JPH09110699A - 抗ウイルス剤 - Google Patents
抗ウイルス剤Info
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- JPH09110699A JPH09110699A JP26388695A JP26388695A JPH09110699A JP H09110699 A JPH09110699 A JP H09110699A JP 26388695 A JP26388695 A JP 26388695A JP 26388695 A JP26388695 A JP 26388695A JP H09110699 A JPH09110699 A JP H09110699A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ウイルス感染症の遺伝子レベルにおける新し
い治療用の抗ウイルス剤を提供する。 【解決手段】 式： 【化１】 で表されるＥＰＣまたはその塩を含有する抗ウイルス
剤。
い治療用の抗ウイルス剤を提供する。 【解決手段】 式： 【化１】 で表されるＥＰＣまたはその塩を含有する抗ウイルス
剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗ウイルス剤に関
する。さらに詳しくは、本発明は、アスコルビン酸とト
コフェロールとのリン酸ジエステル化合物またはその薬
理学的に許容できる塩を含有してなる抗ウイルス剤、特
にＨＩＶウイルス感染症の治療に有用な抗ウイルス剤に
関する。
する。さらに詳しくは、本発明は、アスコルビン酸とト
コフェロールとのリン酸ジエステル化合物またはその薬
理学的に許容できる塩を含有してなる抗ウイルス剤、特
にＨＩＶウイルス感染症の治療に有用な抗ウイルス剤に
関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、酸化還元による細胞内情報伝達系
の制御が、リン酸化による制御同様、生物学的にきわめ
て重要であることが認識されつつある。例えば、ＨＩ
Ｖ、エプスタイン−バーウイルス（Ｅpstein−Ｂar vir
us）などのウイルス感染細胞において、細胞は酸化スト
レスを強く受け、その後、チオレドキシンなどの内因性
還元物質の誘導が起こる。かかるレドックス制御システ
ムはシグナル系に介在する蛋白分子のＳＨ基の修飾を介
して細胞内情報伝達系を極めて多様に調節する。特に、
核内転写因子のレドックス制御は、細胞環境の変化によ
る遺伝子発現調節機構の分子生物学的理解を大きく促進
している。核レセプタースーパーファミリーの一員であ
るグルココルチコイドレセプターがレドックス制御を受
け、その遺伝転写調節機能も変化することが知られてい
る。また、同じく転写因子であるＮＦκＢ、ＡＰ１、Ｍ
ybもレドックス制御を受けることが明らかにされつつあ
る。特に、ＮＦκＢは多くの免疫系遺伝子の発現に密接
に関与しているばかりか、ＨＩＶの増殖、すなわち、Ａ
lＤＳの発症・進展に関わっている。さらに、Ｔリンパ
球において酸化ストレスがＮＦκＢを誘導し、一方で内
因性外因性還元物質がＮＦκＢの活性化を防ぐことを報
告されている。したがって、自己免疫疾患、ＡＩＤＳを
はじめとしたウイルス感染症の遺伝子レベルにおける新
たな治療を考えるとき、ＮＦκＢはその標的分子として
きわめて有望といえる。
の制御が、リン酸化による制御同様、生物学的にきわめ
て重要であることが認識されつつある。例えば、ＨＩ
Ｖ、エプスタイン−バーウイルス（Ｅpstein−Ｂar vir
us）などのウイルス感染細胞において、細胞は酸化スト
レスを強く受け、その後、チオレドキシンなどの内因性
