JPH0920799A - ダニ抗原に対するモノクローナル抗体と該抗体を産生するハイブリドーマセルライン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 コナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farin
ae）由来の抗原Der f Iを哺乳類に免疫して得られる、D
er f I を選択的に認識しＩｇＧに属する抗Derf I モノ
クローナル抗体。該抗体を標識して得られる標識抗体。
Der f I の精製方法。前記抗体を産生するハイブリドー
マセルライン。 【効果】 本発明により得られたモノクローナル抗体を
使用することにより、極めて高感度に特異的にDer f I
を検出測定すること、また、試料中よりDer f Iを簡便
に高純度に精製することが可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、コナヒョウヒダニ（De
rmatophagoides farinae）の主要アレルゲンであるDer
f I に特異的なモノクローナル抗体、その抗体の産生セ
ルライン、モノクローナル抗体を用いた免疫測定法に関
するものである。

【０００２】

【従来の技術】ハウスダスト（室内塵）は気管支喘息、
アレルギー性鼻炎などの重要なアレルゲンであるが、そ
のアレルゲンは主としてダニに由来しているといわれ
（坂本、化学と生物 Vol. 26, No.2 (1988))、ハウスダ
ストの皮膚テスト陽性者の９割以上はダニでも陽性であ
るといわれる（早川、信田、日本臨床 45巻 8号 (198
7))。アレルゲンの起源として重要なダニはコナヒョウ
ヒダニ（Dermatophagoides farinae）やヤケヒョウヒダ
ニ（Dermatophagoides pteronysinuss）である（T. Miy
amoto et al. J. Allergy, 42, 14 (1968))。

【０００３】コナヒョウヒダニには、アレルゲン活性を
もつDer f I（分子量24,000），Derf II（分子量15,000
〜16,000）という２つの主要タンパク（Yasueda, Int.
Arch. Allergy ppl. Immunol., 81, 214 (1986)) のほ
か、さまざまな分子量の複数のアレルゲンが存在してい
る。Der f I はおもにダニ糞中、Der f II はダニ虫体
中（含死体、破片）に含有されている。一般的にアレル
ギーの治療は起因アレルゲンを確定することが治療上最
も重要で、臨床上ではアレルゲンの回避などの患者指導
等が有効（坂本、化学と生物 Vol.26, No.2 (1988)）
で、患者の生活環境中に存在するダニアレルゲンの確定
と量の測定が必要となる。これについては、従来よりさ
まざまなハウスダスト中のダニアレルゲン検出法が提案
されてきている。しかし、アルコール抽出した塵中のダ
ニ排泄物由来タンパク質と芳香族ジアゾ化合物との呈色
反応（特開昭６０−１３５８４４、特開昭６０−１７１
４５９、特開昭６１−５９２６１）では検出方法が複雑
すぎる。またダニアレルゲンの存在を確認するのみで、
アレルゲンの同定や定量は実施できない。小動物の体液
と化学薬品との呈色反応（特開昭６２−２９６８２８、
特開昭６２−２９６８２９）では操作は簡単ではある
が、ダニ以外の小動物も検出されてしまい、ダニアレル
ゲンの同定、定量ができない。またダニ虫体抽出物を動
物に免疫して得られた抗血清による検出方法（特開昭６
３−１９１９６１）では、塵中のダニの生体の検出、定
量はできるが、死体や破片や糞の検出や定量については
不明であり、またアレルゲンの確定、定量はできない。

【０００４】既にダニアレルゲンに対するモノクローナ
ル抗体（特開平５−２０７８９２）が開示されており、
それによればダニアレルゲンの中でDer f II を特異的
かつ高感度に検出及び定量ができるとされている。しか
し、アレルゲンとして重要なものは先に述べたDer f I
とDer f II である。ダニアレルゲンを測定する場合、
この二つの主要アレルゲン、すなわちDer f I およびDe
r f II を測定する必要がある。本発明者らは、この点
に着目し、これまで特異的な定量、検出ができなかった
Der f I に対して特異性を有するモノクローナル抗体を
作製することにより重要な二つのダニアレルゲンの検
出、定量を可能にし、本発明を完成した。本発明と先に
開示されている発明（特開平５−２０７８９２）を併せ
て実施することにより、臨床上重要と考えられているダ
ニアレルゲンをほぼ網羅することができる。

