JPH09234077A - エステラーゼ遺伝子及びその取得方法、並びに醸造用酵母及びそれを用いたアルコール飲料の製造方法 - Google Patents
エステラーゼ遺伝子及びその取得方法、並びに醸造用酵母及びそれを用いたアルコール飲料の製造方法Info
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- JPH09234077A JPH09234077A JP7089196A JP7089196A JPH09234077A JP H09234077 A JPH09234077 A JP H09234077A JP 7089196 A JP7089196 A JP 7089196A JP 7089196 A JP7089196 A JP 7089196A JP H09234077 A JPH09234077 A JP H09234077A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 酵母のエステラーゼ遺伝子を明らかにし、エ
ステラーゼ産生能のみが破壊された酵母を得て、エステ
ル香味の高蓄積されたアルコール飲料を製造可能とす
る。 【解決手段】 ジアゾ染色法によりエステラーゼ欠損株
を取得し、エステラーゼ遺伝子をクローニングして、酵
母のエステラーゼ遺伝子の塩基配列及び構造を明らかに
する。これを利用して遺伝子工学的手法により酵母のエ
ステラーゼ遺伝子のみを破壊し、エステラーゼ産生能の
みを破壊させた形質転換酵母を得る。この形質転換酵母
を用いて糖類を発酵させて、エステル香味の高蓄積され
たアルコール飲料を製造する。
ステラーゼ産生能のみが破壊された酵母を得て、エステ
ル香味の高蓄積されたアルコール飲料を製造可能とす
る。 【解決手段】 ジアゾ染色法によりエステラーゼ欠損株
を取得し、エステラーゼ遺伝子をクローニングして、酵
母のエステラーゼ遺伝子の塩基配列及び構造を明らかに
する。これを利用して遺伝子工学的手法により酵母のエ
ステラーゼ遺伝子のみを破壊し、エステラーゼ産生能の
みを破壊させた形質転換酵母を得る。この形質転換酵母
を用いて糖類を発酵させて、エステル香味の高蓄積され
たアルコール飲料を製造する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、酵母サッカロマイ
セス・セレビシエが産生するようなエステラーゼ、エス
テラーゼの生物工学的産生能を有するＤＮＡ鎖、及びこ
の遺伝子が破壊されたことによりエステル蓄積量が増加
している酵母に関する。また本発明は、この遺伝子破壊
酵母を用いて、エステル香味の高蓄積されたアルコール
飲料を製造する方法に関する。
セス・セレビシエが産生するようなエステラーゼ、エス
テラーゼの生物工学的産生能を有するＤＮＡ鎖、及びこ
の遺伝子が破壊されたことによりエステル蓄積量が増加
している酵母に関する。また本発明は、この遺伝子破壊
酵母を用いて、エステル香味の高蓄積されたアルコール
飲料を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】清酒、ビール、ワイン、焼酎などのアル
コール飲料に於て、各種のエステル成分の量がその品質
を大きく左右することは良く知られている。これらのエ
ステルのうちでも酢酸イソアミルは果実様の香りのエス
テルであり、この酢酸イソアミル及びその前駆体である
イソアミルアルコールの含量比は香りの官能評価との相
関が深いことが知られている。清酒ではこの含量比が高
いほど吟醸香が高いものとして珍重されてきた（例えば
醸試報告No.145, ｐ26（1973）参照）。
コール飲料に於て、各種のエステル成分の量がその品質
を大きく左右することは良く知られている。これらのエ
ステルのうちでも酢酸イソアミルは果実様の香りのエス
テルであり、この酢酸イソアミル及びその前駆体である
イソアミルアルコールの含量比は香りの官能評価との相
関が深いことが知られている。清酒ではこの含量比が高
いほど吟醸香が高いものとして珍重されてきた（例えば
醸試報告No.145, ｐ26（1973）参照）。
【０００３】また、既に報告されているように、酢酸イ
ソアミルは酵母のアルコールアセチルトランスフェラー
ゼにより、イソアミルアルコールとアセチルＣｏＡとか
ら産生される（Agric. Biol. Chem. 45, 2183（1981）
参照）。一方、発酵過程に於て、酢酸イソアミルは酵母
のエステラーゼにより分解されるため、酢酸イソアミル
の蓄積にはエステラーゼが深く関与していることも報告
されている（柳内ら、発酵工学、67、159、（1989）参
照）。
ソアミルは酵母のアルコールアセチルトランスフェラー
ゼにより、イソアミルアルコールとアセチルＣｏＡとか
ら産生される（Agric. Biol. Chem. 45, 2183（1981）
参照）。一方、発酵過程に於て、酢酸イソアミルは酵母
のエステラーゼにより分解されるため、酢酸イソアミル
の蓄積にはエステラーゼが深く関与していることも報告
されている（柳内ら、発酵工学、67、159、（1989）参
照）。
【０００４】従って、アルコール飲料を製造する際に酢
酸イソアミルなどのエステル類の含有量を増やす方法と
しては、アルコールアセチルトランスフェラーゼの活性
を高める方法（例えば特開平６−６２８４９号公報参
照）が提案されている。また、別の方法として、使用す
る酵母のエステラーゼ活性を欠損させる方法が考えられ
る。しかしながら、実際には酵母のエステラーゼそのも
のに関する報告は少なく、特にエステラーゼを産生する
ＤＮＡ鎖に関する報告は、全く見当らない。
酸イソアミルなどのエステル類の含有量を増やす方法と
しては、アルコールアセチルトランスフェラーゼの活性
を高める方法（例えば特開平６−６２８４９号公報参
照）が提案されている。また、別の方法として、使用す
