＡ断片を挿入
することができる。
えば、発現ベクターのマルチクローニングサイトに、Ｎ
ｄｅＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、
ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ等の制限酵素認
識部位を用いて、融合するＴｐ抗原のＤＮＡ断片を挿入
することができる。
【００１３】また、ベクターに挿入するＤＮＡ断片は、
融合するＤＮＡ断片を別々に挿入することも、あらかじ
めリコンビナントＰＣＲ法等によりＤＮＡ断片同士を直
接結合させたものを挿入することもできる。これらの制
限酵素認識部位を用てＤＮＡ断片を挿入すると、挿入し
たＤＮＡ断片の間にリンカーとして短いアミノ酸が挟ま
れることがある。このリンカーは、リコンビナントＰＣ
Ｒ法にてＤＮＡ断片を融合してから発現ベクターのマル
チクローニングサイトに挿入することにより除去するこ
ともできるが、リンカーを含んだまま融合抗原を発現さ
せてもよい。
融合するＤＮＡ断片を別々に挿入することも、あらかじ
めリコンビナントＰＣＲ法等によりＤＮＡ断片同士を直
接結合させたものを挿入することもできる。これらの制
限酵素認識部位を用てＤＮＡ断片を挿入すると、挿入し
たＤＮＡ断片の間にリンカーとして短いアミノ酸が挟ま
れることがある。このリンカーは、リコンビナントＰＣ
Ｒ法にてＤＮＡ断片を融合してから発現ベクターのマル
チクローニングサイトに挿入することにより除去するこ
ともできるが、リンカーを含んだまま融合抗原を発現さ
せてもよい。
【００１４】本発明の融合抗原としては、例えば、Ｎ末
からＣ末への抗原の並びに対応して、４７Ｋ、１７Ｋ及
び１５Ｋを融合した融合抗原（以下本明細書中では４７
−１７−１５と記載する）、４７Ｋ、１５Ｋ及び１７Ｋ
を融合した融合抗原（以下本明細書中では４７−１５−
１７と記載する）、１５Ｋ、１７Ｋ及び４７Ｋを融合し
た融合抗原（以下本明細書中では１５−１７−４７と記
載する）、１５Ｋ、４７Ｋ及び１７Ｋを融合した融合抗
原（以下本明細書中では１５−４７−１７と記載す
る）、１７Ｋ、１５Ｋ及び４７Ｋを融合した融合抗原
（以下本明細書中では１７−１５−４７と記載する）、
１７Ｋ、４７Ｋ及び１５Ｋを融合した融合抗原（以下本
明細書中では１７−４７−１５と記載する）、４７Ｋ及
び１７Ｋを融合した融合抗原（以下本明細書中では４７
−１７と記載する）、４７Ｋ及び１５Ｋを融合した融合
抗原（以下本明細書中では４７−１５と記載する）、１
７Ｋ及び４７Ｋを融合した融合抗原（以下本明細書中で
は１７−４７と記載する）、１７Ｋ及び１５Ｋを融合し
た融合抗原（以下本明細書中では１７−１５と記載す
る）、１５Ｋ及び４７Ｋを融合した融合抗原（以下本明
細書中では１５−４７と記載する）、１５Ｋ及び１７Ｋ
を融合した融合抗原（以下本明細書中では１５−１７と
記載する）、１５Ｋ同士を２つ融合した融合抗原（以下
本明細書中では１５−１５と記載する）、１５Ｋ同士を
３つ融合した融合抗原（以下本明細書中では１５−１５
−１５と記載する）、１５Ｋ同士を４つ融合した融合抗
原（以下本明細書中では１５−１５−１５−１５と記載
する）等を挙げることができる。
からＣ末への抗原の並びに対応して、４７Ｋ、１７Ｋ及
び１５Ｋを融合した融合抗原（以下本明細書中では４７
−１７−１５と記載する）、４７Ｋ、１５Ｋ及び１７Ｋ
を融合した融合抗原（以下本明細書中では４７−１５−
１７と記載する）、１５Ｋ、１７Ｋ及び４７Ｋを融合し
た融合抗原（以下本明細書中では１５−１７−４７と記
載する）、１５Ｋ、４７Ｋ及び１７Ｋを融合した融合抗
原（以下本明細書中では１５−４７−１７と記載す
る）、１７Ｋ、１５Ｋ及び４７Ｋを融合した融合抗原
（以下本明細書中では１７−１５−４７と記載する）、
１７Ｋ、４７Ｋ及び１５Ｋを融合した融合抗原（以下本
明細書中では１７−４７−１５と記載する）、４７Ｋ及
び１７Ｋを融合した融合抗原（以下本明細書中では４７
−１７と記載する）、４７Ｋ及び１５Ｋを融合した融合
抗原（以下本明細書中では４７−１５と記載する）、１
７Ｋ及び４７Ｋを融合した融合抗原（以下本明細書中で
は１７−４７と記載する）、１７Ｋ及び１５Ｋを融合し
た融合抗原（以下本明細書中では１７−１５と記載す
る）、１５Ｋ及び４７Ｋを融合した融合抗原（以下本明
細書中では１５−４７と記載する）、１５Ｋ及び１７Ｋ
を融合した融合抗原（以下本明細書中では１５−１７と
記載する）、１５Ｋ同士を２つ融合した融合抗原（以下
本明細書中では１５−１５と記載する）、１５Ｋ同士を
３つ融合した融合抗原（以下本明細書中では１５−１５
−１５と記載する）、１５Ｋ同士を４つ融合した融合抗
原（以下本明細書中では１５−１５−１５−１５と記載
する）等を挙げることができる。
【００１５】一般に抗Ｔｐ抗体の測定系では、４７Ｋ、
１７Ｋ、１５Ｋ等のＴｐ主要抗原を混合して使用するた
め、必要な抗原をそれぞれ別々に精製しなければならな
い。本発明の融合抗原を用いると、複数の抗原を含む融
合抗原を単一の抗原として精製し、簡便に入手すること
ができる。
１７Ｋ、１５Ｋ等のＴｐ主要抗原を混合して使用するた
め、必要な抗原をそれぞれ別々に精製しなければならな
い。本発明の融合抗原を用いると、複数の抗原を含む融
合抗原を単一の抗原として精製し、簡便に入手すること
ができる。
【００１６】また１７Ｋ及び１５Ｋの抗原は、該抗原を
コードする遺伝子それ自体ではほとんど発現しないた
め、ＴＲＸ、ＧＳＴ等の蛋白との融合蛋白として発現さ
せている。しかしながら、Ｔｐ抗原以外の異種抗原の遺
伝子を含んだ融合遺伝子により発現された融合抗原は、
Ｔｐ抗原には由来しない予想外の非特異反応を引き起こ
す可能性がある。本発明の融合抗原は、Ｔｐ抗原だけを
融合させた抗原であり、発現させた融合抗原の中にはＴ
ｐ抗原以外の異種抗原がないため、抗Ｔｐ抗体を特異的
に測定するための抗原として大変優れているのである。
コードする遺伝子それ自体ではほとんど発現しないた
め、ＴＲＸ、ＧＳＴ等の蛋白との融合蛋白として発現さ
せている。しかしながら、Ｔｐ抗原以外の異種抗原の遺
伝子を含んだ融合遺伝子により発現された融合抗原は、
Ｔｐ抗原には由来しない予想外の非特異反応を引き起こ
す可能性がある。本発明の融合抗原は、Ｔｐ抗原だけを
融合させた抗原であり、発現させた融合抗原の中にはＴ
ｐ抗原以外の異種抗原がないため、抗Ｔｐ抗体を特異的
に測定するための抗原として大変優れているのである。
【００１７】ウイルス感染を診断する抗体測定法の場
合、既に複数の同種抗原を融合させた一つの融合抗原
を、抗体測定の抗原として用いる例が知られている（He
patology, Vol.14, p.381-387, 1991 ）。しかしなが
ら、本発明の融合抗原は、各表面抗原をそれぞれ単独で
用いた場合よりはるかに抗Ｔｐ抗体との反応性が高く、
該融合抗原を抗Ｔｐ抗体の測定系に用いることで、従来
にない高い測定感度をもった抗Ｔｐ抗体測定方法が提供
できるのである。また、本発明では、主要表面抗原のう
ち１７Ｋと１５Ｋの表面抗原はその遺伝子だけではほと
んど発現せず、他のＴｐ抗原と組み合わせた融合抗原と
した場合には驚異的に発現量が増えるという驚くべき事
実がある。
合、既に複数の同種抗原を融合させた一つの融合抗原
を、抗体測定の抗原として用いる例が知られている（He
patology, Vol.14, p.381-387, 1991 ）。しかしなが
ら、本発明の融合抗原は、各表面抗原をそれぞれ単独で
用いた場合よりはるかに抗Ｔｐ抗体との反応性が高く、
該融合抗原を抗Ｔｐ抗体の測定系に用いることで、従来
にない高い測定感度をもった抗Ｔｐ抗体測定方法が提供
できるのである。また、本発明では、主要表面抗原のう
ち１７Ｋと１５Ｋの表面抗原はその遺伝子だけではほと
んど発現せず、他のＴｐ抗原と組み合わせた融合抗原と
した場合には驚異的に発現量が増えるという驚くべき事
実がある。
【００１８】本発明の融合抗原は、抗Ｔｐ抗体の測定方
法に用いることができる。抗Ｔｐ抗体の測定方法とは、
該融合抗原を抗Ｔｐ抗体測定方法の抗原として用いる測
定方法で、検体中の抗Ｔｐ抗体と該融合抗原との免疫反
応に基づく測定方法であれば、その反応方法はどのよう
な方法であってもよい。種々の免疫測定方法が当業者に
とって周知であり、例えば、反応形式で分類すれば、凝
集法、比濁法、サンドイッチ法、競合法等、また標識体
で分類すれば、酵素免疫分析法、蛍光免疫分析法、発光
免疫分析法、放射免疫分析法等を挙げることができる。
これらのうち、専用の設備を必要としない凝集法、多数
検体の操作に適している酵素免疫法によるＥＬＩＳＡ
法、高感度化および自動化が進んでいる発光免疫分析法
等が特に好ましい。
法に用いることができる。抗Ｔｐ抗体の測定方法とは、
該融合抗原を抗Ｔｐ抗体測定方法の抗原として用いる測
定方法で、検体中の抗Ｔｐ抗体と該融合抗原との免疫反
応に基づく測定方法であれば、その反応方法はどのよう
な方法であってもよい。種々の免疫測定方法が当業者に
とって周知であり、例えば、反応形式で分類すれば、凝
集法、比濁法、サンドイッチ法、競合法等、また標識体
で分類すれば、酵素免疫分析法、蛍光免疫分析法、発光
免疫分析法、放射免疫分析法等を挙げることができる。
これらのうち、専用の設備を必要としない凝集法、多数
検体の操作に適している酵素免疫法によるＥＬＩＳＡ
法、高感度化および自動化が進んでいる発光免疫分析法
等が特に好ましい。
【００１９】本発明の融合抗原を抗Ｔｐ抗体の測定に用
いるには、例えば、凝集法の場合、本発明の融合抗原を
ラテックス、ゼラチン粒子、磁性粒子等の担体に感作
し、非特異吸着部位をブロッキングする。検体と融合抗
原感作担体とを一定時間反応させた後、免疫反応によっ
て生じた凝集を濁度、凝集像等を指標として検出するこ
とにより、検体中の抗Ｔｐ抗体量を測定できる。
いるには、例えば、凝集法の場合、本発明の融合抗原を
ラテックス、ゼラチン粒子、磁性粒子等の担体に感作
し、非特異吸着部位をブロッキングする。検体と融合抗
原感作担体とを一定時間反応させた後、免疫反応によっ
て生じた凝集を濁度、凝集像等を指標として検出するこ
とにより、検体中の抗Ｔｐ抗体量を測定できる。
【００２０】またＥＬＩＳＡ法の場合は、本発明の融合
抗原をマイクロタイタープレートのウェルに感作し、非
特異吸着部位をブロッキングする。融合抗原感作プレー
トのウェルに検体を加えて一定時間反応させ、ウェル内
を洗浄後、ペルオキシダーゼ等の酵素で標識した抗ヒト
免疫グロブリン抗体を反応させる。ウェル内を洗浄後、
標識酵素に対する基質を加えて酵素反応を行い、酵素活
性を測定することにより、検体中の抗Ｔｐ抗体量を測定
できる。
抗原をマイクロタイタープレートのウェルに感作し、非
特異吸着部位をブロッキングする。融合抗原感作プレー
トのウェルに検体を加えて一定時間反応させ、ウェル内
を洗浄後、ペルオキシダーゼ等の酵素で標識した抗ヒト
免疫グロブリン抗体を反応させる。ウェル内を洗浄後、
標識酵素に対する基質を加えて酵素反応を行い、酵素活
性を測定することにより、検体中の抗Ｔｐ抗体量を測定
できる。
【００２１】尚、本技術分野においてはこのような凝集
法やＥＬＩＳＡ法は周知の技術であり、本発明の測定方
法は、これに限定されるものではない。本発明の測定方
法に供する検体としては、梅毒トレポネマの診断を行う
べきヒトや動物の血清等の体液及びその希釈物を挙げる
ことができる。
法やＥＬＩＳＡ法は周知の技術であり、本発明の測定方
法は、これに限定されるものではない。本発明の測定方
法に供する検体としては、梅毒トレポネマの診断を行う
べきヒトや動物の血清等の体液及びその希釈物を挙げる
ことができる。
【００２２】
【実施例】本発明を以下参考例及び実施例により更に詳
細に説明する。 参考例１ 抗４７Ｋモノクローナル抗体、抗１７Ｋモノ
クローナル抗体及び抗１５Ｋモノクローナル抗体の作製 Ｔｐの表面抗原として４７Ｋと、１７Ｋ又は１５ＫのＮ
末端にＧＳＴを融合したＧＳＴ１７Ｋ又はＧＳＴ１５Ｋ
とをそれぞれ大腸菌により発現させ精製した。それぞれ
の組換え体抗原を免疫したマウスから採取した脾臓細胞
とマウスミエローマ細胞とを細胞融合させ、ハイブリド
ーマを作製した。各ハイブリドーマを培養し、上記の組
換え体抗原を用いたＥＬＩＳＡ及びネイティブ抗原を用
いたウェスタンブロットにより、組換え体抗原と反応
し、かつネイティブ抗原にも反応するハイブリドーマを
スクリーニングした。スクリーニングしたハイブリドー
マをクローニングしてセルラインを確立した。確立した
クローンをマウス腹腔内に注入し腹水を採取した後、そ
の腹水を精製することにより抗４７Ｋモノクローナル抗
体（以下本明細書中では４７ＫＭａｂと記載する）、抗
１７Ｋモノクローナル抗体（以下本明細書中では１７Ｋ
Ｍａｂと記載する）及び抗１５Ｋモノクローナル抗体
（以下本明細書中では１５ＫＭａｂと記載する）を得
た。
細に説明する。 参考例１ 抗４７Ｋモノクローナル抗体、抗１７Ｋモノ
クローナル抗体及び抗１５Ｋモノクローナル抗体の作製 Ｔｐの表面抗原として４７Ｋと、１７Ｋ又は１５ＫのＮ
末端にＧＳＴを融合したＧＳＴ１７Ｋ又はＧＳＴ１５Ｋ
とをそれぞれ大腸菌により発現させ精製した。それぞれ
の組換え体抗原を免疫したマウスから採取した脾臓細胞
とマウスミエローマ細胞とを細胞融合させ、ハイブリド
ーマを作製した。各ハイブリドーマを培養し、上記の組
換え体抗原を用いたＥＬＩＳＡ及びネイティブ抗原を用
いたウェスタンブロットにより、組換え体抗原と反応
し、かつネイティブ抗原にも反応するハイブリドーマを
スクリーニングした。スクリーニングしたハイブリドー
マをクローニングしてセルラインを確立した。確立した
クローンをマウス腹腔内に注入し腹水を採取した後、そ
の腹水を精製することにより抗４７Ｋモノクローナル抗
体（以下本明細書中では４７ＫＭａｂと記載する）、抗
１７Ｋモノクローナル抗体（以下本明細書中では１７Ｋ
Ｍａｂと記載する）及び抗１５Ｋモノクローナル抗体
（以下本明細書中では１５ＫＭａｂと記載する）を得
た。
【００２３】参考例２ 発現ベクターｐＷ６Ａの作製 ファルマシア社製ベクターｐＧＥＸ２Ｔよりｔａｃプロ
モーターとＧＳＴをコードする塩基配列を除去し、プロ
メガ社製ｐＧＥＭＥＸ−１のＴ７プロモーターからｇｅ
ｎｅ１０、マルチクローニングサイト、Ｔ７トランスク
リプショナル・ターミネーターまでの塩基配列を挿入し
た。得られたベクターからｇｅｎｅ１０の塩基配列を除
去し、Ｔ７プロモーターの直後にＤＮＡ合成装置（アプ
ライドバイオシステム社製モデル３８１Ａ）にて合成し