還元物質の誘導が起こる。かかるレドックス制御システ
ムはシグナル系に介在する蛋白分子のＳＨ基の修飾を介
して細胞内情報伝達系を極めて多様に調節する。特に、
核内転写因子のレドックス制御は、細胞環境の変化によ
る遺伝子発現調節機構の分子生物学的理解を大きく促進
している。核レセプタースーパーファミリーの一員であ
るグルココルチコイドレセプターがレドックス制御を受
け、その遺伝転写調節機能も変化することが知られてい
る。また、同じく転写因子であるＮＦκＢ、ＡＰ１、Ｍ
ybもレドックス制御を受けることが明らかにされつつあ
る。特に、ＮＦκＢは多くの免疫系遺伝子の発現に密接
に関与しているばかりか、ＨＩＶの増殖、すなわち、Ａ
lＤＳの発症・進展に関わっている。さらに、Ｔリンパ
球において酸化ストレスがＮＦκＢを誘導し、一方で内
因性外因性還元物質がＮＦκＢの活性化を防ぐことを報
告されている。したがって、自己免疫疾患、ＡＩＤＳを
はじめとしたウイルス感染症の遺伝子レベルにおける新
たな治療を考えるとき、ＮＦκＢはその標的分子として
きわめて有望といえる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、抗酸化
剤として公知の化合物であるＥＰＣのＮＦκＢ活性化に
及ぼす影響を検討した結果、その作用がウイルス感染
症、特に、ＨＩＶ感染症の治療に有用であり、該化合物
が抗ウイルス剤として期待できることを見出し、本発明
を完成するに至った。
剤として公知の化合物であるＥＰＣのＮＦκＢ活性化に
及ぼす影響を検討した結果、その作用がウイルス感染
症、特に、ＨＩＶ感染症の治療に有用であり、該化合物
が抗ウイルス剤として期待できることを見出し、本発明
を完成するに至った。
【０００４】
【課題を解決するための手段】ＥＰＣは、式：
【０００５】
【化２】
【０００６】[式中、Ｒ1およびＲ2は、同一または異な
って水素原子またはメチル基を示す。]で表されるリン
酸ジエステル化合物であり、例えば、特公平２−４４４
７８号や特開昭６２−２０５０９１号に開示され、そこ
に記載される方法またはそれに準じて適宜合成すること
ができる。ＥＰＣやその塩は、抗白内障剤、更年期障害
予防・治療剤、美肌作用を有する化粧品(特公平２−４
４４７８号)、抗炎症剤(特公平１−２７０４４号)、抗
潰瘍剤(特開昭６３−２７０６２６号)さらには虚血性臓
器障害予防・治療剤(特開平２−１１１７２２号)などの
種々の用途に有用であることが既に知られている。しか
しながら、それらが抗ウイルス剤として有用であること
は、未だ、知られていない。
って水素原子またはメチル基を示す。]で表されるリン
酸ジエステル化合物であり、例えば、特公平２−４４４
７８号や特開昭６２−２０５０９１号に開示され、そこ
に記載される方法またはそれに準じて適宜合成すること
ができる。ＥＰＣやその塩は、抗白内障剤、更年期障害
予防・治療剤、美肌作用を有する化粧品(特公平２−４
４４７８号)、抗炎症剤(特公平１−２７０４４号)、抗
潰瘍剤(特開昭６３−２７０６２６号)さらには虚血性臓
器障害予防・治療剤(特開平２−１１１７２２号)などの
種々の用途に有用であることが既に知られている。しか
しながら、それらが抗ウイルス剤として有用であること
は、未だ、知られていない。
【０００７】かくして、本発明は、ＥＰＣまたはその薬
理学的に許容できる塩（以下、本化合物という）を含有
してなる抗ウイルス剤を提供するものである。
理学的に許容できる塩（以下、本化合物という）を含有
してなる抗ウイルス剤を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明の抗ウイルス剤に用いられ