る酵母のエステラーゼ活性を欠損させる方法が考えられ
る。しかしながら、実際には酵母のエステラーゼそのも
のに関する報告は少なく、特にエステラーゼを産生する
ＤＮＡ鎖に関する報告は、全く見当らない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記したよう
な従来技術の問題点に鑑みなされたものであり、その主
な目的は、エステラーゼ活性のみを欠損させた酵母によ
りアルコール飲料を製造することにある。より詳細に言
えば、本発明の目的は、酵母のエステラーゼ遺伝子を明
らかにし、もってエステラーゼ産生能が破壊された酵母
を得ること、及びこの酵母によりエステル香味を高蓄積
したアルコール飲料を製造可能とすることにある。
な従来技術の問題点に鑑みなされたものであり、その主
な目的は、エステラーゼ活性のみを欠損させた酵母によ
りアルコール飲料を製造することにある。より詳細に言
えば、本発明の目的は、酵母のエステラーゼ遺伝子を明
らかにし、もってエステラーゼ産生能が破壊された酵母
を得ること、及びこの酵母によりエステル香味を高蓄積
したアルコール飲料を製造可能とすることにある。
【０００６】ここで、通常、清酒、ワイン、ビール、焼
酎などの製造に用いられている実用醸造酵母は倍数性が
２倍体（若しくはそれ以上の高次倍数体）であるため、
それぞれ各種アルコール飲料の製造で要求される性質、
例えば、清酒や焼酎でのアルコール耐性、ワインでの亜
硫酸耐性、ビールでの低温発酵特性などを備えている。
従って、実験室株の場合と異なり、醸造用酵母を育種す
る上で実用醸造酵母に人工突然変異を与えて遺伝子を破
壊するのは、目的以外の遺伝子にも変異が生じ、優れた
醸造特性までも変化させる虞があることからあまり望ま
しくない。
酎などの製造に用いられている実用醸造酵母は倍数性が
２倍体（若しくはそれ以上の高次倍数体）であるため、
それぞれ各種アルコール飲料の製造で要求される性質、
例えば、清酒や焼酎でのアルコール耐性、ワインでの亜
硫酸耐性、ビールでの低温発酵特性などを備えている。
従って、実験室株の場合と異なり、醸造用酵母を育種す
る上で実用醸造酵母に人工突然変異を与えて遺伝子を破
壊するのは、目的以外の遺伝子にも変異が生じ、優れた
醸造特性までも変化させる虞があることからあまり望ま
しくない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明のエステラーゼ産
生能を有するＤＮＡ鎖の取得方法は、サッカロマイセス
属酵母よりエステラーゼ欠損株を取得し、その機能を相
補するＤＮＡ鎖を、酵母染色体遺伝子ライブラリーより
クローニングする工程からなることを特徴とする。この
ように本発明によれば、酵母サッカロマイセス・セルビ
シエのエステラーゼをコードするＤＮＡ断片をクローニ
ングすることによって、図１乃至図２の配列表に示すエ
ステラーゼ（ＥＳＴ２）の塩基配列及び構造を明らかに
することができる。
生能を有するＤＮＡ鎖の取得方法は、サッカロマイセス
属酵母よりエステラーゼ欠損株を取得し、その機能を相
補するＤＮＡ鎖を、酵母染色体遺伝子ライブラリーより
クローニングする工程からなることを特徴とする。この
ように本発明によれば、酵母サッカロマイセス・セルビ
シエのエステラーゼをコードするＤＮＡ断片をクローニ
ングすることによって、図１乃至図２の配列表に示すエ
ステラーゼ（ＥＳＴ２）の塩基配列及び構造を明らかに
することができる。
【０００８】実用醸造酵母の目的の遺伝子を破壊するに
は、２本又はそれ以上の染色体上の同一遺伝子を破壊す
る必要があり、選択マーカーの遺伝子を連結した複数個
の破壊用プラスミドの作製が必要となる。本発明によれ
ば、上述したようにエステラーゼ遺伝子（ＥＳＴ２）又
はＤＮＡ鎖が明らかになったことにより、エステラーゼ
遺伝子（ＥＳＴ２）の翻訳領域内に欠失を持つエステラ
ーゼ遺伝子破壊用プラスミドを作製することができる。
２倍体の実用醸造酵母を形質変換する方法として、破壊
用プラスミド１と破壊用プラスミド２とを用いて２段階
で形質転換する方法を採用することにより、実用醸造酵
母の２つの染色体上に存在するエステラーゼ遺伝子（Ｅ
ＳＴ２）のみを破壊した、即ちエステラーゼ産生能のみ
を破壊した形質転換体が得られることを、本願発明者は
見い出した。
は、２本又はそれ以上の染色体上の同一遺伝子を破壊す
る必要があり、選択マーカーの遺伝子を連結した複数個
の破壊用プラスミドの作製が必要となる。本発明によれ
ば、上述したようにエステラーゼ遺伝子（ＥＳＴ２）又
はＤＮＡ鎖が明らかになったことにより、エステラーゼ
遺伝子（ＥＳＴ２）の翻訳領域内に欠失を持つエステラ
ーゼ遺伝子破壊用プラスミドを作製することができる。
２倍体の実用醸造酵母を形質変換する方法として、破壊
用プラスミド１と破壊用プラスミド２とを用いて２段階
で形質転換する方法を採用することにより、実用醸造酵
母の２つの染色体上に存在するエステラーゼ遺伝子（Ｅ
ＳＴ２）のみを破壊した、即ちエステラーゼ産生能のみ
を破壊した形質転換体が得られることを、本願発明者は
見い出した。
【０００９】即ち、本発明によれば、サッカロマイセス
属に属し、エステラーゼの発現に係わる遺伝子のみが破
壊されていることを特徴とする醸造用酵母が提供され
る。ここで、エステラーゼの発現に係わる遺伝子には、
図１及び図２の配列表に示す塩基配列を有するエステラ
ーゼ遺伝子（ＥＳＴ２）がある。また本発明によれば、
このようにして得られた形質転換酵母を用いてアルコー
ル飲料を醸造することにより、エステル香味の高蓄積さ
れたアルコール飲料を製造可能な方法が提供される。
属に属し、エステラーゼの発現に係わる遺伝子のみが破
壊されていることを特徴とする醸造用酵母が提供され
る。ここで、エステラーゼの発現に係わる遺伝子には、
図１及び図２の配列表に示す塩基配列を有するエステラ
ーゼ遺伝子（ＥＳＴ２）がある。また本発明によれば、