たｌａｃオペレーターを挿入し、マルチクローニングサ
イトを一部改変した。こうしてできた発現ベクターをｐ
Ｗ６Ａと命名した。ｐＷ６Ａの詳細図を図１に示す。
モーターとＧＳＴをコードする塩基配列を除去し、プロ
メガ社製ｐＧＥＭＥＸ−１のＴ７プロモーターからｇｅ
ｎｅ１０、マルチクローニングサイト、Ｔ７トランスク
リプショナル・ターミネーターまでの塩基配列を挿入し
た。得られたベクターからｇｅｎｅ１０の塩基配列を除
去し、Ｔ７プロモーターの直後にＤＮＡ合成装置（アプ
ライドバイオシステム社製モデル３８１Ａ）にて合成し
たｌａｃオペレーターを挿入し、マルチクローニングサ
イトを一部改変した。こうしてできた発現ベクターをｐ
Ｗ６Ａと命名した。ｐＷ６Ａの詳細図を図１に示す。
【００２４】参考例３ 各種融合抗原発現用ベクター作
製のためのプライマーの作製 以下の実施例１から１６及び参考例４で作製する各融合
抗原を発現させるベクターを作製するために、下記のよ
うなプライマーをＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシ
ステム社製モデル３８１Ａ）を用いて合成した。
製のためのプライマーの作製 以下の実施例１から１６及び参考例４で作製する各融合
抗原を発現させるベクターを作製するために、下記のよ
うなプライマーをＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシ
ステム社製モデル３８１Ａ）を用いて合成した。
【００２５】 5' ------------------------------------3' Nde I 47K-5' 末端18塩基 プライマー１ TAGCC CATATG GGCTCGTCTCATCATGAG (29塩基) （センス）
【００２６】 15K-5'末端17塩基 47K-3'末端側20塩基 プライマー２ ATAGAACTAAATGAACA AGACACACGGGATAGGACAC (37塩基) （アンチセンス）
【００２７】 15K-5'末端側17塩基 プライマー３ TGTTCATTTAGTTCTATCCC (20塩基) （センス）
【００２８】 17K-5'末端15塩基 15K-3'末端20塩基 プライマー４ TGTGCACGAGACACA CCTGCTAATAATGGCTTCCT (35塩基) （アンチセンス）
【００２９】 17K-5'末端20塩基 プライマー５ TGTGTCTCGTGCACAACCGT (20塩基) （センス）
【００３０】 BamH I 17K-3'末端21塩基 プライマー６ GATCC GGATCC CTA TTTCTTTGTTTTTTTGAGCAC (35塩基) （アンチセンス） 終止コドン
【００３１】 Nde I 15K-5'末端18塩基 プライマー７ TAGCC CATATG TGTTCATTTAGTTCTATC (29塩基) （センス）
【００３２】 Nde I 17K-5'末端18塩基 プライマー８ TAGCC CATATG TGTGTCTCGTGCACAACC (29塩基) （センス）
【００３３】 BamH I 15K-3'末端17塩基 プライマー９ GATCC GGATCC CTA CCTGCTAATAATGGCTT (31塩基) （アンチセンス） 終止コドン
【００３４】 BamH I 47K-3'末端17塩基 プライマー１０ GATCC GGATCC CTA AGACACACGGGATAGGA (31塩基) （アンチセンス） 終止コドン
【００３５】 Sal I 15K-5'末端18塩基 プライマー１１ CGAGGC GTCGAC TGTTCATTTAGTTCTATC (30塩基) （センス）
【００３６】 Sal I 47K-5'末端18塩基 プライマー１２ GAAC GTCGAC TGTGGCTCGTCTCATCAT (28塩基) （センス）
【００３７】 Xho I 47K-3'末端18塩基 プライマー１３ CTTG CTCGAG AGACACACGGGATAGGAC (28塩基) （アンチセンス）
【００３８】 Sal I 17K-5'末端18塩基 プライマー１４ AGTA GTCGAC TGTGTCTCGTGCACAACC (28塩基) （センス）
【００３９】 Xho I 17K-3'末端21塩基 プライマー１５ CAGA CTCGAG TTTCTTTGTTTTTTTGAGCAC (31塩基) （アンチセンス）
【００４０】 Sal I 17K-3'末端21塩基 プライマー１６ CAGA GTCGAC TTTCTTTGTTTTTTTGAGCAC (31塩基) （アンチセンス）
【００４１】 Sal I 15K-3'末端18塩基 プライマー１７ GCTA GTCGAC CCTGCTAATAATGGCTTC (28塩基) （アンチセンス）
【００４２】 Sac I 47K-3'末端20塩基 プライマー１８ CGTA GAGCTC AGACACACGGGATAGGACAC (30塩基) （アンチセンス）
【００４３】 Sac I 17K-5'末端20塩基 プライマー１９ TAGC GAGCTC TGTGTCTCGTGCACAACCGT (30塩基) （センス）
【００４４】 プライマー２０ BamH I 9アミノ酸をコードする塩基 47K-3'末端18塩基 GATCC GGATCC CTA AGACACACGGGATAGGACACCCCTCTT CTGGGCCACTACCTTCGC 終止コドン (59塩基) （アンチセンス）
【００４５】 Sal I 47K-3'末端18塩基 プライマー２１ CTCTT GTCGAC AGACACACGGGATAGGAC (29塩基) （アンチセンス）
【００４６】 BamH I 15K-3'末端18塩基 プライマー２２ CCGG GGATCC CCTGCTAATAATGGCTTC (28塩基) （アンチセンス）
【００４７】 BamH I 15K-5'末端18塩基 プライマー２３ CCGG GGATCC TGTTCATTTAGTTCTATC (28塩基) （センス）
【００４８】 Kpn I 15K-3'末端18塩基 プライマー２４ CCGG GGTACC CTA CCTGCTAATAATGGCTTC (31塩基) （アンチセンス） 終止コドン
【００４９】 Kpn I 15K-3'末端18塩基 プライマー２５ CCGG GGTACC CCTGCTAATAATGGCTTC (28塩基) （アンチセンス）
【００５０】 Kpn I 15K-5'末端18塩基 プライマー２６ CCGG GGTACC TGTTCATTTAGTTCTATC (28塩基) （センス）
【００５１】 Hind III 15K-3'末端15塩基 プライマー２７ CCGG AAGCTT CTA CCTGCTAATAATGGC (28塩基) （アンチセンス） 終止コドン
【００５２】 EcoR I 17K-3'末端21塩基 プライマー２８ GACT GAATTC TTTCTTTGTTTTTTTGAGCAC (31塩基) （アンチセンス）
【００５３】 EcoR I 15K-5'末端21塩基 プライマー２９ GGTG GAATTC TGTTCATTTAGTTCTATCCCG (31塩基) （センス）
【００５４】参考例４ Ｔｐ４７Ｋ、１７Ｋ、１５Ｋ遺
伝子の調製 梅毒菌（Treponema pallidum, Nicols strain ）を継代
培養したウサギ睾丸より菌をパーコール密度遠心により
精製（Sex. Transm. Dis., Vol.11, p.275-286, 1984）
し、ＳＤＳ−プロテナーゼＫ／フェノール・クロロホル
ム法によりジェノミックＤＮＡを抽出した。ポリメラー
ゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法により、センスプ
ライマーとして参考例３で作製したプライマー７を、ア
ンチセンスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー９を選択し、抽出したジェノミックＤＮＡを鋳型と
して１５Ｋ（Molecular Microbiology, Vol.4, p.1371-
1379, 1990）をコードするＤＮＡ断片を作製した。次に
センスプライマーとして参考例３で作製したプライマー
８を、又アンチセンスプライマーとして参考例３で作製
したプライマー６を選択し、１７Ｋ(Infection and Imm
unity,Vol.61, p.1202-1210, 1993 ）をコードするＤＮ
Ａ断片を作製した。更にセンスプライマーとして参考例
３で作製したプライマー１を、アンチセンスプライマー
として参考例３で作製したプライマー２０を選択し、４
７Ｋ(Infection and Immunity, Vol.60, p.1568-1576,
1992) をコードするＤＮＡ断片を作製した。４７Ｋでは
本体の４３４アミノ酸のＣ末端の後ろに更に９アミノ酸
が付加している可能性が報告されているので（Infectio
n and Immunity, Vol.60, p1568-1576, 1992）、図２に
示すように４７ＫのＤＮＡ断片の増幅の際に、使用する
アンチセンスプライマーにこの９アミノ酸に対応する塩
基配列を加えることにより４７ＫをコードするＤＮＡ断
片を作製し使用した。また、１５Ｋ及び１７Ｋをコード
するＤＮＡ断片を図３に示した。
伝子の調製 梅毒菌（Treponema pallidum, Nicols strain ）を継代
培養したウサギ睾丸より菌をパーコール密度遠心により
精製（Sex. Transm. Dis., Vol.11, p.275-286, 1984）
し、ＳＤＳ−プロテナーゼＫ／フェノール・クロロホル
ム法によりジェノミックＤＮＡを抽出した。ポリメラー
ゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法により、センスプ
ライマーとして参考例３で作製したプライマー７を、ア
ンチセンスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー９を選択し、抽出したジェノミックＤＮＡを鋳型と
して１５Ｋ（Molecular Microbiology, Vol.4, p.1371-
1379, 1990）をコードするＤＮＡ断片を作製した。次に
センスプライマーとして参考例３で作製したプライマー
８を、又アンチセンスプライマーとして参考例３で作製
したプライマー６を選択し、１７Ｋ(Infection and Imm
unity,Vol.61, p.1202-1210, 1993 ）をコードするＤＮ
Ａ断片を作製した。更にセンスプライマーとして参考例
３で作製したプライマー１を、アンチセンスプライマー
として参考例３で作製したプライマー２０を選択し、４
７Ｋ(Infection and Immunity, Vol.60, p.1568-1576,
1992) をコードするＤＮＡ断片を作製した。４７Ｋでは
本体の４３４アミノ酸のＣ末端の後ろに更に９アミノ酸
が付加している可能性が報告されているので（Infectio
n and Immunity, Vol.60, p1568-1576, 1992）、図２に
示すように４７ＫのＤＮＡ断片の増幅の際に、使用する
アンチセンスプライマーにこの９アミノ酸に対応する塩
基配列を加えることにより４７ＫをコードするＤＮＡ断
片を作製し使用した。また、１５Ｋ及び１７Ｋをコード
するＤＮＡ断片を図３に示した。
【００５５】実施例１ １５−１７融合抗原発現用ベク
ターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー７を、アンチセンスプライマーとして参考例３で作
製したプライマー４を選択した。各々のプライマー１μ
Ｍと、参考例４で作製した１５Ｋ遺伝子０．１ｎｇ及び
Ｔａｑポリメラーゼ（TaKaRa社製）２．５ユニット用い
て、９４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイク
ルの条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片１を作製した。 ｂ）参考例３で作製したプライマー５及び６と、参考例
４で作製した１７ＫをコードするＤＮＡ断片とを用い、
実施例１−ａ）と同様にＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片２を
作製した。 ｃ）実施例１−ａ）及びｂ）で作製したＤＮＡ断片１及
び２を各々１ｎｇ、参考例３で作製したプライマー７及
び６を各々１μＭ及び前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユ
ニットを用いて、９４℃１分−５５℃２分−７２℃３
分、４０サイクル後、更に７２℃１５分、１サイクルの
条件でＰＣＲ法を行い、１５−１７融合抗原をコードす
るＤＮＡ断片を作製した。 ｄ）参考例２で作製したｐＷ６Ａと実施例１−ｃ）で作
製した１５−１７融合抗原遺伝子を、ＮｄｅＩ（NEW EN
GLAND BIOLAB社製）５ユニット及びＢａｍＨＩ（NEW EN
GLAND BIOLAB社製）５ユニットで３７℃で１時間切断し
た。 ｅ）実施例１−ｄ）で調製したｐＷ６Ａ及び１５−１７
融合抗原遺伝子をTaKaRa社製Ligation Kit ver.1を用い
て、１６℃２時間の条件で反応させた。反応終了後この
反応液を用いてハナハン法で作製したコンピテント細胞
である大腸菌ＤＨ５αをトランスフォームし、５０μｇ
／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上にその菌をま
き、３７℃で一晩培養した。現れたアンピシリン耐性菌
のコロニーの中から１５−１７融合抗原遺伝子が組み込
まれた１５−１７融合抗原発現用ベクターを持つコロニ
ーを選択し、このコロニーをアンピシリンを含むＬＢ液
体培地で３７℃で一晩振盪培養し、集菌後アルカリＳＤ
Ｓ法にて目的とするベクターを精製した。結果を図４に
示す。
ターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー７を、アンチセンスプライマーとして参考例３で作
製したプライマー４を選択した。各々のプライマー１μ
Ｍと、参考例４で作製した１５Ｋ遺伝子０．１ｎｇ及び
Ｔａｑポリメラーゼ（TaKaRa社製）２．５ユニット用い
て、９４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイク
ルの条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片１を作製した。 ｂ）参考例３で作製したプライマー５及び６と、参考例
４で作製した１７ＫをコードするＤＮＡ断片とを用い、
実施例１−ａ）と同様にＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片２を
作製した。 ｃ）実施例１−ａ）及びｂ）で作製したＤＮＡ断片１及
び２を各々１ｎｇ、参考例３で作製したプライマー７及
び６を各々１μＭ及び前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユ
ニットを用いて、９４℃１分−５５℃２分−７２℃３
分、４０サイクル後、更に７２℃１５分、１サイクルの
条件でＰＣＲ法を行い、１５−１７融合抗原をコードす
るＤＮＡ断片を作製した。 ｄ）参考例２で作製したｐＷ６Ａと実施例１−ｃ）で作
製した１５−１７融合抗原遺伝子を、ＮｄｅＩ（NEW EN
GLAND BIOLAB社製）５ユニット及びＢａｍＨＩ（NEW EN
GLAND BIOLAB社製）５ユニットで３７℃で１時間切断し
た。 ｅ）実施例１−ｄ）で調製したｐＷ６Ａ及び１５−１７
融合抗原遺伝子をTaKaRa社製Ligation Kit ver.1を用い
て、１６℃２時間の条件で反応させた。反応終了後この
反応液を用いてハナハン法で作製したコンピテント細胞
である大腸菌ＤＨ５αをトランスフォームし、５０μｇ
／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上にその菌をま
き、３７℃で一晩培養した。現れたアンピシリン耐性菌
のコロニーの中から１５−１７融合抗原遺伝子が組み込
まれた１５−１７融合抗原発現用ベクターを持つコロニ
ーを選択し、このコロニーをアンピシリンを含むＬＢ液
体培地で３７℃で一晩振盪培養し、集菌後アルカリＳＤ
Ｓ法にて目的とするベクターを精製した。結果を図４に
示す。
【００５６】実施例２ １５−４７融合抗原発現用ベク
ターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー７を、アンチセンスプライマーとしてプライマー１
７を選択した。各々のプライマー１μＭと、参考例４で
作製した１５Ｋ遺伝子０．１ｎｇ及び前記Ｔａｑポリメ
ラーゼ２．５ユニットを用いて、９４℃１分−５５℃２
分−７２℃３分、３０サイクルの条件でＰＣＲ法を行い
ＤＮＡ断片３を作製した。 ｂ）実施例２−ａ）で作製したＤＮＡ断片３と参考例２
で作製したｐＷ６Ａを、ＮｄｅＩ５ユニット及びＳａｌ
Ｉ（東洋紡社製）５ユニットで３７℃１時間切断した。
反応終了後実施例１−ｅ）と同一条件で参考例２で作製
したｐＷ６ＡにＤＮＡ断片３を挿入した。 ｃ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー１２を、アンチセンスプライマーとしてプライマー
１０を選択した。各々のプライマー１μＭと、参考例４
で得た４７Ｋ遺伝子０．１ｎg 及び前記Ｔａｑポリメラ
ーゼ２．５ユニットを用いて、９４℃１分−５５℃２分
−７２℃３分、３０サイクルの条件でＰＣＲ法を行いＤ
ＮＡ断片４を得た。 ｄ）実施例２−ｂ）で作製したＤＮＡ断片３挿入ｐＷ６
Ａと実施例２−ｃ）で作製したＤＮＡ断片４を、各々前
記ＳａｌＩ５ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニットで
３７℃１時間切断した。反応終了後、実施例１−ｅ）と
同一条件でＤＮＡ断片３挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ断片４を
挿入し、１５−４７融合抗原発現用ベクターを得た。結
果を図４に示す。
ターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー７を、アンチセンスプライマーとしてプライマー１
７を選択した。各々のプライマー１μＭと、参考例４で
作製した１５Ｋ遺伝子０．１ｎｇ及び前記Ｔａｑポリメ
ラーゼ２．５ユニットを用いて、９４℃１分−５５℃２
分−７２℃３分、３０サイクルの条件でＰＣＲ法を行い
ＤＮＡ断片３を作製した。 ｂ）実施例２−ａ）で作製したＤＮＡ断片３と参考例２
で作製したｐＷ６Ａを、ＮｄｅＩ５ユニット及びＳａｌ
Ｉ（東洋紡社製）５ユニットで３７℃１時間切断した。
反応終了後実施例１−ｅ）と同一条件で参考例２で作製
したｐＷ６ＡにＤＮＡ断片３を挿入した。 ｃ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー１２を、アンチセンスプライマーとしてプライマー
１０を選択した。各々のプライマー１μＭと、参考例４
で得た４７Ｋ遺伝子０．１ｎg 及び前記Ｔａｑポリメラ
ーゼ２．５ユニットを用いて、９４℃１分−５５℃２分
−７２℃３分、３０サイクルの条件でＰＣＲ法を行いＤ
ＮＡ断片４を得た。 ｄ）実施例２−ｂ）で作製したＤＮＡ断片３挿入ｐＷ６
Ａと実施例２−ｃ）で作製したＤＮＡ断片４を、各々前
記ＳａｌＩ５ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニットで
３７℃１時間切断した。反応終了後、実施例１−ｅ）と
同一条件でＤＮＡ断片３挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ断片４を
挿入し、１５−４７融合抗原発現用ベクターを得た。結
果を図４に示す。
【００５７】実施例３ １７−４７融合抗原発現用ベク
ターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー８を、アンチセンスプライマーとして参考例３で作
製したプライマー１５を選択した。各々のプライマー１
μＭと、参考例４で作製した１７Ｋ遺伝子０．１ｎg 及
び前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニットを用いて、９
４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイクルの条
件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片５を作製した。 ｂ）実施例３−ａ）で得られたＤＮＡ断片５と参考例２
で作製したｐＷ６Ａを、前記ＮｄｅＩ５ユニット及びＸ
ｈｏＩ（東洋紡社製）５ユニットで、３７℃１時間切断
した。反応終了後、実施例１−ｅ）と同一条件でｐＷ６
ＡにＤＮＡ断片５を挿入した。 ｃ）実施例２−ｃ）で得られたＤＮＡ断片４は前記Ｓａ
ｌＩ５ユニットとＢａｍＨＩ５ユニットで、実施例３−
ｂ）で得られたＤＮＡ断片５挿入ｐＷ６Ａは前記Ｘｈｏ
Ｉ５ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニットで、３７℃
１時間切断した。その後、実施例１−ｅ）と同一条件で
ＤＮＡ断片５挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ断片４を挿入し、１
７−４７融合抗原発現用ベクターを作製した。結果を図
４に示す。
ターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー８を、アンチセンスプライマーとして参考例３で作
製したプライマー１５を選択した。各々のプライマー１
μＭと、参考例４で作製した１７Ｋ遺伝子０．１ｎg 及
び前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニットを用いて、９
４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイクルの条
件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片５を作製した。 ｂ）実施例３−ａ）で得られたＤＮＡ断片５と参考例２
で作製したｐＷ６Ａを、前記ＮｄｅＩ５ユニット及びＸ
ｈｏＩ（東洋紡社製）５ユニットで、３７℃１時間切断
した。反応終了後、実施例１−ｅ）と同一条件でｐＷ６
ＡにＤＮＡ断片５を挿入した。 ｃ）実施例２−ｃ）で得られたＤＮＡ断片４は前記Ｓａ
ｌＩ５ユニットとＢａｍＨＩ５ユニットで、実施例３−
ｂ）で得られたＤＮＡ断片５挿入ｐＷ６Ａは前記Ｘｈｏ
Ｉ５ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニットで、３７℃
１時間切断した。その後、実施例１−ｅ）と同一条件で
ＤＮＡ断片５挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ断片４を挿入し、１
７−４７融合抗原発現用ベクターを作製した。結果を図
４に示す。
【００５８】実施例４ １７−１５融合抗原発現用ベク
ターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー１１を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー９を選択した。各々のプライマー１
μＭと、参考例４で作製した１５Ｋ遺伝子０．１ｎｇ及
び前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニットを用いて、９
４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイクルの条
件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片６を得た。 ｂ）実施例４−ａ）で作製したＤＮＡ断片６は前記Ｓａ
ｌＩ５ユニットとＢａｍＨＩ５ユニットで、実施例３−
ｂ）で作製したＤＮＡ断片５挿入ｐＷ６Ａは前記Ｘｈｏ
Ｉ５ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニットで３７℃１
時間切断した。反応終了後、実施例１−ｅ）と同一条件
でＤＮＡ断片５挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ断片６を挿入し、
１７−１５融合抗原発現用ベクターを作製した。結果を
図４に示す。
ターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー１１を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー９を選択した。各々のプライマー１
μＭと、参考例４で作製した１５Ｋ遺伝子０．１ｎｇ及
び前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニットを用いて、９
４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイクルの条
件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片６を得た。 ｂ）実施例４−ａ）で作製したＤＮＡ断片６は前記Ｓａ
ｌＩ５ユニットとＢａｍＨＩ５ユニットで、実施例３−
ｂ）で作製したＤＮＡ断片５挿入ｐＷ６Ａは前記Ｘｈｏ
Ｉ５ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニットで３７℃１
時間切断した。反応終了後、実施例１−ｅ）と同一条件
でＤＮＡ断片５挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ断片６を挿入し、
１７−１５融合抗原発現用ベクターを作製した。結果を
図４に示す。
【００５９】実施例５ ４７−１５融合抗原発現用ベク
ターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー１を、アンチセンスプライマーとして参考例３で作
製したプライマー２１を選択した。各々のプライマー１
μＭと、参考例４で得た４７Ｋ遺伝子０．１ｎｇ及び前
記Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニットを用いて、９４℃
１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイクルの条件で
ＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片７を得た。 ｂ）実施例５−ａ）で作製したＤＮＡ断片７とｐＷ６Ａ
を、各々前記ＮｄｅＩ５ユニット及び前記ＳａｌＩ５ユ
ニットで３７℃１時間切断した。反応終了後、実施例１
−ｅ）と同一条件でｐＷ６ＡにＤＮＡ断片７を挿入し
た。 ｃ）実施例４−ａ）で作製したＤＮＡ断片６と実施例５
−ｂ）で作製したＤＮＡ断片７挿入ｐＷ６Ａを、各々前
記ＳａｌＩ５ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニットで
３７℃１時間切断した。反応終了後、実施例１−ｅ）と
同一条件でＤＮＡ断片７挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ断片６を
挿入し、４７−１５融合抗原発現用ベクターを作製し
た。結果を図４に示す。
ターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー１を、アンチセンスプライマーとして参考例３で作
製したプライマー２１を選択した。各々のプライマー１
μＭと、参考例４で得た４７Ｋ遺伝子０．１ｎｇ及び前
記Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニットを用いて、９４℃
１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイクルの条件で
ＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片７を得た。 ｂ）実施例５−ａ）で作製したＤＮＡ断片７とｐＷ６Ａ
を、各々前記ＮｄｅＩ５ユニット及び前記ＳａｌＩ５ユ
ニットで３７℃１時間切断した。反応終了後、実施例１
−ｅ）と同一条件でｐＷ６ＡにＤＮＡ断片７を挿入し
た。 ｃ）実施例４−ａ）で作製したＤＮＡ断片６と実施例５
−ｂ）で作製したＤＮＡ断片７挿入ｐＷ６Ａを、各々前
記ＳａｌＩ５ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニットで
３７℃１時間切断した。反応終了後、実施例１−ｅ）と
同一条件でＤＮＡ断片７挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ断片６を