【０００５】ダニアレルギーの治療においてはダニアレ
ルゲンエキスを用いた減感作療法が行われるのが一般的
である。減感作療法については投与アレルゲンの確定、
精製が望まれている（江田、日本臨床44巻、臨時増刊号
(1986))。この点に関して、従来の虫体、または糞その
ものを免疫した哺乳類から作成されたポリクローナル抗
体の系では、抗体の特異性についてははっきりしていな
い。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明はDer f I に特
異的なモノクローナル抗体を使用することにより上記の
ようなアレルゲン同定、定量系の問題点を解決し、免疫
学的に塵中のDer f I を高感度かつ簡便に同定、定量す
ることを目的とし、塵中のコナヒョウヒダニの数をも推
察可能であることを示唆するとともに、試料中のDer f
I を簡便にかつ高純度に精製することを目的とするもの
である。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、Der f I
に特異的なモノクローナル抗体を複数作製し、これを用
いて免疫学的測定法の検討を行った。その結果、本発明
に関わるモノクローナル抗体はDer f I 測定試薬として
極めて有用であることを見出し、本発明に到達した。即
ち、本発明はDer f I に対して特異的に結合しうるモノ
クローナル抗体を用いることを特徴とする試料中のDer
f I の同定、定量、測定方法である。

【０００８】本発明のモノクローナル抗体は、公知の細
胞融合法により製造できる。さらに詳細には、本発明の
モノクローナル抗体は次の（１）〜（４）の工程、即
ち、（１）抗体産生細胞調製工程、（２）融合、スクリ
ーニング、クローニング工程、（３）ハイブリドーマ培
養工程、（４）必要に応じて行われる精製工程、を実施
することによって得られる。以下、各工程について詳細
に説明する。 （１）抗体産生細胞調製工程 抗Der f I 抗体産生細胞はDer f I を抗原とし、この抗
原を Balｂ／ｃマウスまたはＡ／Ｊマウスに十分免疫し
た脾臓より採取できる。Der f I をマウス一頭あたり10
〜30μｇとなるようにフロイントの完全アジュバントま
たは不完全アジュバントを等量混ぜて腹腔内に投与する
ことを２〜４週間の間隔で繰り返す。血液中の抗体価が
十分にあがっていることを確認し、アジュバンドなしで
同量を尾静脈または腹腔内に投与し最終免疫とする。最
終免疫から２〜５日後、マウスの脾臓から抗体産生細胞
を採取する。

【０００９】（２）融合、スクリーニング、クローニン
グ工程 融合は融合促進剤の存在下、上記マウス抗体産生細胞な
らびに公知のマウス骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）を公
知の方法にて混合することにより行うことができる。一
般にマウスミエローマ細胞は、ハイブリドーマ選択培地
で生育できず、かつ、それ自身が抗体を産生しないもの
が好ましい。このようなマウスミエローマ細胞として
は、マウスミエローマ細胞Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−
１（以下、ＮＳ−１）、Ｓｐ−２ Ｏ−Ａｇ１４（以下
ＳＰ−２）あるいはこれと同様のものが挙げられる。

【００１０】両細胞の比は通常ミエローマ細胞１に対し
て抗体産生細胞１〜20の比率で行う。細胞融合促進剤と
しては例えばポリエチレングリコールが用いられ、好ま
しくは分子量1,000〜7,500のものがよく用いられる。ハ
イブリドーマの培養は、例えば融合促進剤を洗浄除去
し、ハイブリドーマ選択用培地に懸濁したハイブリドー
マの 100〜200μl ずつを96Wellプレートに播き、約37
℃において５％炭酸ガス−空気中で行うことができる。

【００１１】目的とするハイブリドーマのスクリーニン
グは培養液中の抗体価を測定することにより行う。即
ち、Der f I を結合させ、さらにウシ血清アルブミンに
てブロッキングしたアッセイプレートの各ウェルにハイ
ブリドーマの十分生育した培地の上清を加え、充分イン
キュベートし、プレート内で抗原抗体反応させた後、上
清を除去洗浄する。さらに、これにアビジン化抗マウス
ＩｇＧ抗体を作用させ洗浄後、ビオチン化アルカリフォ
スファターゼを作用させ洗浄後、基質となるｐ−ニトロ
フェニルホスフェートを加えて呈色させる。抗体産生陽
性のハイブリドーマについて限界希釈法にてクローニン
グし、目的の単一のハイブリドーマを調製できる。

