JPH0899998A - ｐ５３ａｓタンパク質およびそのための抗体 - Google Patents
ｐ５３ａｓタンパク質およびそのための抗体Info
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- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4746—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used p53
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 哺乳類の正常細胞に存在し、少なくともタン
パク質のカルボキシ末端の最後の５０アミノ酸までは同
じ哺乳類の既知の正常な成長調節タンパク質ｐ５３と本
質的に同一であるｐ５３ａｓと命名されるタンパク質に
対して特異的な抗体。 【効果】 本発明の抗体は、マウスおよびヒトのような
任意の特定の哺乳類のｐ５３ａｓに対して特異的であ
り、ｐ５３タンパク質およびｐ５３ａｓタンパク質が細
胞中で相互作用するかどうかの研究を可能にする。
パク質のカルボキシ末端の最後の５０アミノ酸までは同
じ哺乳類の既知の正常な成長調節タンパク質ｐ５３と本
質的に同一であるｐ５３ａｓと命名されるタンパク質に
対して特異的な抗体。 【効果】 本発明の抗体は、マウスおよびヒトのような
任意の特定の哺乳類のｐ５３ａｓに対して特異的であ
り、ｐ５３タンパク質およびｐ５３ａｓタンパク質が細
胞中で相互作用するかどうかの研究を可能にする。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ｐ５３タンパク質およ
びその変異体に関し、さらに特定すると、そのような変
異体に対する抗体に関する。
びその変異体に関し、さらに特定すると、そのような変
異体に対する抗体に関する。
【０００２】
【従来技術】ｐ５３タンパク質をコードするｐ５３遺伝
子は、全てのヒトのがんの半分以上において欠損してい
る。それがさらに重要であるのは、正常ｐ５３遺伝子を
各種のガン細胞に導入するとその成長を阻止するからで
ある。このように、ｐ５３遺伝子産物（即ち、ｐ５３タ
ンパク質）の欠損は多くのがんにおいて共通しており、
もしこれが直されれば、がん細胞の成長を阻害できるで
あろう。多くのヒトのがんにおいて、ｐ５３タンパク質
はｐ５３遺伝子の変異のために不活性である。一のアミ
ノ酸の置換はｐ５３タンパク質の正常な折りたたみを変
化させるのに十分であり、それを成長調節遺伝子として
不活性化する。ある種の細胞においては、変異型ｐ５３
タンパク質の折りたたみは細胞因子に結合することによ
って正常な立体配置において安定でありえるが、このこ
とはｐ５３タンパク質に結合してそれを正常な立体配置
において維持するようなペプチドを作ることが可能であ
るかもしれないということを示唆している（立体配置と
は折りたたみによって作られるタンパク質の形態であ
る；立体配置はアミノ酸配列の変化なしで（あるいは変
化とともに）変化しうる）。正常な立体配置はがん抑制
効果を有している。変異型ｐ５３立体配置を主に発現す
る細胞は活発な腫瘍を高頻度で生じさせる一方、正常な
立体配置のｐ５３タンパク質を主に発現する細胞は緩や
かに成長する腫瘍を低頻度で生じさせる。
子は、全てのヒトのがんの半分以上において欠損してい
る。それがさらに重要であるのは、正常ｐ５３遺伝子を
各種のガン細胞に導入するとその成長を阻止するからで
ある。このように、ｐ５３遺伝子産物（即ち、ｐ５３タ
ンパク質）の欠損は多くのがんにおいて共通しており、
もしこれが直されれば、がん細胞の成長を阻害できるで
あろう。多くのヒトのがんにおいて、ｐ５３タンパク質
はｐ５３遺伝子の変異のために不活性である。一のアミ
ノ酸の置換はｐ５３タンパク質の正常な折りたたみを変
化させるのに十分であり、それを成長調節遺伝子として
不活性化する。ある種の細胞においては、変異型ｐ５３
タンパク質の折りたたみは細胞因子に結合することによ
って正常な立体配置において安定でありえるが、このこ
とはｐ５３タンパク質に結合してそれを正常な立体配置
において維持するようなペプチドを作ることが可能であ
るかもしれないということを示唆している（立体配置と
は折りたたみによって作られるタンパク質の形態であ
る；立体配置はアミノ酸配列の変化なしで（あるいは変
化とともに）変化しうる）。正常な立体配置はがん抑制
効果を有している。変異型ｐ５３立体配置を主に発現す
る細胞は活発な腫瘍を高頻度で生じさせる一方、正常な
立体配置のｐ５３タンパク質を主に発現する細胞は緩や
かに成長する腫瘍を低頻度で生じさせる。
【０００３】これまでに、ｐ５３タンパク質およびその
機能についての研究の多くは、それに対する特異的な
（ＰＡｂ４２１）抗体に依存していた。ＤＮＡに対する
結合または転写の調節の生体外（in vitro）（無細胞
系）分析を使用して研究されてきた大部分のｐ５３タン
パク質は、ＰＡｂ４２１を使用して精製されたｐ５３タ
ンパク質を使用しており、他のタンパク質は排除されて
いた。今日までに検出しうるｐ５３の結合は配列特異的
である一方、その効率は低い。図１に示すように、ｐ５
３のカルボキシル末端の修飾によるＤＮＡへの結合に関
するｐ５３タンパク質の活性化のためのモデルが提案さ
れている（Hupp et al. (1922) "Regulationof the spe
cific DNA binding function of P53", Cell 71, 875-8
86 ）。修飾には、タンパク質加水分解（カルボキシル
末端アミノ酸の損失）、この領域におけるセリンのリン
酸化またはこの領域内のＰＡｂ４２１抗体の結合が含ま
れる。ｐ５３ａｓＲＮＡが、正常マウス細胞および組織
中並びに腫瘍細胞中に存在していることが示されたが
（Han et al. (b) (1992), "Alternatively spliced p5
3 RNA in transformed and normal cells of different
tissue types", Nucleic Acids Res., 20 (8), 1979-1
981 ）、しかしながら、これまでの所、このＲＮＡによ
ってコードされるタンパク質は見つかっていない。
機能についての研究の多くは、それに対する特異的な
（ＰＡｂ４２１）抗体に依存していた。ＤＮＡに対する
結合または転写の調節の生体外（in vitro）（無細胞
系）分析を使用して研究されてきた大部分のｐ５３タン
パク質は、ＰＡｂ４２１を使用して精製されたｐ５３タ
ンパク質を使用しており、他のタンパク質は排除されて
いた。今日までに検出しうるｐ５３の結合は配列特異的
である一方、その効率は低い。図１に示すように、ｐ５
３のカルボキシル末端の修飾によるＤＮＡへの結合に関
するｐ５３タンパク質の活性化のためのモデルが提案さ
れている（Hupp et al. (1922) "Regulationof the spe
cific DNA binding function of P53", Cell 71, 875-8
86 ）。修飾には、タンパク質加水分解（カルボキシル
末端アミノ酸の損失）、この領域におけるセリンのリン
酸化またはこの領域内のＰＡｂ４２１抗体の結合が含ま
れる。ｐ５３ａｓＲＮＡが、正常マウス細胞および組織
中並びに腫瘍細胞中に存在していることが示されたが
（Han et al. (b) (1992), "Alternatively spliced p5
3 RNA in transformed and normal cells of different
tissue types", Nucleic Acids Res., 20 (8), 1979-1
981 ）、しかしながら、これまでの所、このＲＮＡによ
ってコードされるタンパク質は見つかっていない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、本発明
者らは、本明細書中においてｐ５３ａｓと命名されるタ
ンパク質を発見し精製した。ｐ５３ａｓをコードする配
列を含むプラスミドを含む大腸菌（E. coli)は、アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣ
Ｃ），12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20
852 にＡＴＣＣ受託番号６９６５７とともに寄託され
た。ｐ５３ａｓタンパク質は哺乳類の正常細胞に存在
し、少なくともタンパク質のカルボキシ末端の最後の５
０アミノ酸までは同じ哺乳類の既知の正常な成長調節タ
ンパク質ｐ５３と本質的に同一である。「本質的に同一
である」とは、少なくとも８０％、好ましくは少なくと
も９０％の配列相同性を意味する。ヒトおよびマウスの
ｐ５３はタンパク質レベルで８１％の同一性を共有し、
高度に酸性的なＮ末端、塩基性的なＣ末端および未電荷
アミノ酸を含む中央領域を有している。
者らは、本明細書中においてｐ５３ａｓと命名されるタ
ンパク質を発見し精製した。ｐ５３ａｓをコードする配
列を含むプラスミドを含む大腸菌（E. coli)は、アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣ
Ｃ），12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20
852 にＡＴＣＣ受託番号６９６５７とともに寄託され
た。ｐ５３ａｓタンパク質は哺乳類の正常細胞に存在
し、少なくともタンパク質のカルボキシ末端の最後の５
０アミノ酸までは同じ哺乳類の既知の正常な成長調節タ
ンパク質ｐ５３と本質的に同一である。「本質的に同一
である」とは、少なくとも８０％、好ましくは少なくと
も９０％の配列相同性を意味する。ヒトおよびマウスの
ｐ５３はタンパク質レベルで８１％の同一性を共有し、
高度に酸性的なＮ末端、塩基性的なＣ末端および未電荷
アミノ酸を含む中央領域を有している。
【０００５】本発明はさらにタンパク質ｐ５３ａｓに特
異的な抗体を含み、本抗体は本明細書中においてＡｂｐ
５３ａｓと命名される。本抗体はモノクローナル抗体あ
るいはポリクローナル抗体のどちらでもよく、マウスお
よびヒトのような任意の特定の哺乳類のｐ５３ａｓに特
異的であるかもしれない。ｐ５３ａｓタンパク質のカル
ボキシル末端側のｐ５３ａｓタンパク質の最後の５０ア
ミノ酸は、ｐ５３タンパク質の最後の５０アミノ酸とは
少なくとも部分的には相違している。この相違は、少な
くとも一部は、タンパク質のカルボキシル末端側の２つ
のタンパク質におけるアミノ酸配列の相違によるもので
あり、また一部は、ｐ５３と比較した場合ｐ５３ａｓの
アミノ酸鎖の方がより長いことあるいはより短いことに
よるものである。ｐ５３ａｓのカルボキシル末端のもっ
とも共通かつ本当らしい最後の数アミノ酸は配列ＳＰＮ
ＣおよびＳＰＰＣを含んでいると考えられる。
異的な抗体を含み、本抗体は本明細書中においてＡｂｐ
５３ａｓと命名される。本抗体はモノクローナル抗体あ
るいはポリクローナル抗体のどちらでもよく、マウスお
よびヒトのような任意の特定の哺乳類のｐ５３ａｓに特
異的であるかもしれない。ｐ５３ａｓタンパク質のカル
ボキシル末端側のｐ５３ａｓタンパク質の最後の５０ア
ミノ酸は、ｐ５３タンパク質の最後の５０アミノ酸とは
少なくとも部分的には相違している。この相違は、少な
くとも一部は、タンパク質のカルボキシル末端側の２つ
のタンパク質におけるアミノ酸配列の相違によるもので
あり、また一部は、ｐ５３と比較した場合ｐ５３ａｓの
アミノ酸鎖の方がより長いことあるいはより短いことに
よるものである。ｐ５３ａｓのカルボキシル末端のもっ
とも共通かつ本当らしい最後の数アミノ酸は配列ＳＰＮ
ＣおよびＳＰＰＣを含んでいると考えられる。
【０００６】図面の説明 図１は、ｐ５３タンパク質によるＤＮＡ結合の活性化に
ついての提唱された機構の図解を示す。図２は、ｐ５３
ａｓタンパク質の活性のための提唱された機構について
の図解を示す。図３は、選択的スプライシングによって
導入された変化を示すｐ５３タンパク質のドメイン地図
である。マウスｐ５３は３９０アミノ酸を有する。ドメ
イン（Vogelstein et al., (1992), "p53 function and
dysfunction", Cell 70, 523-526 を参照、本文献は本
明細書中に引用される）は以下の通りである： ＡＣＴ；転写活性化ドメイン ＨＳＰ；変異体ｐ５３の熱ショックタンパク質結合領域 ＨＯＴスポット；大部分の形質転換変異が生じるような
ｐ５３タンパク質中の高度保存領域 ＰＡｂ２４０；一定の変異型に立体配置特異的な抗体が
結合する領域、ネズミ科（murine）アミノ酸１５６−２
１４ ＰＡｂ２４６：正常野性型立体配置に対する抗体が結合
する領域、ネズミ科アミノ酸８８−１０９ ＰＡｂ４２１：野性型および変異型立体配置に対する抗
体が結合する領域、アミノ酸３７０−３７８ ＮＵＣ：核局在シグナル ＣＤＣ２キナーゼセリンリン酸化部位；ＣＫ２カゼイン
キナーゼセリンリン酸化部位、これもまた５．８ｒＲＮ
Ａ結合の部位である ＯＬＩＧＯ：ｐ５３自己結合の部位。
ついての提唱された機構の図解を示す。図２は、ｐ５３
ａｓタンパク質の活性のための提唱された機構について
の図解を示す。図３は、選択的スプライシングによって
導入された変化を示すｐ５３タンパク質のドメイン地図
である。マウスｐ５３は３９０アミノ酸を有する。ドメ
イン（Vogelstein et al., (1992), "p53 function and
dysfunction", Cell 70, 523-526 を参照、本文献は本
明細書中に引用される）は以下の通りである： ＡＣＴ；転写活性化ドメイン ＨＳＰ；変異体ｐ５３の熱ショックタンパク質結合領域 ＨＯＴスポット；大部分の形質転換変異が生じるような
ｐ５３タンパク質中の高度保存領域 ＰＡｂ２４０；一定の変異型に立体配置特異的な抗体が
結合する領域、ネズミ科（murine）アミノ酸１５６−２
１４ ＰＡｂ２４６：正常野性型立体配置に対する抗体が結合
する領域、ネズミ科アミノ酸８８−１０９ ＰＡｂ４２１：野性型および変異型立体配置に対する抗
体が結合する領域、アミノ酸３７０−３７８ ＮＵＣ：核局在シグナル ＣＤＣ２キナーゼセリンリン酸化部位；ＣＫ２カゼイン
キナーゼセリンリン酸化部位、これもまた５．８ｒＲＮ
Ａ結合の部位である ＯＬＩＧＯ：ｐ５３自己結合の部位。
【０００７】選択的にスプライスされた野性型（Han et
al., (b) (1992), supra)または変異型ｐ５３ｍＲＮＡ
（Arai et al., (1986) "Immunologically distinct p5
3 molecules generated by alternative splicing", Mo
l. and Cell. Biol., 6, 3232-3239）から翻訳されたタ
ンパク質のＣ末端領域における予期される変化が示され
ている。ｐ５３ａｓのｍＲＮＡ中に保持されているイン
トロン１０の断片はエキソンの間に三角形として示され
ている。（予期されるα−ヘリックススパニング３３４
−３５６内の）酸性アミノ酸および（位置３６３−３８
６の間で、Ｃ末端ペプチド配列中で底に線が引かれてい
る）塩基性アミノ酸を、Sturzbecher et al. (1992),