挿入し、４７−１５融合抗原発現用ベクターを作製し
た。結果を図４に示す。
【００６０】実施例６ ４７−１７融合抗原発現用ベク
ターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー１４を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー６を選択した。各々のプライマー１
μＭと、参考例４で得た１７Ｋ遺伝子０．１ｎｇ及び前
記Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニットを用いて、９４℃
１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイクルの条件で
ＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片８を作製した。 ｂ）実施例６−ａ）で作製したＤＮＡ断片８と実施例５
−ｂ）で作製したＤＮＡ断片７挿入ｐＷ６Ａを、各々前
記ＳａｌＩ５ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニットで
３７℃１時間切断した。反応終了後、実施例１−ｅ）と
同一条件でＤＮＡ断片７挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ断片８を
挿入し、４７−１７融合抗原発現用ベクターを作製し
た。結果を図４に示す。
ターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー１４を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー６を選択した。各々のプライマー１
μＭと、参考例４で得た１７Ｋ遺伝子０．１ｎｇ及び前
記Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニットを用いて、９４℃
１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイクルの条件で
ＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片８を作製した。 ｂ）実施例６−ａ）で作製したＤＮＡ断片８と実施例５
−ｂ）で作製したＤＮＡ断片７挿入ｐＷ６Ａを、各々前
記ＳａｌＩ５ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニットで
３７℃１時間切断した。反応終了後、実施例１−ｅ）と
同一条件でＤＮＡ断片７挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ断片８を
挿入し、４７−１７融合抗原発現用ベクターを作製し
た。結果を図４に示す。
【００６１】実施例７ ４７−１５−１７融合抗原発現
用ベクターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー１１を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー６を選択した。各々のプライマー１
μＭと、実施例１で作製した１５−１７融合抗原発現用
ベクター０．１ｎｇ及び前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５
ユニットを用いて、９４℃１分−５５℃２分−７２℃３
分、３０サイクルの条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片９
を得た。 ｂ）実施例７−ａ）で作製したＤＮＡ断片９と実施例５
−ｂ）で作製したＤＮＡ断片７挿入ｐＷ６Ａを、各々前
記ＳａｌＩ５ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニットで
３７℃１時間切断した。反応終了後、実施例１−ｅ）と
同一条件でＤＮＡ断片７挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ断片９を
挿入し、４７−１５−１７融合抗原発現用ベクターを作
製した。結果を図５に示す。
用ベクターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー１１を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー６を選択した。各々のプライマー１
μＭと、実施例１で作製した１５−１７融合抗原発現用
ベクター０．１ｎｇ及び前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５
ユニットを用いて、９４℃１分−５５℃２分−７２℃３
分、３０サイクルの条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片９
を得た。 ｂ）実施例７−ａ）で作製したＤＮＡ断片９と実施例５
−ｂ）で作製したＤＮＡ断片７挿入ｐＷ６Ａを、各々前
記ＳａｌＩ５ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニットで
３７℃１時間切断した。反応終了後、実施例１−ｅ）と
同一条件でＤＮＡ断片７挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ断片９を
挿入し、４７−１５−１７融合抗原発現用ベクターを作
製した。結果を図５に示す。
【００６２】実施例８ １７−４７−１５融合抗原発現
用ベクターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー１２を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー２を選択した。各々のプライマー１
μＭと、参考例４で作製した４７Ｋ遺伝子０．１ｎｇ及
び前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニットを用いて、９
４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイクルの条
件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片１０を作製した。 ｂ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー３を、アンチセンスプライマーとして参考例３で作
製したプライマー９を選択した。各々のプライマー１μ
Ｍと、参考例４で作製した１５Ｋ遺伝子０．１ｎｇ及び
前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニットを用いて、９４
℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイクルの条件
でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片１１を作製した。 ｃ）実施例８−ａ）及びｂ）で作製したＤＮＡ断片１０
及び１１を各々１ｎｇと、参考例３で作製したプライマ
ー１２、９を各々１μＭ及び前記Ｔａｑポリメラーゼ
２．５ユニットを用いて、９４℃１分−５５℃２分−７
２℃３分、４０サイクル後、更に７２℃１５分、１サイ
クルの条件でＰＣＲ法を行い、４７−１５融合抗原をコ
ードする遺伝子を作製した。 ｄ）実施例８−ｃ）で得られた４７−１５融合抗原をコ
ードする遺伝子は前記ＳａｌＩ５ユニットとＢａｍＨＩ
５ユニットで、実施例３−ｂ）で作製したＤＮＡ断片５
挿入ｐＷ６Ａは前記ＸｈｏＩ５ユニット及び前記Ｂａｍ
ＨＩ５ユニットで３７℃１時間切断した。反応終了後、
実施例１−ｅ）と同一条件でＤＮＡ断片５挿入ｐＷ６Ａ
に４７−１５融合抗原をコードする遺伝子を挿入し、１
７−４７−１５融合抗原発現用ベクターを作製した。結
果を図５に示す。
用ベクターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー１２を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー２を選択した。各々のプライマー１
μＭと、参考例４で作製した４７Ｋ遺伝子０．１ｎｇ及
び前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニットを用いて、９
４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイクルの条
件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片１０を作製した。 ｂ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー３を、アンチセンスプライマーとして参考例３で作
製したプライマー９を選択した。各々のプライマー１μ
Ｍと、参考例４で作製した１５Ｋ遺伝子０．１ｎｇ及び
前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニットを用いて、９４
℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイクルの条件
でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片１１を作製した。 ｃ）実施例８−ａ）及びｂ）で作製したＤＮＡ断片１０
及び１１を各々１ｎｇと、参考例３で作製したプライマ
ー１２、９を各々１μＭ及び前記Ｔａｑポリメラーゼ
２．５ユニットを用いて、９４℃１分−５５℃２分−７
２℃３分、４０サイクル後、更に７２℃１５分、１サイ
クルの条件でＰＣＲ法を行い、４７−１５融合抗原をコ
ードする遺伝子を作製した。 ｄ）実施例８−ｃ）で得られた４７−１５融合抗原をコ
ードする遺伝子は前記ＳａｌＩ５ユニットとＢａｍＨＩ
５ユニットで、実施例３−ｂ）で作製したＤＮＡ断片５
挿入ｐＷ６Ａは前記ＸｈｏＩ５ユニット及び前記Ｂａｍ
ＨＩ５ユニットで３７℃１時間切断した。反応終了後、
実施例１−ｅ）と同一条件でＤＮＡ断片５挿入ｐＷ６Ａ
に４７−１５融合抗原をコードする遺伝子を挿入し、１
７−４７−１５融合抗原発現用ベクターを作製した。結
果を図５に示す。
【００６３】実施例９ １７−１５−４７融合抗原発現
用ベクターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー8 を、アンチセンスプライマーとして参考例３で作
製したプライマー１７を選択した。各々のプライマー１
μＭと、実施例４で作製した１７−１５融合抗原発現用
ベクター０．１ｎｇ及び前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５
ユニットを用いて、９４℃１分−５５℃２分−７２℃３
分、３０サイクルの条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片１
２を作製した。 ｂ）実施例９−ａ）で作製したＤＮＡ断片１２と参考例
２で作製したｐＷ６Ａを、各々前記ＮｄｅＩ５ユニット
及び前記ＳａｌＩ５ユニットで３７℃１時間切断した。
反応終了後、実施例１−ｅ）と同一条件でｐＷ６ＡにＤ
ＮＡ断片１２を挿入した。 ｃ）実施例２−ｃ）で作製したＤＮＡ断片４と実施例９
−ｂ）で作製したＤＮＡ断片１２挿入ｐＷ６Ａを、各々
前記ＳａｌＩ５ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニット
で３７℃１時間切断した。反応終了後、実施例１−ｅ）
と同一条件でＤＮＡ断片１２挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ断片
４を挿入し、１７−１５−４７融合抗原発現用ベクター
を作製した。結果を図５に示す。
用ベクターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー8 を、アンチセンスプライマーとして参考例３で作
製したプライマー１７を選択した。各々のプライマー１
μＭと、実施例４で作製した１７−１５融合抗原発現用
ベクター０．１ｎｇ及び前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５
ユニットを用いて、９４℃１分−５５℃２分−７２℃３
分、３０サイクルの条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片１
２を作製した。 ｂ）実施例９−ａ）で作製したＤＮＡ断片１２と参考例
２で作製したｐＷ６Ａを、各々前記ＮｄｅＩ５ユニット
及び前記ＳａｌＩ５ユニットで３７℃１時間切断した。
反応終了後、実施例１−ｅ）と同一条件でｐＷ６ＡにＤ
ＮＡ断片１２を挿入した。 ｃ）実施例２−ｃ）で作製したＤＮＡ断片４と実施例９
−ｂ）で作製したＤＮＡ断片１２挿入ｐＷ６Ａを、各々
前記ＳａｌＩ５ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニット
で３７℃１時間切断した。反応終了後、実施例１−ｅ）
と同一条件でＤＮＡ断片１２挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ断片
４を挿入し、１７−１５−４７融合抗原発現用ベクター
を作製した。結果を図５に示す。
【００６４】実施例１０ １５−４７−１７融合抗原発
現用ベクターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー１２を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー１３を選択した。各々のプライマー
１μＭと、参考例４で作製した４７Ｋ遺伝子０．１ｎｇ
及び前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニットを用いて、
９４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイクルの
条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片１３を作製した。 ｂ）実施例１０−ａ）で作製したＤＮＡ断片１３と参考
例２で作製したｐＷ６Ａを、各々前記ＳａｌＩ５ユニッ
ト及び前記ＸｈｏＩ５ユニットで３７℃１時間切断し