る本化合物は、遊離のものであっても、その薬理学的に
許容できる塩であっても、本発明の目的のため適宜に使
用することができる。薬理学的に許容できる塩として
は、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ
金属塩やカルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ
土類金属塩などが例示されるが、これら以外の塩であっ
ても薬理学的に許容できる塩であればいずれのものであ
っても適宜に使用することができる。
る本化合物は、遊離のものであっても、その薬理学的に
許容できる塩であっても、本発明の目的のため適宜に使
用することができる。薬理学的に許容できる塩として
は、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ
金属塩やカルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ
土類金属塩などが例示されるが、これら以外の塩であっ
ても薬理学的に許容できる塩であればいずれのものであ
っても適宜に使用することができる。
【０００９】本発明の抗ウイルス剤には、目的と必要に
応じて、本化合物のうち１種または２種以上を適宜組み
合わせて含有させることもできる。本化合物は、毒性が
きわめて低く安全性に優れているので、本発明の目的の
ため有利に用いることができる[例えば、Ｌ−アスコル
ビン酸−ＤＬ−α−トコフェロールリン酸ジエステルカ
リウム（以下、ＥＰＣ−Ｋと略称する。）のＬＤ50：経
口投与５g／kg(ラット)、静脈注射１００mg／kg（ラッ
ト）以上］。
応じて、本化合物のうち１種または２種以上を適宜組み
合わせて含有させることもできる。本化合物は、毒性が
きわめて低く安全性に優れているので、本発明の目的の
ため有利に用いることができる[例えば、Ｌ−アスコル
ビン酸−ＤＬ−α−トコフェロールリン酸ジエステルカ
リウム（以下、ＥＰＣ−Ｋと略称する。）のＬＤ50：経
口投与５g／kg(ラット)、静脈注射１００mg／kg（ラッ
ト）以上］。
【００１０】本発明の抗ウイルス剤は、経口的にあるい
は非経口的（例えば、静脈注射、皮下注射、筋肉注射、
点滴）にウイルス感染症の治療、特に、ＨＩＶウイルス
感染症の治療に適宜に使用される。製剤の形態として
は、例えば、錠剤、顆粒、散剤、カプセル剤などの固形
製剤または注射剤などの液剤のいずれにも、公知の方法
により適宜調製することができる。これら製剤には、通
常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、分散剤、再吸収
促進剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳
化剤、等張化剤、安定化剤や、pＨ調整剤などの各種添
加剤を適宜使用してもよい。
は非経口的（例えば、静脈注射、皮下注射、筋肉注射、
点滴）にウイルス感染症の治療、特に、ＨＩＶウイルス
感染症の治療に適宜に使用される。製剤の形態として
は、例えば、錠剤、顆粒、散剤、カプセル剤などの固形
製剤または注射剤などの液剤のいずれにも、公知の方法
により適宜調製することができる。これら製剤には、通
常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、分散剤、再吸収
促進剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳
化剤、等張化剤、安定化剤や、pＨ調整剤などの各種添
加剤を適宜使用してもよい。