"A C-terminal a -herix plus basic region motif is
the major structural determinant of p53 tetrameriz
ation",Oncogene 7, 1513-1523 に従って標識する。
al., (b) (1992), supra)または変異型ｐ５３ｍＲＮＡ
（Arai et al., (1986) "Immunologically distinct p5
3 molecules generated by alternative splicing", Mo
l. and Cell. Biol., 6, 3232-3239）から翻訳されたタ
ンパク質のＣ末端領域における予期される変化が示され
ている。ｐ５３ａｓのｍＲＮＡ中に保持されているイン
トロン１０の断片はエキソンの間に三角形として示され
ている。（予期されるα−ヘリックススパニング３３４
−３５６内の）酸性アミノ酸および（位置３６３−３８
６の間で、Ｃ末端ペプチド配列中で底に線が引かれてい
る）塩基性アミノ酸を、Sturzbecher et al. (1992),
"A C-terminal a -herix plus basic region motif is
the major structural determinant of p53 tetrameriz
ation",Oncogene 7, 1513-1523 に従って標識する。
【０００８】図４は、ＥＬＩＳＡによって検出された抗
−ｐ５３ａｓ血清およびアフィニティー精製抗体のｐ５
３ａｓペプチドとの反応性のグラフを示す。ニュージー
ランド白雌ラビットをｐ５３ａｓのＣ末端１７アミノ酸
に等しいペプチドで免疫した。ｐ５３ａｓペプチドはRP
CIバイオポリマー機関（Biopolymer facility ）で合成
し、免疫感作はRPCI Springville Laboratories で行っ
た。ＥＬＩＳＡプレートを２μｇのペプチドで被覆し、
免疫前の血清または６３日免疫血清を１／５００から１
／６４０，０００（１／２希釈）と反応させ、ペルオキ
シダーゼ結合アフィニティー単離ヤギ抗ラビット免疫グ
ロブリンと反応させた。全免疫血清（白丸）または（ペ
プチドに対する）アフィニティー精製抗ｐ５３ａｓ抗体
（黒丸）を一次抗体として使用し、全免疫前血清（白四
角）または硫酸アンモニウム沈澱ＩｇＧ画分（黒四角）
を対照として使用した。
−ｐ５３ａｓ血清およびアフィニティー精製抗体のｐ５
３ａｓペプチドとの反応性のグラフを示す。ニュージー
ランド白雌ラビットをｐ５３ａｓのＣ末端１７アミノ酸
に等しいペプチドで免疫した。ｐ５３ａｓペプチドはRP
CIバイオポリマー機関（Biopolymer facility ）で合成
し、免疫感作はRPCI Springville Laboratories で行っ
た。ＥＬＩＳＡプレートを２μｇのペプチドで被覆し、
免疫前の血清または６３日免疫血清を１／５００から１
／６４０，０００（１／２希釈）と反応させ、ペルオキ
シダーゼ結合アフィニティー単離ヤギ抗ラビット免疫グ
ロブリンと反応させた。全免疫血清（白丸）または（ペ
プチドに対する）アフィニティー精製抗ｐ５３ａｓ抗体
（黒丸）を一次抗体として使用し、全免疫前血清（白四
角）または硫酸アンモニウム沈澱ＩｇＧ画分（黒四角）
を対照として使用した。
【０００９】図５は５３ｋｄタンパク質の抗ｐ５３ａｓ
免疫沈降を示す。扁平細胞がん株291.03RAT からのｐ５
３ａｓの免疫沈降：35Ｓメチオニン標識細胞を溶解し、
２×１０7 ｃｐｍの溶解物を以下に示す抗血清の抗体と
反応させた：ＡｐＡｓはアフィニティー精製抗−ｐ５３
ａｓを示す；Ｐｒｅ−Ｉは免疫前ラビット血清を示す；
ＰＡｂ４２１はｐ５３ａｓに存在しないエピトープに対
する抗−ｐ５３抗体を示す；ＩｇＧ２ａはＰＡｂ４２１
に対するマウスＩｇＧイディオタイプ対照を示す；ＣＭ
−５はｐ５３およびｐ５３ａｓタンパク質の両方と反応
するラビットポリクローナル抗−ｐ５３抗体を示す；Ｍ
Ｗは標準分子量（ｋｄ）を示す。８５℃で５分間加熱す
ることによって抗体複合体から分離した後に、タンパク
質を実験操作で記載するように電気泳動によって溶解し
た。５３ｋｄのタンパク質がＰＡｂ４２１およびアフィ
ニティー精製抗−ｐ５３ａｓ（ＡｐＡｓ）およびラビッ
トポリクローナル抗−ｐ５３血清ＣＭ５によって検出で
きた。
免疫沈降を示す。扁平細胞がん株291.03RAT からのｐ５
３ａｓの免疫沈降：35Ｓメチオニン標識細胞を溶解し、
２×１０7 ｃｐｍの溶解物を以下に示す抗血清の抗体と
反応させた：ＡｐＡｓはアフィニティー精製抗−ｐ５３
ａｓを示す；Ｐｒｅ−Ｉは免疫前ラビット血清を示す；
ＰＡｂ４２１はｐ５３ａｓに存在しないエピトープに対
する抗−ｐ５３抗体を示す；ＩｇＧ２ａはＰＡｂ４２１
に対するマウスＩｇＧイディオタイプ対照を示す；ＣＭ
−５はｐ５３およびｐ５３ａｓタンパク質の両方と反応
するラビットポリクローナル抗−ｐ５３抗体を示す；Ｍ
Ｗは標準分子量（ｋｄ）を示す。８５℃で５分間加熱す
ることによって抗体複合体から分離した後に、タンパク
質を実験操作で記載するように電気泳動によって溶解し
た。５３ｋｄのタンパク質がＰＡｂ４２１およびアフィ
ニティー精製抗−ｐ５３ａｓ（ＡｐＡｓ）およびラビッ
トポリクローナル抗−ｐ５３血清ＣＭ５によって検出で
きた。
【００１０】図６はｐ５３ａｓ抗原活性の核局在を示す
免疫蛍光フィールドを示す。細胞をガラスカバースリッ
プ上に１．５×１０4 細胞／cm2 の割合で植え、約７０
％の集密になるまで成長させた。核反応性を１００％エ
タノールで固定した細胞の間接免疫蛍光分析においてア
フィニティー精製抗−ＡＳｐ５３抗体を使用して検出し
た（Ａ）。この反応性は、（重量）比１：１のｐ５３ａ
ｓタンパク質のＣ末端に対応する１７アミノ酸ペプチド
によって、競合により完全に阻害された（Ｃ）。無関連
１６アミノ酸ペプチドの比が１０：１になるまでは競合
は明白ではなかった（Ｅ）。免疫蛍光フィールドに対応
する位相差光学写真を右側に示す（Ｂ、Ｄ、Ｆ）。結果
は全ての上皮細胞株に関して同様であった（291.03RAT
のトランスフェクタントクローン１１９が示されてい
る）。ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１または硫酸アンモニウム分
画免疫前血清対照における蛍光は無視できた（データは
示されていない）。バーは１５μｍに等しい。
免疫蛍光フィールドを示す。細胞をガラスカバースリッ
プ上に１．５×１０4 細胞／cm2 の割合で植え、約７０
％の集密になるまで成長させた。核反応性を１００％エ
タノールで固定した細胞の間接免疫蛍光分析においてア
フィニティー精製抗−ＡＳｐ５３抗体を使用して検出し
た（Ａ）。この反応性は、（重量）比１：１のｐ５３ａ
ｓタンパク質のＣ末端に対応する１７アミノ酸ペプチド
によって、競合により完全に阻害された（Ｃ）。無関連
１６アミノ酸ペプチドの比が１０：１になるまでは競合
は明白ではなかった（Ｅ）。免疫蛍光フィールドに対応
する位相差光学写真を右側に示す（Ｂ、Ｄ、Ｆ）。結果
は全ての上皮細胞株に関して同様であった（291.03RAT
のトランスフェクタントクローン１１９が示されてい
る）。ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１または硫酸アンモニウム分
画免疫前血清対照における蛍光は無視できた（データは
示されていない）。バーは１５μｍに等しい。
【００１１】図７は、増殖している（ＬＣ）または分化
している（ＨＣ）未形質転換親２９１細胞からの、およ
び291.03RAT （０３ＲＡＴ）がん細胞または変異型ｐ５
３（バリン−１３５）をトランスフェクトしたその誘導
クローン１１９からのｐ５３の競合免疫沈降を示す。細
胞溶解物をＮＥＴ／ＧＥＬ中で２μｇのＰＡｂ４２１、
４μのＰＡｂ２４６または１．４μの抗−ｐ５３ａｓ
（ＡｐＡｓ）とインキュベートする。免疫複合体を５ｍ
ｇのプロテインＡと４℃で２時間インキュベートし、遠
心し、免疫沈降されたタンパク質を８５℃で１５分間加
熱しながらペレットから溶出した。遠心後、上清中のタ
ンパク質を１０％ポリアクリルアミド変性ゲル上で、標
準分子量（ＭＷ、ｋｄ）とともに電気泳動することによ
って分離した。クローン１１９中の免疫沈降可能なｐ５
３ａｓタンパク質は、トランスフェクトされた変異型転
写物から、あるいは内生の野性型ｐ５３ａｓＲＮＡから
生じえた。細胞株中の特定の抗体反応性の比較を助ける
ために、各レーン中のｐ５３シグナルの強度を、２９１
ＬＣのＡｐＡｓ反応性を１として相対的に表す（各レー
ンの底の数字）。
している（ＨＣ）未形質転換親２９１細胞からの、およ
び291.03RAT （０３ＲＡＴ）がん細胞または変異型ｐ５
３（バリン−１３５）をトランスフェクトしたその誘導
クローン１１９からのｐ５３の競合免疫沈降を示す。細
胞溶解物をＮＥＴ／ＧＥＬ中で２μｇのＰＡｂ４２１、
４μのＰＡｂ２４６または１．４μの抗−ｐ５３ａｓ
（ＡｐＡｓ）とインキュベートする。免疫複合体を５ｍ
ｇのプロテインＡと４℃で２時間インキュベートし、遠
心し、免疫沈降されたタンパク質を８５℃で１５分間加
熱しながらペレットから溶出した。遠心後、上清中のタ
ンパク質を１０％ポリアクリルアミド変性ゲル上で、標
準分子量（ＭＷ、ｋｄ）とともに電気泳動することによ
って分離した。クローン１１９中の免疫沈降可能なｐ５
３ａｓタンパク質は、トランスフェクトされた変異型転
写物から、あるいは内生の野性型ｐ５３ａｓＲＮＡから
生じえた。細胞株中の特定の抗体反応性の比較を助ける
ために、各レーン中のｐ５３シグナルの強度を、２９１
ＬＣのＡｐＡｓ反応性を１として相対的に表す（各レー
ンの底の数字）。
【００１２】図８は、アクチノマイシンＤによる処理後
の291.05RAT がん細胞中のｐ５３ＲＮＡのノーザンブロ
ットを示す。細胞を０．５ｎＭのアクチノマイシンＤま
たは０．２％アセトンに４８時間露出した後に回収し、
ＲＮＡを実験操作に詳述したように抽出した。７ＳＲＮ
Ａとの比較によって荷重のために調整された、強度計に
よって検出しうるシグナル中の倍数増加を示す。
の291.05RAT がん細胞中のｐ５３ＲＮＡのノーザンブロ
ットを示す。細胞を０．５ｎＭのアクチノマイシンＤま
たは０．２％アセトンに４８時間露出した後に回収し、
ＲＮＡを実験操作に詳述したように抽出した。７ＳＲＮ
Ａとの比較によって荷重のために調整された、強度計に
よって検出しうるシグナル中の倍数増加を示す。
【００１３】図９Ａから図９Ｆは291.05RAT がん細胞中
におけるｐ５３（ＰＡｂ４２１）およびｐ５３ａｓ抗原
活性の発現を示す。細胞を０．５ｎＭのアクチノマイシ
ンＤで２日間処理し、トリプシン処理によって採取し
た。細胞を、一次抗体対照（上段左）を除いて示された
すべての場合において、（同じチューブ中で）抗−ｐ５
３ａｓおよびＰＡｂ４２１抗体とともに懸濁液中で浸透
させ染色した。上段から中段の３枚のドットプロット、
即ち図９Ａから図９Ｃにおいては、Ｘ軸上のＦＬ１蛍光
強度はＦＩＴＣ（緑）であり、ＰＡｂ４２１反応性を視
覚化するために使用したものであり、Ｙ軸上のＦＬ２蛍
光強度はフィコエリトリン（赤）であり、抗−ｐ５３ａ
ｓ反応性を視覚化するために使用したものである。細胞
のインキュベーションの前に、抗−ｐ５３ａｓ抗体を、
特異的抗−ｐ５３ａｓ反応性を競合的に除去するｐ５３
ａｓペプチドか、あるいはペプチドに対する非特異的結
合を調節する未関連ペプチドのどちらかに露出し、ｐ５
３ａｓタンパク質に対する特異的な反応性のみを残し
た。流動細胞計測法によって集められた事象は、実験操
作に記載したように単一の細胞のみであった。ＩｇＧ２
ａおよび免疫前対照に基づく全細胞データを整合して４
つの領域を描写した：両方の抗体にネガティブ（Ｒ
４）、抗−ｐ５３ａｓのみポジティブ（Ｒ１）、ＰＡｂ
４２１および抗−ｐ５３ａｓにポジティブ（Ｒ２）およ
びＰＡｂ４２１のみポジティブ（Ｒ３）。チューブ当た
り１０，０００の全事象のファイルを回収した後
（（Ａ）から（Ｃ）の３枚のドットプロット中に示され
るように）、さらなるゲートをセットし、ネガティブ細
胞（Ｒ４）を除去し、ＰＡｂ４２１にポジティブな細胞
の回収を最大化したり（棒グラフＲ３に示す）、あるい
は抗−ｐ５３ａｓにポジティブな細胞（Ｒ２）の回収を
最大化するためにネガティブな細胞（Ｒ４）およびＰＡ
ｂ４２１にのみポジティブな細胞（Ｒ３）を除去した。
各領域（Ｒ２からＲ４、図９Ｄから図９Ｆ）からの事象
の細胞周期分布を（Ｄ）から（Ｆ）の３つの棒グラフ中
に示す。全細胞の百分率として表現されている各領域の
細胞数は以下の通りである：未関連ペプチド、Ｒ１：
０．０２、Ｒ２、１．７、Ｒ３、１７およびＲ４、７９
（合計数は、四捨五入誤差および分析に含まれる窓の外
の無視しうる事象数のせいで１００にはならない。）；
ｐ５３ａｓペプチド、Ｒ１、０．０２、Ｒ２、０．０
５、Ｒ３、１９、Ｒ４、７９。細胞周期の各段階におけ
る細胞の百分率および示されている棒グラフ中の各領域
の総事象数（ｎ）は以下の通りである：Ｒ２、Ｇ０／Ｇ
１、１９、Ｓ、１３、Ｇ２／Ｍ、２５および＞Ｇ２／
Ｍ、４３、ｎ＝２２２４；Ｒ３、Ｇ０／Ｇ１、３８、
Ｓ、１６、Ｇ２／Ｍ、３３および＞Ｇ２／Ｍ、１２、ｎ
＝６８７９；Ｒ４、Ｇ０／Ｇ１、６０、Ｓ、１８、Ｇ２
／Ｍ、２１および＞Ｇ２／Ｍ、１、ｎ＝７９２５。
におけるｐ５３（ＰＡｂ４２１）およびｐ５３ａｓ抗原
活性の発現を示す。細胞を０．５ｎＭのアクチノマイシ
ンＤで２日間処理し、トリプシン処理によって採取し
た。細胞を、一次抗体対照（上段左）を除いて示された
すべての場合において、（同じチューブ中で）抗−ｐ５
３ａｓおよびＰＡｂ４２１抗体とともに懸濁液中で浸透
させ染色した。上段から中段の３枚のドットプロット、
即ち図９Ａから図９Ｃにおいては、Ｘ軸上のＦＬ１蛍光
強度はＦＩＴＣ（緑）であり、ＰＡｂ４２１反応性を視
覚化するために使用したものであり、Ｙ軸上のＦＬ２蛍
光強度はフィコエリトリン（赤）であり、抗−ｐ５３ａ
ｓ反応性を視覚化するために使用したものである。細胞
のインキュベーションの前に、抗−ｐ５３ａｓ抗体を、
特異的抗−ｐ５３ａｓ反応性を競合的に除去するｐ５３
ａｓペプチドか、あるいはペプチドに対する非特異的結
合を調節する未関連ペプチドのどちらかに露出し、ｐ５
３ａｓタンパク質に対する特異的な反応性のみを残し
た。流動細胞計測法によって集められた事象は、実験操
作に記載したように単一の細胞のみであった。ＩｇＧ２
ａおよび免疫前対照に基づく全細胞データを整合して４
つの領域を描写した：両方の抗体にネガティブ（Ｒ
４）、抗−ｐ５３ａｓのみポジティブ（Ｒ１）、ＰＡｂ
４２１および抗−ｐ５３ａｓにポジティブ（Ｒ２）およ
びＰＡｂ４２１のみポジティブ（Ｒ３）。チューブ当た
り１０，０００の全事象のファイルを回収した後
（（Ａ）から（Ｃ）の３枚のドットプロット中に示され
るように）、さらなるゲートをセットし、ネガティブ細
胞（Ｒ４）を除去し、ＰＡｂ４２１にポジティブな細胞
の回収を最大化したり（棒グラフＲ３に示す）、あるい
は抗−ｐ５３ａｓにポジティブな細胞（Ｒ２）の回収を
最大化するためにネガティブな細胞（Ｒ４）およびＰＡ
ｂ４２１にのみポジティブな細胞（Ｒ３）を除去した。
各領域（Ｒ２からＲ４、図９Ｄから図９Ｆ）からの事象
の細胞周期分布を（Ｄ）から（Ｆ）の３つの棒グラフ中
に示す。全細胞の百分率として表現されている各領域の
細胞数は以下の通りである：未関連ペプチド、Ｒ１：