【００１２】（３）ハイブリドーマ培養工程 前工程で得たクローン化ハイブリドーマをin vitroまた
はin vivoで培養すれば目的のモノクローナル抗体が産
生できる。in vitroでの培養は、例えば96Wellプレート
中で数個のハイブリドーマの培養から始め、徐々にスケ
ールアップすることにより行うことができる。また、in
vivoでの培養は、例えば、融合細胞の増殖を容易にさ
せるためのプリスタン（2, 6, 10，14−テトラメチルペ
ンタデカン：アルドリッチケミカル社）処理をしたマウ
スにハイブリドーマを腹腔内に接種することによって実
施できる。７〜15日後にはモノクローナル抗体を含む腹
水が蓄積される。 （４）精製工程 必要によって行われる精製工程は、前工程で得られたモ
ノクローナル抗体を通常の物理化学的手法、例えば塩
析、遠心分離、透析、イオン交換クロマトグラフィー等
の手段を組み合わせることにより行うことができるが、
モノクローナル抗体の抗体サブクラスがＩｇＧ１である
場合は、他のサブクラスのようにプロテインＡカラムに
よる吸着、溶出では回収率が悪いので、プロテインＧカ
ラムによる吸着、溶出の方が回収率が高く、かつ、簡便
である。

【００１３】本発明においては、以上の方法により、De
r f I を認識する複数種のモノクローナル抗体を得た。
これらは当該Der f I の互いに異なる部位を認識する抗
体であった。以上のようにして得られたDer f I に対し
て特異的に結合し得るモノクローナル抗体を用いて、公
知の免疫測定法、例えば競合法、サンドイッチ法などが
可能となった。

【００１４】例えばサンドイッチ法による免疫測定法で
は、抗体を固相に固定化する場合は、その方法は公知の
方法を採用でき、固相としては、例えば、ポリスチレ
ン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ラテックス、アガ
ロース、セルロース、ポリメタアクリレート、ガラスな
どを用いたマイクロタイタープレートや粒子が好ましく
用いられる。また、標識で結合された抗体における標識
化の方法、その検出方法は何等限定されるものではな
く、公知の方法により標識化及び測定することができ
る。標識剤としては、酵素を用いる方法では、パーオキ
シダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼまたはアルカリフ
ォスファターゼ等の酵素が、放射性物質を用いる方法で
は、 ¹²⁵Ｉ、 ³Ｈ等が、蛍光物質を用いる方法では、フ
ルオレスカミン、フルオレッセイン・イソチオシアネー
ト等が通常使用されるが、そのほかのものであっても良
い。標識剤が酵素である場合には、その活性を測定する
ために基質が用いられる。例えばパーオキシダーゼの基
質としては、５−アミノサリチル酸、ｏ−フェニレンジ
アミン等が、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質として
は、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
が、アルカリフォスファターゼの基質としては、ｐ−ニ
トロフェニルスルフォニルフォスフェート等が用いられ
る。測定のためには、これらの試薬以外にも溶解剤、洗
浄剤、反応停止剤等の公知の試薬が使用される。

【００１５】通常サンドイッチ法による免疫測定法は、
測定されるべき物質（抗原）を認識する第１のモノクロ
ーナル抗体と、第１のモノクローナル抗体とは異なる抗
原決定部位を認識する第２のモノクローナル抗体を用
い、第１のモノクローナル抗体が固相に固定化されてお
り、第２のモノクローナル抗体が標識化されていること
を特徴とする。

【００１６】

【発明の効果】本発明によりDer f I に対して特異的に
結合し得るモノクローナル抗体（工業技術院生命工学工
業技術研究所、受託番号 FERM P-15026 および FERM P-
15027)が得られた。さらに本発明の方法で試料中のDer
f I は 100〜1,000ng/mlという低濃度の範囲でも高感度
に測定可能である。本発明は、Der f I に特異的な測定
方法であり、化学反応を用いる従来の方法より極めて簡
便であり、またコナヒョウヒダニを免疫して得られたポ
リクローナル抗体を用いた従来の方法より極めて高感度
に特異的にDer f I を検出測定することが可能となっ
た。また、本発明により得られたモノクローナル抗体を
使用することにより、試料中よりDer f I を簡便に高純
度に精製することが可能となった。

【００１７】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説
明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではな
い。 実施例１ （１）抗Der f I モノクローナル抗体の調製 抗Der f I モノクローナル抗体の調製は、以下に示すよ
うな方法で行った。