【００１１】本化合物を抗ウイルス剤として使用する場
合の用量は、使用する化合物の種類、患者の年齢、体
重、性別、適応症状およびその剤型などによって異なる
が、例えば、注射剤の場合、成人１日１回約０．５〜２
００mg、好ましくは、約２〜５０mg程度、内服剤の場合
は、成人１日数回、１回量約５〜２,０００mg、好まし
くは約２０〜５００mg程度投与するのがよい。
合の用量は、使用する化合物の種類、患者の年齢、体
重、性別、適応症状およびその剤型などによって異なる
が、例えば、注射剤の場合、成人１日１回約０．５〜２
００mg、好ましくは、約２〜５０mg程度、内服剤の場合
は、成人１日数回、１回量約５〜２,０００mg、好まし
くは約２０〜５００mg程度投与するのがよい。
【００１２】本発明の抗ウイルス剤には、本発明の目的
に反しないかぎり、その他の抗ウイルス剤および／また
は別種の薬効を奏する成分を含有させてもよい。
に反しないかぎり、その他の抗ウイルス剤および／また
は別種の薬効を奏する成分を含有させてもよい。
【００１３】
【実施例】つぎに、試験例および製剤実施例を挙げて、
本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによ
って限定されるものではない。 試験例１ Ｉ．材料と方法 １．材料 （１）細胞 がん研究振興財団（Ｊapanese Ｃancer Ｒesearch Ｒes
ources Ｂank）より供与されたヒト神経膠芽細胞腫Ｔ９
８Ｇ細胞を使用した。細胞は１０％牛胎児血清、２mＭ
グルタミン酸、１mＭビルビン酸ナトリウム、０.１mＭ
非必須アミノ酸配合加修飾イーグル培地（ＭＥＭ：Ｍod
ified Ｅagle's Ｍedium）で継代培養した。 （２）試薬 ＮＦκＢの誘導にはＴＮＦα(１nＭ、大日本製薬)を用
いた。また、ＥＰＣ−Ｋ１はＥＰＵ（ＥＰＣのアスコル
ビン酸部分がウリジンとなった化合物）は千寿製薬製造
のものを使用した。ビタミンＣ(ＶitＣ)、ビタミンＥ
(ＶitＥ)はナカライ(株)より購入した。
本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによ
って限定されるものではない。 試験例１ Ｉ．材料と方法 １．材料 （１）細胞 がん研究振興財団（Ｊapanese Ｃancer Ｒesearch Ｒes
ources Ｂank）より供与されたヒト神経膠芽細胞腫Ｔ９
８Ｇ細胞を使用した。細胞は１０％牛胎児血清、２mＭ
グルタミン酸、１mＭビルビン酸ナトリウム、０.１mＭ
非必須アミノ酸配合加修飾イーグル培地（ＭＥＭ：Ｍod
ified Ｅagle's Ｍedium）で継代培養した。 （２）試薬 ＮＦκＢの誘導にはＴＮＦα(１nＭ、大日本製薬)を用
いた。また、ＥＰＣ−Ｋ１はＥＰＵ（ＥＰＣのアスコル
ビン酸部分がウリジンとなった化合物）は千寿製薬製造
のものを使用した。ビタミンＣ(ＶitＣ)、ビタミンＥ
(ＶitＥ)はナカライ(株)より購入した。
【００１４】２．方法 （１）プラスミドの作成 転写因子ＮＦκＢの転写誘導活性はルシフェラーゼ法を
用いて検討した。レポータープラスミドＨＩＶ−Ｌuc、
ＨＩＶ(△kＢ)−ＬucおよびpＮＦκＢＨＬは東京工業大
学半田宏教授より供与されたものを使用した。ＨＩＶ−
Ｌuc、ＨＩＶ(△kＢ)−Ｌucは、各々、ＨＩＶ−ＬＴ
Ｒ、ＮＦκＢを除いたＨＩＶ−ＬＴＲをルシフェラーゼ
発現ベクターＰＧＶ−Ｂ(東洋インキ)の上流に組み込ん
だものである。pＮＦκＢＨＬはＮＦκＢ特異的ＤＮＡ
結合認識配列として、ＨＩＶプロモーター上のκＢ配列
（５'−ＡＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴＧＧＧＧＡＣ
ＴＴＴＣＣＡＧ−３'）を用い、ＤＮＡシンセサイザー
で合成し、タンデムに４つ結合させた。その３'側にＴ
ＡＴＡボックスを含むＨＩＶプロモーター断片(−４５
〜＋８３)を連結し、ＰＧＶ−Ｂに組み込んだ。遺伝子
導入の効率はβガラクトシダーゼ発現プラスミド(ファ
ルマシア)で補正した。 （２）遺伝子導入法 細胞を１２ウェルプラスチック皿で培養し、３０〜５０
％密の状態でリン酸緩衝液で３回洗浄後、Ｏpti−ＭＥ
Ｍ無血清培地(ＧlＢＣＯ)と交換した。遺伝子導入はリ
ボフェクチン法を用いた。１ウェル当たり、４μlのリ
ポフェクチンと２μgのpＮＦκＢＨＬを混合し、ミセル
形成後、Ｏpti−ＭＥＭ無血清培地に添加し、９時間イ
ンキュベートした。
用いて検討した。レポータープラスミドＨＩＶ−Ｌuc、
ＨＩＶ(△kＢ)−ＬucおよびpＮＦκＢＨＬは東京工業大
学半田宏教授より供与されたものを使用した。ＨＩＶ−
Ｌuc、ＨＩＶ(△kＢ)−Ｌucは、各々、ＨＩＶ−ＬＴ
Ｒ、ＮＦκＢを除いたＨＩＶ−ＬＴＲをルシフェラーゼ
発現ベクターＰＧＶ−Ｂ(東洋インキ)の上流に組み込ん
だものである。pＮＦκＢＨＬはＮＦκＢ特異的ＤＮＡ
結合認識配列として、ＨＩＶプロモーター上のκＢ配列
（５'−ＡＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴＧＧＧＧＡＣ
ＴＴＴＣＣＡＧ−３'）を用い、ＤＮＡシンセサイザー
で合成し、タンデムに４つ結合させた。その３'側にＴ
ＡＴＡボックスを含むＨＩＶプロモーター断片(−４５
〜＋８３)を連結し、ＰＧＶ−Ｂに組み込んだ。遺伝子
導入の効率はβガラクトシダーゼ発現プラスミド(ファ
ルマシア)で補正した。 （２）遺伝子導入法 細胞を１２ウェルプラスチック皿で培養し、３０〜５０
％密の状態でリン酸緩衝液で３回洗浄後、Ｏpti−ＭＥ
Ｍ無血清培地(ＧlＢＣＯ)と交換した。遺伝子導入はリ
ボフェクチン法を用いた。１ウェル当たり、４μlのリ
ポフェクチンと２μgのpＮＦκＢＨＬを混合し、ミセル
形成後、Ｏpti−ＭＥＭ無血清培地に添加し、９時間イ
ンキュベートした。
【００１５】（３）ルシフェラーゼ法 pＮＦκＢＨＬが導入された細胞にＥＰＣ−Ｋ１、ＥＰ
Ｕ、ＶitＣ、ＶitＥをＴＮＦα添加３０分前に前添加し
た。１nＭ ＴＮＦα添加後、１２時間培養し、リン酸
緩衝液で２回洗浄後、２００μlの細胞溶解液(東洋イン
キ)で細胞を溶解した。さらに、エッペンドルフ・チュ
ーブに溶解液を移して遠心後、上清２０μlを測定に用
いた。ルシフェラーゼ活性の測定はＬumat ＬＢ９５０
１（Ｂerthold）を用い、ＲＬＵ（Ｒeactive Ｌight Ｕ
nit）で表した。また、４回の実験の平均値をそれぞれ
の測定値とした。結果を図１に示す。 （４）核抽出液の採取（Ｄignamらの方法） 細胞をコラーゲンコートした１００mmプラスチック皿で
培養後、リン酸緩衝液で２回洗浄した。さらに、Ｏpti
−ＭＥＭ無血清培地で２４時間培養し、ＥＰＣ−Ｋ１、
ＥＰＵ、ＶitＣ、ＶitＥ前添加(３０分)、１nＭ ＴＮ
Ｆα添加４時間培養した。その後、リン酸緩衝液で２回
洗浄後、ラバーポリースマンで細胞を剥離し、エッペン
ドルフ・チューブに収集した。遠心後、細胞沈査を１２
０μlの低張緩衝液（hypotonic buffer：１０mＭトリス
緩衝液、５mＭ塩化カリウム、１.５mＭ塩化マグネシウ
ム、５mＭ ２−メルカプトエタノール）に再溶解し、
遠心分離した。さらに、溶菌緩衝液（lysis buffer：１
０mＭトリス緩衝液、５mＭ塩化カリウム、１.５mＭ塩化
マグネシウム、５mＭ ２−メルカプトエタノール、０.