０．０２、Ｒ２、１．７、Ｒ３、１７およびＲ４、７９
（合計数は、四捨五入誤差および分析に含まれる窓の外
の無視しうる事象数のせいで１００にはならない。）；
ｐ５３ａｓペプチド、Ｒ１、０．０２、Ｒ２、０．０
５、Ｒ３、１９、Ｒ４、７９。細胞周期の各段階におけ
る細胞の百分率および示されている棒グラフ中の各領域
の総事象数（ｎ）は以下の通りである：Ｒ２、Ｇ０／Ｇ
１、１９、Ｓ、１３、Ｇ２／Ｍ、２５および＞Ｇ２／
Ｍ、４３、ｎ＝２２２４；Ｒ３、Ｇ０／Ｇ１、３８、
Ｓ、１６、Ｇ２／Ｍ、３３および＞Ｇ２／Ｍ、１２、ｎ
＝６８７９；Ｒ４、Ｇ０／Ｇ１、６０、Ｓ、１８、Ｇ２
／Ｍ、２１および＞Ｇ２／Ｍ、１、ｎ＝７９２５。
【００１４】図１０Ａから図１０Ｆは291.05RAT がん細
胞におけるｐ５３（ＰＡｂ４２１）およびｐ５３ａｓ抗
原活性の発現を示す。細胞を細胞成長に有利である低Ｃ
ａ2+濃度（ＬＣ）下で培養した。処理および分析は図９
Ａから図９Ｆにおけるがん細胞の場合と同様にした。ド
ットプロットを図１０Ａから図１０Ｃに示し、棒グラフ
を図１０Ｄから図１０Ｆに示す。全細胞の百分率として
表現した各領域における細胞数は以下の通りである：未
関連ペプチド、Ｒ１、１．２、Ｒ２、２、Ｒ３、４およ
びＲ４、９２；ｐ５３ａｓペプチド、Ｒ１、０．１、Ｒ
２、０．１、Ｒ３、５、Ｒ４、９４。細胞周期の各段階
における対照細胞の百分率および示されている棒グラフ
中の各領域の総事象数（ｎ）は以下の通りである：Ｒ
２、Ｇ０／Ｇ１、２９、Ｓ、１１、Ｇ２／Ｍ、３５およ
び＞Ｇ２／Ｍ、２５、ｎ＝１０７４；Ｒ３、Ｇ０／Ｇ
１、６１、Ｓ、１５、Ｇ２／Ｍ、２２および＞Ｇ２／
Ｍ、２、ｎ＝１９７４；Ｒ４、Ｇ０／Ｇ１、７８、Ｓ、
１１、Ｇ２／Ｍ、１１および＞Ｇ２／Ｍ、０．０４、ｎ
＝９１９４。
胞におけるｐ５３（ＰＡｂ４２１）およびｐ５３ａｓ抗
原活性の発現を示す。細胞を細胞成長に有利である低Ｃ
ａ2+濃度（ＬＣ）下で培養した。処理および分析は図９
Ａから図９Ｆにおけるがん細胞の場合と同様にした。ド
ットプロットを図１０Ａから図１０Ｃに示し、棒グラフ
を図１０Ｄから図１０Ｆに示す。全細胞の百分率として
表現した各領域における細胞数は以下の通りである：未
関連ペプチド、Ｒ１、１．２、Ｒ２、２、Ｒ３、４およ
びＲ４、９２；ｐ５３ａｓペプチド、Ｒ１、０．１、Ｒ
２、０．１、Ｒ３、５、Ｒ４、９４。細胞周期の各段階
における対照細胞の百分率および示されている棒グラフ
中の各領域の総事象数（ｎ）は以下の通りである：Ｒ
２、Ｇ０／Ｇ１、２９、Ｓ、１１、Ｇ２／Ｍ、３５およ
び＞Ｇ２／Ｍ、２５、ｎ＝１０７４；Ｒ３、Ｇ０／Ｇ
１、６１、Ｓ、１５、Ｇ２／Ｍ、２２および＞Ｇ２／
Ｍ、２、ｎ＝１９７４；Ｒ４、Ｇ０／Ｇ１、７８、Ｓ、
１１、Ｇ２／Ｍ、１１および＞Ｇ２／Ｍ、０．０４、ｎ
＝９１９４。
【００１５】本発明によると、本発明者は今や野性型
（正常）ｐ５３タンパク質の新規な形態を発見し、それ
が未形質転換マウス細胞株およびマウス扁平がん細胞中
に存在していることを証明した。ｐ５３ａｓ（選択的に
スプライスされたｐ５３）と命名されたそれは、ｐ５３
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の修飾中の正常な変
化から生じる。野性型の選択的にスプライスされたｐ５
３（ｐ５３ａｓ）ＲＮＡが主要ｐ５３ＲＮＡ形態の約２
５から３３％の割合でマウス培養細胞および正常マウス
組織に存在することは以前に証明されていた。選択的Ｒ
ＮＡ転写物はイントロン１０配列の選択的スプライシン
グのせいで主要転写産物よりも９６ｎｔ長いことが分か
っていた。今や、ｐ５３ａｓタンパク質が未形質転換が
ん（malignant ）上皮細胞中に存在し、主要ｐ５３タン
パク質とともに核に局在しているということが確定し
た。ｐ５３ａｓ転写産物から生成することが予期される
タンパク質は主要ｐ５３タンパク質より９アミノ酸短
く、カルボキシル末端に１７の異なるアミノ酸を有して
いる。さらに、ｐ５３ａｓタンパク質は、Ｇ１で優先的
に発現する主要ｐ５３タンパク質と比較した場合、細胞
周期のＧ２期中に、そしてより大きなＧ２ＤＮＡ含量を
有する細胞中で優先的に発現する。ｐ５３ａｓ免疫反応
性は、未形質転換の悪性ではない細胞のアクチノマイシ
ンＤ処理後に、上昇し細胞周期のＧ１期に移動する。自
身のＤＮＡ結合活性および転写活性化活性に必要である
かもしれないｐ５３タンパク質の二量体化および四量体
化の点から見て、細胞中におけるｐ５３ａｓタンパク質
の存在はｐ５３遺伝子の生理的機能を理解するために重
要な意味を有している。
（正常）ｐ５３タンパク質の新規な形態を発見し、それ
が未形質転換マウス細胞株およびマウス扁平がん細胞中
に存在していることを証明した。ｐ５３ａｓ（選択的に
スプライスされたｐ５３）と命名されたそれは、ｐ５３
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の修飾中の正常な変
化から生じる。野性型の選択的にスプライスされたｐ５
３（ｐ５３ａｓ）ＲＮＡが主要ｐ５３ＲＮＡ形態の約２
５から３３％の割合でマウス培養細胞および正常マウス
組織に存在することは以前に証明されていた。選択的Ｒ
ＮＡ転写物はイントロン１０配列の選択的スプライシン
グのせいで主要転写産物よりも９６ｎｔ長いことが分か
っていた。今や、ｐ５３ａｓタンパク質が未形質転換が
ん（malignant ）上皮細胞中に存在し、主要ｐ５３タン
パク質とともに核に局在しているということが確定し
た。ｐ５３ａｓ転写産物から生成することが予期される
タンパク質は主要ｐ５３タンパク質より９アミノ酸短
く、カルボキシル末端に１７の異なるアミノ酸を有して
いる。さらに、ｐ５３ａｓタンパク質は、Ｇ１で優先的
に発現する主要ｐ５３タンパク質と比較した場合、細胞
周期のＧ２期中に、そしてより大きなＧ２ＤＮＡ含量を
有する細胞中で優先的に発現する。ｐ５３ａｓ免疫反応
性は、未形質転換の悪性ではない細胞のアクチノマイシ
ンＤ処理後に、上昇し細胞周期のＧ１期に移動する。自
身のＤＮＡ結合活性および転写活性化活性に必要である
かもしれないｐ５３タンパク質の二量体化および四量体
化の点から見て、細胞中におけるｐ５３ａｓタンパク質
の存在はｐ５３遺伝子の生理的機能を理解するために重
要な意味を有している。
【００１６】ｐ５３ａｓタンパク質は、ｐ５３と同様
に、細胞の成長および成熟の研究、正常細胞と異常細胞
の成長の検出に使用してもよく、また異常に成長する細
胞の細胞成長を正常化するために使用してもよいと考え
られる。これ以後、現在までに認識されているｐ５３タ
ンパク質は、ｐ５３の主要形態または単純ｐ５３という
ことになろう：このことは、ｐ５３ａｓがｐ５３より比
較的高い量で存在しているかもしれない細胞型の存在を
除外するものではない。ＤＮＡはＲＮＡに転写され、そ
れからイントロンと呼ばれる断片の除去によって加工さ
れ、タンパク質をコードする成熟メッセンジャーＲＮＡ
が生ずる。選択的スプライシングにおいては、イントロ
ンの断片は（選択的にスプライスされたメッセンジャー
ＲＮＡと呼ばれる）コード配列中に保持され、主要形態
のタンパク質とは部分的に異なるタンパク質を作る。マ
ウス正常および腫瘍細胞中に見出されるｐ５３ａｓ配列
は、（主要ｐ５３形態中の全部で３９０アミノ酸のう
ち）ｐ５３タンパク質のカルボキシル末端において１７
の異なるアミノ酸を有している。この特異的な配列を使
用して、マウスｐ５３ａｓに特異的な抗体を製造した。
この抗体は主要ｐ５３タンパク質とは交差反応しない。
ｐ５３ａｓと反応する他の抗体は報告されておらず、ま
た入手可能な知識に基づいて作られていないという点で
これは新規である。
に、細胞の成長および成熟の研究、正常細胞と異常細胞
の成長の検出に使用してもよく、また異常に成長する細
胞の細胞成長を正常化するために使用してもよいと考え
られる。これ以後、現在までに認識されているｐ５３タ
ンパク質は、ｐ５３の主要形態または単純ｐ５３という
ことになろう：このことは、ｐ５３ａｓがｐ５３より比
較的高い量で存在しているかもしれない細胞型の存在を
除外するものではない。ＤＮＡはＲＮＡに転写され、そ
れからイントロンと呼ばれる断片の除去によって加工さ
れ、タンパク質をコードする成熟メッセンジャーＲＮＡ
が生ずる。選択的スプライシングにおいては、イントロ
ンの断片は（選択的にスプライスされたメッセンジャー
ＲＮＡと呼ばれる）コード配列中に保持され、主要形態
のタンパク質とは部分的に異なるタンパク質を作る。マ
ウス正常および腫瘍細胞中に見出されるｐ５３ａｓ配列
は、（主要ｐ５３形態中の全部で３９０アミノ酸のう
ち）ｐ５３タンパク質のカルボキシル末端において１７
の異なるアミノ酸を有している。この特異的な配列を使
用して、マウスｐ５３ａｓに特異的な抗体を製造した。
この抗体は主要ｐ５３タンパク質とは交差反応しない。
ｐ５３ａｓと反応する他の抗体は報告されておらず、ま
た入手可能な知識に基づいて作られていないという点で
これは新規である。
【００１７】ｐ５３ａｓタンパク質は、カルボキシル末
端内の１７アミノ酸の置換および９アミノ酸の損失によ
って、この「ＤＮＡ活性化」領域内の変化をすでに有し
ている。それ自体との複合体（ｐ５３タンパク質の二量
体化にとって重要であることが知られている酸性残基の
保持により二量体の形成が可能である）または主要ｐ５
３タンパク質との複合体で存在するｐ５３ａｓタンパク
質は、主要ｐ５３タンパク質単独のホモ二量体またはホ
モ四量体よりも、変化したおそらくより大きな効率で、
ＤＮＡに結合し、特異的な標的遺伝子の転写を調節する
のであろう（図２参照）。本発明以前に入手可能なマウ
スｐ５３に対するポリクローナルおよびモノクローナル
抗体は、ｐ５３ａｓを特異的には認識しない。これらに
は、正常な折りたたみ状態のマウスｐ５３を認識するＰ
Ａｂ２４６、一定の変異型ｐ５３タンパク質を認識する
ＰＡｂ２４０、ｐ５３ａｓ中では置換または損失されて
いるカルボキシル末端アミノ酸を認識するＰＡｂ４２１
が含まれる。同様に、ヒトｐ５３はモノクローナルおよ
びポリクローナル抗体によって認識される。カルボキシ
ル末端における選択的スプライシングによって製造され
たヒトｐ５３の報告はなく、ヒトｐ５３ａｓに対する特
異的な抗体は入手できない。
端内の１７アミノ酸の置換および９アミノ酸の損失によ
って、この「ＤＮＡ活性化」領域内の変化をすでに有し
ている。それ自体との複合体（ｐ５３タンパク質の二量
体化にとって重要であることが知られている酸性残基の
保持により二量体の形成が可能である）または主要ｐ５
３タンパク質との複合体で存在するｐ５３ａｓタンパク
質は、主要ｐ５３タンパク質単独のホモ二量体またはホ
モ四量体よりも、変化したおそらくより大きな効率で、
ＤＮＡに結合し、特異的な標的遺伝子の転写を調節する
のであろう（図２参照）。本発明以前に入手可能なマウ
スｐ５３に対するポリクローナルおよびモノクローナル
抗体は、ｐ５３ａｓを特異的には認識しない。これらに
は、正常な折りたたみ状態のマウスｐ５３を認識するＰ
Ａｂ２４６、一定の変異型ｐ５３タンパク質を認識する
ＰＡｂ２４０、ｐ５３ａｓ中では置換または損失されて
いるカルボキシル末端アミノ酸を認識するＰＡｂ４２１
が含まれる。同様に、ヒトｐ５３はモノクローナルおよ
びポリクローナル抗体によって認識される。カルボキシ
ル末端における選択的スプライシングによって製造され
たヒトｐ５３の報告はなく、ヒトｐ５３ａｓに対する特
異的な抗体は入手できない。
【００１８】本発明によるｐ５３ａｓタンパク質に対す
る抗体の開発により、ｐ５３タンパク質およびｐ５３ａ
ｓタンパク質が細胞中で相互作用するかどうかの研究が
可能になり、またｐ５３およびｐ５３ａｓタンパク質間
の複合体のＤＮＡ結合および転写調節の効率の生体外
（in vitro）研究が可能になるであろう。そのような抗
体はまた、異常に加速した成長を示す細胞から正常な成
長を示す細胞を検出することを可能にするであろう。マ
ウスｐ５３ＲＮＡの選択的スプライシングにより、ｐ５
３遺伝子のイントロン１０から９６ｎｔの挿入が生じ
る。これらの９６ｎｔは主要なｐ５３ＲＮＡ形態のもの
とは異なる１７アミノ酸を（フレーム中で）コードして
いて、残基３６５で始まり残基３８１まで伸び、９アミ
ノ酸の切断をもたらす終止コドンが続いている。マウス
ｐ５３ａｓペプチドと呼ばれる、選択的にスプライスさ
れたマウスｐ５３のこの１７アミノ酸ペプチドは、ＬＱ
ＰＲＡＦＱＡＬＩＫＥＥＳＰＮＣである。それは標準の
合成法によって製造され、その正確さを試験し、実験室
中で保存されている。詳細および操作法は以下の通りで
ある。
る抗体の開発により、ｐ５３タンパク質およびｐ５３ａ
ｓタンパク質が細胞中で相互作用するかどうかの研究が
可能になり、またｐ５３およびｐ５３ａｓタンパク質間
の複合体のＤＮＡ結合および転写調節の効率の生体外
（in vitro）研究が可能になるであろう。そのような抗
体はまた、異常に加速した成長を示す細胞から正常な成
長を示す細胞を検出することを可能にするであろう。マ
ウスｐ５３ＲＮＡの選択的スプライシングにより、ｐ５
３遺伝子のイントロン１０から９６ｎｔの挿入が生じ
る。これらの９６ｎｔは主要なｐ５３ＲＮＡ形態のもの
とは異なる１７アミノ酸を（フレーム中で）コードして
いて、残基３６５で始まり残基３８１まで伸び、９アミ
ノ酸の切断をもたらす終止コドンが続いている。マウス
ｐ５３ａｓペプチドと呼ばれる、選択的にスプライスさ
れたマウスｐ５３のこの１７アミノ酸ペプチドは、ＬＱ
ＰＲＡＦＱＡＬＩＫＥＥＳＰＮＣである。それは標準の
合成法によって製造され、その正確さを試験し、実験室
中で保存されている。詳細および操作法は以下の通りで
ある。
【００１９】
【実施例】マウスクローン化ケラチン細胞モデルの腫瘍
および正常細胞由来のｐ５３ｃＤＮＡの配列決定の間
に、本発明者はその中に選択的にスプライスされたｐ５
３ｍＲＮＡを検出したが、そこではイントロン１０の
３’末端の９６ｎｔがマウスｐ５３遺伝子（１は最初の
ＡＴＧコドンのアデニンである）のｎｔ１０９１とｎｔ
１０９２の間に挿入されていた；（Han et al. (b) (19
92), supra）。ｐ５３ｍＲＮＡは、Wolf et al., (198
5) "Isolation of a full-length mouse cDNA clone c
oding for an immunologically distinct p53 molecul
e", Mol. and Cell.Biol. 51, 127-132によって化学的
に形質転換した線維芽細胞株から変異型ｐ５３ｃＤＮＡ
（Ｍ−８）として最初にクローン化された。Arai et a
l., supraは、このｐ５３ｃＤＮＡ変異体の配列を報告
し、選択的スプライシングによって生成されていること
を確かめた。それは未形質転換ヘルパーＴ細胞ｃＤＮＡ
ライブラリー中では検出できなかったために、それはこ
の腫瘍細胞系列に特異的であるように見えた。しかしな
がら、野性型の選択的にスプライスされたｐ５３ＲＮＡ
が、主要ｐ５３ＲＮＡ形態の約２５から３３％の割合
で、正常細胞および組織中で発現していることが証明さ
れた（Han et al., (b) (1992) supra）。さらに、それ
は、ｐ５３ＲＮＡを（上記したように）過剰発現する２
つの独立的に由来する上皮がん細胞株中においてほとん
ど同じ割合で存在しており、それゆえ、ｐ５３の主要形
態とともに調和的に増加するように見えた。
