JPH09227592A - 新規ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 次に示すアミノ酸配列で有するペプチド
又はその塩。 H-Trp-Leu-Gly-Arg-X-Asp-Gly-Ser-Glu-OH又はH-Arg-Le
u-Gly-Arg-X-Asp-Gly-Ser-Glu-OH （ここでＸはGlu又はGlnを表わす。） 【効果】 本ペプチドはすぐれたマクロファージ走化活
性を示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は生理活性ペプチド、
更に詳しくはマクロファージ走化活性を有する新規ペプ
チドに関する。

【０００２】

【従来の技術】一般的に、マクロファージ走化性因子
（以下ＭＣＦと略す）は、リンパ球及びリンパ球系株化
細胞から特異的または非特異的に分泌されるマクロファ
ージ走化活性を有するリンフォカインの一種として知ら
れている。たとえば、末梢血リンパ球（以下ＰＢＬと略
す）をレクチンたとえばフィトヘムアグルチニン（以下
ＰＨＡと略す）で刺激した後、その刺激リンパ球を培養
した上清には高いマクロファージ走化活性が認められる
ことは既に知られている。さらに永続生存性を持たせる
ために白血病細胞株と上記刺激リンパ球を融合させて得
られたハイブリドーマの培養上清にもマクロファージ走
化活性が認められる（特開昭６０−１８１０１８号公
報）。

【０００３】一方、遅延型過敏症において、感作動物に
惹起反応を生じさせ、皮膚反応が最大となる約４８時間
後において、その組織中にリンパ球の他マクロファージ
の浸潤が著明であることから、遅延型過敏症発症におい
てＭＣＦの関与が考えられている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】このように、ＭＣＦは
反応局所にマクロファージを集合させる活性を有するこ
とで定義されるので、抗腫瘍剤として医薬への応用が期
待されている。しかし、上記リンパ球の培養上清中に
も、惹起反応を生じさせた皮膚中にも、いずれにもＭＣ
Ｆの濃度は低く、未だその構造は明らかとなっていな
い。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＭＣＦ活
性を有する化合物について解析を進めてきた結果、特定
のアミノ酸配列を有するペプチドが高いＭＣＦ活性を有
することを見出し、本発明に至った。

【０００６】すなわち、本発明は、アミノ酸がペプチド
結合によりTrp-Leu-Gly-Arg-Glu-(又はGln)-Arg-Gly-Se
r-Glu又はArg-Leu-Gly-Arg-Glu(又はGln)-Asp-Gly-Ser-
Gluの順で配列している新規ペプチドに関するものであ
る。以下、本発明について詳述する。

【０００７】本発明の新規ペプチドは高いＭＣＦ活性を
有しており、遅延型過敏症の研究用試薬、更には抗腫瘍
剤としての医薬用途に有効に用いられる。

【０００８】本発明のペプチドは、生体試料又はその
培養物を用いる生化学的な方法、あるいは化学的にア
ミノ酸を順次結合させる化学合成法によって製造され
る。

【０００９】 生体試料又はその培養物を用いる生化
学的な方法

【００１０】ａ）ヒト末梢血リンパ球を用いる方法 本発明の新規ペプチドを製造する原料としては、ヒト末
梢血リンパ球（以下ＰＢＬと略す）を用いる方法があ
る。ＰＢＬは、ヒト末梢血を用い、比重によってリンパ
球を分離する方法によって取得される。すなわちシグマ
社Histohypaque液やファルマシア社製FicolやPercoll液
の適当な比重液に末梢血を重層し、例えば１５００ｒｐ
ｍ×２０ｍｉｎの強さの遠心をかけると、リンパ球が豊
富な画分を得ることができる。この画分をプラスチック
シャーレにはりつけ、非付着細胞をリンパ球として用い
ることもできる。

【００１１】本発明のペプチドを製造するには、通常用
いられる培地たとえば１０％牛胎児血清（FCS）含有Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地にＰＢＬを浮遊させ、レクチン（コ
ンカナバリンＡやフィトヘムアグルチニンなど）を加え
て培養されるが、例えば２０ｈｒなど適当な時間培養し
ておいたリンパ球を用いる方が培養効率がよいのでより
好ましい。

【００１２】本発明のペプチドを得るためには、ＰＢＬ
を無血清培地に再懸濁させ、通常の培養方法、たとえば
５％ＣＯ₂存在下３７℃で１時間から数日間培養する方
法で培養したのち、その上清液を用いる。ＰＢＬの無血
清培地への再懸濁、培養を行なわないで、ＰＢＬ細胞を
そのまま破壊し、比較的大きな細胞器官を除くための遠
心分離を行なってその上清液（セルライセート）を用い
ることもできる。この際の遠心分離は、例えば１０，０
００Ｘｇ、２０分程度行なえば良い。