４％ノニデットＰ−４０）で細胞膜を溶解し核分画を採
取した。核分画は２０mＭトリス緩衝液、２０mＭ塩化カ
リウム、０.２mＭ ＥＤＴＡ、１.５mＭ塩化マグネシウ
ム、２５％グリセリン、５mＭ ２−メルカプトエタノ
ール、０.５mＭフェニルメチルスルホニルフルオリドか
らなる緩衝液１５μlで溶解し、さらに、２０mＭトリス
緩衝液、６００mＭ塩化カリウム、０.２mＭ ＥＤＴ
Ａ、１.５mＭ塩化マグネシウム、２５％グリセリン、５
mＭ ２−メルカプトエタノール、０.５mＭフェニルメ
チルスルホニルフルオリドからなる緩衝液６０μlを添
加し、３０分間氷上でインキュベートした。その後、遠
心分離し、上清を核抽出液とした。
Ｕ、ＶitＣ、ＶitＥをＴＮＦα添加３０分前に前添加し
た。１nＭ ＴＮＦα添加後、１２時間培養し、リン酸
緩衝液で２回洗浄後、２００μlの細胞溶解液(東洋イン
キ)で細胞を溶解した。さらに、エッペンドルフ・チュ
ーブに溶解液を移して遠心後、上清２０μlを測定に用
いた。ルシフェラーゼ活性の測定はＬumat ＬＢ９５０
１（Ｂerthold）を用い、ＲＬＵ（Ｒeactive Ｌight Ｕ
nit）で表した。また、４回の実験の平均値をそれぞれ
の測定値とした。結果を図１に示す。 （４）核抽出液の採取（Ｄignamらの方法） 細胞をコラーゲンコートした１００mmプラスチック皿で
培養後、リン酸緩衝液で２回洗浄した。さらに、Ｏpti
−ＭＥＭ無血清培地で２４時間培養し、ＥＰＣ−Ｋ１、
ＥＰＵ、ＶitＣ、ＶitＥ前添加(３０分)、１nＭ ＴＮ
Ｆα添加４時間培養した。その後、リン酸緩衝液で２回
洗浄後、ラバーポリースマンで細胞を剥離し、エッペン
ドルフ・チューブに収集した。遠心後、細胞沈査を１２
０μlの低張緩衝液（hypotonic buffer：１０mＭトリス
緩衝液、５mＭ塩化カリウム、１.５mＭ塩化マグネシウ
ム、５mＭ ２−メルカプトエタノール）に再溶解し、
遠心分離した。さらに、溶菌緩衝液（lysis buffer：１
０mＭトリス緩衝液、５mＭ塩化カリウム、１.５mＭ塩化
マグネシウム、５mＭ ２−メルカプトエタノール、０.
４％ノニデットＰ−４０）で細胞膜を溶解し核分画を採
取した。核分画は２０mＭトリス緩衝液、２０mＭ塩化カ
リウム、０.２mＭ ＥＤＴＡ、１.５mＭ塩化マグネシウ
ム、２５％グリセリン、５mＭ ２−メルカプトエタノ
ール、０.５mＭフェニルメチルスルホニルフルオリドか
らなる緩衝液１５μlで溶解し、さらに、２０mＭトリス
緩衝液、６００mＭ塩化カリウム、０.２mＭ ＥＤＴ
Ａ、１.５mＭ塩化マグネシウム、２５％グリセリン、５
mＭ ２−メルカプトエタノール、０.５mＭフェニルメ
チルスルホニルフルオリドからなる緩衝液６０μlを添
加し、３０分間氷上でインキュベートした。その後、遠
心分離し、上清を核抽出液とした。
【００１６】（５）ゲルシフト法 核抽出液中のＮＦκＢはκＢ認識配列（ＧＧＧＡＣＴＴ
ＴＣＣ）を含む二本鎖オリゴヌクレオチド（５'−ＣＴ
ＣＧＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ ＣＡＧＧＣ
Ｇ−３')をプローブとして検出した。プローブは二本鎖
オリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼのクレノー断
片を用いて、［α−32Ｐ］dＣＴＰ（アマーシャム）で
３'−末端標識された。各試薬反応後の核抽出液２μg
と、標識した二本鎖オリゴヌクレオチド(３０,０００cp
m)を２０mＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、６０mＭ塩化カリウ
ム、１mＭジチオスレイール、５０μg／ml牛アルブミ
ン、８％フィコール、２μg ポリ(dl−dＣ)中で室温に
て３０分間インキュベートした。さらに、４％ポリアク
リルアミドゲルを用いて電気泳動し、オートラジオグラ
フィーで検討した。得られたオートラジオグラムを図２
に示す。
ＴＣＣ）を含む二本鎖オリゴヌクレオチド（５'−ＣＴ
ＣＧＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ ＣＡＧＧＣ