および正常細胞由来のｐ５３ｃＤＮＡの配列決定の間
に、本発明者はその中に選択的にスプライスされたｐ５
３ｍＲＮＡを検出したが、そこではイントロン１０の
３’末端の９６ｎｔがマウスｐ５３遺伝子（１は最初の
ＡＴＧコドンのアデニンである）のｎｔ１０９１とｎｔ
１０９２の間に挿入されていた；（Han et al. (b) (19
92), supra）。ｐ５３ｍＲＮＡは、Wolf et al., (198
5) "Isolation of a full-length mouse cDNA clone c
oding for an immunologically distinct p53 molecul
e", Mol. and Cell.Biol. 51, 127-132によって化学的
に形質転換した線維芽細胞株から変異型ｐ５３ｃＤＮＡ
（Ｍ−８）として最初にクローン化された。Arai et a
l., supraは、このｐ５３ｃＤＮＡ変異体の配列を報告
し、選択的スプライシングによって生成されていること
を確かめた。それは未形質転換ヘルパーＴ細胞ｃＤＮＡ
ライブラリー中では検出できなかったために、それはこ
の腫瘍細胞系列に特異的であるように見えた。しかしな
がら、野性型の選択的にスプライスされたｐ５３ＲＮＡ
が、主要ｐ５３ＲＮＡ形態の約２５から３３％の割合
で、正常細胞および組織中で発現していることが証明さ
れた（Han et al., (b) (1992) supra）。さらに、それ
は、ｐ５３ＲＮＡを（上記したように）過剰発現する２
つの独立的に由来する上皮がん細胞株中においてほとん
ど同じ割合で存在しており、それゆえ、ｐ５３の主要形
態とともに調和的に増加するように見えた。
【００２０】選択的にスプライスされたｐ５３の翻訳
は、１７アミノ酸の置換および調節的にスプライスされ
た形態のｐ５３の９アミノ酸の切断をもたらす（図
３）。選択的にスプライスされたｐ５３ＲＮＡから翻訳
されたタンパク質は、セリン３８９カゼインキナーゼII
およびＲＮＡ結合部位、ＰＡｂ４２１ｐ５３抗体の結合
のためのエピトープ、および基本多量体化ドメインを、
ｐ５３の多量体化に対する強い効果、ＤＮＡ結合および
転写活性化に関する潜在的能力とともに欠いている。タ
ンパク質ｐ５３ａｓは研究室でいくつかの方法において
製造されており、これらには網状赤血球溶解物における
生体外翻訳およびバキュロウイルスベクターによる感染
後の昆虫細胞中における翻訳が含まれる。バキュロウイ
ルスベクターは全長の野性型ｐ５３を含むプラスミドか
ら本発明者の研究室で構築され、主要ｐ５３形態のＣ末
端は、マウス上皮細胞のｍＲＮＡからＲＴ／ＰＣＲによ
って製造されたｐ５３ａｓのＣ末端と置換されている。
本発明者の研究室で構築された、網状赤血球溶解物にお
ける生体外翻訳のための完全なｐ５３ａｓタンパク質を
コードするプラスミドの例は、ｐＢＳｐ５３ａｓであ
る。このプラスミドを含む微生物株は、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション＃ＡＴＣＣ６９６５７
とともに寄託された；E. coli DH5 アルファｐＢＳｐ５
３ａｓ。このプラスミドは、ｐ５３ｍＲＮＡの完全コー
ド配列およびｎｔ−１０９からｎｔ１６３５までの上流
および下流の非コード領域にまたがるＮ末端およびＣ末
端ＲＴ／ＰＣＲ断片のライゲーションによって構築し
た。配列決定によってこのプラスミドがタンパク質レベ
ルで全長野性型ｐ５３ａｓをコードしていることを確認
した。それには３個のコード領域ヌクレオチド置換が含
まれているが（ｎｔ３０６ＣからＴ、７０８ＴからＣお
よび９５１ＡからＧ、１は最初のＡＴＧコドンの最初の
ヌクレオチドである）、これらの変化は何も起こさず、
内生のｐ５３ａｓｍＲＮＡ配列と同じアミノ酸をコード
している。
は、１７アミノ酸の置換および調節的にスプライスされ
た形態のｐ５３の９アミノ酸の切断をもたらす（図
３）。選択的にスプライスされたｐ５３ＲＮＡから翻訳
されたタンパク質は、セリン３８９カゼインキナーゼII
およびＲＮＡ結合部位、ＰＡｂ４２１ｐ５３抗体の結合
のためのエピトープ、および基本多量体化ドメインを、
ｐ５３の多量体化に対する強い効果、ＤＮＡ結合および
転写活性化に関する潜在的能力とともに欠いている。タ
ンパク質ｐ５３ａｓは研究室でいくつかの方法において
製造されており、これらには網状赤血球溶解物における
生体外翻訳およびバキュロウイルスベクターによる感染
後の昆虫細胞中における翻訳が含まれる。バキュロウイ
ルスベクターは全長の野性型ｐ５３を含むプラスミドか
ら本発明者の研究室で構築され、主要ｐ５３形態のＣ末
端は、マウス上皮細胞のｍＲＮＡからＲＴ／ＰＣＲによ
って製造されたｐ５３ａｓのＣ末端と置換されている。
本発明者の研究室で構築された、網状赤血球溶解物にお
ける生体外翻訳のための完全なｐ５３ａｓタンパク質を
コードするプラスミドの例は、ｐＢＳｐ５３ａｓであ
る。このプラスミドを含む微生物株は、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション＃ＡＴＣＣ６９６５７
とともに寄託された；E. coli DH5 アルファｐＢＳｐ５
３ａｓ。このプラスミドは、ｐ５３ｍＲＮＡの完全コー
ド配列およびｎｔ−１０９からｎｔ１６３５までの上流
および下流の非コード領域にまたがるＮ末端およびＣ末
端ＲＴ／ＰＣＲ断片のライゲーションによって構築し
た。配列決定によってこのプラスミドがタンパク質レベ
ルで全長野性型ｐ５３ａｓをコードしていることを確認
した。それには３個のコード領域ヌクレオチド置換が含
まれているが（ｎｔ３０６ＣからＴ、７０８ＴからＣお
よび９５１ＡからＧ、１は最初のＡＴＧコドンの最初の
ヌクレオチドである）、これらの変化は何も起こさず、
内生のｐ５３ａｓｍＲＮＡ配列と同じアミノ酸をコード
している。
【００２１】本発明より以前においては、単一のｐ５３
遺伝子から選択的なｍＲＮＡ種のための証拠があったに
も係わらず、ｐ５３タンパク質の野性型内生変異体は検
出されていなかった。選択的にスプライスされた野性型
ｐ５３タンパク質（本明細書中ではｐ５３ａｓと称す）
がマウス上皮細胞形質転換モデルの正常および腫瘍細胞
中に存在し、主要ｐ５３形態と比較して細胞周期中に異
なって発現していることが今や見つかった。細胞中にお
けるこの生理的形態のｐ５３タンパク質の存在は、正常
なｐ５３の機能および腫瘍におけるｐ５３の不活性化に
関して重要な意味を有している。ｐ５３ａｓタンパク質
が細胞中で作られているかどうかを決定するために、マ
ウスｐ５３ａｓに特異的な１７アミノ酸配列に対するポ
リクローナル抗体をラビット中で作製した。免疫後に間
隔をおいて回収したラビット血清をＥＬＩＳＡプレート
穴上に被覆したｐ５３ａｓペプチドに対する反応性に関
して試験した（図４）。（示されるような）高力価血清
を１７アミノ酸ペプチドに対してアフィニティー精製し
た。１０ｎｇのアフィニティー精製抗体の（抗原μｇ当
たりの）反応性は、全抗−ｐ５３ａｓ抗血清の１／４
０，０００希釈にほとんど等しかった。ＥＬＩＳＡおよ
び間接免疫蛍光分析における抗−ｐ５３ａｓ反応性は、
抗体をｐ５３ａｓペプチドと予めインキュベーションす
ることによって競合的に阻害された。
遺伝子から選択的なｍＲＮＡ種のための証拠があったに
も係わらず、ｐ５３タンパク質の野性型内生変異体は検
出されていなかった。選択的にスプライスされた野性型
ｐ５３タンパク質（本明細書中ではｐ５３ａｓと称す）
がマウス上皮細胞形質転換モデルの正常および腫瘍細胞
中に存在し、主要ｐ５３形態と比較して細胞周期中に異
なって発現していることが今や見つかった。細胞中にお
けるこの生理的形態のｐ５３タンパク質の存在は、正常
なｐ５３の機能および腫瘍におけるｐ５３の不活性化に
関して重要な意味を有している。ｐ５３ａｓタンパク質
が細胞中で作られているかどうかを決定するために、マ
ウスｐ５３ａｓに特異的な１７アミノ酸配列に対するポ
リクローナル抗体をラビット中で作製した。免疫後に間
隔をおいて回収したラビット血清をＥＬＩＳＡプレート
穴上に被覆したｐ５３ａｓペプチドに対する反応性に関
して試験した（図４）。（示されるような）高力価血清
を１７アミノ酸ペプチドに対してアフィニティー精製し
た。１０ｎｇのアフィニティー精製抗体の（抗原μｇ当
たりの）反応性は、全抗−ｐ５３ａｓ抗血清の１／４
０，０００希釈にほとんど等しかった。ＥＬＩＳＡおよ
び間接免疫蛍光分析における抗−ｐ５３ａｓ反応性は、
抗体をｐ５３ａｓペプチドと予めインキュベーションす
ることによって競合的に阻害された。
【００２２】免疫沈降 細胞タンパク質との反応性を決定するために、ｐ５３ａ
ｓに対するアフィニティー精製抗血清をマウス上皮細胞
溶解物と反応させた（図５）。５３ｋｄのタンパク質が
抗−ｐ５３ａｓによって免疫沈降した。このタンパク質
は、（ｐ５３ａｓに存在しないカルボキシル末端エピト
ープに結合する）ＰＡｂ４２１によって免疫沈降したｐ
５３タンパク質よりもわずかに速く１０％ポリアクリル
アミドゲル上を移動した。ラビットポリクローナル抗−
ｐ５３抗体ＣＭ５は、より別々のＰＡｂ４２１−および
抗−ｐ５３ａｓ−反応性の形態を含む領域にまたがるよ
り広いバンドを認識した。
ｓに対するアフィニティー精製抗血清をマウス上皮細胞
溶解物と反応させた（図５）。５３ｋｄのタンパク質が
抗−ｐ５３ａｓによって免疫沈降した。このタンパク質
は、（ｐ５３ａｓに存在しないカルボキシル末端エピト
ープに結合する）ＰＡｂ４２１によって免疫沈降したｐ
５３タンパク質よりもわずかに速く１０％ポリアクリル
アミドゲル上を移動した。ラビットポリクローナル抗−
ｐ５３抗体ＣＭ５は、より別々のＰＡｂ４２１−および
抗−ｐ５３ａｓ−反応性の形態を含む領域にまたがるよ
り広いバンドを認識した。
【００２３】間接免疫蛍光 カバースリップ上で成長した細胞集団におけるｐ５３ａ
ｓの発現の位置および発生を間接免疫蛍光によって決定
した。図６に示すように、アフィニティー精製抗−ｐ５
３ａｓ抗体を使用した場合に核の染色が見られた。この
活性はｐ５３ａｓペプチドの競合的結合によって完全に
阻害された（図６Ｃ）。２９１個の未形質転換細胞およ
びがん細胞における抗−ｐ５３ａｓ抗体の反応性はこれ
らの分析の条件下においてはいつも核であり（クローン
１１９のデータが示されている）、この点において、ｐ
５３の腫瘍抑制立体配置を認識するＰＡｂ２４６抗体の
反応性に似ていた。ＰＡｂ４２１反応性が核と同様に細
胞質にもあるようなｐ５３のｐｍＭＴｖａｌ−１３５温
度感受性変異体でトランスフェクトした291.03RATのク
ローンにおいても、このことは当てはまった。これらの
結果から、主要ｐ５３形態と同様に野性型ｐ５３ａｓタ
ンパク質は主に核においてその効果を発揮していること
が示唆される。
ｓの発現の位置および発生を間接免疫蛍光によって決定
した。図６に示すように、アフィニティー精製抗−ｐ５
３ａｓ抗体を使用した場合に核の染色が見られた。この
活性はｐ５３ａｓペプチドの競合的結合によって完全に
阻害された（図６Ｃ）。２９１個の未形質転換細胞およ
びがん細胞における抗−ｐ５３ａｓ抗体の反応性はこれ
らの分析の条件下においてはいつも核であり（クローン
１１９のデータが示されている）、この点において、ｐ
５３の腫瘍抑制立体配置を認識するＰＡｂ２４６抗体の
反応性に似ていた。ＰＡｂ４２１反応性が核と同様に細
胞質にもあるようなｐ５３のｐｍＭＴｖａｌ−１３５温
度感受性変異体でトランスフェクトした291.03RATのク
ローンにおいても、このことは当てはまった。これらの
結果から、主要ｐ５３形態と同様に野性型ｐ５３ａｓタ
ンパク質は主に核においてその効果を発揮していること
が示唆される。
【００２４】未形質転換細胞および腫瘍細胞におけるｐ
５３の発現 扁平がん細胞291.03RAT は、前駆２９１細胞より３倍多
くのｐ５３ｍＲＮＡを発現し、１０倍以下までのｐ５３
タンパク質（ＰＡｂ４２１およびＰＡｂ２４６抗体反応
性）を発現する（Han et al. (a) (1992), "Altered ex
pression of wild-type p53 tumor suppressor gene du
ring murine epithelial cell transformation", Cance
r Research 52, 749-753）。これらの細胞株におけるｐ
５３ａｓタンパク質の発現の比較を免疫沈降によって行
った。図７に示されるように、抗−ｐ５３ａｓ抗体との
反応性を未形質転換２９１細胞およびがん細胞において
検出した。これらの細胞株におけるｐ５３ａｓ−沈降性
タンパク質は、９個のカルボキシル末端のアミノ酸がｐ
５３ａｓから切断されていることから予期されるように
（分子量で約１ｋｄの相違が得られることが予測され
る）、ＰＡｂ４２１およびＰＡｂ２４６−沈降性タンパ
ク質よりもわずかに速く移動する。以前の研究から予期
されるように（Han et al. (a) supra）、３つの全ての
抗−ｐ５３抗体に対する免疫反応性は、291.03RAT がん
細胞においては正常細胞よりも低かった。増殖している
細胞対分化している２９１細胞の集団における免疫沈降
タンパク質の比率はＰＡｂ２４６反応性（１／１）より
も抗−ｐ５３ａｓ（５／１）およびＰＡｂ４２１（２／
１の比率）の方が高かった。増殖している集団における
上昇したＰＡｂ４２１反応性はまた、マウスリンパ球の
研究において、Milner (1984） "Different forms of p
53 detected by monoclonal antibodies in non-dividi
ng and dividing lymphocytes", Nature 20, 143-145に
よって記載されている。今回の結果から、ｐ５３ａｓタ
ンパク質は細胞の増殖段階または分化段階に依存してＰ
Ａｂ４２１およびＰＡｂ２４６タンパク質と比較して異
なって発現しているかもしれないということが示唆され
た。
５３の発現 扁平がん細胞291.03RAT は、前駆２９１細胞より３倍多
くのｐ５３ｍＲＮＡを発現し、１０倍以下までのｐ５３
タンパク質（ＰＡｂ４２１およびＰＡｂ２４６抗体反応
性）を発現する（Han et al. (a) (1992), "Altered ex
pression of wild-type p53 tumor suppressor gene du
ring murine epithelial cell transformation", Cance
r Research 52, 749-753）。これらの細胞株におけるｐ
５３ａｓタンパク質の発現の比較を免疫沈降によって行
った。図７に示されるように、抗−ｐ５３ａｓ抗体との
反応性を未形質転換２９１細胞およびがん細胞において
検出した。これらの細胞株におけるｐ５３ａｓ−沈降性
タンパク質は、９個のカルボキシル末端のアミノ酸がｐ
５３ａｓから切断されていることから予期されるように
（分子量で約１ｋｄの相違が得られることが予測され
る）、ＰＡｂ４２１およびＰＡｂ２４６−沈降性タンパ
ク質よりもわずかに速く移動する。以前の研究から予期
されるように（Han et al. (a) supra）、３つの全ての
抗−ｐ５３抗体に対する免疫反応性は、291.03RAT がん
細胞においては正常細胞よりも低かった。増殖している
細胞対分化している２９１細胞の集団における免疫沈降
タンパク質の比率はＰＡｂ２４６反応性（１／１）より