このようにして得られた形質転換酵母を用いてアルコー
ル飲料を醸造することにより、エステル香味の高蓄積さ
れたアルコール飲料を製造可能な方法が提供される。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明によるエステラーゼ遺伝子
は、次のようにして選択する。先ず、実験室酵母より公
知のジアゾ活性染色法を用いてスクリーニングすること
によりエステラーゼ欠損株を取得する。この菌株をホス
ト酵母として、その活性を相補するＤＮＡ鎖を酵母染色
体遺伝子ライブラリーよりクローニングする。その結果
得られたエステラーゼ活性を持つＤＮＡ鎖の塩基配列
を、公知の方法を用いて決定する。図１及び図２に、本
発明によるエステラーゼ遺伝子（ＥＳＴ２）の塩基配列
の好適な実施例を示す。ここで、図１及び図２の下線部
は、ＴＡＴＡシグナル、活性中心サイト及びポリアデニ
レーション配列を示す。
は、次のようにして選択する。先ず、実験室酵母より公
知のジアゾ活性染色法を用いてスクリーニングすること
によりエステラーゼ欠損株を取得する。この菌株をホス
ト酵母として、その活性を相補するＤＮＡ鎖を酵母染色
体遺伝子ライブラリーよりクローニングする。その結果
得られたエステラーゼ活性を持つＤＮＡ鎖の塩基配列
を、公知の方法を用いて決定する。図１及び図２に、本
発明によるエステラーゼ遺伝子（ＥＳＴ２）の塩基配列
の好適な実施例を示す。ここで、図１及び図２の下線部
は、ＴＡＴＡシグナル、活性中心サイト及びポリアデニ
レーション配列を示す。
【００１１】エステラーゼ遺伝子（ＥＳＴ２）又はＤＮ
Ａ鎖が明らかになったことにより、エステラーゼ遺伝子
（ＥＳＴ２）の翻訳領域内に欠失を持つエステラーゼ遺
伝子破壊用プラスミドを作製することができる。作製し
た破壊用プラスミド１と破壊用プラスミド２とを用いて
２倍体の実用醸造酵母を２段階で形質転換する方法によ
り、実用醸造酵母の２つの染色体上にあるエステラーゼ
遺伝子（ＥＳＴ２）のみが破壊された、即ちエステラー
ゼ産生能のみが破壊された形質転換体を得る。
Ａ鎖が明らかになったことにより、エステラーゼ遺伝子
（ＥＳＴ２）の翻訳領域内に欠失を持つエステラーゼ遺
伝子破壊用プラスミドを作製することができる。作製し
た破壊用プラスミド１と破壊用プラスミド２とを用いて
２倍体の実用醸造酵母を２段階で形質転換する方法によ
り、実用醸造酵母の２つの染色体上にあるエステラーゼ
遺伝子（ＥＳＴ２）のみが破壊された、即ちエステラー
ゼ産生能のみが破壊された形質転換体を得る。
【００１２】このようにエステラーゼ遺伝子（ＥＳＴ
２）の塩基配列が明らかになったことによって、本発明
のエステラーゼ遺伝子（ＥＳＴ２）は、そのエステラー
ゼを産生する能力を有するＤＮＡ鎖の一部、例えば比較
的短い鎖長のＤＮＡ鎖をプローブとして酵母染色体ライ
ブラリーなどから、プラークハイブリダイゼーション、
コロニーハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ・チェ
イン・リアクション（ＰＣＲ）などの当業者に周知のク
ローニング手段を用いて、その活性を相補するＤＮＡ鎖
を容易に取得できる。
２）の塩基配列が明らかになったことによって、本発明
のエステラーゼ遺伝子（ＥＳＴ２）は、そのエステラー
ゼを産生する能力を有するＤＮＡ鎖の一部、例えば比較
的短い鎖長のＤＮＡ鎖をプローブとして酵母染色体ライ
ブラリーなどから、プラークハイブリダイゼーション、
コロニーハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ・チェ
イン・リアクション（ＰＣＲ）などの当業者に周知のク
ローニング手段を用いて、その活性を相補するＤＮＡ鎖
を容易に取得できる。
【００１３】ここで、本発明によるエステラーゼを産生
するＤＮＡ配列、ＤＮＡ鎖又は遺伝子とは、エステラー
ゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列又
はＤＮＡ鎖のことであり、それがコードするポリペプチ
ド即ちエステラーゼのアミノ酸配列で示せば、実質的に
図１乃至図２に示すものである。ここで、ＤＮＡ鎖と
は、図１乃至図２に示すＤＮＡ配列又はその相補体にハ
イブリダイズし、かつエステラーゼ活性を有するポリペ
プチドを産生し得るＤＮＡ鎖のことである。尚、本明細
書において、ＤＮＡ配列、ＤＮＡ鎖、遺伝子は実質的に
同義に解する。
するＤＮＡ配列、ＤＮＡ鎖又は遺伝子とは、エステラー
ゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列又
はＤＮＡ鎖のことであり、それがコードするポリペプチ
ド即ちエステラーゼのアミノ酸配列で示せば、実質的に
図１乃至図２に示すものである。ここで、ＤＮＡ鎖と
は、図１乃至図２に示すＤＮＡ配列又はその相補体にハ
イブリダイズし、かつエステラーゼ活性を有するポリペ
プチドを産生し得るＤＮＡ鎖のことである。尚、本明細
書において、ＤＮＡ配列、ＤＮＡ鎖、遺伝子は実質的に
同義に解する。
【００１４】また、ポリペプチドの生理活性がいくつか
のアミノ酸の付加、挿入、削除、欠失又は置換によって
も変化しないことがあることは、遺伝子工学、蛋白工学
において良く知られるところである。従って、本発明の
ＤＮＡ配列がコードするポリペプチドの上記定義におけ
る「実質的に」の意味は、図１乃至図２に示すアミノ酸
配列と全く同じものに限定するのではなく、エステラー
ゼ産生能がコードされるポリペプチドに保存される限
り、アミノ酸の付加、挿入、削除、欠失又は置換などの
改変によるものを包含するという意味である。ＤＮＡ配
列も、それがコードするポリペプチドの変動に対応して
変動するが、この「ポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列」という表現もまた、所謂遺伝暗号に関する知見に従
