JPH09216832A - 成人用ヒト成長ホルモン剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 天然型２０キロダルトンヒト成長ホルモンを
有効成分とし、体成分改善能、脂肪分解促進能及び／ま
たは血中ＩＧＦ−Ｉ濃度上昇能を有している成人用ヒト
成長ホルモン剤を提供する。 【解決手段】 組換え体大腸菌ＭＴ−１０６７５を培
養、精製して得られる天然型２０キロダルトンヒト成長
ホルモンを含有してなるヒト成長ホルモン剤を製造す
る。 【効果】 本発明の成人用ヒト成長ホルモン剤は、正常
な成人及び成長ホルモンの分泌が欠損もしくは正常人に
比べて低下している成人に対して投与することで、体成
分改善、脂肪分解促進、血中ＩＧＦ−Ｉ濃度上昇に有効
に作用し、心血管系疾患や筋力、運動能力低下の予防・
治療剤となり得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、成人用ヒト成長ホ
ルモン剤に関し、特に、本発明は、成長ホルモン欠損症
患者への成人補充療法用ヒト成長ホルモン剤に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術】ヒト成長ホルモンは、正常人においては
成長期のみならず生涯に亘って下垂体から分泌され続け
るホルモンである。ヒト成長ホルモンは、はじめヒト下
垂体から抽出、精製して分離された。このものには分子
量約２２０００のもの（２２キロダルトンヒト成長ホル
モン）と、分子量約２００００のもの（２０キロダルト
ンヒト成長ホルモン）の２種が存在することが知られて
いた。この２０キロダルトンヒト成長ホルモンは２２キ
ロダルトンヒト成長ホルモンと同等の成長活性を有する
が２２キロダルトンヒト成長ホルモンより耐糖能異常を
誘発する作用が弱く糖尿病原性が低い可能性が報告され
ている（Lewis.U.J.,et al:Endocrinol.Japon.34 73-8
5 (1987)）。このことから成長ホルモン欠損者に対する
治療薬として２０キロダルトンヒト成長ホルモンの有用
性が注目されていた（妹尾久雄ら：医学のあゆみ 165 2
47-251(1993)）。

【０００３】しかし、組換えDNA技術の発達にもかかわ
らず、その製造は極めて困難で、菌体内発現法において
Ｎ末端にMetが付加した２０キロダルトンヒト成長ホル
モンの発現量は２２キロダルトンヒト成長ホルモンの２
０分の１であった（Miyamotoet al:International Symp
osium on GRF,Growth Hormone and Somatomedin Progra
m and Abstracts 28 1-2 (1986)）。蛋白質の製造にお
いて、菌体内発現法では一般に細胞内で正しい高次構造
が形成されず、そのためrefoldingの操作が必要である
ことが知られている。しかし、この２０キロダルトンヒ
ト成長ホルモンには２２キロダルトンヒト成長ホルモン
の様な国際標準品が存在しないため、refoldingによる
構造の妥当性を標準品と比較して評価することは困難で
ある。更に、この２０キロダルトンヒト成長ホルモンは
疎水的性質が強く、そのため精製に困難をきたし、ま
た、それ故に下垂体由来の２０キロダルトンヒト成長ホ
ルモンと同一のアミノ酸配列を有するところの天然型２
０キロダルトンヒト成長ホルモンを製造する分泌生産法
の障害となっていた。これらのことから、天然型２０キ
ロダルトンヒト成長ホルモンは入手困難で、医薬として
の可能性の解明の障害となっていた（松崎 宸：医学の
歩み 165 243-246(1993)）。

【０００４】医薬としての可能性の基盤であるヒト成長
ホルモンの生物学的作用について以下に述べる。ヒト成
長ホルモンは、脂肪分解作用、蛋白同化作用、骨形成作
用等の多様な生体内作用に関与している。故に、成長ホ
ルモン欠損症患者は、脂肪分解活性、インシュリン様成
長因子−Ｉ（以下、ＩＧＦ−Ｉと略記する）分泌活性、
蛋白合成促進活性、骨代謝活性等が低下している。この
うち脂肪分解活性の低下は皮下脂肪や内臓脂肪の蓄積を
引き起こす原因の１つとなり、このため肥満が顕著とな
る。故に成長ホルモン欠損症患者の多くは高脂血症を併
発することが知られており、動脈硬化症等の循環器障害
の罹病率が高く、心血管系疾患による死亡率も高いと報
告されている。また、ＩＧＦ−Ｉは生体内で様々な生理
作用に関与しているため、ＩＧＦ−Ｉ分泌活性の低下に
よる血中ＩＧＦ−Ｉ濃度の低下は、種々の障害を引き起
こすことが報告されている。更に、蛋白合成促進活性の
低下は筋力、運動能力の低下を起こし、日常活動に支障
が出ることも報告されている。以上のことから、成長ホ
ルモン欠損症患者における、体成分の改善、即ち体蛋白
分、体脂肪分、骨密度を正常値に近づけることが求めら
れている。具体的には減少していた体蛋白分、骨密度を
増加させ、増加していた体脂肪分を減少させることであ
る。ここで言う体脂肪分の減少とは、体脂肪の蓄積抑
制、体脂肪の分解促進等から成るため、体脂肪の分解促
進が一義的に体脂肪の減少を示さない。従って、体脂肪
の分解促進とは体成分の改善の一要素である。