も抗−ｐ５３ａｓ（５／１）およびＰＡｂ４２１（２／
１の比率）の方が高かった。増殖している集団における
上昇したＰＡｂ４２１反応性はまた、マウスリンパ球の
研究において、Milner (1984） "Different forms of p
53 detected by monoclonal antibodies in non-dividi
ng and dividing lymphocytes", Nature 20, 143-145に
よって記載されている。今回の結果から、ｐ５３ａｓタ
ンパク質は細胞の増殖段階または分化段階に依存してＰ
Ａｂ４２１およびＰＡｂ２４６タンパク質と比較して異
なって発現しているかもしれないということが示唆され
た。
【００２５】アクチノマイシンＤに対する応答性 ｐ５３タンパク質は、アクチノマイシンＤのようなＤＮ
Ａ損傷剤への細胞の露出後にＳ期に入るのを調節する細
胞周期チェックポイントに参加しているものと仮定され
てきた。野性型ｐ５３（ＰＡｂ４２１反応性）を発現す
る細胞はＤＮＡ損傷後の細胞周期のＧ１段階において生
育が停止し、ｐ５３免疫反応性は調和して増加する。ｐ
５３ａｓポジティブ上皮細胞の細胞周期分布の研究以前
においては、ｐ５３ａｓタンパク質もまたＤＮＡ損傷に
対して応答するかどうか、それによって細胞集団中のｐ
５３ａｓポジティブ細胞の割合を最大にして未形質転換
の腫瘍上皮細胞の応答を比較することができるかどうか
を決定するための実験が行われた。穏やかに分化した扁
平がん細胞株291.05RAT をこれらの研究のために使用し
たのは、それが291.03RAT よりも高水準の免疫沈降性ｐ
５３タンパク質を発現しているが、291.03RAT のように
上皮クローン２９１から由来し、野性型のｐ５３遺伝子
を有しているためである（Han et al. (a) supra）。ア
クチノマイシンＤによる処理により、間接免疫蛍光によ
るｐ５３抗体との反応性がポジティブな細胞の割合に基
づいて、２つの別々の実験におけるｐ５３およびｐ５３
ａｓタンパク質の発現が誘導された（表１）。
Ａ損傷剤への細胞の露出後にＳ期に入るのを調節する細
胞周期チェックポイントに参加しているものと仮定され
てきた。野性型ｐ５３（ＰＡｂ４２１反応性）を発現す
る細胞はＤＮＡ損傷後の細胞周期のＧ１段階において生
育が停止し、ｐ５３免疫反応性は調和して増加する。ｐ
５３ａｓポジティブ上皮細胞の細胞周期分布の研究以前
においては、ｐ５３ａｓタンパク質もまたＤＮＡ損傷に
対して応答するかどうか、それによって細胞集団中のｐ
５３ａｓポジティブ細胞の割合を最大にして未形質転換
の腫瘍上皮細胞の応答を比較することができるかどうか
を決定するための実験が行われた。穏やかに分化した扁
平がん細胞株291.05RAT をこれらの研究のために使用し
たのは、それが291.03RAT よりも高水準の免疫沈降性ｐ
５３タンパク質を発現しているが、291.03RAT のように
上皮クローン２９１から由来し、野性型のｐ５３遺伝子
を有しているためである（Han et al. (a) supra）。ア
クチノマイシンＤによる処理により、間接免疫蛍光によ
るｐ５３抗体との反応性がポジティブな細胞の割合に基
づいて、２つの別々の実験におけるｐ５３およびｐ５３
ａｓタンパク質の発現が誘導された（表１）。
【００２６】ポジティブ細胞における増加は、ｐ５３ａ
ｓについての方が、ＰＡｂ４２１およびＰＡｂ２４６反
応性よりも少なく、より高濃度のアクチノマイシンＤを
必要としたが、これはｐ５３ａｓタンパク質の存在量が
より小さいということを反映しているのかもしれない。
未処理２９１上皮細胞および野性型ｐ５３を発現する29
1.03RAT 腫瘍細胞における場合のように、アクチノマイ
シンＤ処理細胞におけるｐ５３ａｓ抗体反応性は不明確
であった。ｐ５３ａｓポジティブ核もまたＰＡｂ４２１
およびＰＡｂ２４６についてポジティブであった一方、
大部分のＰＡｂ４２１（＋）またはＰＡｂ２４６（＋）
細胞はｐ５３ａｓ抗体反応性に関してネガティブであっ
た。アクチノマイシンＤ処理291.05RAT 細胞におけるｐ
５３ＲＮＡの存在量は、ノーザンブロット分析によれば
３倍以上増加した（図８）。独立した細胞の調製におい
て、逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
を、前記したようにｐ５３またはｐ５３ａｓのＣ末端コ
ード配列を含むｎｔ１０４２から１５３９までの断片を
増幅するプライマーを使用することによって行った（Ha
n et al. (b), supra ）。ｐ５３およびｐ５３ａｓの両
方の転写産物を、対照と比較してアクチノマイシンＤ処
理細胞からの試料中で調和させながら増加させたところ
（データは示されていない）、アクチノマイシンＤに対
する上皮細胞の反応はＲＮＡ存在量の増加を含有してい
ることが示唆された。アクチノマイシンＤ処理後のｐ５
３抗体反応性の存在量の増加は、Kastan et al. (199
1), "Participation of p53 protein in the cellular
response to DNA damage", CancerResearch, 51, 6304-
6311 によって報告されているＭＬ−１および正常骨髄
前駆細胞のγ線に対する応答に似ていた。しかしなが
ら、ｐ５３ＲＮＡの存在量はγ線に対する応答において
は増加せず、著者はｐ５３免疫反応性において観察され
た変化は転写後の機構から生じているということを示唆
した。今回の発見は、アクチノマイシンＤに対する細胞
応答におけるｐ５３タンパク質と一緒のｐ５３ａｓタン
パク質の機能的役割と合致する。
ｓについての方が、ＰＡｂ４２１およびＰＡｂ２４６反
応性よりも少なく、より高濃度のアクチノマイシンＤを
必要としたが、これはｐ５３ａｓタンパク質の存在量が
より小さいということを反映しているのかもしれない。
未処理２９１上皮細胞および野性型ｐ５３を発現する29
1.03RAT 腫瘍細胞における場合のように、アクチノマイ
シンＤ処理細胞におけるｐ５３ａｓ抗体反応性は不明確
であった。ｐ５３ａｓポジティブ核もまたＰＡｂ４２１
およびＰＡｂ２４６についてポジティブであった一方、
大部分のＰＡｂ４２１（＋）またはＰＡｂ２４６（＋）
細胞はｐ５３ａｓ抗体反応性に関してネガティブであっ
た。アクチノマイシンＤ処理291.05RAT 細胞におけるｐ
５３ＲＮＡの存在量は、ノーザンブロット分析によれば
３倍以上増加した（図８）。独立した細胞の調製におい
て、逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
を、前記したようにｐ５３またはｐ５３ａｓのＣ末端コ
ード配列を含むｎｔ１０４２から１５３９までの断片を
増幅するプライマーを使用することによって行った（Ha
n et al. (b), supra ）。ｐ５３およびｐ５３ａｓの両
方の転写産物を、対照と比較してアクチノマイシンＤ処
理細胞からの試料中で調和させながら増加させたところ
（データは示されていない）、アクチノマイシンＤに対
する上皮細胞の反応はＲＮＡ存在量の増加を含有してい
ることが示唆された。アクチノマイシンＤ処理後のｐ５
３抗体反応性の存在量の増加は、Kastan et al. (199
1), "Participation of p53 protein in the cellular
response to DNA damage", CancerResearch, 51, 6304-
6311 によって報告されているＭＬ−１および正常骨髄
前駆細胞のγ線に対する応答に似ていた。しかしなが
ら、ｐ５３ＲＮＡの存在量はγ線に対する応答において
は増加せず、著者はｐ５３免疫反応性において観察され
た変化は転写後の機構から生じているということを示唆
した。今回の発見は、アクチノマイシンＤに対する細胞
応答におけるｐ５３タンパク質と一緒のｐ５３ａｓタン
パク質の機能的役割と合致する。
【００２７】流動細胞計測法 各種のＤＮＡ損傷剤との応答における細胞のＧ１停止と
調和する野性型ｐ５３の増加は、激しい損傷を受けた細
胞におけるＤＮＡ損傷の修復またはプログラムされた細
胞死の誘導のための時間を与えるＧ１／Ｓ細胞周期チェ
ックポイントとしての役割を示唆した（Lane, (1992),
p53, "Guardian of the genome", Nature 358, 15-16
）。流動細胞計測法を、ｐ５３ａｓ抗原活性が細胞周
期中で異なって発現しているかどうかを決定するために
行った。アクチノマイシンＤまたは溶媒に露出した細胞
をｐ５３ａｓに対する抗体およびＰＡｂ４２１またはＰ
Ａｂ２４６で染色し、異なる種を起源とするポリクロー
ナルおよびモノクローナル抗体の利点を得ることによっ
て同じ細胞中のｐ５３ａｓおよびｐ５３抗原の免疫検出
を可能にした。抗−ラビット免疫グロブリンに結合した
フィコエリトリン（赤）を使用してｐ５３ａｓを認識
し、抗−マウス免疫グロブリンに結合したＦＩＴＣ
（緑）を使用してＰＡｂ４２１およびＰＡｂ２４６を認
識した。抗−ｐ５３ａｓの特異性は図９において証明さ
れている。蛍光強度に基づいて整理することによって、
検出された事象（単一の細胞）をｐ５３ａｓ単独にポジ
ティブなもの（領域１、Ｒ１）、ｐ５３ａｓおよびＰＡ
ｂ４２１またはＰＡｂ２４６にポジティブなもの（Ｒ
２）、ｐ５３ａｓにネガティブでＰＡｂ４２１またはＰ
Ａｂ２４６にポジティブなもの（Ｒ３）、並びに抗−ｐ
５３ａｓおよびＰＡｂ４２１またはＰＡｂ２４６の両方
にネガティブなもの（Ｒ４）に分類した。がん細胞は抗
−ｐ５３ａｓ単独にポジティブなものは稀であった（図
９、Ｒ１）。抗−ｐ５３ａｓにポジティブな細胞もまた
ＰＡｂ４２１（Ｒ２、示される）またはＰＡｂ２４６に
ポジティブであった。未関連ペプチドではなくｐ５３ａ
ｓペプチドとの競合は、Ｒ３事象の割合を減少させたり
抗−ｐ５３ａｓ抗体の特異性を変化させたりすることな
く、Ｒ２領域において検出しうる事象を完全に阻害した
（図９においては291.05RAT そして図１０においては２
９１細胞について示されている）。Ｒ１からＲ４までの
各領域の事象を、細胞周期分布の分析のために多数集め
（図９を参照）、棒グラフで表した（図９および図１
０）。アクチノマイシンＤ処理291.05RAT 細胞（示され
ている）および対照細胞の分布は本質的に同じであっ
た。ＰＡｂ４２１（＋）／ｐ５３ａｓ（−）291.05RAT
がん細胞は細胞周期のＧ０／Ｇ１期に主として分布して
いた一方、ｐ５３ａｓ（＋）／ＰＡｂ４２１（＋）細胞
は周期のＧ２／Ｍ期に優先的に分布していた（図７）。
Ｇ２／Ｍ細胞以上のＤＮＡ含量を示す「尾（tail）」に
おけるｐ５３ａｓ（＋）細胞の分布は特に顕著である。
単一の細胞だけを分析のために回収したために、そのよ
うな細胞はＤＮＡ合成または有糸分裂（mitosis ）さえ
も経過したらしいが、細胞質分裂（cytokinesis ）を経
過することはなかった。カバースリップ上で成長したｐ
５３ａｓ（＋）細胞の検査により、大部分（約８５％）
が２以上の核を含有していることが明らかになり（デー
タは示されていない）、これらのがん細胞がＤＮＡを合
成し続け、有糸核分裂（Karyokinesis）（核分裂）を経
過したが細胞分裂を経過していないというという結論が
支持される。増殖に好適な条件（ＬＣ）下で培養した未
形質転換２９１細胞をがん細胞との比較のために同様に
処理した。図１０に示されるように、未処理の細胞は主
としてＧ２／Ｍ段階にあった。アクチノマイシンＤに対
する応答において分布はＧ０／Ｇ１の方に変化し、この
ことはｐ５３ａｓタンパク質、およびＰＡｂ４２１また
はＰＡｂ２４６と反応しうるｐ５３タンパク質がＤＮＡ
損傷に露出された正常細胞のＧ１停止に寄与しているこ
とを示唆している。がん細胞とは対照的に、抗−ｐ５３
ａｓ反応性だけにポジティブな２９１細胞の集団が見ら
れた（図１０、Ｒ１）。これらは、抗ｐ５３ａｓおよび
ＰＡｂ４２１またはＰＡｂ２４６で標識した細胞と同様
の細胞周期分布を示した。がん細胞とは違って、カバー
スリップ上に観察されたｐ５３ａｓ（＋）２９１細胞は
一般的には単核であった（データは示されていない）。
調和する野性型ｐ５３の増加は、激しい損傷を受けた細
胞におけるＤＮＡ損傷の修復またはプログラムされた細
胞死の誘導のための時間を与えるＧ１／Ｓ細胞周期チェ
ックポイントとしての役割を示唆した（Lane, (1992),
p53, "Guardian of the genome", Nature 358, 15-16
）。流動細胞計測法を、ｐ５３ａｓ抗原活性が細胞周
期中で異なって発現しているかどうかを決定するために
行った。アクチノマイシンＤまたは溶媒に露出した細胞
をｐ５３ａｓに対する抗体およびＰＡｂ４２１またはＰ
Ａｂ２４６で染色し、異なる種を起源とするポリクロー
ナルおよびモノクローナル抗体の利点を得ることによっ
て同じ細胞中のｐ５３ａｓおよびｐ５３抗原の免疫検出
を可能にした。抗−ラビット免疫グロブリンに結合した
フィコエリトリン（赤）を使用してｐ５３ａｓを認識
し、抗−マウス免疫グロブリンに結合したＦＩＴＣ
（緑）を使用してＰＡｂ４２１およびＰＡｂ２４６を認
識した。抗−ｐ５３ａｓの特異性は図９において証明さ
れている。蛍光強度に基づいて整理することによって、
検出された事象（単一の細胞）をｐ５３ａｓ単独にポジ
ティブなもの（領域１、Ｒ１）、ｐ５３ａｓおよびＰＡ
ｂ４２１またはＰＡｂ２４６にポジティブなもの（Ｒ
２）、ｐ５３ａｓにネガティブでＰＡｂ４２１またはＰ
Ａｂ２４６にポジティブなもの（Ｒ３）、並びに抗−ｐ
５３ａｓおよびＰＡｂ４２１またはＰＡｂ２４６の両方
にネガティブなもの（Ｒ４）に分類した。がん細胞は抗
−ｐ５３ａｓ単独にポジティブなものは稀であった（図
９、Ｒ１）。抗−ｐ５３ａｓにポジティブな細胞もまた
ＰＡｂ４２１（Ｒ２、示される）またはＰＡｂ２４６に
ポジティブであった。未関連ペプチドではなくｐ５３ａ
ｓペプチドとの競合は、Ｒ３事象の割合を減少させたり
抗−ｐ５３ａｓ抗体の特異性を変化させたりすることな
く、Ｒ２領域において検出しうる事象を完全に阻害した
（図９においては291.05RAT そして図１０においては２
９１細胞について示されている）。Ｒ１からＲ４までの
各領域の事象を、細胞周期分布の分析のために多数集め
（図９を参照）、棒グラフで表した（図９および図１
０）。アクチノマイシンＤ処理291.05RAT 細胞（示され
ている）および対照細胞の分布は本質的に同じであっ
た。ＰＡｂ４２１（＋）／ｐ５３ａｓ（−）291.05RAT
がん細胞は細胞周期のＧ０／Ｇ１期に主として分布して
いた一方、ｐ５３ａｓ（＋）／ＰＡｂ４２１（＋）細胞
は周期のＧ２／Ｍ期に優先的に分布していた（図７）。
Ｇ２／Ｍ細胞以上のＤＮＡ含量を示す「尾（tail）」に
おけるｐ５３ａｓ（＋）細胞の分布は特に顕著である。
単一の細胞だけを分析のために回収したために、そのよ
うな細胞はＤＮＡ合成または有糸分裂（mitosis ）さえ
も経過したらしいが、細胞質分裂（cytokinesis ）を経
過することはなかった。カバースリップ上で成長したｐ
５３ａｓ（＋）細胞の検査により、大部分（約８５％）
が２以上の核を含有していることが明らかになり（デー
タは示されていない）、これらのがん細胞がＤＮＡを合
成し続け、有糸核分裂（Karyokinesis）（核分裂）を経
過したが細胞分裂を経過していないというという結論が
支持される。増殖に好適な条件（ＬＣ）下で培養した未