って最も広い意味に解するものとする。従って、縮退
（degeneracy）によって所与のアミノ酸をコードする核
酸のトリプレットは複数種類考えられるし、アミノ酸の
付加、挿入、削除、欠失又は置換に対応してトリプレッ
トのいくつか及び／又はその構成核酸のいくつかが変化
しても良い。尚、本明細書において「コードする」と
は、コードする能力を有することと同義に解する。
のアミノ酸の付加、挿入、削除、欠失又は置換によって
も変化しないことがあることは、遺伝子工学、蛋白工学
において良く知られるところである。従って、本発明の
ＤＮＡ配列がコードするポリペプチドの上記定義におけ
る「実質的に」の意味は、図１乃至図２に示すアミノ酸
配列と全く同じものに限定するのではなく、エステラー
ゼ産生能がコードされるポリペプチドに保存される限
り、アミノ酸の付加、挿入、削除、欠失又は置換などの
改変によるものを包含するという意味である。ＤＮＡ配
列も、それがコードするポリペプチドの変動に対応して
変動するが、この「ポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列」という表現もまた、所謂遺伝暗号に関する知見に従
って最も広い意味に解するものとする。従って、縮退
（degeneracy）によって所与のアミノ酸をコードする核
酸のトリプレットは複数種類考えられるし、アミノ酸の
付加、挿入、削除、欠失又は置換に対応してトリプレッ
トのいくつか及び／又はその構成核酸のいくつかが変化
しても良い。尚、本明細書において「コードする」と
は、コードする能力を有することと同義に解する。
【００１５】本発明で対象とするＤＮＡ配列は、天然物
由来のものでも、全合成したものでも、又は天然物由来
のものの一部を利用して合成を行ったもの即ち半合成の
ものでも良い。このＤＮＡ配列は、エステラーゼにちょ
うど対応する長さのものや、その上流側及び／又は下流
側にＤＮＡ配列が結合した構造のものであっても良い。
後者の具体例は、適当なベクターに組み込まれたプラス
ミドの形状のものである。図１乃至図２には、特定のＤ
ＮＡ配列が示されているが、これは実験室酵母から得ら
れたエステラーゼからのものであり、本発明によるＤＮ
Ａ配列の好ましい具体例の１つである。
由来のものでも、全合成したものでも、又は天然物由来
のものの一部を利用して合成を行ったもの即ち半合成の
ものでも良い。このＤＮＡ配列は、エステラーゼにちょ
うど対応する長さのものや、その上流側及び／又は下流
側にＤＮＡ配列が結合した構造のものであっても良い。
後者の具体例は、適当なベクターに組み込まれたプラス
ミドの形状のものである。図１乃至図２には、特定のＤ
ＮＡ配列が示されているが、これは実験室酵母から得ら
れたエステラーゼからのものであり、本発明によるＤＮ
Ａ配列の好ましい具体例の１つである。
【００１６】また、エステラーゼ産生能を有するＤＮＡ
鎖を取得するための遺伝子源として有用なものとして
は、細菌、酵母、植物などが考えられ、特に酒、醤油な
どの発酵食品の製造に使用されている酵母類は上記の条
件に当てはまるＤＮＡ鎖を有している可能性が高い。し
かし、このことより、スクリーニングを行うライブラリ
ーの遺伝子源が限定されるものではない。
鎖を取得するための遺伝子源として有用なものとして
は、細菌、酵母、植物などが考えられ、特に酒、醤油な
どの発酵食品の製造に使用されている酵母類は上記の条
件に当てはまるＤＮＡ鎖を有している可能性が高い。し
かし、このことより、スクリーニングを行うライブラリ
ーの遺伝子源が限定されるものではない。
【００１７】クローニングに用いる宿主としてはエシェ
リシア・コリ（Escherichia coli）Ｑ３５９（Molecula
r Cloning, Cold Spring Harbor, New York, p.504-506
(1982)参照）など、ベクターとしては酵母用として知ら
れているもの、例えばＹＲｐ系（酵母染色体のＡＲＳ配
列を複製起点とする酵母用マルチコピーベクター）、Ｙ
Ｅｐ系（酵母の２μｍＤＮＡの複製起点を持つ酵母用マ
ルチコピーベクター）、ＹＣｐ系（酵母染色体のＡＲＳ
配列を複製起点として有し、かつ酵母セントロメアＤＮ
Ａ配列を有する酵母用シングルコピーベクター）、ＹＩ
ｐ系（酵母の複数の起点を有しない酵母染色体組み込み
用ベクター）など（朝倉書店刊、日本農芸化学ＡＢＣシ
リーズ「物質生産のための遺伝子工学」p.68参照）、従
来から知られているもの全てを用いることができる。更
に本発明のクローニングの目的を達成するものであれ
ば、上記以外の宿主及びベクターも用いることができ
る。
リシア・コリ（Escherichia coli）Ｑ３５９（Molecula
r Cloning, Cold Spring Harbor, New York, p.504-506
(1982)参照）など、ベクターとしては酵母用として知ら
れているもの、例えばＹＲｐ系（酵母染色体のＡＲＳ配
列を複製起点とする酵母用マルチコピーベクター）、Ｙ
Ｅｐ系（酵母の２μｍＤＮＡの複製起点を持つ酵母用マ
ルチコピーベクター）、ＹＣｐ系（酵母染色体のＡＲＳ
配列を複製起点として有し、かつ酵母セントロメアＤＮ
Ａ配列を有する酵母用シングルコピーベクター）、ＹＩ
ｐ系（酵母の複数の起点を有しない酵母染色体組み込み
用ベクター）など（朝倉書店刊、日本農芸化学ＡＢＣシ
リーズ「物質生産のための遺伝子工学」p.68参照）、従
来から知られているもの全てを用いることができる。更
に本発明のクローニングの目的を達成するものであれ
ば、上記以外の宿主及びベクターも用いることができ
る。
【００１８】また、破壊用プラスミド作製のためには、
ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９（Gene 33p.103-119 (1985)参