【０００５】成長ホルモン欠損症患者における２２キロ
ダルトンヒト成長ホルモンの係る作用のいくつかについ
ては従来から以下のことが知られている。即ち、成長ホ
ルモン欠損症患者への補充療法として、遺伝子組換えに
より製造された２２キロダルトンヒト成長ホルモンを患
者に投与することが試みられ、上記の体成分改善につい
ては３年間に亘る該２２キロダルトンヒト成長ホルモン
の投与により体脂肪が正常人のレベルに減少すること
（Jorgensen,J.OL.,et al:European Journal of Endocr
inology,130,224-228(1994)）、及び６週間の該２２キ
ロダルトンヒト成長ホルモンの投与で血中ＩＧＦ−Ｉ濃
度が正常値にまで上昇し、又、体蛋白量を示す体窒素量
が改善し、正常値に近づくという報告がなされている
（Bengtsson,B.A.et al:J.Clin.Endocrinol.Metab.,76,
309-317(1993)）。但し、成長ホルモン欠損症患者以外
の成人については、投与がなされていないために、知見
は得られていない。

【０００６】一方、成人へのヒト成長ホルモンの投与は
耐糖能異常をきたし易いことが懸念され、実際、成人の
成長ホルモン欠損症患者への投与から、少数ではあるが
重大な糖代謝異常を誘発することが示された（Beshyah.
S.A.,et al:Endocrinology and Metabolism (suppl.B)
32 (1994)）。このことから２０キロダルトンヒト成長
ホルモンが成人成長ホルモン欠損症患者に用いられた場
合、脂肪代謝改善に有用なものであることが期待され
る。

【０００７】天然型２０キロダルトンヒト成長ホルモン
は、入手することが困難であった。そのため、現在まで
２０キロダルトンヒト成長ホルモンの生理活性に関する
実験は、そのほとんどが下垂体からの精製品、或いは遺
伝子組換えにより製造され、Ｎ末端にメチオニンが付加
した非天然型のリコンビナント品（以下、Met型２０キ
ロダルトンヒト成長ホルモンと呼ぶ）のいずれかを用い
て行われてきた。それらにより行われた実験から得られ
た生理的性質は以下に示すとおりである。

【０００８】成長活性については、下垂体から抽出、精
製して得られた２０キロダルトンヒト成長ホルモンの成
長促進は２２キロダルトンヒト成長ホルモンと同等であ
ることが報告されている（Lewis,U.J.,et al:J.Biol.Ch
em.,253,2679-2687(1978)）。

【０００９】脂肪細胞に対する親和性、脂肪分解促進能
については、以下のことが知られている。下垂体から抽
出、精製して得られた２０キロダルトンヒト成長ホルモ
ンの脂肪細胞に対する親和性は２２キロダルトンヒト成
長ホルモンの親和性の３％と著しく低い（De Meyts,P.,
et al:J.Biol.Chem.,262,11071-11079(1987)）。一方、
成人の成長ホルモン欠損症患者への投与において重要な
脂肪分解促進能については、in vivoにおける脂肪分解
促進による血中遊離脂肪酸濃度の上昇率が２２キロダル
トンヒト成長ホルモン場合４０％であるのに対し、下垂
体から抽出、精製して得られた２０キロダルトンヒト成
長ホルモンでは確認されない（Lewis,U.J.,et al:Bioch
em.Biophys.Res.Commun.,91,778-782(1979)）。更にin
vitroにおいて、下垂体から抽出、精製して得られた２
０キロダルトンヒト成長ホルモンは脂肪分解促進能を有
さない（Lewis,U.J.,et al:Metabolism,4,237-243(198
5)）。

【００１０】以上のことから２０キロダルトンヒト成長
ホルモンは、脂肪分解促進能については２２キロダルト
ンヒト成長ホルモンに比べて低下もしくは欠損している
と従来考えられていた。このことは耐糖能異常誘発能の
低さから考えられる成人、特に成人成長ホルモン欠損症
患者への投与における２０キロダルトンヒト成長ホルモ
ンの優位性への期待に反し、成人成長ホルモン欠損症患
者への投与に対する上述の脂肪分解促進及び体成分改善
に対する有用性欠如を示すものと考えられてきた。