【００１８】イ）免疫 コナヒョウヒダニを飽和食塩水浮遊法で採取し、ＰＢＳ
バッファーで抽出、60％飽和硫安沈澱の沈澱画分を透析
にて硫安を除去した後、ＤＥＡＥ−Sephacel（0.05M Tr
is C1, pH 8.0）にかけ、非吸着画分を S-Sepharose
(0.02M acetate buffer, pH 5.5〜0.2 M NaCl linear g
radient）にかけ、80mM NaCl溶出画分を Sephadex G-75
にかけて得られるピークを回収し、粗精製Der f I とし
免疫抗原とした。Der f I が30μg/100μl （Ａ／Ｊマ
ウスでは10μg/100μl)となるように、等量のフロイン
ト完全アジュバント（ＦＣＡ Difco社）と混合乳化
し、Bal b/ｃマウス（♂）（または A/Jマウス（♂))の
腹腔に１頭あたり30μg (A/Jマウスでは10μg)となるよ
うに混合乳化物を投与する。約２〜４週間のインターバ
ルで同量のDer f I をフロイント不完全アジュバント
（ＦＩＡ Difco社）に混合乳化したものを腹腔に５回
追加免疫した。最終免疫は細胞融合の３日前に予め血中
抗体価が陽性になることを確認したマウス（血清を1,00
0倍以上に希釈してもDer f I を固相とする酵素免疫測
定で陽性）についてDer f I 30μg (A/Jマウスでは５μ
g)を含むＰＢＳを尾静脈（A/Jマウスでは腹腔）に投与
した。

【００１９】ロ）細胞の調製 最終免疫の３日後にマウスの脾臓を摘出し、脾細胞を10
％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地（FLOW Lab. Co., L
TD 以下ＲＰＭＩ）中に分散させ、200m/sステンレスメ
ッシュで濾過した後、ウシ胎児血清を含まないＲＰＭＩ
（以下、−ＲＰＭＩ）で３回洗浄した。融合パートナー
であるマウスの骨髄腫細胞（ミエローマ）としてはBal
b/c マウスに対してはＮＳ−１、A/Jマウスに対しては
ＳＰ−２を用いた。これを予め８−アザグアニン30μg/
mlを添加したＲＰＭＩで細胞融合の約１週間前まで培養
し、その後、ＲＰＭＩで培養した対数増殖期のものを−
ＲＰＭＩで３回洗浄した。

【００２０】ハ）細胞融合及び抗体産生ハイブリドーマ
の選択 脾細胞１〜２×10⁸cellsとミエローマを約５：１の割合
で混合し、遠心後ペレットとした。これにポリエチレン
グリコール（PEG 4000 関東化学）50％を含む−ＲＰＭ
Ｉ 1mlを加えて１分間攪拌し、さらに１分間攪拌後、−
ＲＰＭＩ 8mlを８分間かけて添加攪拌し、ＲＰＭＩ 10m
l を加えて遠心し、ペレットを脾細胞が５×10⁶/mlとな
るように懸濁し、100μl ずつ96Wellプレート（住友ベ
ークライト）に播種した。翌日からヒポキサンチン 0.1
mM、アミノプテリン 0.4μM、チミジン16μM を含むＲ
ＰＭＩ（以下ＨＡＴ培地）を各Wellに 100μl 添加し、
その後約１〜２週間ＨＡＴ培地をハイブリドーマのコロ
ニーが出現するまで 100μl ずつ交換した。ハイブリド
ーマのコロニーがWellに出現した時点で抗Der f I抗体
の検出を行い、陽性であったWellの細胞について限界希
釈を実施し、ヒポキサンチン 0.1mM、チミジン16μMを
含むＲＰＭＩでの培養期間を経た後コロニーの出現して
いるWellについて抗Der f I 抗体の検出を確認後、２回
目の限界希釈を実施し、クローニングを行った。こうし
て抗Der f I モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを
得た。

【００２１】ニ）モノクローナル抗体の産生 クローニングされたモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマはＲＰＭＩで増殖させた後、予め２週間前に 0.5ml
のプリスタンを腹腔に投与したBalb/cマウス（A/J由来
のハイブリドーマでは CAF−１マウス）の腹腔に、１頭
あたり 10⁶〜10⁷cellsで移植した。約２週間後に溜った
腹水を回収し、これよりモノクローナル抗体を精製し
た。得られたモノクローナル抗体産生セルラインのう
ち、２種類について通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所に寄託した。受託番号は次の通りである。