Ｇ−３')をプローブとして検出した。プローブは二本鎖
オリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼのクレノー断
片を用いて、［α−32Ｐ］dＣＴＰ（アマーシャム）で
３'−末端標識された。各試薬反応後の核抽出液２μg
と、標識した二本鎖オリゴヌクレオチド(３０,０００cp
m)を２０mＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、６０mＭ塩化カリウ
ム、１mＭジチオスレイール、５０μg／ml牛アルブミ
ン、８％フィコール、２μg ポリ(dl−dＣ)中で室温に
て３０分間インキュベートした。さらに、４％ポリアク
リルアミドゲルを用いて電気泳動し、オートラジオグラ
フィーで検討した。得られたオートラジオグラムを図２
に示す。
【００１７】ＩＩ．成績 １．ＮＦκＢの遺伝子転写誘導能に及ぼす影響 細胞にpＡＰ１ＨＬをトランスフェクト後、ＴＮＦαに
よるＮＦκＢの遺伝子転写誘導能に及ぼす各種薬剤の影
響をルシフェラーゼ法を用いて検討した。ＴＮＦα非存
在下では、ＥＰＣ−Ｋ１、ＥＰＵ、ＶitＥ、ＶitＣはい
ずれもルシフェラーゼ活性に影響しなかった。しかし、
ＴＮＦα（１nＭ）存在下では、ＥＰＣ−Ｋ１は濃度依
存性（０.１、１μＭ）にpＮＦκＢＨＬの発現を抑制し
た。また、ＥＰＵ(１μＭ)、ＶitＥ(１μＭ)、ＶitＣ
(１μＭ)もＴＮＦαで誘導したルシフェラーゼ活性を抑
制する傾向は認めたが、ＥＰＣ−Ｋ１に比較してその作
用は弱いものと思われた。さらに、ＨＩＶ−Ｌuc、ＨＩ
Ｖ(△kＢ)−Ｌucをトランスフェクト後同様の実験を行
なった結果、ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターのＴＮＦαに
よるＮＦkＢ活性化を介した誘導もＥＰＣ１μＭによっ
て抑制されることが明らかとなった。結果を図３に示
す。
よるＮＦκＢの遺伝子転写誘導能に及ぼす各種薬剤の影
響をルシフェラーゼ法を用いて検討した。ＴＮＦα非存
在下では、ＥＰＣ−Ｋ１、ＥＰＵ、ＶitＥ、ＶitＣはい
ずれもルシフェラーゼ活性に影響しなかった。しかし、
ＴＮＦα（１nＭ）存在下では、ＥＰＣ−Ｋ１は濃度依
存性（０.１、１μＭ）にpＮＦκＢＨＬの発現を抑制し
た。また、ＥＰＵ(１μＭ)、ＶitＥ(１μＭ)、ＶitＣ
(１μＭ)もＴＮＦαで誘導したルシフェラーゼ活性を抑
制する傾向は認めたが、ＥＰＣ−Ｋ１に比較してその作
用は弱いものと思われた。さらに、ＨＩＶ−Ｌuc、ＨＩ
Ｖ(△kＢ)−Ｌucをトランスフェクト後同様の実験を行
なった結果、ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターのＴＮＦαに
よるＮＦkＢ活性化を介した誘導もＥＰＣ１μＭによっ
て抑制されることが明らかとなった。結果を図３に示
す。
【００１８】２．ＮＦκＢのＤＮＡ結合能に及ぼす影響 各種試薬によるＮＦκＢのＤＮＡ結合能に及ぼす影響を
ゲルシフト法を用いて検討した。Ｔ９８Ｇ細胞におい
て、構成的に発現するＮＦκＢは認めなかった。１nＭ
ＴＮＦαはＮＦκＢのＤＮＡ結合能を明らかに誘導し
た。さらに、ＴＮＦαによるＮＦκＢのＤＮＡ結合能の
誘導を１μＭ ＥＰＣは抑制したが、１μＭＥＰＵ、１
μＭ ＶitＥ、１μＭ ＶitＣはほとんど作用しなかっ
た。ここで、蛋白−ＤＮＡ複合体中の構成蛋白は各種Ｎ
ＦκＢ関連抗体とのインキュベートによるスーパーシフ
ト法により、p６５とp５０の二量体であることを確認し
た。以上の結果から、ＥＰＣはＴＮＦαによるＮＦκＢ
の活性化を抑制し、ＮＦκＢ応答性遺伝子の発現を負に
調節しうることが判明した。さらに、ＨＩＶ−ＬＴＲプ
ロモーターの誘導をも抑制したことは本化合物が、自己
免疫疾患、ＡＩＤＳをはじめとしたウイルス感染症の治
療薬として有効であることを示している。
ゲルシフト法を用いて検討した。Ｔ９８Ｇ細胞におい
て、構成的に発現するＮＦκＢは認めなかった。１nＭ
ＴＮＦαはＮＦκＢのＤＮＡ結合能を明らかに誘導し
た。さらに、ＴＮＦαによるＮＦκＢのＤＮＡ結合能の