【００１１】血中ＩＧＦ−Ｉ濃度上昇能については、以
下のことが知られている。血中ＩＧＦ−Ｉの殆どは成長
ホルモンの肝レセプターへの結合により肝臓から放出さ
れるものであることが知られているが（鎮目和夫著、Ｉ
ＧＦ−成長ホルモンとその関連ペプチド、132-136,(199
2)）、下垂体から抽出、精製して得られた２０キロダル
トンヒト成長ホルモンの肝レセプターに対する親和性
は、２２キロダルトンヒト成長ホルモンに比べてラット
の場合３〜１２％、ウサギの場合８〜２０％であり(Sig
el,M.B.,et al:Endocrinology,vol.108,pp.1600-1603,
(1981))、ヒトの場合は、下垂体から抽出、精製して得
られた２０キロダルトンヒト成長ホルモン及びMet型２
０キロダルトンヒト成長ホルモンの肝レセプターに対す
る親和性は殆どないことが知られている(Baumann,G.et
al.:Molecular and cellular Endocrinology,vol.73,p
p.11-14,(1990))。

【００１２】これらのことから２０キロダルトンヒト成
長ホルモンには肝臓におけるＩＧＦ−Ｉ産生、放出の作
用が低いもしくはないことが示唆されていた。但し、下
垂体から抽出、精製して得られた２０キロダルトンヒト
成長ホルモンはラット下垂体摘出モデルに対する投与に
おいて２２キロダルトンヒト成長ホルモンと同程度の血
中ＩＧＦ−Ｉ濃度をもたらすという報告はあった（Spen
cer,E.,et al:Endocrinol.,vol.101,pp.1301-1302,(198
1)）。しかし、下垂体からの２０キロダルトンヒト成長
ホルモンの精製においては、物理化学的性質の近似性に
より２０キロダルトンヒト成長ホルモンと２２キロダル
トンヒト成長ホルモンを完全に分離することは困難なた
め、これまで実験に使用された下垂体から抽出、精製し
て得られた２０キロダルトンヒト成長ホルモンには２２
キロダルトンヒト成長ホルモンが混在し、実験結果に影
響を与えていた可能性が指摘されていた（Baumann.G.,e
tal:Molecular and Cellular Endocrinology,vol.73,p
p.11-14,(1990)）。従って、これまで純粋な２０キロダ
ルトンヒト成長ホルモンを用いた検討による十分な知見
は得られていなかった。

【００１３】以上のとおり、天然型の２０キロダルトン
ヒト成長ホルモンに関して、体成分改善能、脂肪分解促
進能及び血中ＩＧＦ−Ｉ濃度上昇能に関する知見は殆ど
得られていなかった。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、体成分改善
能、脂肪分解促進能及び／または血中ＩＧＦ−Ｉ濃度上
昇能を有する成人用ヒト成長ホルモン剤の提供を課題と
するものであり、また本発明は、天然型２０キロダルト
ンヒト成長ホルモンを有効成分として含有する、耐糖能
異常誘発能の低い、成人、特に成人の成長ホルモン欠損
症患者に対する成人補充療法用ヒト成長ホルモン剤を提
供することを目的とする。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の課題
を解決するために、天然型２０キロダルトンヒト成長ホ
ルモンの組換えDNA技術による製造法を確立し、天然型
２０キロダルトンヒト成長ホルモンを含有する製剤を作
製し、得られたヒト成長ホルモン剤を用いて種々の検討
を行った。その結果、天然型２０キロダルトンヒト成長
ホルモンが十分な体成分改善能、脂肪分解促進能及び／
または血中ＩＧＦ−Ｉ濃度上昇能を有することを新規に
見い出し、更に糖尿病原性が２２キロダルトンヒト成長
ホルモンに比較して低いことを再確認し、本発明を完成
した。