【００２２】 寄託者が付した識別のための表示 受託番号 ２Ｅ１ ＦＥＲＭ Ｐ−１５０２６ ６Ｇ１ ＦＥＲＭ Ｐ−１５０２７ ホ）モノクローナル抗体の精製 腹水を10,000rpm 20分間遠心して沈澱物を除き、 0.3μ
m の減菌フィルター（マイレスク 0.3μm：ミリポア
社）で濾過した濾液について Lowry法によりタンパク濃
度を測定するタンパク量として100〜150mg分の濾液を市
販のプロテインＧカラムキット（Mab Trap G：ファルマ
シア社）処理し、吸着画分をＰＢＳに透析し、SDS PAGE
電気泳動、CBB染色でシングルバンドであることを確認
後、精製モノクローナル抗体とした。

【００２３】（２）不溶化抗体の調製 未処理の96Wellマイクロタイタープレート（Immulon
１：ダイナテクラボラトリー社、以下マイクロタイター
プレート）の各WellにＰＢＳに溶解した５μg/mlのマウ
ス抗Der f I モノクローナル抗体の１つ（名称６Ｇ１と
する）の溶液を50μl 加えて室温で２時間インキュベー
トする。次に各Wellの溶液を除去し、0.05％のTween 20
を含むＰＢＳ（以下ＰＢＳ−Tween)で３回洗浄し、１％
ＢＳＡを含むＰＢＳで室温で１時間（または４℃で１
晩) プロッキングした。ＰＢＳ−Tween で３回洗浄後、
このプレートを使用した。このプレートは−30℃で保存
してもかまわない。

【００２４】（３）ウシ膵臓アルカリフォスファターゼ
標識抗体の調製 精製済みモノクローナル抗体1.7mg あたりウシ膵臓アル
カリフォスファターゼ（ＥＩＡグレード：ベーリンガー
社）５mgを添加し、ＰＢＳに１晩透析した。透析後の体
積を測定し、１／10容積の20％グルタルアルデヒド（和
光純薬）を添加、室温にて２時間攪拌する。溶液を全て
回収してＰＢＳで１晩透析後、0.25M Tris C1 ：pH 8.0
に１晩透析したものを標識抗体液とし、NaN₃を0.02％に
なるように加えて４℃で保存した。

【００２５】（４）精製Der f I と精製Der f IIを用い
た検量線の作成 本実施例中の（２）で述べた方法で作成したモノクロー
ナル抗体の１つ（名称６Ｇ１とする）を固定したマイク
ロタイタープレートに精製Der f I ０〜1.0μg/mlを含
有するＰＢＳ（またはＰＢＳ−Tween)を50μl 加えた。
特異的結合の対照物として同じコナヒョウヒダニのアレ
ルゲンDer f II（分子量14Ｋ）、ヤケヒョウダニのアレ
ルゲンDer p I（分子量24Ｋ）、及びDer p II (分子量1
5Ｋ）を０〜 1.0μg/ml含有するＰＢＳ（またはＰＢＳ
−Tween)をおのおの別なWellに50μl 加えた。室温で２
時間でインキュベート後、ＰＢＳ−Tween で３回洗浄
し、次いで、（３）で作成したアルカリフォスファター
ゼ標識抗Der f I モノクローナル抗体の１つ（名称２Ｅ
１＊とする）を９μg/mlとなるようにＰＢＳ（またはＰ
ＢＳ−Tween)で希釈し、50μl ずつ添加した。室温で２
時間インキュベート後、ＰＢＳ−Tween で３回洗浄し、
ジエタノールアミンバッファー（pH8.0、５ml）に基質
タブレット（アルカリフォスファターゼ基質タブレッ
ト、シグマ社）１個の割合で溶解した基質溶液（以下基
質溶液）を100μl加えて発色させた。室温で10分間反応
後、５ＮのNaOH 50μl 添加し反応を停止させた。各Wel
lについてマイクロオートリーダー（コロナ社、以下、
オートリーダー）で波長405nm の吸光度を測定したとこ
ろ本抗体の組み合せではDer f I にのみ特異的に反応し
0.5μg/ml濃度の抗原量としたときに約0.4の吸光度を示
した。

【００２６】実施例２ 実施例１で用いたモノクローナル抗体６Ｇ１、２Ｅ１＊
を使用した酵素免疫測定法を用い、Der f II、Der p
I、Der p II の共存下でDer f I のみが検出される範囲
を測定した。