照）などの大腸菌のベクターや、上記酵母のベクター等
を適宜使用することができる。また、形質転換体の作製
のための手順又は方法として、例えば酵母などについて
公知の形質転換法、プロトプラスト法、電気融合法、又
はリチウムなどのアルカリ金属の存在下での形質転換法
などは、遺伝子工学の分野に於て慣用されているもので
あり、これらを適宜用いることができる。本発明に於て
も、下記のもの以外については慣用基準（例えば、ANAL
YTICAL BIOCHEMISTRY 163 p.391（1987）など参照）に
準じて実施すれば良い。
ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９（Gene 33p.103-119 (1985)参
照）などの大腸菌のベクターや、上記酵母のベクター等
を適宜使用することができる。また、形質転換体の作製
のための手順又は方法として、例えば酵母などについて
公知の形質転換法、プロトプラスト法、電気融合法、又
はリチウムなどのアルカリ金属の存在下での形質転換法
などは、遺伝子工学の分野に於て慣用されているもので
あり、これらを適宜用いることができる。本発明に於て
も、下記のもの以外については慣用基準（例えば、ANAL
YTICAL BIOCHEMISTRY 163 p.391（1987）など参照）に
準じて実施すれば良い。
【００１９】本発明に於けるホスト酵母即ち形質転換す
べき酵母は、市販の酵母（例えば清酒酵母、ビール酵
母、ワイン酵母、焼酎酵母など）或いは自然界から分離
された酵母など、分類学上、酵母の範疇に入りうる任意
のものである。しかし、本発明の目的からすれば、サッ
カロマイセス・セレビシエに属する酒類製造用酵母、具
体的には清酒酵母、ビール酵母、ワイン酵母などが望ま
しい。例えば、清酒酵母：ＡＴＣＣ４１３４、ＡＴＣＣ
２６４２１及びＩＦＯ２３４７、ビール酵母：ＡＴＣＣ
２６２９２、ＡＴＣＣ２７０４及びＡＴＣＣ３２６３
４、ワイン酵母：ＡＴＣＣ３８６３７、ＡＴＣＣ３８６
３８及びＩＦＯ２２６０を例示することができる。ホス
ト酵母として好ましい他の一群は、パン酵母である。具
体的には、ＡＴＣＣ３２１２０を例示することができ
る。
べき酵母は、市販の酵母（例えば清酒酵母、ビール酵
母、ワイン酵母、焼酎酵母など）或いは自然界から分離
された酵母など、分類学上、酵母の範疇に入りうる任意
のものである。しかし、本発明の目的からすれば、サッ
カロマイセス・セレビシエに属する酒類製造用酵母、具
体的には清酒酵母、ビール酵母、ワイン酵母などが望ま
しい。例えば、清酒酵母：ＡＴＣＣ４１３４、ＡＴＣＣ
２６４２１及びＩＦＯ２３４７、ビール酵母：ＡＴＣＣ
２６２９２、ＡＴＣＣ２７０４及びＡＴＣＣ３２６３
４、ワイン酵母：ＡＴＣＣ３８６３７、ＡＴＣＣ３８６
３８及びＩＦＯ２２６０を例示することができる。ホス
ト酵母として好ましい他の一群は、パン酵母である。具
体的には、ＡＴＣＣ３２１２０を例示することができ
る。
【００２０】上記のようにして得た、エステラーゼ産生
能の破壊された形質転換酵母は、破壊された形質に加え
てホスト酵母固有の形質を具備しているから、その固有
の形質に着目した各種の用途に利用することができる。
即ち、ここで使用される形質転換酵母は、サッカロマイ
セス属に属し、例えば図１乃至図２に示すエステラーゼ
遺伝子のみが破壊された酵母であり、上述したようない
ずれの種類の酵母をホストとして用いても良い。
能の破壊された形質転換酵母は、破壊された形質に加え
てホスト酵母固有の形質を具備しているから、その固有
の形質に着目した各種の用途に利用することができる。
即ち、ここで使用される形質転換酵母は、サッカロマイ
セス属に属し、例えば図１乃至図２に示すエステラーゼ
遺伝子のみが破壊された酵母であり、上述したようない
ずれの種類の酵母をホストとして用いても良い。
【００２１】ホスト酵母が酒類製造用酵母である場合
は、その形質転換酵母も糖類を発酵させてアルコールを
産生する能力を有するから、この形質転換されてエステ
ラーゼ産生能が破壊された酵母を使用すれば、エステル
香味の高蓄積されたアルコール飲料を製造することがで
きる。アルコール飲料としては、清酒、ビール、ワイ
ン、及び焼酎が代表的であるが、本発明はこれら以外の
アルコール飲料についても同様に適用できる。また、こ
れらアルコール飲料の製造方法は周知であることからそ
の詳細な説明は省略する。
は、その形質転換酵母も糖類を発酵させてアルコールを
産生する能力を有するから、この形質転換されてエステ
ラーゼ産生能が破壊された酵母を使用すれば、エステル
香味の高蓄積されたアルコール飲料を製造することがで
きる。アルコール飲料としては、清酒、ビール、ワイ
ン、及び焼酎が代表的であるが、本発明はこれら以外の
アルコール飲料についても同様に適用できる。また、こ
れらアルコール飲料の製造方法は周知であることからそ
の詳細な説明は省略する。
【００２２】
【実施例】本発明の好適実施例について添付の図面を参
照して、 （１）実験室酵母からのエステラーゼ欠損株の取得 （２）エステラーゼを産生するＤＮＡ鎖のクローニング （３）エステラーゼ遺伝子破壊のためのプラスミドの構
築 （４）エステラーゼ遺伝子破壊株の取得 （５）形質転換体によるアルコール飲料の製造 の順に詳しく説明する。
照して、 （１）実験室酵母からのエステラーゼ欠損株の取得 （２）エステラーゼを産生するＤＮＡ鎖のクローニング （３）エステラーゼ遺伝子破壊のためのプラスミドの構
築 （４）エステラーゼ遺伝子破壊株の取得 （５）形質転換体によるアルコール飲料の製造 の順に詳しく説明する。
【００２３】（１）実験室酵母からのエステラーゼ欠損
株の取得 実験室株ＩＦＯ１０４８０株を１０ｍｌＹＰＤ培地で一
晩振とう培養し、集菌洗浄後、常法通りにＥＭＳ変異処
理を行い、適宜希釈して、ＳＤ培地（０．６７％イース
トナイトロゲンベース（アミノ酸不含有）、２％グルコ