【００１６】今回得られた天然型２０キロダルトンヒト
成長ホルモンに関する上記知見は、下垂体から抽出、精
製して得られた２０キロダルトンヒト成長ホルモン或い
はMet型２０キロダルトンヒト成長ホルモンに関する従
来の知見からは予想不可能なものである。即ち、天然型
２０キロダルトンヒト成長ホルモンが体成分改善能の１
つである脂肪分解促進能を有することは下垂体から抽
出、精製して得られた２０キロダルトンヒト成長ホルモ
ンを使用した実験結果からは予想できない知見である。
また、２２キロダルトンヒト成長ホルモンを含有しない
純粋な天然型２０キロダルトンヒト成長ホルモンが２２
キロダルトンヒト成長ホルモンと同等の血中ＩＧＦ−Ｉ
濃度上昇能を有することは、２０キロダルトンヒト成長
ホルモンの肝レセプターに対する親和性が低いという従
来の知見（Baumann.G.,et al:Molecular and Cellular
Endocrinology,vol.73,pp.11-14,(1990)）からは容易に
予想できないことである。今回、上記天然型２０キロダ
ルトンヒト成長ホルモンの十分な体成分改善能、脂肪分
解促進能、血中ＩＧＦ−Ｉ上昇能を見出したことによ
り、成人における医薬としての有用性を確認した。

【００１７】

【発明の実施の形態】よって、本発明は天然型２０キロ
ダルトンヒト成長ホルモンを有効成分として含有する成
人用ヒト成長ホルモン剤を提供するものである。

【００１８】本発明の成人用ヒト成長ホルモン剤とは天
然型２０キロダルトンヒト成長ホルモンを主成分とする
ものである。

【００１９】本発明に係わる天然型２０キロダルトンヒ
ト成長ホルモンは、分子量約２００００の、Ｎ末端にMe
tが付加していないヒト成長ホルモンを意味している。
天然型２０キロダルトンヒト成長ホルモンとしては、Ｎ
末端から第１４番目のアミノ酸がMetとSerの２種類のも
のが報告されている。即ち、Martial,J.A.,et al.:Scie
nce,205,602(1979)ではmRNAのＮ末端から第１４番目の
アミノ酸をコ−ドするRNA配列はAUG（Metをコード）と
され、Masuda,N.,et al.,:Biophysica Acta,949,125(19
88)ではＮ末端から第１４番目のアミノ酸をコードするc
DNA塩基配列がAGT（Serをコード）と報告されている。
本発明のホルモン剤に使用されるものとしてはどちらの
タイプのものであっても差し支えない。また、１又は２
アミノ酸が置換、欠落、挿入、欠損したアミノ酸配列は
本発明における天然型２０キロダルトンヒト成長ホルモ
ンの範疇に含まれるものである。

【００２０】本発明の製剤を調製するに際しては、通常
製剤に使用される添加物、医学的に許容される溶媒等を
使用しても差し支えない。

【００２１】

【実施例】以下、本発明を具体例で説明するが、本発明
はこれらの例に何ら限定されるものではない。 ［実施例１］ 天然型２０キロダルトンヒト成長ホルモンの製造 組換え体大腸菌MT-10765（本菌株は受託番号FERM BP-50
20として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
にブダペスト条約に基づいて寄託されている）を０．５
％グリセロールを含む２倍濃度のＬＢ培地に接種し、２
８℃で２０時間培養した。培養後、菌体を集菌し、浸透
圧ショック法により天然型２０キロダルトンヒト成長ホ
ルモンを含有するペリプラズム画分溶液を得た。その
後、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマト
グラフィーを用いて精製し、得られた天然型２０キロダ
ルトンヒト成長ホルモンをリン酸緩衝液に溶解した。更
に該リン酸緩衝液の精製を行い、最終的に逆相ＨＰＬ
Ｃ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた分析において純度９９．
９％の天然型２０キロダルトンヒト成長ホルモンの標品
を得た。これを凍結保存した。

【００２２】［実施例２］ 成人補充療法用ヒト成長ホルモン剤の製造 実施例１で得られた天然型２０キロダルトンヒト成長ホ
ルモン１．４ｍｇ相当分にＤ−マンニトール２．４ｍｇ
を加え、これを凍結保存して成人補充療法用ヒト成長ホ
ルモン剤を製造した。