誘導を１μＭ ＥＰＣは抑制したが、１μＭＥＰＵ、１
μＭ ＶitＥ、１μＭ ＶitＣはほとんど作用しなかっ
た。ここで、蛋白−ＤＮＡ複合体中の構成蛋白は各種Ｎ
ＦκＢ関連抗体とのインキュベートによるスーパーシフ
ト法により、p６５とp５０の二量体であることを確認し
た。以上の結果から、ＥＰＣはＴＮＦαによるＮＦκＢ
の活性化を抑制し、ＮＦκＢ応答性遺伝子の発現を負に
調節しうることが判明した。さらに、ＨＩＶ−ＬＴＲプ
ロモーターの誘導をも抑制したことは本化合物が、自己
免疫疾患、ＡＩＤＳをはじめとしたウイルス感染症の治
療薬として有効であることを示している。
【００１９】製剤実施例１内服錠 ＥＰＣ−Ｋ １００mg 乳糖 ７５mg デンプン ２０mg ポリエチレングリコール６０００ ５ｍｇ 以上の成分を常法により混和し、１錠分の錠剤とする。
必要に応じて糖衣を付してもよい。
必要に応じて糖衣を付してもよい。
【００２０】製剤実施例２ 以上の成分を常法により混和し無菌濾過する。濾液を無
菌的に５mlずつガラスアンプルに充填熔閉し、注射剤と
する。
菌的に５mlずつガラスアンプルに充填熔閉し、注射剤と
する。
【００２１】
【発明の効果】本発明の製剤は、ＥＰＣのＮＦκＢ活性
化を介する免疫系遺伝子の発現抑制による有用な抗ウイ
ルス活性を発揮する。
化を介する免疫系遺伝子の発現抑制による有用な抗ウイ
ルス活性を発揮する。
【図１】 試験例１におけるルシフェラーゼ法による活
性測定結果を示すグラフである。
性測定結果を示すグラフである。
【図２】 試験例１におけるゲルシフト法によるオート
ラジオグラムである。
ラジオグラムである。
【図３】 試験例１におけるＮＦκＢの遺伝子転写誘導
能に及ぼす影響を試験した結果を示すグラフである。
能に及ぼす影響を試験した結果を示すグラフである。
Claims (2)
- 【請求項１】 式： 【化１】 ［式中、Ｒ1およびＲ2は、同一または異なって水素原子
またはメチル基を示す。］で表されるリン酸ジエステル
化合物またはその薬理学的に許容できる塩を含有してな
る抗ウイルス剤。 - 【請求項２】 ＨＩＶウイルス感染症治療用である請求
項１記載の抗ウイルス剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26388695A JPH09110699A (ja) | 1995-10-12 | 1995-10-12 | 抗ウイルス剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26388695A JPH09110699A (ja) | 1995-10-12 | 1995-10-12 | 抗ウイルス剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09110699A true JPH09110699A (ja) | 1997-04-28 |
Family
ID=17395625
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26388695A Withdrawn JPH09110699A (ja) | 1995-10-12 | 1995-10-12 | 抗ウイルス剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09110699A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113164608A (zh) * | 2021-02-02 | 2021-07-23 | 学校法人日本医科大学 | 抗病毒剂 |
-
1995
- 1995-10-12 JP JP26388695A patent/JPH09110699A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113164608A (zh) * | 2021-02-02 | 2021-07-23 | 学校法人日本医科大学 | 抗病毒剂 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20030107 |