ース、２％寒天）に塗沫後、３０℃、３日間培養した。
その後、出現したコロニーを公知のジアゾ活性染色法
（柳内ら、発酵工学、６７、１５９、(1989)）を用いて
色調の差をもってスクリーニングし、親株（Ｓ１）が赤
く染色されるのに対し、ピンク色を示すエステラーゼを
欠損しているＩＡＨ−１株（Ｓ２）を得た。親株と取得
した欠損株とのコロニーをジアゾ活性染色した結果を図
３（ａ）に示した。同図は、白黒表示のため、赤色の親
株（Ｓ１）が濃い灰色の丸い点で表されるのに対し、ピ
ンク色の欠損株（Ｓ２）は白色の丸い点で表されている
が、両者間の色彩の相違は容易に判別される。また、親
株と取得した欠損株との酵母無細胞抽出液を調製し、ポ
リアクリルアミド電気泳動後にジアゾ活性染色した結果
を図３（ｂ）に示す。同図において、親株（Ｓ１）に
は、ＥＳＴ１とＥＳＴ２との２種のエステラーゼが検出
されているが、欠損株（Ｓ２）には、主に酢酸イソアミ
ルなどのエステルの分解に関与するエステラーゼ遺伝子
（ＥＳＴ２）が欠損している。
株の取得 実験室株ＩＦＯ１０４８０株を１０ｍｌＹＰＤ培地で一
晩振とう培養し、集菌洗浄後、常法通りにＥＭＳ変異処
理を行い、適宜希釈して、ＳＤ培地（０．６７％イース
トナイトロゲンベース（アミノ酸不含有）、２％グルコ
ース、２％寒天）に塗沫後、３０℃、３日間培養した。
その後、出現したコロニーを公知のジアゾ活性染色法
（柳内ら、発酵工学、６７、１５９、(1989)）を用いて
色調の差をもってスクリーニングし、親株（Ｓ１）が赤
く染色されるのに対し、ピンク色を示すエステラーゼを
欠損しているＩＡＨ−１株（Ｓ２）を得た。親株と取得
した欠損株とのコロニーをジアゾ活性染色した結果を図
３（ａ）に示した。同図は、白黒表示のため、赤色の親
株（Ｓ１）が濃い灰色の丸い点で表されるのに対し、ピ
ンク色の欠損株（Ｓ２）は白色の丸い点で表されている
が、両者間の色彩の相違は容易に判別される。また、親
株と取得した欠損株との酵母無細胞抽出液を調製し、ポ
リアクリルアミド電気泳動後にジアゾ活性染色した結果
を図３（ｂ）に示す。同図において、親株（Ｓ１）に
は、ＥＳＴ１とＥＳＴ２との２種のエステラーゼが検出
されているが、欠損株（Ｓ２）には、主に酢酸イソアミ
ルなどのエステルの分解に関与するエステラーゼ遺伝子
（ＥＳＴ２）が欠損している。
【００２４】（２）エステラーゼを産生するＤＮＡ鎖の
クローニング サッカロマイセス・セレビシエの染色体ライブラリー
（ＡＴＣＣ３７３２４）と取得した上記欠損株とを用い
てエステラーゼ活性の相補性を利用し、クローンの選択
を行った。約１５０００個の形質転換体の中からエステ
ラーゼ活性を相補する１個のクローンを選択できた。こ
のクローンの中のプラスミドｐＩＡＨ１１８に挿入され
ているサッカロマイセス・セレビシエのＤＮＡ断片のＰ
ｓｔＩ−ＨｉｎｄIII 、約２．４ｋｂ中にエステラーゼ
活性が見い出され、この断片をバクテリアファージベク
ターＭ１３ｍｐ１８とＭ１３ｍｐ１９とに連結した。そ
の後、キロシーケンスデリーションキット（宝酒造株式
会社製）を用いてオーバーラッピングデリーションシリ
ーズを構築し、塩基配列の決定をＤＮＡシークエンサー
（ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡシークエンスシステム、アプ
ライドバイオシステム社製）を用いてジデオキシ法によ
り行った。図１乃至図２に示す塩基配列がエステラーゼ
をコードする部分である。
クローニング サッカロマイセス・セレビシエの染色体ライブラリー
（ＡＴＣＣ３７３２４）と取得した上記欠損株とを用い
てエステラーゼ活性の相補性を利用し、クローンの選択
を行った。約１５０００個の形質転換体の中からエステ
ラーゼ活性を相補する１個のクローンを選択できた。こ
のクローンの中のプラスミドｐＩＡＨ１１８に挿入され
ているサッカロマイセス・セレビシエのＤＮＡ断片のＰ
ｓｔＩ−ＨｉｎｄIII 、約２．４ｋｂ中にエステラーゼ
活性が見い出され、この断片をバクテリアファージベク
ターＭ１３ｍｐ１８とＭ１３ｍｐ１９とに連結した。そ
の後、キロシーケンスデリーションキット（宝酒造株式
会社製）を用いてオーバーラッピングデリーションシリ
ーズを構築し、塩基配列の決定をＤＮＡシークエンサー
（ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡシークエンスシステム、アプ
ライドバイオシステム社製）を用いてジデオキシ法によ
り行った。図１乃至図２に示す塩基配列がエステラーゼ
をコードする部分である。
【００２５】尚、本実施例に用いたサッカロマイセス・
セレビシエの染色体ライブラリーは、市販品（ＡＴＣＣ
３７３２４）であるが、酒類製造などに一般に用いられ
ているサッカロマイセス・セレビシエは本発明によるエ
ステラーゼ遺伝子（ＥＳＴ２）を含んでいる可能性が高
い。従って、それらのサッカロマイセス・セレビシエか
ら染色体ＤＮＡを抽出し、染色体遺伝子ライブラリーを
作製して用いても同様な結果が得られることが予想され
るから、ライブラリーは上記実施例のものに限定されな
い。
セレビシエの染色体ライブラリーは、市販品（ＡＴＣＣ
３７３２４）であるが、酒類製造などに一般に用いられ
ているサッカロマイセス・セレビシエは本発明によるエ
ステラーゼ遺伝子（ＥＳＴ２）を含んでいる可能性が高
い。従って、それらのサッカロマイセス・セレビシエか
ら染色体ＤＮＡを抽出し、染色体遺伝子ライブラリーを
作製して用いても同様な結果が得られることが予想され
るから、ライブラリーは上記実施例のものに限定されな
い。
【００２６】（３）エステラーゼ遺伝子破壊のためのプ
ラスミドの構築 実用醸造酵母の目的の遺伝子を破壊又は置換するには、
２本又はそれ以上の染色体上の同一遺伝子を破壊又は置
換する必要があり、複数個の破壊又は置換用プラスミド
の構築が必要となる。次に、その破壊用プラスミドの構