【００２３】［実施例３］ 天然型２０キロダルトンヒト成長ホルモンのマウス3T3-
L1脂肪細胞における脂肪分解促進能の検討 ２４wellのmultiwell plateに１０％牛血清を含むDulbe
cco's Modified EagleMedium（ＤＭＥＭ）を分注し、こ
れにマウス3T3-L1線維芽細胞（大日本製薬製）を播種し
てconfluentまで培養し、その後更に２日間培養した。
この培養が終了した日を分化誘導０日目とした。培地を
分化誘導培地である１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）、０．
５ｍＭ 3-isobutyl-1-methylxanthine、０．２５μＭ d
examethasone、１７２ｎＭ insulinを含むＤＭＥＭに交
換して更に培養した。分化誘導２日目で１０％ＦＣＳ、
１７２ｎＭ insulinを含むＤＭＥＭに培地交換し、分化
誘導４日目で１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに培地交換し
て培養した。分化誘導６または７日目に分化誘導４日目
と同組成の培地に交換し、マウス3T3-L1線維芽細胞を脂
肪細胞へと分化させた。以上の培養においては、contam
ination防止のため培地には全て５０Ｕ penicillin、５
０μｇ／ｍｌ streptomycinを添加し、培養は３７℃、
５％ＣＯ₂存在下で行った。細胞が脂肪細胞に十分に分
化した分化誘導８または９日目に、血清の影響を除く目
的で培地を２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＤＭ
ＥＭ培地に交換し、２４時間培養した。このようにして
得られた脂肪細胞の培地を一旦除去し、４％ＢＳＡ、２
ｍＭグルコース、４０ｎＭ dexamethasoneを含むKrebs-
Ringer buffer（１．２ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、４．７ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、１１８ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ₃、
２．５ｍＭ ＣａＣｌ₂、ｐＨ７．４）をmultiwell plat
eの１ウエルあたり７５０μｌ分注した。培地交換され
たウエルに、実施例１で作製した天然型２０キロダルト
ンヒト成長ホルモン或いは２２キロダルトンヒト成長ホ
ルモン（住友製薬社製ジェノトロピン）を０、０．１、
０．５、１、１０、１００ｎｇ／ｍｌの濃度になるよう
に加えて３７℃で４８時間、５％ＣＯ₂存在下で培養し
た。培養上清中に放出された脂肪分解の指標の１つであ
る遊離脂肪酸量は、ＮＥＦＡ Ｃ−テストワコー（和光
純薬工業社製）によって測定した。脂肪分解促進の実験
は成長ホルモンの各濃度に対して４連で行った。測定値
はオレイン酸換算の当量で示しStudent's t-test（micr
osoft EXCEL）による統計処理を行った。

【００２４】結果を図１（図１）に示した。天然型２０
キロダルトンヒト成長ホルモンは、２２キロダルトンヒ
ト成長ホルモンに対して、用量依存性のある系で０．５
ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で有意に脂肪分解を促進し、成人
において、特に成人成長ホルモン欠損症患者における補
充療法として臨床的に意味のある濃度において２２キロ
ダルトンヒト成長ホルモンと同等以上の脂肪分解促進能
を示した。

【００２５】［実施例４］ 天然型２０キロダルトンヒト成長ホルモンのラット精巣
上体由来脂肪組織における脂肪分解促進能の検討 ６週齢のSlc:SDラットの雄を安楽死させた後、精巣上体
由来脂肪組織を摘出した。直径１００ｍｍのdishに４％
ＢＳＡ、２５５ｎＭ dexamethasone、５．５ｍＭ グル
コースを含むKrebs-Ringer buffer（ｐＨ７．４）を１
０ｍｌ分注し、摘出した組織を３０−５０ｍｇの断片と
したものを１５個ずつ入れた。これに実施例１で作製し
た天然型２０キロダルトンヒト成長ホルモン或いは２２
キロダルトンヒト成長ホルモン（住友製薬社製ジェノト
ロピン）を０、１、１０、１００、１０００、２５００
ｎｇ／ｍｌの濃度になるように加え、３７℃で４時間、
５％ＣＯ₂条件下で前培養した。前培養後、前培養と同
組成の培地を１ウエルあたり１ｍｌ分注した２４well m
ultiwell plateに組織を各ウエル１つずつ移し、前培養
と同条件下で５時間培養した。その後、培養上清中に放
出された脂肪分解の指標の１つであるグリセロール量を
boehringer manheim社製F-kit glycerolにより測定し
た。脂肪分解促進の実験は成長ホルモンの各濃度に対し
て１５連で行い、測定値は各脂肪組織断片重量あたりの
モル濃度で示し、Student's t-test（microsoft EXCE
L）による統計処理を行った。

【００２６】結果を図２（図２）に示した。天然型２０
キロダルトンヒト成長ホルモンは２２キロダルトンヒト
成長ホルモンに対して、用量依存性のある系で１ｎｇ／
ｍｌ以上の濃度で有意に脂肪分解を促進し、成人におい
て、特に成人成長ホルモン欠損症患者における補充療法
として臨床的に意味のある濃度において２２キロダルト
ンヒト成長ホルモンと同等以上の脂肪分解促進能を示し
た。