【００１３】ＰＢＬの培養上清又はセルライセートから
本発明のペプチドを得るには、まず、培養上清又はセル
ライセートから限外ろ過など分子のサイズでわける方法
を用いて高分子画分を除く。この溶液を陰イオン交換体
に吸着させ、塩濃度を上昇させることによりペプチドを
溶出させることができる。尚用いる陰イオン交換体はＤ
ＥＡＥ（ジエチルアミノエチル交換体）やＱＡＥ（第４
級アミノエチル交換体）さらに、ファルマシア社製Ｍｏ
ｎｏ Ｑなども用いることができる。

【００１４】さらに、ここに得られる活性画分を、陽イ
オン交換体に吸着させ、塩濃度を上昇させることにより
溶出させることができる。尚、用いる陽イオン交換体は
ファルマシア社製Ｍｏｎｏ Ｓやカルボキシメチル交換
体などを用いることができる。さらに、ここに得られる
活性画分を逆相クロマトグラフィーに供与し、通常アセ
トニトリルなどの有機溶媒の濃度を上昇させることによ
って溶出してほぼ純粋なペプチドを得ることができる。

【００１５】ｂ）株化されている細胞を用いる方法 本発明の新規ペプチドを製造する原料としては、株化さ
れている細胞を用いることができる。原料としての効率
を考慮に入れなければ、白血病細胞株ＣＥＭなどを用い
ることもできるが、末梢血リンパ球と白血病細胞株のハ
イブリドーマを用いた方が、本発明のペプチドを効率よ
く製造することができるので好ましい。株化された細胞
を用いて本発明のペプチドを製造するには、ＰＢＬを用
いて本発明のペプチドを製造する際に採用した手順をそ
のまま採用することができる。

【００１６】 化学的にアミノ酸を順次結合させる化
学合成法 ペプチドの化学合成法としては、固相合成法が広く用い
られている。本発明のペプチド類を合成する際にも、こ
の方法を用いることができる。

【００１７】固相合成法においては、種々のアミノ酸部
分の反応性側鎖を適当な保護基で保護することにより、
保護基が最後に除去されるまで反応性側鎖で起こる可能
性のある化学反応を防止することができる。例えば、Ａ
ｓｐ、Ｇｌｕにおける側鎖保護基としては、ＯＢｚｌ、
ＯｔＢｕを用いることができ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ
における側鎖保護基としてＢｚｌ、Ｂｒ−Ｚ、ｔＢｕを
用いることができる。また、ＬｙｓにおいてはＣｌ−
Ｚ、Ｔｏｓが、ＡｒｇにおいてＴｏｓ、ＭＴＳ、Ｍｔｒ
が、ＨｉｓにおいてＴｏｓ、ＤＮＰ、Ｔｒｔ・ＯＨが、
ＴｒｐにおいてＣＨＯが、Ｃｙｓにおいては４−ＭｅＢ
ｚｌ、４−ＭｅＯＢｚｌが側鎖保護基として用いられ
る。Ｍｅｔはスルホキシドの形で保護することができ
る。

【００１８】固相合成法としては、Ｂｏｃ法、Ｆｍｏｃ
法が代表的であり、どちらの方法も本発明のペプチド類
合成の際に利用できる。固相合成は、例えば、α−アミ
ノ保護アミノ酸を用いてペプチドのＣ−末端から開始す
ることができる。適当な出発材料は、例えば必要なα−
アミノ保護アミノ酸をクロロメチル樹脂、オキシメチル
樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂に付加することにより
調製できる。また、α−アミノ基及び側鎖基が保護され
たアミノ酸の付加した４（オキシメチル）フェニルアセ
タミドメチル樹脂が市販されており、本発明のペプチド
類合成の際にも使用することができる。また、本発明の
ペプチド類は、自動固相合成機を利用しても合成するこ
とができる。

【００１９】典型的なＢｏｃ法ペプチド合成の工程を示
す。例えば、出発材料として、α−アミノ基をＢｏｃ基
で保護したアミノ酸樹脂を使用する。

【００２０】１．ＤＣＭで洗浄（３回） ２．ＴＦＡ／ＤＣＭで脱Ｂｏｃ化 ３．ＤＣＭで洗浄（３回） ４．ＤＩＥＡ／ＤＭＦで中和 ５．ＤＭＦで洗浄（５回） ６．Ｂｏｃアミノ酸無水物と反応 ７．ＤＣＭで洗浄（５回） ８．工程２〜７の繰り返し ９．ＤＣＭで洗浄（２回） １０．Ａｒガスで乾燥 １１．アニソール／メチルエチルスルフィド添加 １２．−７０℃でＨＦを添加、−２０℃／３０分、０℃
／３０分反応 １３．ＨＦを留去 １４．クロロホルム・エーテルで洗浄（３回） １５．５Ｎ−酢酸水溶液で合成ペプチドを抽出 １６．合成ペプチドをＨＰＬＣにて精製