築方法を説明する。
ラスミドの構築 実用醸造酵母の目的の遺伝子を破壊又は置換するには、
２本又はそれ以上の染色体上の同一遺伝子を破壊又は置
換する必要があり、複数個の破壊又は置換用プラスミド
の構築が必要となる。次に、その破壊用プラスミドの構
築方法を説明する。
【００２７】プラスミド１は、エステラーゼ遺伝子由来
の２．４ｋｂｐのＰｓｔＩ−ＨｉｎｄIII フラグメント
を組み込んだプラスミドｐＵＣ１９ＰＨのＨｉｎｃIIサ
イトに、ｐＹＥＵｒａ３ベクターより切り出したＵＲＡ
３遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII フラグメント
をブランチングした後に連結してｐＵＣ１９ＰＨ−ＵＲ
Ａ３を構築することにより作製した（図４）。
の２．４ｋｂｐのＰｓｔＩ−ＨｉｎｄIII フラグメント
を組み込んだプラスミドｐＵＣ１９ＰＨのＨｉｎｃIIサ
イトに、ｐＹＥＵｒａ３ベクターより切り出したＵＲＡ
３遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII フラグメント
をブランチングした後に連結してｐＵＣ１９ＰＨ−ＵＲ
Ａ３を構築することにより作製した（図４）。
【００２８】また、プラスミド２は、エステラーゼ遺伝
子由来の２．４ｋｂｐのＰｓｔＩ−ＨｉｎｄIII フラグ
メントを組み込んだプラスミドｐＵＣ１９ＨＰのＨｉｎ
ｃIIサイトに、ＹＲｐ７ベクターより切り出したＴＲＰ
１遺伝子を含むＥｃｏＲＩフラグメントをブランチング
した後に連結してｐＵＣ１９ＰＨ−ＴＲＰ１を構築する
ことにより作製した（図５）。
子由来の２．４ｋｂｐのＰｓｔＩ−ＨｉｎｄIII フラグ
メントを組み込んだプラスミドｐＵＣ１９ＨＰのＨｉｎ
ｃIIサイトに、ＹＲｐ７ベクターより切り出したＴＲＰ
１遺伝子を含むＥｃｏＲＩフラグメントをブランチング
した後に連結してｐＵＣ１９ＰＨ−ＴＲＰ１を構築する
ことにより作製した（図５）。
【００２９】（４）エステラーゼ遺伝子破壊株の取得 清酒酵母協会７０１号由来のＵＴ−１（ｕｒａ３／ｕｒ
ａ３ ｔｒｐ１／ｔｒｐ１）を上記エステラーゼ遺伝子
破壊用プラスミド１及び２を用いて２段階の形質転換を
行い、ウラシルとトリプトファン要求性のなくなった形
質転換体ＵＴ−１ＥをＳＤ培地により取得した。この形
質転換体は、サザン解析により２本の染色体上のエステ
ラーゼ遺伝子がともに破壊されていることを確認でき
た。
ａ３ ｔｒｐ１／ｔｒｐ１）を上記エステラーゼ遺伝子
破壊用プラスミド１及び２を用いて２段階の形質転換を
行い、ウラシルとトリプトファン要求性のなくなった形
質転換体ＵＴ−１ＥをＳＤ培地により取得した。この形
質転換体は、サザン解析により２本の染色体上のエステ
ラーゼ遺伝子がともに破壊されていることを確認でき
た。
【００３０】（５）形質転換体によるアルコール飲料の
製造 上記形質転換体ＵＴ−１Ｅ及び親株協会７０１号を用
い、表１に示す仕込配合で総米１７０ｇの清酒製造試験
を行った。この結果、表２に示すように、形質転換体Ｕ
Ｔ−１Ｅでは、発酵速度及び一般成分は親株と変わらな
いが、エステル類の含有量が著しく高くなっており（酢
酸イソアミルで親株の１７倍、酢酸イソブチルで親株の
１０倍）、官能的評価に優れた清酒の製造が可能となっ
た。
製造 上記形質転換体ＵＴ−１Ｅ及び親株協会７０１号を用
い、表１に示す仕込配合で総米１７０ｇの清酒製造試験
を行った。この結果、表２に示すように、形質転換体Ｕ
Ｔ−１Ｅでは、発酵速度及び一般成分は親株と変わらな
いが、エステル類の含有量が著しく高くなっており（酢
酸イソアミルで親株の１７倍、酢酸イソブチルで親株の
１０倍）、官能的評価に優れた清酒の製造が可能となっ
た。
【００３１】
【表１】
【００３２】
【表２】
【００３３】
【発明の効果】以上の説明により明らかなように、本発
明によれば、酵母エステラーゼ遺伝子（ＥＳＴ２）の構
造又は塩基配列を明らかにした。このことにより、遺伝
子工学的手法によって酵母のエステラーゼ遺伝子（ＥＳ
Ｔ２）のみを破壊することが可能となり、エステラーゼ
産生能のみを破壊することができる。このエステラーゼ
産生能のみを破壊した形質転換酵母を用いて糖類を発酵
させることにより、エステル香味の高蓄積されたアルコ
ール飲料を製造することができる。
明によれば、酵母エステラーゼ遺伝子（ＥＳＴ２）の構
造又は塩基配列を明らかにした。このことにより、遺伝
子工学的手法によって酵母のエステラーゼ遺伝子（ＥＳ
Ｔ２）のみを破壊することが可能となり、エステラーゼ
産生能のみを破壊することができる。このエステラーゼ
産生能のみを破壊した形質転換酵母を用いて糖類を発酵
させることにより、エステル香味の高蓄積されたアルコ
ール飲料を製造することができる。
【図１】図２と共に本発明に基づくエステラーゼ遺伝子
（ＥＳＴ２）の塩基配列及びアミノ酸配列の前半を示す
配列図。
（ＥＳＴ２）の塩基配列及びアミノ酸配列の前半を示す
配列図。
【図２】図１と共に本発明に基づくエステラーゼ遺伝子
（ＥＳＴ２）の塩基配列及びアミノ酸配列の後半を示す
配列図。
（ＥＳＴ２）の塩基配列及びアミノ酸配列の後半を示す
配列図。
【図３】（ａ）は、親株ＩＦＯ１０４８０（Ｓ１）及び
エステラーゼ欠損株ＩＡＨ−１（Ｓ２）のコロニーをジ
アゾ活性染色した結果、（ｂ）は、親株Ｓ１及びエステ
ラーゼ欠損株Ｓ２の酵母無細胞抽出液を調製し、ポリア
クリルアミド電気泳動後にジアゾ活性染色した結果を示
す図。
エステラーゼ欠損株ＩＡＨ−１（Ｓ２）のコロニーをジ
アゾ活性染色した結果、（ｂ）は、親株Ｓ１及びエステ
ラーゼ欠損株Ｓ２の酵母無細胞抽出液を調製し、ポリア
クリルアミド電気泳動後にジアゾ活性染色した結果を示
す図。
【図４】エステラーゼ遺伝子破壊のためのプラスミド１
の構築の過程を示す説明図。
の構築の過程を示す説明図。
【図５】エステラーゼ遺伝子破壊のためのプラスミド２