た。反応終了後、実施例１−ｅ）と同一条件でｐＷ６Ａ
にＤＮＡ断片１３を挿入した。 ｃ）実施例６で作製したＤＮＡ断片８は前記ＳａｌＩ５
ユニットとＢａｍＨＩ５ユニットで、実施例１０−ｂ）
で作製したＤＮＡ断片１３挿入ｐＷ６Ａは前記ＸｈｏＩ
５ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニットで３７℃１時
間切断した。反応終了後、実施例１−ｅ）と同一条件で
ＤＮＡ断片１３挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ断片８を挿入し
た。（以下、ＤＮＡ断片１３−８挿入ｐＷ６Ａと表
す。） ｄ）実施例２−ａ）で作製したＤＮＡ断片３と実施例１
０−ｃ）で作製したＤＮＡ断片１３−８挿入ｐＷ６Ａ
を、各々前記ＮｄｅＩ５ユニット及び前記ＳａｌＩ５ユ
ニットで３７℃１時間切断した。反応終了後、実施例１
−ｅ）と同一条件でＤＮＡ断片１３−８挿入ｐＷ６Ａに
ＤＮＡ断片３を挿入し、１５−４７−１７融合抗原発現
用ベクターを得た。結果を図５に示す。
現用ベクターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー１２を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー１３を選択した。各々のプライマー
１μＭと、参考例４で作製した４７Ｋ遺伝子０．１ｎｇ
及び前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニットを用いて、
９４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイクルの
条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片１３を作製した。 ｂ）実施例１０−ａ）で作製したＤＮＡ断片１３と参考
例２で作製したｐＷ６Ａを、各々前記ＳａｌＩ５ユニッ
ト及び前記ＸｈｏＩ５ユニットで３７℃１時間切断し
た。反応終了後、実施例１−ｅ）と同一条件でｐＷ６Ａ
にＤＮＡ断片１３を挿入した。 ｃ）実施例６で作製したＤＮＡ断片８は前記ＳａｌＩ５
ユニットとＢａｍＨＩ５ユニットで、実施例１０−ｂ）
で作製したＤＮＡ断片１３挿入ｐＷ６Ａは前記ＸｈｏＩ
５ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニットで３７℃１時
間切断した。反応終了後、実施例１−ｅ）と同一条件で
ＤＮＡ断片１３挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ断片８を挿入し
た。（以下、ＤＮＡ断片１３−８挿入ｐＷ６Ａと表
す。） ｄ）実施例２−ａ）で作製したＤＮＡ断片３と実施例１
０−ｃ）で作製したＤＮＡ断片１３−８挿入ｐＷ６Ａ
を、各々前記ＮｄｅＩ５ユニット及び前記ＳａｌＩ５ユ
ニットで３７℃１時間切断した。反応終了後、実施例１
−ｅ）と同一条件でＤＮＡ断片１３−８挿入ｐＷ６Ａに
ＤＮＡ断片３を挿入し、１５−４７−１７融合抗原発現
用ベクターを得た。結果を図５に示す。
【００６５】実施例１１ １５−１７−４７融合抗原発
現用ベクターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー７を、アンチセンスプライマーとして参考例３で作
製したプライマー１６を選択した。各々のプライマー１
μＭと、実施例１で作製した１５−１７融合抗原発現用
ベクター０．１ｎｇ及び前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５
ユニットを用いて、９４℃１分−５５℃２分−７２℃３
分、３０サイクルの条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片１
４を作製した。 ｂ）実施例１１−ａ）で作製したＤＮＡ断片１４と参考
例２で作製したｐＷ６Ａを、各々前記ＮｄｅＩ５ユニッ
ト及び前記ＳａｌＩ５ユニットで３７℃１時間切断し
た。反応終了後、実施例１−ｅ）と同一条件でｐＷ６Ａ
にＤＮＡ断片１４を挿入した。 ｃ）実施例２−ｃ）で作製したＤＮＡ断片４と実施例１
１−ｂ）で作製したＤＮＡ断片１４挿入ｐＷ６Ａを、各
々前記ＳａｌＩ５ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニッ
トで３７℃１時間切断した。反応終了後、実施例１−
ｅ）と同一条件でＤＮＡ断片１４挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ
断片４を挿入し、１５−１７−４７融合抗原発現用ベク
ターを作製した。結果を図５に示す。
現用ベクターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー７を、アンチセンスプライマーとして参考例３で作
製したプライマー１６を選択した。各々のプライマー１
μＭと、実施例１で作製した１５−１７融合抗原発現用
ベクター０．１ｎｇ及び前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５
ユニットを用いて、９４℃１分−５５℃２分−７２℃３
分、３０サイクルの条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片１
４を作製した。 ｂ）実施例１１−ａ）で作製したＤＮＡ断片１４と参考
例２で作製したｐＷ６Ａを、各々前記ＮｄｅＩ５ユニッ
ト及び前記ＳａｌＩ５ユニットで３７℃１時間切断し
た。反応終了後、実施例１−ｅ）と同一条件でｐＷ６Ａ
にＤＮＡ断片１４を挿入した。 ｃ）実施例２−ｃ）で作製したＤＮＡ断片４と実施例１
１−ｂ）で作製したＤＮＡ断片１４挿入ｐＷ６Ａを、各
々前記ＳａｌＩ５ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニッ
トで３７℃１時間切断した。反応終了後、実施例１−
ｅ）と同一条件でＤＮＡ断片１４挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ
断片４を挿入し、１５−１７−４７融合抗原発現用ベク
ターを作製した。結果を図５に示す。
【００６６】実施例１２ ４７−１７−１５融合抗原発
現用ベクターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー１を、アンチセンスプライマーとして参考例３で作
製したプライマー１８を選択した。各々のプライマー１
μＭと、参考例４で作製した47Ｋ遺伝子０．１ｎｇ及び
前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニットを用いて、９４
℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイクルの条件
でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片１５を作製した。 ｂ）実施例１２−ａ）で作製したＤＮＡ断片１５と参考
例２で作製したｐＷ６Ａを、前記ＳａｃＩ（東洋紡社
製）５ユニットで３７℃１時間切断後、更に前記Ｎｄｅ
Ｉ５ユニットで１時間切断した。反応終了後、実施例１
−ｅ）と同一条件でｐＷ６ＡにＤＮＡ断片１５を挿入し
た。 ｃ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー１９を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー２８を選択した。各々のプライマー
１μＭと、参考例４で作製した１７Ｋ遺伝子０．１ｎｇ
及び前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニットを用いて、
９４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイクルの
条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片１６を作製した。 ｄ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー２９を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー９を選択した。各々のプライマー１
μＭと、参考例４で作製した１５Ｋ遺伝子０．１ｎｇ及
び前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニットを用いて、９
４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイクルの条
件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片１７を作製した。 ｅ）実施例１２−ｃ）で得られたＤＮＡ断片１６は前記
ＳａｃＩ５ユニットで３７℃１時間切断後、更にＥｃｏ
ＲＩ（東洋紡社製）５ユニットで３７℃１時間切断し
た。実施例１２−ｄ）で得られたＤＮＡ断片１７は前記
ＥｃｏＲＩ５ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニットで
３７℃１時間切断した。又実施例１２−ｂ）で作製した
ＤＮＡ断片１５挿入ｐＷ６Ａを、前記ＳａｃＩ５ユニッ
トで３７℃１時間切断後、更に前記ＢａｍＨＩ５ユニッ
トで３７℃１時間切断した。反応終了後、実施例１−
ｅ）と同一条件でＤＮＡ断片１５挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ
断片１６とＤＮＡ断片１７を同時に挿入し、４７−１７
−１５融合抗原発現用ベクターを得た。結果を図５に示
す。
現用ベクターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー１を、アンチセンスプライマーとして参考例３で作
製したプライマー１８を選択した。各々のプライマー１
μＭと、参考例４で作製した47Ｋ遺伝子０．１ｎｇ及び
前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニットを用いて、９４
℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイクルの条件
でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片１５を作製した。 ｂ）実施例１２−ａ）で作製したＤＮＡ断片１５と参考
例２で作製したｐＷ６Ａを、前記ＳａｃＩ（東洋紡社
製）５ユニットで３７℃１時間切断後、更に前記Ｎｄｅ
Ｉ５ユニットで１時間切断した。反応終了後、実施例１
−ｅ）と同一条件でｐＷ６ＡにＤＮＡ断片１５を挿入し
た。 ｃ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー１９を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー２８を選択した。各々のプライマー
１μＭと、参考例４で作製した１７Ｋ遺伝子０．１ｎｇ
及び前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニットを用いて、
９４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイクルの
条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片１６を作製した。 ｄ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー２９を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー９を選択した。各々のプライマー１
μＭと、参考例４で作製した１５Ｋ遺伝子０．１ｎｇ及
び前記Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニットを用いて、９
４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイクルの条
件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片１７を作製した。 ｅ）実施例１２−ｃ）で得られたＤＮＡ断片１６は前記
ＳａｃＩ５ユニットで３７℃１時間切断後、更にＥｃｏ
ＲＩ（東洋紡社製）５ユニットで３７℃１時間切断し
た。実施例１２−ｄ）で得られたＤＮＡ断片１７は前記
ＥｃｏＲＩ５ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニットで
３７℃１時間切断した。又実施例１２−ｂ）で作製した
ＤＮＡ断片１５挿入ｐＷ６Ａを、前記ＳａｃＩ５ユニッ
トで３７℃１時間切断後、更に前記ＢａｍＨＩ５ユニッ
トで３７℃１時間切断した。反応終了後、実施例１−
ｅ）と同一条件でＤＮＡ断片１５挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ
断片１６とＤＮＡ断片１７を同時に挿入し、４７−１７
−１５融合抗原発現用ベクターを得た。結果を図５に示
す。
【００６７】実施例１３ １５抗原発現用ベクターの作
製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー７を、アンチセンスプライマーとして参考例３で作
製したプライマー９を選択した。各々のプライマー１μ
Ｍと、参考例４で作製した１５Ｋ遺伝子０．１ｎｇ及び
Ｔａｑポリメラーゼ（TaKaRa社製）２．５ユニット用い
て、９４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイク
ルの条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片１８を作製した。 ｂ）ＤＮＡ断片１８と参考例２で作製したｐＷ６Ａを、
各々前記ＮｄｅＩ５ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニ
ットで３７℃１時間切断した。反応終了後、実施例１−
ｅ）と同一条件でｐＷ６ＡにＤＮＡ断片１８を挿入し、
１５抗原発現用ベクターを得た。結果を図６に示す。
製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー７を、アンチセンスプライマーとして参考例３で作