【００２７】［実施例５］ 天然型２０キロダルトンヒト成長ホルモンの下垂体摘出
ラットにおける脂肪分解促進能の検討 ４週齢のSlc:SDラットの雄から下垂体を摘出し、６週齢
まで飼育した後一晩絶食させた。実施例１で作製した天
然型２０キロダルトンヒト成長ホルモン或いは２２キロ
ダルトンヒト成長ホルモン（住友製薬社製ジェノトロピ
ン）をラット１頭あたり５０、１００μｇ量で上記ラッ
トの腹腔内に投与した。対照群（control）には成長ホ
ルモンの代わりに生理食塩液を投与した。成長ホルモン
（或いは生理食塩液）を投与してから５時間後に頚静脈
より採血し、血清中の遊離脂肪酸濃度をＮＥＦＡ Ｃ−
テストワコー（和光純薬工業社製）により測定した。上
記実験は各群６匹の下垂体摘出ラットを用いて行い、測
定値はオレイン酸換算の当量で示し、Student's t-test
（microsoft EXCEL）による統計処理を行った。

【００２８】結果を図３（図３）に示した。天然型２０
キロダルトンヒト成長ホルモン投与の場合は、２２キロ
ダルトンヒト成長ホルモン投与の場合と同様に、体脂肪
の分解によって生じる血中遊離脂肪酸濃度が有意に上昇
した。これにより天然型２０キロダルトンヒト成長ホル
モンは、成人において、特に成人成長ホルモン欠損症患
者における補充療法に必要な脂肪分解促進能を実際の生
体中においても２２キロダルトンヒト成長ホルモンと同
等に有することが示された。

【００２９】［実施例６］ 天然型２０キロダルトンヒト成長ホルモンによるC57BL/
6j-ob/obマウスにおける体成分改善能の検討 ６週齢のC57BL/6j-ob/obマウスの雌に実施例１で作製し
た天然型２０キロダルトンヒト成長ホルモン或いは２２
キロダルトンヒト成長ホルモン（住友製薬社製ジェノト
ロピン）を５００μｇ／マウス／dayで１０日間、背部
皮下投与した。対照群（Control）には生理食塩液を投
与した。最終日に体重を測定した後、マウスを安楽死さ
せ各個体を凍結乾燥後、水を添加してホモジナイズし、
全量２００ｍｌのホモジネートを得た。このホモジネー
トを用いて以下の測定を行った。

【００３０】１．体水分含量測定 上記ホモジネートの一部を凍結乾燥した後、乾燥重量を
求め、この値から全体の乾燥重量を求めた。先に求めた
体重と、この乾燥重量との差から各個体の体水分含量を
求めた。

【００３１】２．体蛋白量測定 上記ホモジネート１ｍｌを１規定のＮａＯＨ溶液にて１
００倍に希釈し、１規定のＨＣｌ溶液で中和した。脂肪
分を取り除くために、この内１ｍｌを１ｍｌのＣＨＣｌ
₃と１０分間混和し、１０分間の静置後水層を採取し
た。この水層をLowry法、BSA standardにより蛋白定量
し、この値から全体の体蛋白量を算出した。

【００３２】３．脂肪量測定 上記ホモジネート５ｍｌに２５０ｍｇ／ｍｌのＫＣｌ溶
液２００μｌ、メタノール７．５ｍｌを加えて攪拌した
後、３．７５ｍｌのＣＨＣｌ₃を加え、更に振とう機で
１０分間攪拌した。１０分間の静置の後、更に３．７５
ｍｌのＣＨＣｌ ₃を加え３０秒間攪拌し、２０ｍｇ／ｍ
ｌのＫＣｌ溶液３．７５ｍｌを加えて、更に３０秒間攪
拌した。これを３０００ ｇで１０分間遠心分離し、Ｃ
ＨＣｌ₃層をネジ付試験管にとり、４０℃、窒素ガス気
流下で濃縮した。更にＣＨＣｌ₃：メタノール＝２：１
溶液を添加して８ｍｌとし、そこへ８．８ｍｇ／ｍｌの
ＫＣｌ溶液１．６ｍｌを加えて、１０分間振とうした。
その後、これを３０００ｇで１０分間遠心分離し、ＣＨ
Ｃｌ₃層を秤量済みのガラス製試験管にとり４０℃、窒
素ガス気流下で濃縮し、脂肪量を秤量した。この値をも
とに各個体全体の脂肪量を算出した。

【００３３】体蛋白量測定の結果から、体蛋白量の増加
は、天然型２０キロダルトンヒト成長ホルモンと２２キ
ロダルトンヒト成長ホルモンでは同等であった。

【００３４】また、以上の測定で得られた体水分、体蛋
白、脂肪量を合計し、その合計に対する脂肪量の割合を
体脂肪量として求め、成長ホルモン投与前後の値を比較
した。実験は各群７匹のマウスを用いて行い、測定値は
Student's t-test（Macintosh microsoft EXCEL）によ
る統計処理を行った。