【００２１】典型的なＦｍｏｃ法ペプチド合成の工程を
示す。例えば、出発材料として、α−アミノ基をＢｏｃ
基で保護したアミノ酸樹脂を使用する。

【００２２】１．ＤＣＭで洗浄（３回） ２．ＴＦＡ／ＤＣＭで脱Ｂｏｃ化 ３．ＤＣＭで洗浄（３回） ４．ＤＭＦで洗浄（３回） ５．Ｆｍｏｃアミノ酸無水物と反応 ６．ＤＭＦで洗浄（５回） ７．ピペリジン／ＤＭＦで脱Ｆｍｏｃ化 ８．工程４〜７の繰り返し ９．ＤＭＦで洗浄（５回） １０．ＤＣＭで洗浄（２回） １１．Ａｒガスで乾燥 １２．アニソール／メチルエチルスルフィド／１，２エ
タンジチオール添加 １３．−７０℃でＨＦを添加、−２０℃／３０分、０℃
／３０分反応 １４．ＨＦを留去 １５．クロロホルム・エーテルで洗浄（３回） １６．５Ｎ−酢酸水溶液で合成ペプチドを抽出 １７．合成ペプチドをＨＰＬＣにて精製

【００２３】以下、実施例により、本発明を更に詳細に
説明する。尚、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性基等
が本明細書において記号で示される場合、ＩＵＰＡＣ及
びＩＵＰにより測定された或るいは、ペプチド化学の分
野で使用される通常の記号を用いる。記号の例は、次の
通りである。

【００２４】Ｌ−Ａｌａ…Ｌ−アラニン Ｌ−Ａｒｇ…Ｌ−アルギニン Ｌ−Ａｓｎ…Ｌ−アスパラギン Ｌ−Ａｓｐ…Ｌ−アスパラギン酸 Ｌ−Ｃｙｓ…Ｌ−システイン Ｌ−Ｇｌｎ…Ｌ−グルタミン Ｌ−Ｇｌｕ…Ｌ−グルタミン酸 Ｇｌｙ… …グリシン Ｌ−Ｈｉｓ…Ｌ−ヒスチジン Ｌ−Ｉｌｅ…Ｌ−イソロイシン Ｌ−Ｌｅｕ…Ｌ−ロイシン Ｌ−Ｌｙｓ…Ｌ−リジン Ｌ−Ｍｅｔ…Ｌ−メチオニン Ｌ−Ｐｈｅ…Ｌ−フェニルアラニン Ｌ−Ｐｒｏ…Ｌ−プロリン Ｌ−Ｓｅｒ…Ｌ−セリン Ｌ−Ｔｈｒ…Ｌ−スレオニン Ｌ−Ｔｒｐ…Ｌ−トリプトファン Ｌ−Ｔｙｒ…Ｌ−タイロシン Ｌ−Ｖａｌ…Ｌ−バリン

【００２５】Ｄ−Ａｌａ…Ｄ−アラニン Ｄ−Ａｒｇ…Ｄ−アルギニン Ｄ−Ａｓｎ…Ｄ−アスパラギン Ｄ−Ａｓｐ…Ｄ−アスパラギン酸 Ｄ−Ｃｙｓ…Ｄ−システイン Ｄ−Ｇｌｎ…Ｄ−グルタミン Ｄ−Ｇｌｕ…Ｄ−グルタミン酸 Ｄ−Ｈｉｓ…Ｄ−ヒスチジン Ｄ−Ｉｌｅ…Ｄ−イソロイシン Ｄ−Ｌｅｕ…Ｄ−ロイシン Ｄ−Ｌｙｓ…Ｄ−リジン Ｄ−Ｍｅｔ…Ｄ−メチオニン Ｄ−Ｎｌｅ…Ｄ−ノルロイシン Ｄ−Ｐｈｅ…Ｄ−フェニルアラニン Ｄ−Ｐｒｏ…Ｄ−プロリン Ｄ−Ｓｅｒ…Ｄ−セリン Ｄ−Ｔｈｒ…Ｄ−スレオニン Ｄ−Ｔｒｐ…Ｄ−トリプトファン Ｄ−Ｔｙｒ…Ｄ−タイロシン Ｄ−Ｖａｌ…Ｄ−バリン

【００２６】ＨＰＬＣ…高速液体クロマトグラフィー ＯＤＳカラム…Ｃ１８カラム ＨＭＰレジン…ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸レジン
（樹脂） ＰＡＭレジン…フェニルアセタミドレジン（樹脂） ＢＨＡレジン…ベンズヒドリルアミンレジン（樹脂） ＤＣＭ…ジクロロメタン ＤＭＦ…ジメチルホルムアミド ＴＦＡ…トリフルオロ酢酸 Ａｒガス…アルゴンガス Ｂｚｌ…ベンジル基 ｔＢｕ…ｔ−ブチル基 Ｚ… …ベンジルオキシカルボニル基 Ｂｏｃ…ブチルオキシカルボニル基 Ｔｏｓ…トシル基 ＭＴＳ…メシチレン−二−スルホニル基 Ｔｒｔ…トリチル基 ＤＮＰ…２，４−ジニトロフェニル基 Ｍｔｒ…４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼ
ンスルホニル基 Ｆｍｏｃ…９−フルオレニルメトキシカルボニル基