製したプライマー９を選択した。各々のプライマー１μ
Ｍと、参考例４で作製した１５Ｋ遺伝子０．１ｎｇ及び
Ｔａｑポリメラーゼ（TaKaRa社製）２．５ユニット用い
て、９４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイク
ルの条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片１８を作製した。 ｂ）ＤＮＡ断片１８と参考例２で作製したｐＷ６Ａを、
各々前記ＮｄｅＩ５ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニ
ットで３７℃１時間切断した。反応終了後、実施例１−
ｅ）と同一条件でｐＷ６ＡにＤＮＡ断片１８を挿入し、
１５抗原発現用ベクターを得た。結果を図６に示す。
【００６８】実施例１４ １５−１５抗原発現用ベクタ
ーの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー１１を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー９を選択した。各々のプライマー１
μＭと、参考例４で作製した１５Ｋ遺伝子０．１ｎｇ及
びＴａｑポリメラーゼ（TaKaRa社製）２．５ユニット用
いて、９４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイ
クルの条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片１９を作製し
た。 ｂ）ＤＮＡ断片１９と実施例１０で得られた１５−４７
−１７融合抗原発現用ベクターを、各々前記ＳａｌＩ５
ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニットで３７℃１時間
切断した。反応終了後、実施例１−ｅ）と同一条件でＤ
ＮＡ断片４７−１７を除去した１５−４７−１７融合抗
原発現用ベクターにＤＮＡ断片１９を挿入し、１５−１
５融合抗原発現用ベクターを得た。結果を図６に示す。
ーの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー１１を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー９を選択した。各々のプライマー１
μＭと、参考例４で作製した１５Ｋ遺伝子０．１ｎｇ及
びＴａｑポリメラーゼ（TaKaRa社製）２．５ユニット用
いて、９４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サイ
クルの条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片１９を作製し
た。 ｂ）ＤＮＡ断片１９と実施例１０で得られた１５−４７
−１７融合抗原発現用ベクターを、各々前記ＳａｌＩ５
ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニットで３７℃１時間
切断した。反応終了後、実施例１−ｅ）と同一条件でＤ
ＮＡ断片４７−１７を除去した１５−４７−１７融合抗
原発現用ベクターにＤＮＡ断片１９を挿入し、１５−１
５融合抗原発現用ベクターを得た。結果を図６に示す。
【００６９】実施例１５ １５−１５−１５抗原発現用
ベクターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー１１を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー２２を選択した。各々のプライマー
１μＭと、参考例４で作製した１５Ｋ遺伝子０．１ｎｇ
及びＴａｑポリメラーゼ（TaKaRa社製）２．５ユニット
用いて、９４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サ
イクルの条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片２０を作製し
た。 ｂ）ＤＮＡ断片２０と実施例１０で得られた１５−４７
−１７融合抗原発現用ベクターを、各々前記ＳａｌＩ５
ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニットで３７℃１時間
切断した。反応終了後、実施例１−ｅ）と同一条件でＤ
ＮＡ断片４７−１７を除去した１５−４７−１７融合抗
原発現用ベクターにＤＮＡ断片２０を挿入した（以下、
ＤＮＡ断片１５−１５挿入ｐＷ６Ａと表す）。 ｃ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー２３を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー２４を選択した。各々のプライマー
１μＭと、参考例４で作製した１５Ｋ遺伝子０．１ｎｇ
及びＴａｑポリメラーゼ（TaKaRa社製）２．５ユニット
用いて、９４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サ
イクルの条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片２１を作製し
た。 ｄ）実施例１５−ｃ）で得られたＤＮＡ断片２１と実施
例１５−ｂ）で作製したＤＮＡ断片１５−１５挿入ｐＷ
６Ａを、ＫｐｎＩ（東洋紡社製）５ユニットで３７℃１
時間切断後、更に前記ＢａｍＨＩ５ユニットで３７℃１
時間切断した。反応終了後、実施例１−ｅ）と同一条件
でＤＮＡ断片１５−１５挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ断片２１
を挿入し、１５−１５−１５融合抗原発現用ベクターを
得た。結果を図６に示す。
ベクターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー１１を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー２２を選択した。各々のプライマー
１μＭと、参考例４で作製した１５Ｋ遺伝子０．１ｎｇ
及びＴａｑポリメラーゼ（TaKaRa社製）２．５ユニット
用いて、９４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サ
イクルの条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片２０を作製し
た。 ｂ）ＤＮＡ断片２０と実施例１０で得られた１５−４７
−１７融合抗原発現用ベクターを、各々前記ＳａｌＩ５
ユニット及び前記ＢａｍＨＩ５ユニットで３７℃１時間
切断した。反応終了後、実施例１−ｅ）と同一条件でＤ
ＮＡ断片４７−１７を除去した１５−４７−１７融合抗
原発現用ベクターにＤＮＡ断片２０を挿入した（以下、
ＤＮＡ断片１５−１５挿入ｐＷ６Ａと表す）。 ｃ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー２３を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー２４を選択した。各々のプライマー
１μＭと、参考例４で作製した１５Ｋ遺伝子０．１ｎｇ
及びＴａｑポリメラーゼ（TaKaRa社製）２．５ユニット
用いて、９４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サ
イクルの条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片２１を作製し
た。 ｄ）実施例１５−ｃ）で得られたＤＮＡ断片２１と実施
例１５−ｂ）で作製したＤＮＡ断片１５−１５挿入ｐＷ
６Ａを、ＫｐｎＩ（東洋紡社製）５ユニットで３７℃１
時間切断後、更に前記ＢａｍＨＩ５ユニットで３７℃１
時間切断した。反応終了後、実施例１−ｅ）と同一条件
でＤＮＡ断片１５−１５挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ断片２１
を挿入し、１５−１５−１５融合抗原発現用ベクターを
得た。結果を図６に示す。
【００７０】実施例１６ １５−１５−１５−１５抗原
発現用ベクターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー２３を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー２５を選択した。各々のプライマー
１μＭと、参考例４で作製した１５Ｋ遺伝子０．１ｎｇ
及びＴａｑポリメラーゼ（TaKaRa社製）２．５ユニット
用いて、９４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サ
イクルの条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片２２を作製し
た。 ｂ）実施例１６−ａ）で得られたＤＮＡ断片２２と実施
例１５−ｂ）で作製したＤＮＡ断片１５−１５挿入ｐＷ
６Ａを、前記ＫｐｎＩ５ユニットで３７℃１時間切断
後、更に前記ＢａｍＨＩ５ユニットで３７℃１時間切断
した。反応終了後、実施例１−ｅ）と同一条件でＤＮＡ
断片１５−１５挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ断片２２を挿入し
た（以下、ＤＮＡ断片１５−１５−１５挿入ｐＷ６Ａと
表す）。 ｃ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー２６を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー２７を選択した。各々のプライマー
１μＭと、参考例４で作製した１５Ｋ遺伝子０．１ｎｇ
及びＴａｑポリメラーゼ（TaKaRa社製）２．５ユニット
用いて、９４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サ
イクルの条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片２３を作製し
た。 ｄ）実施例１６−ｃ）で得られたＤＮＡ断片２３と実施
例１６−ｂ）で作製したＤＮＡ断片１５−１５−１５挿
入ｐＷ６Ａを、前記ＫｐｎＩ５ユニットで３７℃１時間
切断後、更にＨｉｎｄＩＩＩ（東洋紡社製）５ユニット
で３７℃１時間切断した。反応終了後、実施例１−ｅ）
と同一条件でＤＮＡ断片１５−１５−１５挿入ｐＷ６Ａ
にＤＮＡ断片２３を挿入し、１５−１５−１５−１５融
合抗原発現用ベクターを得た。結果を図６に示す。
発現用ベクターの作製 ａ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー２３を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー２５を選択した。各々のプライマー
１μＭと、参考例４で作製した１５Ｋ遺伝子０．１ｎｇ
及びＴａｑポリメラーゼ（TaKaRa社製）２．５ユニット
用いて、９４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サ
イクルの条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片２２を作製し
た。 ｂ）実施例１６−ａ）で得られたＤＮＡ断片２２と実施
例１５−ｂ）で作製したＤＮＡ断片１５−１５挿入ｐＷ
６Ａを、前記ＫｐｎＩ５ユニットで３７℃１時間切断
後、更に前記ＢａｍＨＩ５ユニットで３７℃１時間切断
した。反応終了後、実施例１−ｅ）と同一条件でＤＮＡ
断片１５−１５挿入ｐＷ６ＡにＤＮＡ断片２２を挿入し
た（以下、ＤＮＡ断片１５−１５−１５挿入ｐＷ６Ａと
表す）。 ｃ）センスプライマーとして参考例３で作製したプライ
マー２６を、アンチセンスプライマーとして参考例３で
作製したプライマー２７を選択した。各々のプライマー
１μＭと、参考例４で作製した１５Ｋ遺伝子０．１ｎｇ
及びＴａｑポリメラーゼ（TaKaRa社製）２．５ユニット
用いて、９４℃１分−５５℃２分−７２℃３分、３０サ
イクルの条件でＰＣＲ法を行いＤＮＡ断片２３を作製し
た。 ｄ）実施例１６−ｃ）で得られたＤＮＡ断片２３と実施
例１６−ｂ）で作製したＤＮＡ断片１５−１５−１５挿
入ｐＷ６Ａを、前記ＫｐｎＩ５ユニットで３７℃１時間
切断後、更にＨｉｎｄＩＩＩ（東洋紡社製）５ユニット
で３７℃１時間切断した。反応終了後、実施例１−ｅ）
と同一条件でＤＮＡ断片１５−１５−１５挿入ｐＷ６Ａ
にＤＮＡ断片２３を挿入し、１５−１５−１５−１５融
合抗原発現用ベクターを得た。結果を図６に示す。
【００７１】実施例１７ 各種融合抗原の発現 実施例１から１２で得られた各発現ベクターを用いてハ
ナハン法で作製したコンピテント細胞である大腸菌ＢＬ
２１（ＤＥ３）をトランスフォームし、５０μｇ／ｍｌ
アンピシリンを含むＬＢ寒天培地上にその菌をまき３７
℃で一晩培養した。現れたアンピシリン耐性菌のコロニ
ーの中から各融合抗原遺伝子が組み込まれた融合抗原発
現用ベクターを持つコロニーを選択し、５０μｇ／ｍｌ
アンピシリンを含む４ｍｌのＬＢ液体培地で３７℃で一
晩振盪培養した。この培養した菌をさらに５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリンを含む１ＬのＬＢ液体培地で３７℃で３
時間振盪培養後、終濃度として１ｍＭＩＰＴＧ( イソプ
ロピル- β-D(-)-チオガラクトピラノシド) を添加し、
更に３７℃で一晩振盪培養し、各融合抗原の発現を誘導
した。
ナハン法で作製したコンピテント細胞である大腸菌ＢＬ
２１（ＤＥ３）をトランスフォームし、５０μｇ／ｍｌ
アンピシリンを含むＬＢ寒天培地上にその菌をまき３７
℃で一晩培養した。現れたアンピシリン耐性菌のコロニ
ーの中から各融合抗原遺伝子が組み込まれた融合抗原発
現用ベクターを持つコロニーを選択し、５０μｇ／ｍｌ
アンピシリンを含む４ｍｌのＬＢ液体培地で３７℃で一
晩振盪培養した。この培養した菌をさらに５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリンを含む１ＬのＬＢ液体培地で３７℃で３
時間振盪培養後、終濃度として１ｍＭＩＰＴＧ( イソプ
ロピル- β-D(-)-チオガラクトピラノシド) を添加し、
更に３７℃で一晩振盪培養し、各融合抗原の発現を誘導