【００３５】結果を図４（図４）に示した。天然型２０
キロダルトンヒト成長ホルモンは２２キロダルトンヒト
成長ホルモンに対して同等以上の体脂肪量減少促進能を
示し、体成分改善能を有することが明らかとなった。こ
のことから、２０キロダルトンヒト成長ホルモンは成人
において、特に成人成長ホルモン欠損症患者における補
充療法に必要な体成分改善能を２２キロダルトンヒト成
長ホルモンと同等に有することが明らかとなった。

【００３６】［実施例７］ 天然型２０キロダルトンヒト成長ホルモンの下垂体摘出
ラットにおける血中ＩＧＦ−Ｉ濃度上昇能の検討 ４週齢のSlc:SDラットの雄から下垂体を摘出し、６週齢
まで飼育した後、実施例１で作製した天然型２０キロダ
ルトンヒト成長ホルモン或いは２２キロダルトンヒト成
長ホルモン（住友製薬社製ジェノトロピン）を１０、５
０μｇ／rat／dayで１０日間、頸背部皮下に投与した。
対照群（Control）には生理食塩液を投与した。成長ホ
ルモン（或いは生理食塩液）の最終投与の３時間後に背
大静脈より採血し、血中ＩＧＦ−Ｉ濃度を栄研化学社製
ソマトメジン−Ｃ’栄研’IIにより測定した。 実験は
各群６匹の下垂体摘出ラットを用いて行い、測定値はSt
udent's t-test（microsoft EXCEL）による統計処理を
行った。

【００３７】結果を図５（図５）に示した。天然型２０
キロダルトンヒト成長ホルモン投与の場合は２２キロダ
ルトンヒト成長ホルモン投与の場合と同等に血中ＩＧＦ
−Ｉ濃度が上昇した。これにより天然型２０キロダルト
ンヒト成長ホルモンは２２キロダルトンヒト成長ホルモ
ンと同等に成人において、特に成人成長ホルモン欠損症
患者における補充療法に必要な血中ＩＧＦ−Ｉ上昇能を
有することが示された。

【００３８】［実施例８］ 天然型２０キロダルトン成長ホルモンのC57BL/6j-ob/ob
マウスにおける耐糖能の検討 ６週齢のC57BL/6j-ob/obマウスの雌に、実施例１で作製
した２０キロダルトン成長ホルモン或いは２２キロダル
トン成長ホルモン（住友製薬社製ジェノトロピン）を５
０μｇ／マウス／dayで３日間または１０日間、背部皮
下投与した。対照群（control）には生理食塩水を投与
した。成長ホルモン（或いは生理食塩水）の最終投与の
翌日、dexamethasone-21-phosphate ２μｇを背部皮下
投与した。このマウスを６時間絶食させた後、グルコー
スを１ｇ／ｋｇ−体重、腹腔内投与した。グルコース投
与直前（０分）、投与後３０，６０，９０分に眼窩静脈
叢より採血し、boehringer mannheim社製新ブラッドシ
ュガーテストにより測定した。実験は各群６匹のマウス
を用いて行い、測定値はStudent's t testによる統計処
理を行った。結果を図６（図６）に示した。２２キロダ
ルトン成長ホルモン投与の場合は、グルコース投与後に
上昇した血糖値が正常レベルにまで低下しにくくなる耐
糖能異常を示した。一方、２０キロダルトン成長ホルモ
ン投与の場合は、３０分後に対照群と同レベルの血糖値
を示し耐糖能異常は示さなかった。また、グルコース投
与直前（絶食時）では、２０キロダルトン成長ホルモン
投与の場合は、正常値を示したのに対し、２２キロダル
トン成長ホルモン投与の場合は、この時点で既に血糖値
の上昇が見られた。これらの結果から、２２キロダルト
ン成長ホルモンが糖尿病原性を有し、２０キロダルトン
成長ホルモンは糖尿病原性を有さないことが示された。

【００３９】

【発明の効果】本発明者らは、天然型２０キロダルトン
ヒト成長ホルモンがこれまで報告されていた２０キロダ
ルトンヒト成長ホルモンの知見とは相反し、優れた体成
分改善能、脂肪分解促進能及び／または血中ＩＧＦ−Ｉ
濃度上昇能を有することを見い出した。これらのことか
ら、本剤は成人用ヒト成長ホルモン剤特に成長ホルモン
欠損症患者に対する優れた成人補充療法用ヒト成長ホル
モン剤として使用が可能である。

【００４０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１７６ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖型 配列の種類：タンパク質 配列 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu 1 5 10 15 Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu 20 25 30 Phe Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr 35 40 45 Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu 50 55 60 Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val 65 70 75 Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala 80 85 90 Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly 95 100 105 Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr 110 115 120 Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser 125 130 135 His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys 140 145 150 Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val 155 160 165 Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 170 175