【００２７】以下に実施例を示して本発明をより詳細に
説明する。尚、実施例におけるマクロファージ走化活性
の測定は次の如く行なった。

【００２８】あらかじめ３〜４日前に、腹腔内に流動パ
ラフィンを注入したモルモットから採取した腹腔浸出細
胞（通常９５％以上マクロファージ）をマクロファージ
として２×１０⁶／ｍｌの細胞濃度で用いた。４８穴ケ
モタキシスチャンバーの下室に活性を測定する試料を入
れ、ポアサイズ５μｍのポリカーボネート膜をその上に
載せ、上室にマクロファージ懸濁液を入れＣＯ₂インキ
ュベーター内で３７℃、９０ｍｉｎ、インキュベートし
た。インキュベート後、非遊走面の付着細胞を除き、固
定、ギムザ染色、封入処理を行い、遊走面の細胞数を顕
微鏡下（×４００）で計測し、ＭＣＦ活性とした。

【００２９】また、株化された細胞として本発明ではＭ
ＣＦ−Ａ５１株を用いたが、その調製法を以下に示す。

【００３０】（ヒトＴ細胞ハイブリドーマ調製法）Ｔ細
胞は、免疫系を制御する因子の他に、様々な生理活性を
示すと考え得る各種のリンホカインを産生する事が知ら
れているが、近年、このＴ細胞においても細胞融合の技
術を用いてハイブリドーマを作成しようとする試みがな
されている。その中でヒトＴ細胞ハイブリドーマ作成に
関しては、小林らによって開発されたエメチン、アクチ
ノマイシン法（J. Immunology 128, 2714(1982)）は、
融合効率が高く、高頻度でハイブリドーマを取得し得る
事が知られている。

【００３１】ヒトＴ細胞ハイブリドーマ ＭＣＦ−Ａ５
１株の親株であるヒト急性Ｔ細胞白血病細胞株ＣＥＭ−
１１は、Kobayashi, Y, et al(J. Immunol., 128 2714
1982）及びHiguchi, M. et al（Cell, Immunol., 78, 2
57 1983）によって発表されたもので、入手可能なもの
である。

【００３２】ＭＣＦ−Ａ５１株は、ヒト急性Ｔ細胞白血
病細胞株ＣＥＭ−１１とフィトヘムアグルチニン（ＰＨ
Ａ）で刺激したヒト末梢血リンパ球をエメチン、アチノ
マイシン法によって融合させて得られたもので、融合株
の確認は培養液のマクロファージ走化活性の測定（前
述）によって行なわれた。

【００３３】ＰＢＬを１×１０⁸／ｍｌの割合でＰＨＡ
−Ｐ（マイルス社製ＰＨＡ）（１０μｇ／ｍｌ）存在下
で、ＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＣＳ（仔牛血清））培
養液にて３７℃、５％ＣＯ₂インキュベータ中で２日間
培養した。その後、リンパ球のブラスト化が起っている
事を確認し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）
し、細胞を０．１Ｍラクトース溶液に分散させ、３０分
間３７℃に保存し、さらに遠心洗浄（１０００ｒｐｍ、
５ｍｉｎ）し、ＰＨＡ−Ｐによる細胞凝集を除去した。
この様にして調製した末梢血リンパ球を融合に使用す
る。

【００３４】一方、ヒト急性Ｔ細胞白血病細胞株ＣＥＭ
−１１をＲＰＭＩ１６４０（無血清）に分散させ、エメ
チン５×１０-⁵Ｍ、アクチノマイシンＤ ０．２５μｇ
／ｍｌ存在条件下で、３７℃２時間保存し、リン酸等張
バッファー（ＰＢＳ）にて３回洗浄した。この細胞と、
前述の末梢血リンパ細胞を１：１０の割合で混合し、ゆ
るいペレットを作り、この中に４５％ポリエチレングリ
コール−４０００と、ポリ−Ｌ−アルギニン５μｇ／ｍ
ｌの溶液を３７℃の条件下で徐々に入れて融合した。遠
心分離（８００ｒｐｍ、４分）後、上清を十分に除去
し、ＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミ
ン、５×１０-⁵Ｍ、２−メルカプトエタノール）中に１
×１０⁹／ｍｌ割合で分散させ、この０．１ｍｌを９６
ｗｅｌｌ（穴）フラットマイクロプレートに入れた。さ
らにフィーダー細胞として、マイトマイシン−Ｃ処理
（５μｇ／ｍｌ）した細胞株ＣＥＭ−５を４×１０⁵／
ｍｌの割合で０．１ｍｌ加えた。このプレートを３７
℃、５％ＣＯ₂の条件下培養した。その後、約１日おき
に培養液を交換し、約２週間後、ハイブリドーマを取得
した。