【００２７】実施例１と同様にして６Ｇ１を固定化した
マイクロタイタープレートを作成し各Wellに精製Der f
I が0.5μg/mlとなり、Der f II、Der p I、Der p II
が０〜30μg/mlで共存するようにＰＢＳ−Tween で調製
した溶液を、50μl ずつ加えた。室温で２時間インキュ
ベートした後、ＰＢＳ−Tween で洗浄し、続いて実施例
１で用いたモノクローナル抗体２Ｅ１＊を９μg/mlとな
るようにＰＢＳで希釈し、50μl ずつWellへ添加した。
室温で２時間反応させた後に、ＰＢＳ−Tweenで３回洗
浄し基質溶液100μl を加え発色させた。室温で10分間
反応させた後、５ＮのNaOH 50μl を添加し、反応を停
止させた。オートリーダーで波長405nmにおける吸光度
を測定した結果、０〜３μg/mlのDer f II、Der p I、D
er p II存在下でも正しくDer f I のみを検出している
ことが明らかになった。

【００２８】実施例３ 実施例１の（１）で得られたモノクローナル抗体６Ｇ１
をリガンドとしたゲルを用いてダニ虫体凍結乾燥粉末か
らDer f I をアフィニティークロマトグラフィーにより
精製した。CNBr−Sepharose（ファルマシア社）1.5gを
１mM HClで膨張させ、0.1M NaHCO₃-0.5M NaCl ：pH8.3
バッファー（以下Ｃバッファー）で充分洗浄する。ゲル
をネジ付き試験管にうつし、Ｃバッファーに透析してお
いた６Ｇ１（732μg/ml）５mlを添加し、20mlのＣバッ
ファーを加えた後、室温にて２時間振とう、反応させ
る。2,500rpmで10分間遠心分離し、ゲルに0.2Mグリシン
pH8.0バッファーを25ml加え、室温にて２時間振とうす
る。2,500rpmで10分間遠心分離し、ゲルをＣバッファ
ー、0.1M酢酸−0.5M NaCl：pH4.0バッファーで交互に２
回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄後、５ml容プラスチックシ
リンジに充填しカラムとする。カラムを0.2Mグリシン−
HCl：pH2.3バッファー（以下、溶出バッファー）、ＰＢ
Ｓ−0.5M NaCl バッファー（以下、洗浄バッファー）で
交互に洗浄し、洗浄バッファーで平衡化しておく。コナ
ヒョウヒダニの凍結乾燥粉末0.05gをＰＢＳ500μl に溶
解し、0.3μフィルター（マイレスク：ミリポア社）で
濾過後、500μl をカラムに添加する。流速92秒／mlの
条件下でバッファーで非吸着画分を洗浄し、溶出バッフ
ァーで吸着画分を溶出させる。それぞれの画分の吸光度
を280nm にて測定した。各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにか
け、同時に実施例２で用いたモノクローナル抗体６Ｇ
１、２Ｅ１＊を使用した酵素免疫測定法を用いて、画分
中のDer f I 量を測定した結果、このゲルはダニ虫体凍
結乾燥粉末溶液の中からDer f I のみを特異的に吸着し
ていることが明らかとなり、Der f I をダニ虫体凍結乾
燥粉末から１ステップで精製できることが示された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/535 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 9162−4Ｂ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 赤川 みどり 東京都墨田区吾妻橋１−23−１ アサヒビ ール吾妻橋ビル アサヒビール飲料株式会 社内 (72)発明者 森 俊夫 東京都大田区大森北２−13−１ アサヒビ ール株式会社酒類開発研究所内 (72)発明者 奥村 康 東京都大田区大森北２−13−１ アサヒビ ール株式会社中央研究所内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】コナヒョウヒダニ（Dermatophagoides far
   inae）由来の抗原Der f I を哺乳類に免疫して得られ
   る、Der f I を選択的に認識しＩｇＧに属する抗Der f
   I モノクローナル抗体。
2. 【請求項２】モノクローナル抗体のDer f I 上の認識部
   位が互いに異なる請求項１記載のモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】請求項１または２に記載のモノクローナル
   抗体を酵素、蛍光色素、化学発光物質またはラジオアイ
   ソトープのいずれかもしくはその組合せにより標識して
   得られる標識抗体。
4. 【請求項４】請求項１または２に記載のモノクローナル
   抗体を用いてダニ抗原またはダニが存在すると考えられ
   る試料中からDer f I を精製する方法。
5. 【請求項５】請求項１記載のモノクローナル抗体を産生
   するハイブリドーマセルライン。
6. 【請求項６】２Ｅ１（受託番号 FERM P-15026) および
   ６Ｇ１（受託番号 FERM P-15027）から選ばれる請求項
   ５記載のハイブリドーマセルライン。