形質転換２９１細胞をがん細胞との比較のために同様に
処理した。図１０に示されるように、未処理の細胞は主
としてＧ２／Ｍ段階にあった。アクチノマイシンＤに対
する応答において分布はＧ０／Ｇ１の方に変化し、この
ことはｐ５３ａｓタンパク質、およびＰＡｂ４２１また
はＰＡｂ２４６と反応しうるｐ５３タンパク質がＤＮＡ
損傷に露出された正常細胞のＧ１停止に寄与しているこ
とを示唆している。がん細胞とは対照的に、抗−ｐ５３
ａｓ反応性だけにポジティブな２９１細胞の集団が見ら
れた（図１０、Ｒ１）。これらは、抗ｐ５３ａｓおよび
ＰＡｂ４２１またはＰＡｂ２４６で標識した細胞と同様
の細胞周期分布を示した。がん細胞とは違って、カバー
スリップ上に観察されたｐ５３ａｓ（＋）２９１細胞は
一般的には単核であった（データは示されていない）。
【００２８】アクチノマイシンＤまたは溶媒で処理した
未形質転換２９１および291.05RATがん細胞の細胞周期
段階による百分率分布を表２に示す。ｐ５３ａｓ抗原活
性がＧ２／Ｍおよび＞Ｇ２／Ｍと優先的に関連している
こと、（ＰＡｂ４２１およびＰＡｂ２４６反応性の）ｐ
５３タンパク質がＧ０／Ｇ１と関連していること、およ
びアクチノマイシンＤに対する応答性は、細胞型当たり
３個の独立した実験の全部の間で一致した。未形質転換
２９１細胞において、アクチノマイシンＤは免疫的に検
出しうるｐ５３ａｓおよびｐ５３（ＰＡｂ４２１および
ＰＡｂ２４６）を発現する細胞の百分率を約４倍増加さ
せ、溶媒対照と比較して細胞周期のＧ１期における細胞
の優先的な蓄積をもたらした。対照的に、291.05RAT 腫
瘍細胞はアクチノマイシンＤ処理に対する応答におい
て、Ｇ１の細胞の百分率にほとんど相違を示さず、この
ことは、たとえＰＡｂ４２１およびＰＡｂ２４６にポジ
ティブな細胞の百分率が上昇したとしても、これらの細
胞におけるｐ５３タンパク質がＧ１停止を引き起こすこ
とがほとんどできないことを示唆している。
未形質転換２９１および291.05RATがん細胞の細胞周期
段階による百分率分布を表２に示す。ｐ５３ａｓ抗原活
性がＧ２／Ｍおよび＞Ｇ２／Ｍと優先的に関連している
こと、（ＰＡｂ４２１およびＰＡｂ２４６反応性の）ｐ
５３タンパク質がＧ０／Ｇ１と関連していること、およ
びアクチノマイシンＤに対する応答性は、細胞型当たり
３個の独立した実験の全部の間で一致した。未形質転換
２９１細胞において、アクチノマイシンＤは免疫的に検
出しうるｐ５３ａｓおよびｐ５３（ＰＡｂ４２１および
ＰＡｂ２４６）を発現する細胞の百分率を約４倍増加さ
せ、溶媒対照と比較して細胞周期のＧ１期における細胞
の優先的な蓄積をもたらした。対照的に、291.05RAT 腫
瘍細胞はアクチノマイシンＤ処理に対する応答におい
て、Ｇ１の細胞の百分率にほとんど相違を示さず、この
ことは、たとえＰＡｂ４２１およびＰＡｂ２４６にポジ
ティブな細胞の百分率が上昇したとしても、これらの細
胞におけるｐ５３タンパク質がＧ１停止を引き起こすこ
とがほとんどできないことを示唆している。
【００２９】マウスｐ５３ａｓタンパク質に特異的なポ
リクローナル抗体 上記したようなマウスｐ５３ａｓ特異的ペプチドに対す
るポリクローナル抗体をラビットにおいて作製し、その
高い力価を酵素結合免疫吸収分析（ＥＬＩＳＡ）によっ
て測定し、ｐ５３タンパク質に対するその特異性をマウ
ス細胞からの免疫沈降、ｐ５３のポリクローナル抗体に
対する抗−ｐ５３沈降性タンパク質（ＣＭ５、ｐ５３お
よびｐ５３ａｓタンパク質によって共有されているエピ
トープと反応する）のウェスタンイムノブロッティング
によって測定し、細胞中およびウェスタンイムノブロッ
ト中における反応性を競合的に阻害するペプチドの能
力、およびｐ５３ａｓ抗体の結合を阻害するがｐ５３ａ
ｓの特異的領域とは異なるエピトープに結合する他のｐ
５３抗体（ＰＡｂ４２１およびＰＡｂ２４６）の結合を
阻害しないというｐ５３ａｓペプチドの能力が分かっ
た。ポリクローナル抗−ペプチド抗体は以下の一般的操
作方法に記載されているようにラビット中において作製
する。
リクローナル抗体 上記したようなマウスｐ５３ａｓ特異的ペプチドに対す
るポリクローナル抗体をラビットにおいて作製し、その
高い力価を酵素結合免疫吸収分析（ＥＬＩＳＡ）によっ
て測定し、ｐ５３タンパク質に対するその特異性をマウ
ス細胞からの免疫沈降、ｐ５３のポリクローナル抗体に
対する抗−ｐ５３沈降性タンパク質（ＣＭ５、ｐ５３お
よびｐ５３ａｓタンパク質によって共有されているエピ
トープと反応する）のウェスタンイムノブロッティング
によって測定し、細胞中およびウェスタンイムノブロッ
ト中における反応性を競合的に阻害するペプチドの能
力、およびｐ５３ａｓ抗体の結合を阻害するがｐ５３ａ
ｓの特異的領域とは異なるエピトープに結合する他のｐ
５３抗体（ＰＡｂ４２１およびＰＡｂ２４６）の結合を
阻害しないというｐ５３ａｓペプチドの能力が分かっ
た。ポリクローナル抗−ペプチド抗体は以下の一般的操
作方法に記載されているようにラビット中において作製
する。
【００３０】マウスｐ５３ａｓタンパク質に特異的なモ
ノクローナル抗体 ハイブリドーマ細胞株を、マウスｐ５３ａｓペプチドで
標準的方法に従って免疫したＢＡＬＢｃマウスからのリ
ンパ節または脾臓細胞の融合によって作製した。操作法
は以下の一般的操作方法に記載されている。ＥＬＩＳＡ
によって測定した場合に特異的な抗体を製造する各ハイ
ブリドーマ細胞株からのモノクローナル抗体を、マウス
ｐ５３ａｓに対するポリクローナル抗体に関して上記し
たように、免疫沈降、ウェスタンイムノブロッティング
および免疫蛍光法によってマウス細胞性ｐ５３ａｓとの
反応性に関して試験する。特異性はマウスｐ５３ａｓペ
プチドとの競合によって測定する。ハイブリドーマＲＰ
１を、マウスｐ５３ａｓ特異的１７アミノ酸ペプチドに
対してマウス中で製造し、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、12301 Parklawn Dri
ve, Rockville, Maryland 20852, (受託標識ＣＢ４上の
バイアル）、＃ＡＴＣＣ HB 11685 とともに寄託され
た。モノクローナル抗体ＲＰ１は生体外でｐ５３ａｓペ
プチドと、マウス細胞内でｐ５３ａｓタンパク質と反応
する。
ノクローナル抗体 ハイブリドーマ細胞株を、マウスｐ５３ａｓペプチドで
標準的方法に従って免疫したＢＡＬＢｃマウスからのリ
ンパ節または脾臓細胞の融合によって作製した。操作法
は以下の一般的操作方法に記載されている。ＥＬＩＳＡ
によって測定した場合に特異的な抗体を製造する各ハイ
ブリドーマ細胞株からのモノクローナル抗体を、マウス
ｐ５３ａｓに対するポリクローナル抗体に関して上記し
たように、免疫沈降、ウェスタンイムノブロッティング
および免疫蛍光法によってマウス細胞性ｐ５３ａｓとの
反応性に関して試験する。特異性はマウスｐ５３ａｓペ
プチドとの競合によって測定する。ハイブリドーマＲＰ
１を、マウスｐ５３ａｓ特異的１７アミノ酸ペプチドに
対してマウス中で製造し、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、12301 Parklawn Dri
ve, Rockville, Maryland 20852, (受託標識ＣＢ４上の
バイアル）、＃ＡＴＣＣ HB 11685 とともに寄託され
た。モノクローナル抗体ＲＰ１は生体外でｐ５３ａｓペ
プチドと、マウス細胞内でｐ５３ａｓタンパク質と反応
する。
【００３１】合成ｐ５３ａｓペプチドによるマウスの免
疫のための一般的操作方法−モノクローナル抗体の製造 使用するべき操作法はモノクローナル抗体を製造するた
めの標準的な操作法に基づく。哺乳類由来のｐ５３ａｓ
ペプチドを使用するまで光および酸素から保護して保存
する。それは注入直前に再構成される。未修飾ペプチド
がマウスｐ５３ａｓタンパク質に対するポリクローナル
抗体の製造において成功したので、それを最初の免疫原
として使用する。免疫感作を改良するために必要ならば
使用されるであろう選択枝には、もう一つ別のタンパク
質（例えば、オバルブミン、またはＫＬＨ）への結合、
またはバキュロウイルスベクター系を使用して昆虫細胞
において製造した全長ｐ５３ａｓタンパク質の使用が含
まれる。ｐ５３ａｓのｃＤＮＡを含むそのようなベクタ
ーはマウスｐ５３ａｓタンパク質の製造のために当実験
室で既に作られていた。各マウスに対して、２５０μｌ
（３０から５０μｇのペプチド）を等量の完全フロイン
トアジュバンドで乳化する。
疫のための一般的操作方法−モノクローナル抗体の製造 使用するべき操作法はモノクローナル抗体を製造するた
めの標準的な操作法に基づく。哺乳類由来のｐ５３ａｓ
ペプチドを使用するまで光および酸素から保護して保存
する。それは注入直前に再構成される。未修飾ペプチド
がマウスｐ５３ａｓタンパク質に対するポリクローナル
抗体の製造において成功したので、それを最初の免疫原
として使用する。免疫感作を改良するために必要ならば
使用されるであろう選択枝には、もう一つ別のタンパク
質（例えば、オバルブミン、またはＫＬＨ）への結合、
またはバキュロウイルスベクター系を使用して昆虫細胞
において製造した全長ｐ５３ａｓタンパク質の使用が含
まれる。ｐ５３ａｓのｃＤＮＡを含むそのようなベクタ
ーはマウスｐ５３ａｓタンパク質の製造のために当実験
室で既に作られていた。各マウスに対して、２５０μｌ
（３０から５０μｇのペプチド）を等量の完全フロイン
トアジュバンドで乳化する。
【００３２】この乳濁液を、ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（各
体重は約２０ｇ）に対して、背部に沿った複数の部位の
皮膚内に、および腹腔内に注入する（もし免疫感作応答
を改良することが必要ならば、選択マウス株が使用され
るであろう）。４週間後、不完全フロイントアジュバン
ドと混合した１００μｌ（２０μｇのペプチド）の腹腔
内注入とともにマウスの追加免疫を行う。２週間後、血
清について、供給された説明書に従って、ＥＬＩＳＡに
よって抗体力価を試験する。融合の３日前に、最良の応
答株をアジュバンドなしの１００μｌ（２０μｇのペプ
チド）の静脈内注入によって再追加免疫する。
体重は約２０ｇ）に対して、背部に沿った複数の部位の
皮膚内に、および腹腔内に注入する（もし免疫感作応答
を改良することが必要ならば、選択マウス株が使用され
るであろう）。４週間後、不完全フロイントアジュバン
ドと混合した１００μｌ（２０μｇのペプチド）の腹腔
内注入とともにマウスの追加免疫を行う。２週間後、血
清について、供給された説明書に従って、ＥＬＩＳＡに
よって抗体力価を試験する。融合の３日前に、最良の応
答株をアジュバンドなしの１００μｌ（２０μｇのペプ
チド）の静脈内注入によって再追加免疫する。
【００３３】細胞融合融合のためのミエローマ細胞の調製 ミエローマ細胞を液体窒素から融解し、融合の１週間前
に培養を始める。細胞を融合の１日前に５×１０5 細胞
／ｍｌの細胞密度に達するように成長させる。融合の朝
に、１０ｍｌの培養細胞を等量のＣＭＥＭで希釈する。完全培地調製（ＣＭＥＭ）： ０．５ｍｌ 硫酸ゲンタマイシン ５．０ｍｌ ピルビン酸貯蔵溶液 ５．０ｍｌ ヒポキサンチン貯蔵溶液 ５．０ｍｌ チミジン貯蔵溶液 ５．０ｍｌ オキサロ酢酸貯蔵溶液 ５．０ｍｌ ペニシリンＧ貯蔵溶液 ５．０ｍｌ ウシインシュリン貯蔵溶液 ５０ｍｌ ＮＣＴＣ１０９（MA Bioproducts） １００ｍｌ ウシ胎児血清（熱不活性化） 上記の溶液を滅菌した５００ｍｌの瓶に入れ、容量をダ
ルベッコのＭＥＭ（Ｌ−グルタミンを含み、４５００ｍ
ｇ／ＬのＤ−グルコースを含み、ピルビン酸ナトリウム
を含まない、Gibco ）で５００ｍｌに調整する。培地を
０．２ミクロンのろ過によって滅菌し、３７℃で一晩イ
ンキュベートすることによって汚染を試験した。ＣＭＥ
Ｍは４℃で貯蔵して２週間以内に使用した。
に培養を始める。細胞を融合の１日前に５×１０5 細胞
／ｍｌの細胞密度に達するように成長させる。融合の朝
に、１０ｍｌの培養細胞を等量のＣＭＥＭで希釈する。完全培地調製（ＣＭＥＭ）： ０．５ｍｌ 硫酸ゲンタマイシン ５．０ｍｌ ピルビン酸貯蔵溶液 ５．０ｍｌ ヒポキサンチン貯蔵溶液 ５．０ｍｌ チミジン貯蔵溶液 ５．０ｍｌ オキサロ酢酸貯蔵溶液 ５．０ｍｌ ペニシリンＧ貯蔵溶液 ５．０ｍｌ ウシインシュリン貯蔵溶液 ５０ｍｌ ＮＣＴＣ１０９（MA Bioproducts） １００ｍｌ ウシ胎児血清（熱不活性化） 上記の溶液を滅菌した５００ｍｌの瓶に入れ、容量をダ
ルベッコのＭＥＭ（Ｌ−グルタミンを含み、４５００ｍ
ｇ／ＬのＤ−グルコースを含み、ピルビン酸ナトリウム
を含まない、Gibco ）で５００ｍｌに調整する。培地を
０．２ミクロンのろ過によって滅菌し、３７℃で一晩イ
ンキュベートすることによって汚染を試験した。ＣＭＥ
Ｍは４℃で貯蔵して２週間以内に使用した。
【００３４】融合のための脾臓細胞の調製 マウスを殺し、脾臓を無菌的に除去する。汚染している
組織は解剖して捨てる。脾臓をステンレス鋼メッシュ上
に置き細胞を解放させる。脾臓細胞を血清を含まない１
０ｍｌの培地で２回洗浄し、細胞の数を数える。 細胞融合 ミエローマ細胞を１回洗浄し、血清を含まない培地中に
再懸濁する。ミエローマ細胞および脾臓細胞（１：１
０）を血清を含まない培地中で混合する。これらの細胞
を８００ｇで５分間一緒に遠心する。上清を除去する。
５０％ＰＥＧ１５００を１分以上かけてゆっくりと細胞
ペレットに添加する一方、ピペットの先端で攪拌するこ
とによって細胞を再懸濁する。攪拌をさらに１分間続け
る。次いで、血清を含まない１ｍｌの培地をさらに続く
１分以上をかけて細胞懸濁液に添加する。最後に、９ｍ
ｌの培地を攪拌しながら２分以上かけて添加する。細胞
を４００ｇで５分間遠心する。上清を除去し、細胞を３
０ｍｌのＨＡＴ培地中に再懸濁した。
組織は解剖して捨てる。脾臓をステンレス鋼メッシュ上
に置き細胞を解放させる。脾臓細胞を血清を含まない１
０ｍｌの培地で２回洗浄し、細胞の数を数える。 細胞融合 ミエローマ細胞を１回洗浄し、血清を含まない培地中に
再懸濁する。ミエローマ細胞および脾臓細胞（１：１
０）を血清を含まない培地中で混合する。これらの細胞
を８００ｇで５分間一緒に遠心する。上清を除去する。
５０％ＰＥＧ１５００を１分以上かけてゆっくりと細胞
ペレットに添加する一方、ピペットの先端で攪拌するこ
とによって細胞を再懸濁する。攪拌をさらに１分間続け
る。次いで、血清を含まない１ｍｌの培地をさらに続く
１分以上をかけて細胞懸濁液に添加する。最後に、９ｍ
ｌの培地を攪拌しながら２分以上かけて添加する。細胞
を４００ｇで５分間遠心する。上清を除去し、細胞を３
０ｍｌのＨＡＴ培地中に再懸濁した。
【００３５】ＨＡＴ培地の調製：ＨＡＴ培地を、培地を
１００ｍｌの全容量にする前に１．０ｍｌのアミノプテ
リン貯蔵溶液および１．０ｍｌのグリシン貯蔵溶液を添
加する以外はＣＭＥＭと同様に調製する。１００ｍｌの
細胞を９６穴プレートの穴に分配する。プレートを５％
ＣＯ2 大気下でインキュベートする。 単一の細胞のクローニング ＥＬＩＳＡによるポジティブクローンのスクリーニン
グ。約５０μｌの培養上清を、抗体に適当なｐ５３ａｓ
合成ペプチド（マウスまたはヒトｐ５３ａｓペプチド）
で被覆したもう一つ別の９６穴マイクロタイタープレー
トの穴に植える。ポジティブクローンを供給された説明