【００３５】マクロファージ走化性因子を単クローン性
の因子として取得するため、マクロファージ走化活性の
高いハイブリドーマのクローニングを限界希釈法にて行
った。すなわち、９６ｗｅｌｌのフラットマイクロプレ
ートを用い、０．５／ｗｅｌｌの割合で希釈したハイブ
リドーマ分散液をまき、マイトマイシンＣ処理した細胞
株ＣＥＭ−１１をフィーダー細胞として入れ、３７℃５
％ＣＯ₂の条件下で２週間放置し、３９コのクローンを
得た。

【００３６】これらのハイブリドーマクローンの培養上
清を前述の方法に従ってマクロファージ走化活性を測定
し、高い走化活性を示したハイブリドーマクローンをＭ
ＣＦ−Ａ５１株として用いた。

【００３７】

【実施例１】ヒトＴ細胞ハイブリドーマ ＭＣＦ−Ａ５
１株をHanks'培地に５×１０⁵／ｍｌとなるように分散
し、３７℃９０分間５％ＣＯ₂存在下インキュベートし
た。この培養液を遠心分離（１０００ｒｐｍ×５ｍｉ
ｎ）することで培養上清を得た。この上清をアミコン社
製限外ろ過膜ＵＭ１０を通過させ、そのろ液を、５ｍＭ
ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ハイドロキシエチルピペラジン−
Ｎ′−２−エタンスルホン酸）ｐＨ８．０（緩衝液Ａ）
であらかじめ緩衝化させてあるSephadex A-25カラムに
供与し、その後、緩衝液Ａで十分に洗浄し、０．２Ｍ塩
化ナトリウムを含む緩衝液Ａおよび０．５Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む緩衝液Ａで段階的に溶出すると、マクロファ
ージ走化活性は０．５Ｍ塩化ナトリウム溶出画分に含ま
れる。

【００３８】さらに、この画分を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
ｐＨ７．２（緩衝液Ｂ）であらかじめ緩衝化している
Ｍｏｎｏ Ｓ（ファルマシア社製）カラムに供与し、緩
衝液Ｂで十分に洗浄後、塩化ナトリウム濃度を２Ｍまで
の直線的濃度勾配溶出法によって溶出させると活性は約
１Ｍ付近の画分に溶出される。

【００３９】さらにこの画分を１ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ
５．７で平衡化されている逆相カラムＯＤＳ−１２０Ｔ
（東ソー社製）に供与し、十分に洗浄後、アセトニトリ
ル濃度を直線的に上昇させることにより溶出させ、２１
５ｎｍの吸光度でペプチドの溶出状況をモニターし、得
られたピークの活性を測定したところ約２５％アセトニ
トリル溶出位置のピークに活性を認めた。本画分を精製
ＭＣＦとして用いる。

【００４０】

【実施例２】実施例１で用いたのと同じＡ５１株を、Ha
nks'培地で洗浄後、高圧窒素ガス細胞破砕法により、細
胞を破砕した後、遠心（１０，０００×ｇ、２０ｍｉ
ｎ）し、得られた上清をさらに１５０，０００×ｇ、２
７ｈｒの遠心によって上清とペレットに分離した。その
沈澱画分を５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０(緩衝液Ａ)
に懸濁し、超音波処理後、再度６０，０００×ｇ １ｈ
ｒの遠心を行ない上清を得た。この上清を限外ろ過膜Ｕ
Ｍ１０（アミコン社製）を用いろ過後、そのろ液を緩衝
液Ａであらかじめ緩衝化させてあるSephadex A-25カラ
ムに供与し、その後、緩衝液Ａで十分に洗浄し、０．２
Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａおよび０．５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む緩衝液Ａで段階的に溶出すると、マクロ
ファージ走化活性は０．５Ｍ塩化ナトリウム溶出画分に
含まれる。この結果は図１に示される。

【００４１】さらに、この画分を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
ｐＨ７．２（緩衝液Ｂ）であらかじめ緩衝化している
Ｍｏｎｏ Ｓ（ファルマシア社製）カラムに供与し、緩
衝液Ｂで十分洗浄後、塩化ナトリウム濃度を２Ｍまでの
直線的濃度勾配溶出法によって溶出させると活性は約１
Ｍ付近の画分に溶出される。この結果は図２に示され
る。

【００４２】さらにこの画分を１ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ
５．７で平衡化されている逆相カラムＯＤＳ−８０ＴＭ
（東ソー社製）に供与し、十分に洗浄後、アセトニトリ
ル濃度を直線的に上昇させることにより溶出させ、２１
５ｎｍの吸光度でペプチドの溶出状況をモニターし、得
られたピークの活性を測定したところ、約２５％アセト
ニトリル溶出位置のピークに活性を認めた。（図３に示
す）本画分のペプチドを気相シークェンサー（ＡＢＩ社
製モデル４７７Ａ型）を用いその構造を解析したとこ
ろ、Trp-Leu-Gly-Arg-X-Asp-Gly-Ser-Glu又は、Arg-Leu
-Gly-X-Asp-Gly-Ser-Gluであった。アミノ酸組成分析の
結果から、ＸはいずれもＧｌｕ又はＧｌｎである。