の構築の過程を示す説明図。
の構築の過程を示す説明図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 柳内 敏靖 京都市伏見区塩屋町223番地 黄桜酒造株 式会社内 (72)発明者 若井 芳則 京都市伏見区塩屋町223番地 黄桜酒造株 式会社内
Claims (5)
- 【請求項１】 サッカロマイセス属酵母よりエステラー
ゼ欠損株を取得し、その機能を相補するＤＮＡ鎖を、酵
母染色体遺伝子ライブラリーよりクローニングする工程
からなることを特徴とするエステラーゼ産生能を有する
ＤＮＡ鎖の取得方法。 - 【請求項２】 図１乃至図２の配列表に示す塩基配列を
有するエステラーゼ（ＥＳＴ２）遺伝子。 - 【請求項３】 サッカロマイセス属に属し、エステラー
ゼの発現に係わる遺伝子のみが破壊されていることを特
徴とする醸造用酵母。 - 【請求項４】 前記エステラーゼの発現に係わる遺伝子
が請求項２に記載の遺伝子であることを特徴とする請求
項３に記載の醸造用酵母。 - 【請求項５】 請求項３又は請求項４に記載の酵母を用
いて醸造することを特徴とするアルコール飲料の製造方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7089196A JP3050372B2 (ja) | 1996-03-04 | 1996-03-04 | エステラーゼ遺伝子及びその取得方法、並びに醸造用酵母及びそれを用いたアルコール飲料の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7089196A JP3050372B2 (ja) | 1996-03-04 | 1996-03-04 | エステラーゼ遺伝子及びその取得方法、並びに醸造用酵母及びそれを用いたアルコール飲料の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09234077A true JPH09234077A (ja) | 1997-09-09 |
| JP3050372B2 JP3050372B2 (ja) | 2000-06-12 |
Family
ID=13444615
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7089196A Expired - Fee Related JP3050372B2 (ja) | 1996-03-04 | 1996-03-04 | エステラーゼ遺伝子及びその取得方法、並びに醸造用酵母及びそれを用いたアルコール飲料の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3050372B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007032523A2 (en) * | 2005-09-13 | 2007-03-22 | Suntory Limited | Esterase gene and use thereof |
| WO2007032524A2 (en) | 2005-09-13 | 2007-03-22 | Suntory Limited | Alcohol acetyl transferase gene and use thereof |
| WO2007097091A1 (en) * | 2006-02-24 | 2007-08-30 | Suntory Limited | Acyl-coa: ethanol o-acyltransferase/esterase gene and use thereof |
-
1996
- 1996-03-04 JP JP7089196A patent/JP3050372B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007032523A2 (en) * | 2005-09-13 | 2007-03-22 | Suntory Limited | Esterase gene and use thereof |
| WO2007032524A2 (en) | 2005-09-13 | 2007-03-22 | Suntory Limited | Alcohol acetyl transferase gene and use thereof |
| WO2007032523A3 (en) * | 2005-09-13 | 2007-06-21 | Suntory Ltd | Esterase gene and use thereof |
| JP2009507466A (ja) * | 2005-09-13 | 2009-02-26 | サントリー株式会社 | エステラーゼ遺伝子及びその用途 |
| AU2006289719B2 (en) * | 2005-09-13 | 2011-08-04 | Suntory Holdings Limited | Esterase gene and use thereof |
| JP4870089B2 (ja) * | 2005-09-13 | 2012-02-08 | サントリーホールディングス株式会社 | エステラーゼ遺伝子及びその用途 |
| WO2007097091A1 (en) * | 2006-02-24 | 2007-08-30 | Suntory Limited | Acyl-coa: ethanol o-acyltransferase/esterase gene and use thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3050372B2 (ja) | 2000-06-12 |
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