書に示されるようにＥＬＩＳＡによって検出する。
１００ｍｌの全容量にする前に１．０ｍｌのアミノプテ
リン貯蔵溶液および１．０ｍｌのグリシン貯蔵溶液を添
加する以外はＣＭＥＭと同様に調製する。１００ｍｌの
細胞を９６穴プレートの穴に分配する。プレートを５％
ＣＯ2 大気下でインキュベートする。 単一の細胞のクローニング ＥＬＩＳＡによるポジティブクローンのスクリーニン
グ。約５０μｌの培養上清を、抗体に適当なｐ５３ａｓ
合成ペプチド（マウスまたはヒトｐ５３ａｓペプチド）
で被覆したもう一つ別の９６穴マイクロタイタープレー
トの穴に植える。ポジティブクローンを供給された説明
書に示されるようにＥＬＩＳＡによって検出する。
【００３６】ポジティブクローンの保存。ポジティブの
穴を同定した後、細胞を９６穴プレートから同じ培地を
含む２４穴プレートの穴に移動する。２４穴プレートの
培養が集密になった後に、それを１００ｍｍ皿に移す。
１００ｍｍ皿の段階で細胞を凍結する。
穴を同定した後、細胞を９６穴プレートから同じ培地を
含む２４穴プレートの穴に移動する。２４穴プレートの
培養が集密になった後に、それを１００ｍｍ皿に移す。
１００ｍｍ皿の段階で細胞を凍結する。
【００３７】限界希釈 クローニングの前日に、脾臓細胞懸濁液を上記の融合技
術中に記載した操作方法に従って調製する。穴当たり１
０3 の脾臓細胞を９６穴プレート中に植える（穴当たり
一滴を使用）。２５ｃｍ2 フラスコからの最小の１０5
の増殖性ハイブリドーマ細胞をクローニングのために使
用する。ハイブリドーマ細胞を、活発に成長している培
養物を新鮮な培地で１：１に希釈することによって、ク
ローニングに先立ち２４〜４８時間予備培養する。中間
対数（mid-log ）期の細胞を限界希釈のために使用す
る。細胞数をｍｌ当たり１０5 個の生育細胞に調節する
（細胞の生育度は７０％以上）。
術中に記載した操作方法に従って調製する。穴当たり１
０3 の脾臓細胞を９６穴プレート中に植える（穴当たり
一滴を使用）。２５ｃｍ2 フラスコからの最小の１０5
の増殖性ハイブリドーマ細胞をクローニングのために使
用する。ハイブリドーマ細胞を、活発に成長している培
養物を新鮮な培地で１：１に希釈することによって、ク
ローニングに先立ち２４〜４８時間予備培養する。中間
対数（mid-log ）期の細胞を限界希釈のために使用す
る。細胞数をｍｌ当たり１０5 個の生育細胞に調節する
（細胞の生育度は７０％以上）。
【００３８】連続的な１０倍の希釈を作製する（例え
ば、ｍｌ当たり１０4 、１０3 ）。５０ｍｌチューブ中
において、０．３０ｍｌの１０3 個のハイブリドーマ細
胞をｍｌ当たり添加し、２９．７ｍｌのＣＭＥＭを添加
する。細胞懸濁液の２．０ｍｌ（５０μｌ）のピペット
からの１滴を、クローニング前日に調製した脾臓細胞を
含む９６穴プレートの各穴に添加する。培養液を２〜３
日ごとに観察し、一つの細胞クローンを有する穴に印を
つける。クローンが穴の２５％を覆うようになった時点
で、ＥＬＩＳＡによってクローンの抗−ｐ５３ａｓ活性
を分析する。ポジティブクローンを２４穴プレート、１
００ｍｍ皿に移し、次いでハイブリドーマ細胞をNuncの
凍結チューブ(cryotubes）中で凍結保存する。
ば、ｍｌ当たり１０4 、１０3 ）。５０ｍｌチューブ中
において、０．３０ｍｌの１０3 個のハイブリドーマ細
胞をｍｌ当たり添加し、２９．７ｍｌのＣＭＥＭを添加
する。細胞懸濁液の２．０ｍｌ（５０μｌ）のピペット
からの１滴を、クローニング前日に調製した脾臓細胞を
含む９６穴プレートの各穴に添加する。培養液を２〜３
日ごとに観察し、一つの細胞クローンを有する穴に印を
つける。クローンが穴の２５％を覆うようになった時点
で、ＥＬＩＳＡによってクローンの抗−ｐ５３ａｓ活性
を分析する。ポジティブクローンを２４穴プレート、１
００ｍｍ皿に移し、次いでハイブリドーマ細胞をNuncの
凍結チューブ(cryotubes）中で凍結保存する。
【００３９】腹水製造 ８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスに０．４ｍｌのプリスタンを
腹腔内に注入した。２週間後、中間対数期の０．５ｍｌ
の細胞（１０5 細胞）を各プリスタン処理マウスに注入
する。２〜３週間後、マウスを殺し腹水液体を採取す
る。腹水を１０００ｇで１０分間遠心し、中間層を回収
し、−２０℃で保存する。モノクローナル抗体の適当な
細胞（マウスまたはヒト）中のｐ５３ａｓに対する特異
性を、ＥＬＩＳＡ、間接免疫蛍光、免疫沈降およびウェ
スタンイムノブロッティングによって試験する。製造す
るために使用されたペプチドによって競合的に阻害され
る抗体反応性の能力が試験される。
腹腔内に注入した。２週間後、中間対数期の０．５ｍｌ
の細胞（１０5 細胞）を各プリスタン処理マウスに注入
する。２〜３週間後、マウスを殺し腹水液体を採取す
る。腹水を１０００ｇで１０分間遠心し、中間層を回収
し、−２０℃で保存する。モノクローナル抗体の適当な
細胞（マウスまたはヒト）中のｐ５３ａｓに対する特異
性を、ＥＬＩＳＡ、間接免疫蛍光、免疫沈降およびウェ
スタンイムノブロッティングによって試験する。製造す
るために使用されたペプチドによって競合的に阻害され
る抗体反応性の能力が試験される。
【００４０】合成ｐ５３ａｓペプチドによってラビット
を免疫するための一般的操作方法−ポリクローナル抗体
の製造 使用される操作はポリクローナル抗体を製造するための
標準的操作方法に基づく。哺乳類由来のｐ５３ａｓペプ
チドを使用するまで光および酸素から保護して保存す
る。それは注入直前に再構成される。モノクローナル抗
体製造のために上記したように、未修飾ペプチドを最初
に免疫原として使用するが、もし必要ならば、もう一つ
別のタンパク質との結合が行われたり、全長ｐ５３ａｓ
タンパク質が使用されるであろう。ニュージーランド白
雌ラビット（６−８ １ｂ）（４）を免疫感作のために
使用する。
を免疫するための一般的操作方法−ポリクローナル抗体
の製造 使用される操作はポリクローナル抗体を製造するための
標準的操作方法に基づく。哺乳類由来のｐ５３ａｓペプ
チドを使用するまで光および酸素から保護して保存す
る。それは注入直前に再構成される。モノクローナル抗
体製造のために上記したように、未修飾ペプチドを最初
に免疫原として使用するが、もし必要ならば、もう一つ
別のタンパク質との結合が行われたり、全長ｐ５３ａｓ
タンパク質が使用されるであろう。ニュージーランド白
雌ラビット（６−８ １ｂ）（４）を免疫感作のために
使用する。
【００４１】操作方法 基礎（免疫前）血清は、免疫感作前一週間に回収する。 （０日目） １頭のラビット当たり５００μｇのペプチ
ドをリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中に新しく溶解し、完全
フロイントアジュバンドと混合し（全容量は２ｍｌ以
下）、抗原として使用する。免疫感作は、背部に沿った
複数の部位（少なくとも１０ヶ所）における皮内注入
と、それと同時に行う百日咳ワクチンの筋肉内注入によ
る。 （２１日目） ２５０μｇペプチド／ラビットをＰＢＳ
に新しく溶解し、不完全フロイントアジュバンドと混合
する（全容量は１ｍｌ以下）。注入は背部（少なくとも
１０ヶ所）における皮内に行う。 （２８日目） 血清のために採血する。ＥＬＩＳＡによ
って抗−ｐ５３ａｓ抗体の力価を試験する。 （３５日目） ２１日目と同様に、２５０μｇペプチド
／ラビットで免疫感作する。 （４２日目） 血清のために採血する。 （４９日目） ２１日目および３５日目と同様に２５０
μｇペプチド／ラビットで免疫感作する。 （５６日目および６３日目） 血清のために採血する。 （７７日目） 上記したように２５０μｇペプチド／ラ
ビットで免疫感作する。 （８４日目） 以後週ごとの単位で血清を採血する。休
止、追加免疫を抗体力価（２５０μｇペプチド／ラビッ
ト）を維持するために必要に応じて行う、３週間毎週採
血し、１週間休止し、力価を維持するのに必要ならば追
加免疫とともにこれを繰り返す。
ドをリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中に新しく溶解し、完全
フロイントアジュバンドと混合し（全容量は２ｍｌ以
下）、抗原として使用する。免疫感作は、背部に沿った
複数の部位（少なくとも１０ヶ所）における皮内注入
と、それと同時に行う百日咳ワクチンの筋肉内注入によ
る。 （２１日目） ２５０μｇペプチド／ラビットをＰＢＳ
に新しく溶解し、不完全フロイントアジュバンドと混合
する（全容量は１ｍｌ以下）。注入は背部（少なくとも
１０ヶ所）における皮内に行う。 （２８日目） 血清のために採血する。ＥＬＩＳＡによ
って抗−ｐ５３ａｓ抗体の力価を試験する。 （３５日目） ２１日目と同様に、２５０μｇペプチド
／ラビットで免疫感作する。 （４２日目） 血清のために採血する。 （４９日目） ２１日目および３５日目と同様に２５０
μｇペプチド／ラビットで免疫感作する。 （５６日目および６３日目） 血清のために採血する。 （７７日目） 上記したように２５０μｇペプチド／ラ
ビットで免疫感作する。 （８４日目） 以後週ごとの単位で血清を採血する。休
止、追加免疫を抗体力価（２５０μｇペプチド／ラビッ
ト）を維持するために必要に応じて行う、３週間毎週採
血し、１週間休止し、力価を維持するのに必要ならば追
加免疫とともにこれを繰り返す。
【００４２】抗体のアフィニティー精製 ポリクローナル抗体を、アミノ基を通してアミノリンク
（AminoLink ）カラム（供給される説明書を参照）に結
合しているか、あるいはペプチドがシステインを通して
結合しているようなカラムに結合している好適なペプチ
ド（ヒトまたはマウスｐ５３ａｓ）と複合させることに
よってアフィニティー精製する。約７ｍｇのペプチドが
カラムへの結合のために必要であり、約２５ｍｌの血清
からの抗体をラン当たり精製する。カラムは製造業者の
指示に従って再構成して再使用する。アフィニティー精
製抗体のｐ５３ａｓに対する特異性を、ＥＬＩＳＡ、間
接免疫蛍光法、免疫沈降およびウェスタンイムノブロッ
ティングによって試験する。製造するために使用された
ペプチドによって競合的に阻害される抗体反応性の能力
が試験される。
（AminoLink ）カラム（供給される説明書を参照）に結
合しているか、あるいはペプチドがシステインを通して
結合しているようなカラムに結合している好適なペプチ
ド（ヒトまたはマウスｐ５３ａｓ）と複合させることに
よってアフィニティー精製する。約７ｍｇのペプチドが
カラムへの結合のために必要であり、約２５ｍｌの血清
からの抗体をラン当たり精製する。カラムは製造業者の
指示に従って再構成して再使用する。アフィニティー精
製抗体のｐ５３ａｓに対する特異性を、ＥＬＩＳＡ、間
接免疫蛍光法、免疫沈降およびウェスタンイムノブロッ
ティングによって試験する。製造するために使用された
ペプチドによって競合的に阻害される抗体反応性の能力
が試験される。
【００４３】上記で示したように、腫瘍抑制タンパク質
ｐ５３の生理的変異型であるｐ５３ａｓは、野性型ｐ５
３遺伝子を含む哺乳類上皮細胞において検出された。以
前には内生の野性型ｐ５３ａｓタンパク質が細胞中に検
出されなかったという事実は、その可能性ある存在を認
識することが以前はできなかったこと、その存在の量の
低さおよび抗−ｐ５３モノクローナル抗体ＰＡｂ４２１
との反応性の欠如を含む多数の因子によるものかもしれ
ない。野性型ｐ５３ａｓのｍＲＮＡが主要ｐ５３ＲＮＡ
形態の２５から３３％の割合で正常マウス組織および培
養マウス線維芽細胞中に存在し（Han et al., (b) ）、
選択的にスプライスされたｐ５３のＲＮＡが異なる組織
の型の形質転換された正常の細胞中に存在する（Nuclei
c AcidsRes., 20 (8), 1979-1981 ）ということが以前
に示された。本発明によると、ｐ５３ａｓタンパク質が
細胞中に存在していること、それが正常上皮および腫瘍
細胞では核に局在していて、分化している正常細胞と比
較した場合増殖中において異なって発現していて、ＤＮ
Ａ損傷剤アクチノマイシンＤによってＰＡｂ４２１−お
よびＰＡｂ２４６−反応性ｐ５３と一緒に誘導可能であ
るということが証明された。
ｐ５３の生理的変異型であるｐ５３ａｓは、野性型ｐ５
３遺伝子を含む哺乳類上皮細胞において検出された。以
前には内生の野性型ｐ５３ａｓタンパク質が細胞中に検
出されなかったという事実は、その可能性ある存在を認
識することが以前はできなかったこと、その存在の量の
低さおよび抗−ｐ５３モノクローナル抗体ＰＡｂ４２１
との反応性の欠如を含む多数の因子によるものかもしれ
ない。野性型ｐ５３ａｓのｍＲＮＡが主要ｐ５３ＲＮＡ
形態の２５から３３％の割合で正常マウス組織および培
養マウス線維芽細胞中に存在し（Han et al., (b) ）、
選択的にスプライスされたｐ５３のＲＮＡが異なる組織
の型の形質転換された正常の細胞中に存在する（Nuclei
c AcidsRes., 20 (8), 1979-1981 ）ということが以前
に示された。本発明によると、ｐ５３ａｓタンパク質が
細胞中に存在していること、それが正常上皮および腫瘍
細胞では核に局在していて、分化している正常細胞と比
較した場合増殖中において異なって発現していて、ＤＮ
Ａ損傷剤アクチノマイシンＤによってＰＡｂ４２１−お
よびＰＡｂ２４６−反応性ｐ５３と一緒に誘導可能であ
るということが証明された。
【００４４】アセトン対照におけるＧ２／Ｍ含量以上を
有する細胞の存在は、これらが上皮細胞集団の生理的成
分であることを示唆している。ＬＣ条件下で培養した細
胞において他のｐ５３抗体反応性に対するｐ５３ａｓの
より高い比率は、ｐ５３ａｓが増殖している集団で優先
的に発現していることを示唆している。さらに、Ｇ２／
Ｍおよび＞Ｇ２／Ｍにおけるｐ５３ａｓポジティブ細胞
の分布は、成長停止または成熟経路に反映している可能
性が高い。上皮細胞集団は、増殖している細胞および分
化している細胞または成長が停止した細胞から成り、上
皮において厳格に維持されている成長と分化の均衡を反
映している。増殖に好適な条件（ＬＣ条件、実験操作を
参照）下でさえも、基礎（増殖関連）細胞マーカーは、
プレーティングし分化している細胞が全集団の割合とし
て増加した後、時間とともに失われていく（Kulesz-Mar
tin et al., (1989), "Pemphigoid, pemphigus and des
moplakin as antigenic markers of differentiation i
n normal and tumorigenicmouse keratinocyte lines",
Cell Tissue Kinet, 22, 279-290）。マウスケラチン
細胞は、初代培養確立後３から１９日後の近二倍体また
は近四倍体の安定な集団を含み、二つのモードのＤＮＡ
含量を示す（Kulesz-Martin et al. (1983),"Propertie
s of carcinogen altered mouse epidermal cells resi
stant to calcium-induced terminal differentiatio
n", Carcinogen, 4, 1367-1377 ）。２９１細胞は不完
全四倍体であるが（Kulesz-Martin et al., (1985) "Mo