【００４３】ただし、アミノ酸の略号は次の通りであ
る。

【００４４】実施例３は、中間体の合成を示し、実施例
４〜１３は、ペプチド自動合成機（ＡＢＩ社製４３０Ａ
型）を用いた固相合成法による本発明ペプチド類の合
成、物性値（ＨＰＬＣの保持時間）、プロトン−ＮＭＲ
のスペクトルを示す（図４〜図１２）。

【００４５】本発明のペプチド類は、精製後或いは脱保
護の後精製後、プロテインシークエンサー（ＡＢＩ社製
４７７Ａ型）にて配列を確認した。

【００４６】

【実施例３】 Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｎｌｅ−ＯＨ Ｄ−Ｎｌｅ−ＯＨ（１．０１ｇ）を３０ｍｌの１０％Ｎ
ａＣＯ₃及び１０ｍｌのジオキサンに溶解させた。攪拌
しながら０℃にてジオキサン１０ｍｌに溶解させたＦｍ
ｏｃ−Ｃｌ（２．０ｇ）を加えた。室温で２時間攪拌
後、水４００ｍｌを加え、エーテル２００ｍｌで２回、
副生成物を除去するため抽出操作を行った。水層には氷
を加え、濃塩酸を用いて中和し、酢酸エチルで抽出後、
水で洗浄した。エーテルから再結晶することにより、Ｆ
ｍｏｃ−Ｄ−Ｎｌｅ−ＯＨを９３３ｍｇ得た。

【００４７】

【実施例４】 H-L-Trp-L-Leu-Gly-L-Arg-L-Glu-L-Asp-Gly-L-Ser-L-Gl
u-OH

【００４８】Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＰＡＭ
レジンをＬ−Ｇｌｕ−ＯＨを基準にして０．５ｍｍｏｌ
用い、Ｂｏｃ法ペプチド合成の工程に従って、順次Ｂｏ
ｃ−Ｌ−アミノ酸を縮合させた。用いたＢｏｃ試薬は、
以下の通りである。

【００４９】Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＨ Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ Ｂｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ

【００５０】本ペプチドは、ＨＰＬＣにより精製した。
条件は、以下の通りである。 ＯＤＳカラム（２０×２５０）山村化学社製 移動相；Ａ：水（０．１％ＴＦＡ） Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ） Ａ：Ｂ＝１００：０から１０：９０のリニアーグラジエ
ント（６０分） 流速；７ｍｌ／分 本ペプチドの保持時間は、２１．３分であった。 収量２１２ｍｇ、収率４０．５％

【００５１】

【実施例５】 H-L-Trp-L-Leu-Gly-L-Arg-L-Glu-L-Asp-Gly-L-Ser-L-Gl
u-OH

【００５２】Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＰＡＭ
レジンをＬ−Ｇｌｕ−ＯＨを基準にして０．５ｍｍｏｌ
用い、Ｆｍｏｃ法ペプチド合成の工程に従って、順次Ｆ
ｍｏｃ−Ｌ−アミノ酸を縮合させた。用いたＦｍｏｃ試
薬は、以下の通りである。

【００５３】Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ

【００５４】本ペプチドは、ＨＰＬＣにより精製した。
条件は、以下の通りである。 ＯＤＳカラム（１９×３００）Ｗａｔｅｒｓ社製 移動相；Ａ：水（０．１％ＴＦＡ） Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ） Ａ：Ｂ＝９５：５から５：９５のリニアーグラジエント
（６０分） 流速；６ｍｌ／分 本ペプチドの保持時間は、２５．３分であった。 収量１８７ｍｇ、収率３５．７％

【００５５】

【実施例６】 H-L-Trp-L-Leu-Gly-L-Arg-L-Gln-L-Asp-Gly-L-Ser-L-Gl
u-OH

【００５６】Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＰＡＭ
レジンをＬ−Ｇｌｕ−ＯＨを基準にして０．５ｍｍｏｌ
用い、Ｂｏｃ法ペプチド合成の工程に従って、順次Ｂｏ
ｃ−Ｌ−アミノ酸を縮合させた。用いたＢｏｃ試薬は、
以下の通りである。

【００５７】Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＨ Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ−ＯＨ Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ Ｂｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ

【００５８】本ペプチドは、ＨＰＬＣにより精製した。
条件は、以下の通りである。 ＯＤＳカラム（１９×３００）Ｗａｔｅｒｓ社製 移動相；Ａ：水（０．１％ＴＦＡ） Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ） Ａ：Ｂ＝９５：５から５：９５のリニアーグラジエント
（６０分） 流速；６ｍｌ／分 本ペプチドの保持時間は、２２．０分であった。 収量１９４ｍｇ、収率３７．１％