した。
【００７２】実施例１８ 融合抗原の精製 実施例１７で発現した各融合抗原のうち４７−１７−１
５融合抗原、４７−１５−１７融合抗原、１５−１７−
４７融合抗原及び１５−１７融合抗原の精製を行った。
３抗原融合型の４７−１７−１５融合抗原、４７−１５
−１７融合抗原及び１５−１７−４７融合抗原は、抗原
発現後の大腸菌を超音波破砕し、遠心操作後その沈渣を
尿素によって可溶化し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００（フ
ァルマシア社製）を用いたゲルろ過クロマトグラフィ
ー、Ｑ−セファロース（ファルマシア社製）を用いたイ
オン交換クロマトグラフィー、セラミックハイドロキシ
アパタイト（旭光学社製）を用いた吸着クロマトグラフ
ィーにて精製した。２抗原融合型の１５−１７融合抗原
については、抗原発現後の大腸菌を超音波破砕し、遠心
操作後その上清を尿素で変性し、Ｑ−セファロース（フ
ァルマシア社製）を用いたイオン交換クロマトグラフィ
ー、セラミックハイドロキシアパタイト（旭光学社製）
を用いた吸着クロマトグラフィー、ＳＰ−セファロース
（ファルマシア社製）を用いたイオン交換クロマトグラ
フィーにて精製した。各抗原共に１リットルの培養液か
ら純度９５％以上で、４７−１７−１５融合抗原は７ｍ
ｇ、４７−１５−１７融合抗原は１０ｍｇ、１５−１７
−４７融合抗原は２０ｍｇ、１５−１７融合抗原は１０
ｍｇを得た。精製後の各融合抗原を還元ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動後クマシー染色した。結果を
図７に示す。３抗原融合型の抗原はアミノ酸配列から７
５Ｋの分子量を有し１５−１７融合抗原は２９Ｋの分子
量を有するものと予想されたが、電気泳動の結果から精
製した抗原がそれぞれ予想された分子量をもっているこ
とが確認された。また参考例１で作製した４７ＫＭａ
ｂ、１７ＫＭａｂ及び１５ＫＭａｂを用いてウェスタン
ブロットを行ったところ、融合抗原中の各抗原に対応し
て、各モノクローナル抗体が反応することが認められ
た。
５融合抗原、４７−１５−１７融合抗原、１５−１７−
４７融合抗原及び１５−１７融合抗原の精製を行った。
３抗原融合型の４７−１７−１５融合抗原、４７−１５
−１７融合抗原及び１５−１７−４７融合抗原は、抗原
発現後の大腸菌を超音波破砕し、遠心操作後その沈渣を
尿素によって可溶化し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００（フ
ァルマシア社製）を用いたゲルろ過クロマトグラフィ
ー、Ｑ−セファロース（ファルマシア社製）を用いたイ
オン交換クロマトグラフィー、セラミックハイドロキシ
アパタイト（旭光学社製）を用いた吸着クロマトグラフ
ィーにて精製した。２抗原融合型の１５−１７融合抗原
については、抗原発現後の大腸菌を超音波破砕し、遠心
操作後その上清を尿素で変性し、Ｑ−セファロース（フ
ァルマシア社製）を用いたイオン交換クロマトグラフィ
ー、セラミックハイドロキシアパタイト（旭光学社製）
を用いた吸着クロマトグラフィー、ＳＰ−セファロース
（ファルマシア社製）を用いたイオン交換クロマトグラ
フィーにて精製した。各抗原共に１リットルの培養液か
ら純度９５％以上で、４７−１７−１５融合抗原は７ｍ
ｇ、４７−１５−１７融合抗原は１０ｍｇ、１５−１７
−４７融合抗原は２０ｍｇ、１５−１７融合抗原は１０
ｍｇを得た。精製後の各融合抗原を還元ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動後クマシー染色した。結果を
図７に示す。３抗原融合型の抗原はアミノ酸配列から７
５Ｋの分子量を有し１５−１７融合抗原は２９Ｋの分子
量を有するものと予想されたが、電気泳動の結果から精
製した抗原がそれぞれ予想された分子量をもっているこ
とが確認された。また参考例１で作製した４７ＫＭａ
ｂ、１７ＫＭａｂ及び１５ＫＭａｂを用いてウェスタン
ブロットを行ったところ、融合抗原中の各抗原に対応し
て、各モノクローナル抗体が反応することが認められ
た。
【００７３】実施例１９ 融合抗原感作プレートの作製 ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（BECTON DICKINSON社
製）の各ウェルに、実施例１８で精製した各融合抗原を
１０ｍＭＰＢＳで希釈して０．６６ｐｍｏｌ／ウェルで
分注し一晩４℃に放置することにより感作した。感作後
１％スキムミルクを含む１０ｍＭＰＢＳで３７℃２時間
ブロッキングした。
製）の各ウェルに、実施例１８で精製した各融合抗原を
１０ｍＭＰＢＳで希釈して０．６６ｐｍｏｌ／ウェルで
分注し一晩４℃に放置することにより感作した。感作後
１％スキムミルクを含む１０ｍＭＰＢＳで３７℃２時間
ブロッキングした。
【００７４】参考例５ 単独抗原感作プレートの作製 大腸菌で発現させ精製した組み換え体の単独抗原４７Ｋ
抗原、Ｎ末端にシグナルペプチドを含む１７Ｋ抗原（以
下本明細書中ではＳ１７Ｋ抗原と記載する）及びＧＳＴ
１５Ｋ抗原を各々又は全てを別のウェルに０．６６ｐｍ
ｏｌ／ウェルで感作した。感作後１％スキムミルクを含
む１０ｍＭＰＢＳで３７℃２時間ブロッキングした。
抗原、Ｎ末端にシグナルペプチドを含む１７Ｋ抗原（以
下本明細書中ではＳ１７Ｋ抗原と記載する）及びＧＳＴ
１５Ｋ抗原を各々又は全てを別のウェルに０．６６ｐｍ
ｏｌ／ウェルで感作した。感作後１％スキムミルクを含
む１０ｍＭＰＢＳで３７℃２時間ブロッキングした。
【００７５】実施例２０ 融合抗原とモノクローナル抗
体との反応性試験 参考例１で作製した４７ＫＭａｂ、１７ＫＭａｂ、１５
ＫＭａｂのそれぞれまたは混合物の各モノクローナル抗
体終濃度が１０μＭとなるように１％スキムミルク及び
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）を含む１０ｍＭＰ
ＢＳ（以下含スキムミルクＰＢＳＴと記載する）で希釈
し、実施例１９及び参考例５で作製した抗原感作プレー
トの洗浄後の各ウェルに５０μｌ加え、室温１．５時間
インキュベートした。洗浄後、含スキムミルクＰＢＳＴ
で１／１０００に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウ
スＩｇ（DAKO社製）を５０μｌ加え、室温１．５時間イ
ンキュベートした。洗浄後、過酸化水素水とＡＢＴＳの
混合溶液を５０μｌ加えて３分間発色させた。反応を停
止させた後、分光光度計で４０５ｎｍの吸光度を測定し
た。結果を表１に示す。表１に示されるように、融合抗
原は単独抗原である４７Ｋ、Ｓ１７Ｋ、ＧＳＴ１５Ｋと
比べ同等以上の活性を示した。
体との反応性試験 参考例１で作製した４７ＫＭａｂ、１７ＫＭａｂ、１５
ＫＭａｂのそれぞれまたは混合物の各モノクローナル抗
体終濃度が１０μＭとなるように１％スキムミルク及び
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）を含む１０ｍＭＰ
ＢＳ（以下含スキムミルクＰＢＳＴと記載する）で希釈
し、実施例１９及び参考例５で作製した抗原感作プレー
トの洗浄後の各ウェルに５０μｌ加え、室温１．５時間
インキュベートした。洗浄後、含スキムミルクＰＢＳＴ
で１／１０００に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウ
スＩｇ（DAKO社製）を５０μｌ加え、室温１．５時間イ
ンキュベートした。洗浄後、過酸化水素水とＡＢＴＳの
混合溶液を５０μｌ加えて３分間発色させた。反応を停
止させた後、分光光度計で４０５ｎｍの吸光度を測定し
た。結果を表１に示す。表１に示されるように、融合抗
原は単独抗原である４７Ｋ、Ｓ１７Ｋ、ＧＳＴ１５Ｋと
比べ同等以上の活性を示した。
【００７６】
【表１】
【００７７】実施例２１ 融合抗原と単独抗原との反応
性比較試験 含スキムミルクＰＢＳＴで１／１０００に希釈したＴｐ
陽性血清（Boston Biomedica Inc. 社から購入）及び陰
性血清を、実施例１９及び参考例５で作製した抗原感作
プレートの洗浄後の各ウェルに５０μｌ加え、室温１．
５時間インキュベートした。洗浄後、含スキムミルクＰ
ＢＳＴで１／１０００に希釈したペルオキシダーゼ標識
抗ヒトＩｇＧ（BIO SOURCE社製）を５０μｌ加え、室温
１．５時間インキュベートした。洗浄後、過酸化水素水
とＡＢＴＳの混合溶液を５０μｌ加えて３分間発色させ
た。反応を停止させた後、分光光度計で４０５ｎｍの吸
光度を測定した。結果を表２に示す。融合抗原は単独抗
原及び単独抗原を混合して感作したものよりも陽性血清
との反応が高く、陰性血清とは全く反応しなかった。
性比較試験 含スキムミルクＰＢＳＴで１／１０００に希釈したＴｐ
陽性血清（Boston Biomedica Inc. 社から購入）及び陰
性血清を、実施例１９及び参考例５で作製した抗原感作
プレートの洗浄後の各ウェルに５０μｌ加え、室温１．
５時間インキュベートした。洗浄後、含スキムミルクＰ
ＢＳＴで１／１０００に希釈したペルオキシダーゼ標識
抗ヒトＩｇＧ（BIO SOURCE社製）を５０μｌ加え、室温
１．５時間インキュベートした。洗浄後、過酸化水素水
とＡＢＴＳの混合溶液を５０μｌ加えて３分間発色させ
た。反応を停止させた後、分光光度計で４０５ｎｍの吸
光度を測定した。結果を表２に示す。融合抗原は単独抗
原及び単独抗原を混合して感作したものよりも陽性血清
との反応が高く、陰性血清とは全く反応しなかった。
【００７８】
【表２】
【００７９】実施例２２ 融合抗原と陽性血清との反応
性試験 Ｔｐ陽性血清２４例（Boston Biomedica Inc. 社から購
入）及び陰性血清１例を実施例２１と同様の方法で発色
時間を３０分にして測定した。結果を表３に示す。融合
抗原の２４例の陽性血清との反応は、陰性血清との反応
と比べ有意に高かった。
性試験 Ｔｐ陽性血清２４例（Boston Biomedica Inc. 社から購
入）及び陰性血清１例を実施例２１と同様の方法で発色
時間を３０分にして測定した。結果を表３に示す。融合
抗原の２４例の陽性血清との反応は、陰性血清との反応
と比べ有意に高かった。
【００８０】
【表３】
【００８１】実施例２３ １５Ｋ、１５Ｋ−１５Ｋ、１
５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋ、１５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋ−１５
Ｋの発現 実施例１３から１６で得られた１５Ｋ、１５Ｋ−１５
Ｋ、１５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋ、１５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋ
−１５Ｋの発現ベクターを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ
３）をハナハン法でトランスフォームした。次に、５０
μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上にトラン
スフォームした菌をまき３７℃で一晩培養した。現れた
アンピシリン耐性菌のコロニーの中から各融合抗原遺伝
子が組み込まれた融合抗原発現用ベクターを持つコロニ
ーを選択し、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ｍｌ
のＬＢ液体培地で３７℃で一晩振盪培養した。この培養
した菌の内４０μｌを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含
む２ｍｌのＬＢ液体培地で３７℃で２時間振盪培養後、
終濃度として１ｍＭＩＰＴＧ( イソプロピル- β-D(-)-
チオガラクトピラノシド) を添加し、更に３７℃で一晩
振盪培養し、各融合抗原の発現を誘導した。このように
して得られた大腸菌培養液２ｍｌの内１．５ｍｌをマイ
クロ遠心チューブに移し、マイクロ遠心分離機（日立社
製ｈｉｍａｃ ＣＴ １５Ｄ）を用いて１５０００回転
で３０秒間遠心操作を行い集菌した。各チューブに１５
０μｌＴＥバッファー（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、
ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）と１５０μｌ ｘ２サ
ンプルバッファー（１Ｍトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ６．
８、２０％ｗ／ｖＳＤＳ、１０％ｖ／ｖβ−ＭＥ）を加
え、よく混合した後５分間煮沸し、更に１０分間超音波
処理した。この様にして得たサンプル１３μｌに２μｌ
の５０％グリセリンを加えて混合し、内１０μｌを１５
％ポリアクリルアミドゲルを使用して、還元ＳＤＳ電気
泳動した（Laemmli, U.K. 1970: Nature 227, 680 ）。
電気泳動後、ゲルをクマシー染色した。その結果を図８
に示す。一晩発現誘導すると１５Ｋ−１５Ｋ、１５Ｋ−
１５Ｋ−１５Ｋ、１５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋのバ
ンドが確認できた。又、一晩発現誘導した各抗原を同様
に１０〜１５％のポリアクリルアミドグラジエントゲル
を用いて還元ＳＤＳ電気泳動を行い、ニトロセルロース
膜にエレクトロブロットしブロッキング後一次抗体とし
て参考例１で作製した１５ＫＭａｂを用いてウエスタン
ブロットを行った。図９に示すように１５Ｋ、１５Ｋ−
１５Ｋ、１５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋ、１５Ｋ−１５Ｋ−１
５Ｋ−１５Ｋのすべてのバンドが確認できた。
５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋ、１５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋ−１５
Ｋの発現 実施例１３から１６で得られた１５Ｋ、１５Ｋ−１５
Ｋ、１５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋ、１５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋ
−１５Ｋの発現ベクターを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ
３）をハナハン法でトランスフォームした。次に、５０
μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上にトラン
スフォームした菌をまき３７℃で一晩培養した。現れた
アンピシリン耐性菌のコロニーの中から各融合抗原遺伝
子が組み込まれた融合抗原発現用ベクターを持つコロニ
ーを選択し、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ｍｌ
のＬＢ液体培地で３７℃で一晩振盪培養した。この培養
した菌の内４０μｌを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含
む２ｍｌのＬＢ液体培地で３７℃で２時間振盪培養後、
終濃度として１ｍＭＩＰＴＧ( イソプロピル- β-D(-)-
チオガラクトピラノシド) を添加し、更に３７℃で一晩
振盪培養し、各融合抗原の発現を誘導した。このように
して得られた大腸菌培養液２ｍｌの内１．５ｍｌをマイ
クロ遠心チューブに移し、マイクロ遠心分離機（日立社
製ｈｉｍａｃ ＣＴ １５Ｄ）を用いて１５０００回転
で３０秒間遠心操作を行い集菌した。各チューブに１５
０μｌＴＥバッファー（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、
ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）と１５０μｌ ｘ２サ
ンプルバッファー（１Ｍトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ６．
８、２０％ｗ／ｖＳＤＳ、１０％ｖ／ｖβ−ＭＥ）を加
え、よく混合した後５分間煮沸し、更に１０分間超音波
処理した。この様にして得たサンプル１３μｌに２μｌ
の５０％グリセリンを加えて混合し、内１０μｌを１５
％ポリアクリルアミドゲルを使用して、還元ＳＤＳ電気
泳動した（Laemmli, U.K. 1970: Nature 227, 680 ）。
電気泳動後、ゲルをクマシー染色した。その結果を図８
に示す。一晩発現誘導すると１５Ｋ−１５Ｋ、１５Ｋ−
１５Ｋ−１５Ｋ、１５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋのバ
ンドが確認できた。又、一晩発現誘導した各抗原を同様
に１０〜１５％のポリアクリルアミドグラジエントゲル
を用いて還元ＳＤＳ電気泳動を行い、ニトロセルロース
膜にエレクトロブロットしブロッキング後一次抗体とし
て参考例１で作製した１５ＫＭａｂを用いてウエスタン
ブロットを行った。図９に示すように１５Ｋ、１５Ｋ−
１５Ｋ、１５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋ、１５Ｋ−１５Ｋ−１
５Ｋ−１５Ｋのすべてのバンドが確認できた。
【００８２】実施例２４ １５Ｋ、１５Ｋ−１５Ｋ、１
５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋ、１５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋ−１５
Ｋの発現量の比較 一晩発現誘導した大腸菌を実施例２３に示した様に調製
した電気泳動用サンプルと、濃度既知のＢＳＡを含む電
気泳動用マーカー（Pharmacia LKB 製 LowMolecular We
ight Calibration Kit）を１５％ポリアクリルミドゲル
を用いて還元ＳＤＳ電気泳動を行い、電気泳動後ゲルを
クマシー染色した。その結果を図１０に示す。次にデン
シトメーター（アトー社製AE-6900 デンシトグラフ）を
用いて染色されたバンドより発現した抗原の量を算出し
た。図１０のｌａｎｅ１からｌａｎｅ６の濃度既知のＢ
ＳＡのバンドの濃さをデンシトメーターを用いて測定
し、検量線を作製した。その結果を図１１に示す。更に
１５Ｋ、１５Ｋ−１５Ｋ、１５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋ、１
５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋの相当するバンドの濃さ
を同様にデンシトメーターを用いて測定し図１１の検量
線を使用して発現量を算出した。その結果を表４に示
す。１５Ｋはバンドが認められず、逆に１５Ｋ−１５Ｋ
−１５Ｋではｌａｎｅあたり１μｇ（菌体培養液１ｌあ
たり２３ｍｇに相当）と最も発現量が大きかった。この
様に１５Ｋを直列に繰り返して融合する事により、その
発現量が増加した。
５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋ、１５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋ−１５
Ｋの発現量の比較 一晩発現誘導した大腸菌を実施例２３に示した様に調製
した電気泳動用サンプルと、濃度既知のＢＳＡを含む電
気泳動用マーカー（Pharmacia LKB 製 LowMolecular We
ight Calibration Kit）を１５％ポリアクリルミドゲル
を用いて還元ＳＤＳ電気泳動を行い、電気泳動後ゲルを
クマシー染色した。その結果を図１０に示す。次にデン
シトメーター（アトー社製AE-6900 デンシトグラフ）を
用いて染色されたバンドより発現した抗原の量を算出し
た。図１０のｌａｎｅ１からｌａｎｅ６の濃度既知のＢ
ＳＡのバンドの濃さをデンシトメーターを用いて測定
し、検量線を作製した。その結果を図１１に示す。更に
１５Ｋ、１５Ｋ−１５Ｋ、１５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋ、１
５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋ−１５Ｋの相当するバンドの濃さ
を同様にデンシトメーターを用いて測定し図１１の検量
線を使用して発現量を算出した。その結果を表４に示
す。１５Ｋはバンドが認められず、逆に１５Ｋ−１５Ｋ
−１５Ｋではｌａｎｅあたり１μｇ（菌体培養液１ｌあ
たり２３ｍｇに相当）と最も発現量が大きかった。この
様に１５Ｋを直列に繰り返して融合する事により、その
発現量が増加した。
【００８３】
【表４】
【図１】発現ベタクーｐＷ６Ａの詳細を示した図であ
る。
る。
【図２】４７Ｋ抗原をコードする遺伝子の調製手順を示
した図である。
した図である。
【図３】１５Ｋ及び１７Ｋ抗原をコードする遺伝子の調
製手順を示した図である。
製手順を示した図である。
【図４】二抗原融合抗原を発現するベクターの詳細を示
した図である。
した図である。
【図５】三抗原融合抗原を発現するベクターの詳細を示
した図である。
した図である。
【図６】１５Ｋを繰り返して融合させた抗原を発現する
ベクターの詳細を示した図である。
ベクターの詳細を示した図である。
【図７】精製した融合抗原の電気泳動図である。
【図８】１５Ｋ繰り返し融合抗原の電気泳動図である。
【図９】１５Ｋ繰り返し融合抗原のウエスタンブロット
の図である。
の図である。
【図１０】１５Ｋ繰り返し融合抗原の定量を行うための
電気泳動図である。
電気泳動図である。
【図１１】ＢＳＡを用いて作製した電気泳動のゲル上の
バンドの定量用の検量線を示すグラフである。
バンドの定量用の検量線を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 谷本 徹二 東京都新宿区西新宿２丁目７番１号 富士 レビオ株式会社内 (72)発明者 岡田 政久 東京都新宿区西新宿２丁目７番１号 富士 レビオ株式会社内
Claims (6)
- 【請求項１】 梅毒トレポネマの表面抗原を２つ以上融
合させた梅毒トレポネマ融合抗原。 - 【請求項２】 梅毒トレポネマの表面抗原を３つ以上融
合させた梅毒トレポネマ融合抗原。 - 【請求項３】 梅毒トレポネマの表面抗原を２ないし３
つ融合させた梅毒トレポネマ融合抗原。 - 【請求項４】 梅毒トレポネマの表面抗原の分子量が、
４７ｋＤａ、１７ｋＤａ、１５ｋＤａである請求項１な
いし３に記載の梅毒トレポネマ融合抗原。 - 【請求項５】 梅毒トレポネマ融合抗原がＮ末端側から
Ｃ末端側へ、４７ｋＤａ、１７ｋＤａ、１５ｋＤａの順
で融合された融合抗原、４７ｋＤａ、１５ｋＤａ、１７
ｋＤａの順で融合された融合抗原、１５ｋＤａ、１７ｋ
Ｄａ、４７ｋＤａの順で融合された融合抗原、１５ｋＤ
ａ、４７ｋＤａ、１７ｋＤａの順で融合された融合抗
原、１７ｋＤａ、１５ｋＤａ、４７ｋＤａの順で融合さ
れた融合抗原、１７ｋＤａ、４７ｋＤａ、１５ｋＤａの
順で融合された融合抗原、４７ｋＤａ、１７ｋＤａの順
で融合された融合抗原、４７ｋＤａ、１５ｋＤａの順で
融合された融合抗原、１７ｋＤａ、４７ｋＤａの順で融
合された融合抗原、１７ｋＤａ、１５ｋＤａの順で融合
された融合抗原、１５ｋＤａ、４７ｋＤａの順で融合さ
れた融合抗原、１５ｋＤａ、１７ｋＤａの順で融合され
た融合抗原、１５ｋＤａ、１５ｋＤａの順で融合された
融合抗原、１５ｋＤａ、１５ｋＤａ、１５ｋＤａの順で
融合された融合抗原、１５ｋＤａ、１５ｋＤａ、１５ｋ
Ｄａ、１５ｋＤａの順で融合された融合抗原、である請
求項４に記載の融合抗原。 - 【請求項６】 請求項１ないし５に記載の梅毒トレポネ
マ融合抗原を用いた抗梅毒トレポネマ抗体の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35580496A JP3533857B2 (ja) | 1995-12-25 | 1996-12-25 | 梅毒トレポネマ融合抗原及び該融合抗原を用いた抗梅毒トレポネマ抗体の測定方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7-350072 | 1995-12-25 | ||
| JP35007295 | 1995-12-25 | ||
| JP35580496A JP3533857B2 (ja) | 1995-12-25 | 1996-12-25 | 梅毒トレポネマ融合抗原及び該融合抗原を用いた抗梅毒トレポネマ抗体の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09235298A true JPH09235298A (ja) | 1997-09-09 |
| JP3533857B2 JP3533857B2 (ja) | 2004-05-31 |
Family
ID=26579111
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35580496A Expired - Lifetime JP3533857B2 (ja) | 1995-12-25 | 1996-12-25 | 梅毒トレポネマ融合抗原及び該融合抗原を用いた抗梅毒トレポネマ抗体の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3533857B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003064100A (ja) * | 2001-08-24 | 2003-03-05 | Shino Test Corp | タンパク質の担体への固定化方法、タンパク質を固定化した担体及びタンパク質を固定化した担体を用いた被検物質の測定試薬 |
| JP2005514060A (ja) * | 2001-12-21 | 2005-05-19 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド | アルブミン融合タンパク質 |
| JP2013007759A (ja) * | 2012-10-05 | 2013-01-10 | Shino Test Corp | タンパク質の担体への固定化方法、タンパク質を固定化した担体及びタンパク質を固定化した担体を用いた被検物質の測定試薬 |
| JP2014506134A (ja) * | 2011-01-13 | 2014-03-13 | オーソ−クリニカル・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド | 梅毒トレポネーマトリプレット抗原 |
-
1996
- 1996-12-25 JP JP35580496A patent/JP3533857B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003064100A (ja) * | 2001-08-24 | 2003-03-05 | Shino Test Corp | タンパク質の担体への固定化方法、タンパク質を固定化した担体及びタンパク質を固定化した担体を用いた被検物質の測定試薬 |
| JP2005514060A (ja) * | 2001-12-21 | 2005-05-19 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド | アルブミン融合タンパク質 |
| JP2009213477A (ja) * | 2001-12-21 | 2009-09-24 | Human Genome Sciences Inc | アルブミン融合タンパク質 |
| JP2013172734A (ja) * | 2001-12-21 | 2013-09-05 | Human Genome Sciences Inc | アルブミン融合タンパク質 |
| JP2014506134A (ja) * | 2011-01-13 | 2014-03-13 | オーソ−クリニカル・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド | 梅毒トレポネーマトリプレット抗原 |
| JP2013007759A (ja) * | 2012-10-05 | 2013-01-10 | Shino Test Corp | タンパク質の担体への固定化方法、タンパク質を固定化した担体及びタンパク質を固定化した担体を用いた被検物質の測定試薬 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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