【００４１】配列番号：２ 配列の長さ：１７６ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖型 配列の種類：タンパク質 配列 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Ser Leu 1 5 10 15 Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu 20 25 30 Phe Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr 35 40 45 Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu 50 55 60 Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val 65 70 75 Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala 80 85 90 Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly 95 100 105 Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr 110 115 120 Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser 125 130 135 His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys 140 145 150 Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val 155 160 165 Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 170 175

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト成長ホルモンのマウス3T3-L1脂肪細胞にお
ける脂肪分解促進能を表す図である。白の棒グラフは成
長ホルモン無添加を、斜め格子縞模様の棒グラフは２２
キロダルトンヒト成長ホルモンを、黒の棒グラフは天然
型２０キロダルトンヒト成長ホルモンをそれぞれ示す。

【図２】ヒト成長ホルモンのラット精巣上体由来脂肪組
織における脂肪分解促進能を表す図である。白の棒グラ
フは成長ホルモン無添加を、斜め格子縞模様の棒グラフ
は２２キロダルトンヒト成長ホルモンを、黒の棒グラフ
は天然型２０キロダルトンヒト成長ホルモンをそれぞれ
示す。

【図３】ヒト成長ホルモンの下垂体摘出ラットにおける
脂肪分解促進能を表す図である。白の棒グラフはcontro
lを、斜め格子縞模様の棒グラフは２２キロダルトンヒ
ト成長ホルモンを、黒の棒グラフは天然型２０キロダル
トンヒト成長ホルモンをそれぞれ示す。

【図４】ヒト成長ホルモンのC57BL/6j-ob/obマウスにお
ける体成分改善能を表す図である。斜め格子縞模様の棒
グラフは２２キロダルトンヒト成長ホルモンを、黒の棒
グラフは天然型２０キロダルトンヒト成長ホルモンをそ
れぞれ示す。

【図５】ヒト成長ホルモンの下垂体摘出ラットにおける
血中ＩＧＦ−Ｉ濃度上昇能を表す図である。白の棒グラ
フはcontrolを、斜め格子縞模様の棒グラフは２２キロ
ダルトンヒト成長ホルモンを、黒の棒グラフは天然型２
０キロダルトンヒト成長ホルモンをそれぞれ示す。

【図６】２０キロダルトン成長ホルモンのC57BL/6j-ob/
obマウスにおける耐糖能を表す図である。図中の各シン
ボルのうち、四角はcontrolを、三角は２２キロダルト
ン成長ホルモンを、丸は２０キロダルトン成長ホルモン
をそれぞれ示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 堀込 和利 千葉県茂原市東郷1900番地の１ 三井東圧 化学株式会社内 (72)発明者 神岡 健 千葉県茂原市東郷1900番地の１ 三井東圧 化学株式会社内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 天然型２０キロダルトンヒト成長ホルモ
   ンを有効成分として含有する成人用ヒト成長ホルモン
   剤。
2. 【請求項２】 天然型２０キロダルトンヒト成長ホルモ
   ンが配列表の配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ
   酸配列を有する天然型２０キロダルトンヒト成長ホルモ
   ンであることを特徴とする請求項１に記載の成人用ヒト
   成長ホルモン剤。
3. 【請求項３】 成人に対して体成分改善能を有する請求
   項１又は請求項２に記載の成人用ヒト成長ホルモン剤。
4. 【請求項４】 成人に対して脂肪分解促進能を有する請
   求項１又は請求項２に記載の成人用ヒト成長ホルモン
   剤。
5. 【請求項５】 成人に対して血中インシュリン様成長因
   子−Ｉ濃度上昇能を有する請求項１又は請求項２に記載
   の成人用ヒト成長ホルモン剤。
6. 【請求項６】 成人補充療法用である請求項１に記載の
   成人用ヒト成長ホルモン剤。
7. 【請求項７】 天然型２０キロダルトンヒト成長ホルモ
   ンが配列表の配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ
   酸配列を有する天然型２０キロダルトンヒト成長ホルモ
   ンであることを特徴とする請求項６に記載の成人用ヒト
   成長ホルモン剤。
8. 【請求項８】 成人の成長ホルモン欠損症患者に対して
   体成分改善能を有する請求項６又は請求項７に記載の成
   人用ヒト成長ホルモン剤。
9. 【請求項９】 成人の成長ホルモン欠損症患者に対して
   脂肪分解促進能を有する請求項６又は請求項７に記載の
   成人用ヒト成長ホルモン剤。
10. 【請求項１０】 成人の成長ホルモン欠損症患者に対し
    て血中インシュリン様成長因子−Ｉ濃度上昇能を有する
    請求項６又は請求項７に記載の成人用ヒト成長ホルモン
    剤。