【００５９】

【実施例７】 H-L-Trp-L-Leu-Gly-D-Arg-L-Glu-L-Asp-Gly-L-Ser-L-Gl
u-OH

【００６０】Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＰＡＭ
レジンをＬ−Ｇｌｕ−ＯＨを基準にして０．５ｍｍｏｌ
用い、Ｆｍｏｃ法ペプチド合成の工程に従って、順次Ｆ
ｍｏｃアミノ酸を縮合させた。用いたＦｍｏｃ試薬は、
以下の通りである。

【００６１】Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ

【００６２】本ペプチドは、ＨＰＬＣにより精製した。
条件は、以下の通りである。 ＯＤＳカラム（１９×３００）Ｗａｔｅｒｓ社製 移動相；Ａ：水（０．１％ＴＦＡ） Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ） Ａ：Ｂ＝９５：５から５：９５のリニアーグラジエント
（６０分） 流速；６ｍｌ／分 本ペプチドの保持時間は、２５．０分であった。 収量２７４ｍｇ、収率５２．３％

【００６３】

【実施例８】 H-D-Trp-L-Leu-Gly-L-Arg-L-Glu-L-Asp-Gly-L-Ser-L-Gl
u-OH

【００６４】Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＰＡＭ
レジンをＬ−Ｇｌｕ−ＯＨを基準にして０．５ｍｍｏｌ
用い、Ｆｍｏｃ法ペプチド合成の工程に従って、順次Ｆ
ｍｏｃアミノ酸を縮合させた。用いたＦｍｏｃ試薬は、
以下の通りである。

【００６５】Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ

【００６６】本ペプチドは、ＨＰＬＣにより精製した。
条件は、以下の通りである。 ＯＤＳカラム（１９×３００）Ｗａｔｅｒｓ社製 移動相；Ａ：水（０．１％ＴＦＡ） Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ） Ａ：Ｂ＝９５：５から５：９５のリニアーグラジエント
（６０分） 流速；６ｍｌ／分 本ペプチドの保持時間は、２３．６分であった。 収量２６８ｍｇ、収率５１．１％

【００６７】

【実施例９】 H-L-Trp-L-Leu-Gly-L-Arg-L-Glu-L-Asp-Gly-D-Ser-L-Gl
u-OH

【００６８】Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＰＡＭ
レジンをＬ−Ｇｌｕ−ＯＨを基準にして０．５ｍｍｏｌ
用い、Ｆｍｏｃ法ペプチド合成の工程に従って、順次Ｆ
ｍｏｃアミノ酸を縮合させた。用いたＦｍｏｃ試薬は、
以下の通りである。

【００６９】Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ

【００７０】本ペプチドは、ＨＰＬＣにより精製した。
条件は、以下の通りである。 ＯＤＳカラム（１９×３００）Ｗａｔｅｒｓ社製 移動相；Ａ：水（０．１％ＴＦＡ） Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ） Ａ：Ｂ＝９５：５から５：９５のリニアーグラジエント
（６０分） 流速；６ｍｌ／分 本ペプチドの保持時間は、２４．９分であった。 収量４０５ｍｇ、収率７７．３％

【００７１】

【実施例１０】 H-L-Trp-D-Leu-Gly-L-Arg-L-Glu-L-Asp-Gly-L-Ser-L-Gl
u-OH

【００７２】Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＰＡＭ
レジンをＬ−Ｇｌｕ−ＯＨを基準にして０．５ｍｍｏｌ
用い、Ｆｍｏｃ法ペプチド合成の工程に従って、順次Ｆ
ｍｏｃアミノ酸を縮合させた。用いたＦｍｏｃ試薬は、
以下の通りである。

【００７３】Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ

【００７４】本ペプチドは、ＨＰＬＣにより精製した。
条件は、以下の通りである。 ＯＤＳカラム（１９×３００）Ｗａｔｅｒｓ社製 移動相；Ａ：水（０．１％ＴＦＡ） Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ） Ａ：Ｂ＝９５：５から５：９５のリニアーグラジエント
（６０分） 流速；６ｍｌ／分 本ペプチドの保持時間は、２８．６分であった。 収量２８８ｍｇ、収率５５．０％

【００７５】

【実施例１１】 H-L-Trp-L-Leu-Gly-L-Arg-D-Glu-L-Asp-Gly-L-Ser-L-Gl
u-OH

【００７６】Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＰＡＭ
レジンをＬ−Ｇｌｕ−ＯＨを基準にして０．５ｍｍｏｌ
用い、Ｆｍｏｃ法ペプチド合成の工程に従って、順次Ｆ
ｍｏｃアミノ酸を縮合させた。用いたＦｍｏｃ試薬は、
以下の通りである。

【００７７】Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ

【００７８】本ペプチドは、ＨＰＬＣにより精製した。
条件は、以下の通りである。 ＯＤＳカラム（１９×３００）Ｗａｔｅｒｓ社製 移動相；Ａ：水（０．１％ＴＦＡ） Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ） Ａ：Ｂ＝９５：５から５：９５のリニアーグラジエント
（６０分） 流速；６ｍｌ／分 本ペプチドの保持時間は、２４．３分であった。 収量１８０ｍｇ、収率３６．０％

【００７９】

【実施例１２】 H-L-Arg-L-Leu-Gly-L-Arg-L-Gln-L-Asp-Gly-OH

【００８０】Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｙ−ＰＡＭレジンをＬ−
Ｇｌｙ−ＯＨを基準にして０．５ｍｍｏｌ用い、Ｆｍｏ
ｃ法ペプチド合成の工程に従って、順次Ｆｍｏｃ−Ｌ−
アミノ酸を縮合させた。用いたＦｍｏｃ試薬は、以下の
通りである。

【００８１】Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ

【００８２】本ペプチドは、ＨＰＬＣにより精製した。
条件は、以下の通りである。 ＯＤＳカラム（１９×３００）Ｗａｔｅｒｓ社製 移動相；Ａ：水（０．１％ＴＦＡ） Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ） Ａ：Ｂ＝９５：５から５：９５のリニアーグラジエント
（６０分） 流速；６ｍｌ／分 本ペプチドの保持時間は、１９．６分であった。 収量２６０ｍｇ、収率６５．０％

【００８３】

【実施例１３】 H-L-Arg-L-Leu-Gly-L-Arg-L-Gln-L-Asp-L-Lys-OH

【００８４】Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−ＰＡＭ
レジンをＬ−Ｌｙｓ−ＯＨを基準にして０．５ｍｍｏｌ
用い、Ｆｍｏｃ法ペプチド合成の工程に従って、順次Ｆ
ｍｏｃ−Ｌ−アミノ酸を縮合させた。用いたＦｍｏｃ試
薬は、以下の通りである。

【００８５】Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ

【００８６】本ペプチドは、ＨＰＬＣにより精製した。
条件は、以下の通りである。 ＯＤＳカラム（１９×３００）Ｗａｔｅｒｓ社製 移動相；Ａ：水（０．１％ＴＦＡ） Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ） Ａ：Ｂ＝９５：５から５：９５のリニアーグラジエント
（６０分） 流速；６ｍｌ／分 本ペプチドの保持時間は、２４．３分であった。 収量３０９ｍｇ、収率７０．９％

【００８７】

【実施例１４】実施例５で合成されたペプチドを５ｍＭ
ＭｇＣｌ₂に溶解させ、０．５％ＦＣＳ含有Hanks'培
養液で適当に希釈したのち、マクロファージ走化活性を
測定したところ高い活性が認められた。測定した相対活
性は次の表１に示される。

【００８８】

【表１】

【００８９】上記結果から明らかなように、本発明のペ
プチドは、Ｃｕ++、Ｚｎ++、Ｃａ++、Ｍｎ++、Ｓｒ++、
Ｃｏ++、Ｓｎ++、Ｆｅ+++、Ｐｂ++等のイオンを含む溶
液に懸濁して用いても同様に高いＭＣＦ活性を示した。

【００９０】

【実施例１５】本発明に係るマクロファージ走化性良好
物質は、実施例１４に記載した試験において、すぐれた
マクロファージ走化活性を示した。その結果を関連ペプ
チドとともに下記表２、表３、表４、表５に示す。

【００９１】

【表２】

【００９２】

【表３】

【００９３】

【表４】

【００９４】

【表５】

【００９５】

【発明の効果】本発明の新規ペプチドは高いマクロファ
ージ走化活性を有しているため、遅延型過敏症の研究用
試薬として有用であり、更には、抗腫瘍剤としての医薬
用途に有効に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２における陰イオン交換体ＤＥＡＥ−Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５によるＭＣＦの分離図であ
る。

【図２】ＭＣＦ濃縮部分の陽イオン交換体Ｍｏｎｏ Ｓ
カラムによる分離図である。

【図３】更に濃縮されたＭＣＦ濃縮部分の逆相カラムに
よるＭＣＦの分離図である。

【図４】化合物Ｎｏ．１のＮＭＲスペクトルを示す。

【図５】化合物Ｎｏ．２のＮＭＲスペクトルを示す。

【図６】化合物Ｎｏ．１４のＮＭＲスペクトルを示す。

【図７】化合物Ｎｏ．１６のＮＭＲスペクトルを示す。

【図８】化合物Ｎｏ．３６のＮＭＲスペクトルを示す。

【図９】化合物Ｎｏ．３７のＮＭＲスペクトルを示す。

【図１０】化合物Ｎｏ．４１のＮＭＲスペクトルを示
す。

【図１１】化合物Ｎｏ．５５のＮＭＲスペクトルを示
す。

【図１２】化合物Ｎｏ．５７のＮＭＲスペクトルを示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次に示すアミノ酸配列で表わされるペプ
   チド又はその塩。 H-Trp-Leu-Gly-Arg-X-Asp-Gly-Ser-Glu-OH又はH-Arg-Le
   u-Gly-Arg-X-Asp-Gly-Ser-Glu-OH （ここでＸはGlu又はGlnを表わす。）