use cellclones for improved quantitation of carcin
ogen-induced altered differentiation", "Carcinogen
esis" 6, 1245-1254 ）、それらは二倍のＤＮＡ含量を
有する細胞の副集団を生成する能力を保持しているよう
に見える。Davies et al.(1993), "Antioxidants can d
elay liver cell maturation which in turn affects
γ-glutamyltranspeptidase expression", Carcinogen,
14, 47-52は、正常肝臓細胞の細胞質分裂および付随す
る成熟を伴わずに有糸分裂によって生じる２Ｎから４Ｎ
および８Ｎへの倍数性における変化を議論している。彼
らは、部分的肝切除後に、肝臓を再構成することは、周
期を進行している細胞およびＤＮＡ合成および無糸分裂
細胞質分裂を経て単核四倍体細胞になる二核四倍体細胞
の数の増加を含むということを記している。上皮細胞の
集合における＞Ｇ２／ＭのＤＮＡ含量を有する細胞の存
在は、成熟経路に沿った進行を反映している可能性があ
る。アクチノマイシンＤに対する応答におけるｐ５３ａ
ｓ（＋）２９１未形質転換細胞の割合の増加は、ｐ５３
ａｓタンパク質がＤＮＡ損傷誘導性Ｇ１停止においてＰ
Ａｂ４２１およびＰＡｂ２４６によって検出しうるｐ５
３と調和していることを示唆している。しかしながら、
ｐ５３ａｓタンパク質免疫反応性とＧ２／Ｍとの優先的
な関連は対照細胞およびアクチノマイシンＤ処理細胞に
おいて生じ、これは、それが処理の結果よりもむしろＧ
２段階におけるｐ５３ａｓタンパク質の生理学的活性を
反映していることを示唆している。アクチノマイシンＤ
およびγ線処理がＧ１およびＧ２停止を誘発するが、Ｇ
１停止のみがＰＡｂ４２１活性の発生に関連していた
（Kastan et al., supra）ということは興味をそそる。
ｐ５３ａｓタンパク質がＤＮＡ損傷に対する応答におけ
るＧ２／Ｍ停止において役割を有していると推測するこ
ができる。これとは反対に、ｐ５３ポジティブ細胞の割
合が増加したにも係わらず、細胞周期分布におけるアク
チノマイシンＤ依存性の変化が腫瘍細胞において生じな
かったことは、腫瘍細胞では細胞周期停止を経る能力が
欠損していることを示唆する。
有する細胞の存在は、これらが上皮細胞集団の生理的成
分であることを示唆している。ＬＣ条件下で培養した細
胞において他のｐ５３抗体反応性に対するｐ５３ａｓの
より高い比率は、ｐ５３ａｓが増殖している集団で優先
的に発現していることを示唆している。さらに、Ｇ２／
Ｍおよび＞Ｇ２／Ｍにおけるｐ５３ａｓポジティブ細胞
の分布は、成長停止または成熟経路に反映している可能
性が高い。上皮細胞集団は、増殖している細胞および分
化している細胞または成長が停止した細胞から成り、上
皮において厳格に維持されている成長と分化の均衡を反
映している。増殖に好適な条件（ＬＣ条件、実験操作を
参照）下でさえも、基礎（増殖関連）細胞マーカーは、
プレーティングし分化している細胞が全集団の割合とし
て増加した後、時間とともに失われていく（Kulesz-Mar
tin et al., (1989), "Pemphigoid, pemphigus and des
moplakin as antigenic markers of differentiation i
n normal and tumorigenicmouse keratinocyte lines",
Cell Tissue Kinet, 22, 279-290）。マウスケラチン
細胞は、初代培養確立後３から１９日後の近二倍体また
は近四倍体の安定な集団を含み、二つのモードのＤＮＡ
含量を示す（Kulesz-Martin et al. (1983),"Propertie
s of carcinogen altered mouse epidermal cells resi
stant to calcium-induced terminal differentiatio
n", Carcinogen, 4, 1367-1377 ）。２９１細胞は不完
全四倍体であるが（Kulesz-Martin et al., (1985) "Mo
use cellclones for improved quantitation of carcin
ogen-induced altered differentiation", "Carcinogen
esis" 6, 1245-1254 ）、それらは二倍のＤＮＡ含量を
有する細胞の副集団を生成する能力を保持しているよう
に見える。Davies et al.(1993), "Antioxidants can d
elay liver cell maturation which in turn affects
γ-glutamyltranspeptidase expression", Carcinogen,
14, 47-52は、正常肝臓細胞の細胞質分裂および付随す
る成熟を伴わずに有糸分裂によって生じる２Ｎから４Ｎ
および８Ｎへの倍数性における変化を議論している。彼
らは、部分的肝切除後に、肝臓を再構成することは、周
期を進行している細胞およびＤＮＡ合成および無糸分裂
細胞質分裂を経て単核四倍体細胞になる二核四倍体細胞
の数の増加を含むということを記している。上皮細胞の
集合における＞Ｇ２／ＭのＤＮＡ含量を有する細胞の存
在は、成熟経路に沿った進行を反映している可能性があ
る。アクチノマイシンＤに対する応答におけるｐ５３ａ
ｓ（＋）２９１未形質転換細胞の割合の増加は、ｐ５３
ａｓタンパク質がＤＮＡ損傷誘導性Ｇ１停止においてＰ
Ａｂ４２１およびＰＡｂ２４６によって検出しうるｐ５
３と調和していることを示唆している。しかしながら、
ｐ５３ａｓタンパク質免疫反応性とＧ２／Ｍとの優先的
な関連は対照細胞およびアクチノマイシンＤ処理細胞に
おいて生じ、これは、それが処理の結果よりもむしろＧ
２段階におけるｐ５３ａｓタンパク質の生理学的活性を
反映していることを示唆している。アクチノマイシンＤ
およびγ線処理がＧ１およびＧ２停止を誘発するが、Ｇ
１停止のみがＰＡｂ４２１活性の発生に関連していた
（Kastan et al., supra）ということは興味をそそる。
ｐ５３ａｓタンパク質がＤＮＡ損傷に対する応答におけ
るＧ２／Ｍ停止において役割を有していると推測するこ
ができる。これとは反対に、ｐ５３ポジティブ細胞の割
合が増加したにも係わらず、細胞周期分布におけるアク
チノマイシンＤ依存性の変化が腫瘍細胞において生じな
かったことは、腫瘍細胞では細胞周期停止を経る能力が
欠損していることを示唆する。
【００４５】ｐ５３ａｓタンパク質の機能的な特性につ
いての付加的な影響は、他の研究に基づいて作ることが
できる。部位特異的変異誘発または遺伝子欠失マッピン
グによって設計されたｐ５３タンパク質のカルボキシル
末端における変化は、ｐ５３の構造と機能に対して劇的
な影響を有してことが示された（Hupp et al., supra;
図１を参照）。Sturzbecher et al., supra は、Ｃ末端
塩基性残基の損失はｐ５３タンパク質の二量体形成を許
すが四量体形成は許さないことを証明した一方、Hainau
t et al.（ (1992), "Interaction of heat-shock prot
ein 70 with p53 translated in vitro evidence for i
nteraction with dimeric p53 and fora role in the r
egulation of p53 conformation", EMBO J. 11, 3513-3
520）は、ｐ５３の２５個のＣ末端アミノ酸の欠失によ
り、同様に、二量体は生じるがより高い次元の複合体は
生じないことを示した。ｐ５３タンパク質は四量体とし
てＤＮＡに結合するものと考えられているために（Barg
onetti et al., (1992), "Site-specific binding of w
ild-type p53 to cellular DNA is inhibited by SV40
T antigen and mutant p53", Genes & Dev. 6, 1886-18
98; およびStengeret al., (1992), "Formation of sta
ble p53 homotetramers and multiples oftetramers",
Mol. Carcinogen", 5, 102-106）、ｐ５３ａｓの二量体
形成への制限はＤＮＡとのその相互作用に影響している
かもしれない、図２を参照。
いての付加的な影響は、他の研究に基づいて作ることが
できる。部位特異的変異誘発または遺伝子欠失マッピン
グによって設計されたｐ５３タンパク質のカルボキシル
末端における変化は、ｐ５３の構造と機能に対して劇的
な影響を有してことが示された（Hupp et al., supra;
図１を参照）。Sturzbecher et al., supra は、Ｃ末端
塩基性残基の損失はｐ５３タンパク質の二量体形成を許
すが四量体形成は許さないことを証明した一方、Hainau
t et al.（ (1992), "Interaction of heat-shock prot
ein 70 with p53 translated in vitro evidence for i
nteraction with dimeric p53 and fora role in the r
egulation of p53 conformation", EMBO J. 11, 3513-3
520）は、ｐ５３の２５個のＣ末端アミノ酸の欠失によ
り、同様に、二量体は生じるがより高い次元の複合体は
生じないことを示した。ｐ５３タンパク質は四量体とし
てＤＮＡに結合するものと考えられているために（Barg
onetti et al., (1992), "Site-specific binding of w
ild-type p53 to cellular DNA is inhibited by SV40
T antigen and mutant p53", Genes & Dev. 6, 1886-18
98; およびStengeret al., (1992), "Formation of sta
ble p53 homotetramers and multiples oftetramers",
Mol. Carcinogen", 5, 102-106）、ｐ５３ａｓの二量体
形成への制限はＤＮＡとのその相互作用に影響している
かもしれない、図２を参照。
【００４６】Ｍ−８ｃＤＮＡクローン（Arai et al., s
upra）から生体外で翻訳された選択的にスプライスされ
たｐ５３タンパク質の変異の形態の特性が報告されてい
る。Hainaut et al. supraは、生体外翻訳に続いて、Ｍ
−８によってコードされている変異型の選択的にスプラ
イスされたｐ５３タンパク質が一量体および二量体を形
成するが四量体を形成しないことを見つけた。変異型Ｍ
−８タンパク質と同様に、野性型ｐ５３ａｓはＣ末端の
塩基性アミノ酸を失っていたが、二量体形成を許すこと
が示されている酸性アミノ酸は保持している。これらの
結果は、野性型ｐ５３ａｓが主要ｐ５３タンパク質形態
とは異なる特性を有しているという考え方を支持する。
しかしながら、Ｍ−８ｐ５３ｃＤＮＡ配列は、ｎｔ３９
５においてヌクレオチドの置換を有しており、システイ
ン−１３２からフェニルアラニンへの変化を生じさせて
いる。Eliyahu et al. (1990), "Meth a fibrosarcoma
cells express two transforming mutant p53 specie
s", Oncogene 3, 313-321 は、Ｍ−８ｐ５３ｃＤＮＡを
含むプラスミドが、トランスフェクトされた細胞中にお
いて形質転換活性を有していたことを報告した。選択的
スプライシングなしのｐ５３のこの領域内の変異は、腫
瘍抑制機能およびＤＮＡ結合の欠損である（Eliyahu et
al., supra; Finlay et al., (1989) "The p53 proto-
oncogene can act as a suppressor of transformatio
n", Cell, 57, 1083-1093; およびVogelstein et al.,
(1992), supra）。従って、Ｍ−８タンパク質は選択的
スプライシングによるＣ末端の変化とは別にその機能に
影響する変異を有している。ｃＤＮＡクローンＭ−８か
ら翻訳されたｐ５３タンパク質は、ＰＡｂ２４８抗体
（ＰＡｂ２４６のように野性型で立体配置特異的であ
る）とは反応せず、また、Ｃ末端エピトープの欠損のた
めに、ＰＡｂ４２１とも反応しない（Wolf et al., (19
85) supra ）。野性型ｐ５３ａｓが変異型Ｍ−８タンパ
ク質とは異なる立体配置を有しているために、ＤＮＡ結
合のような機能的特性はＭ−８タンパク質の研究からは
予測することができず、直接試験をしなければならな
い。
upra）から生体外で翻訳された選択的にスプライスされ
たｐ５３タンパク質の変異の形態の特性が報告されてい
る。Hainaut et al. supraは、生体外翻訳に続いて、Ｍ
−８によってコードされている変異型の選択的にスプラ
イスされたｐ５３タンパク質が一量体および二量体を形
成するが四量体を形成しないことを見つけた。変異型Ｍ
−８タンパク質と同様に、野性型ｐ５３ａｓはＣ末端の
塩基性アミノ酸を失っていたが、二量体形成を許すこと
が示されている酸性アミノ酸は保持している。これらの
結果は、野性型ｐ５３ａｓが主要ｐ５３タンパク質形態
とは異なる特性を有しているという考え方を支持する。
しかしながら、Ｍ−８ｐ５３ｃＤＮＡ配列は、ｎｔ３９
５においてヌクレオチドの置換を有しており、システイ
ン−１３２からフェニルアラニンへの変化を生じさせて
いる。Eliyahu et al. (1990), "Meth a fibrosarcoma
cells express two transforming mutant p53 specie
s", Oncogene 3, 313-321 は、Ｍ−８ｐ５３ｃＤＮＡを
含むプラスミドが、トランスフェクトされた細胞中にお
いて形質転換活性を有していたことを報告した。選択的
スプライシングなしのｐ５３のこの領域内の変異は、腫
瘍抑制機能およびＤＮＡ結合の欠損である（Eliyahu et
al., supra; Finlay et al., (1989) "The p53 proto-
oncogene can act as a suppressor of transformatio
n", Cell, 57, 1083-1093; およびVogelstein et al.,
(1992), supra）。従って、Ｍ−８タンパク質は選択的
スプライシングによるＣ末端の変化とは別にその機能に
影響する変異を有している。ｃＤＮＡクローンＭ−８か
ら翻訳されたｐ５３タンパク質は、ＰＡｂ２４８抗体
（ＰＡｂ２４６のように野性型で立体配置特異的であ
る）とは反応せず、また、Ｃ末端エピトープの欠損のた
めに、ＰＡｂ４２１とも反応しない（Wolf et al., (19
85) supra ）。野性型ｐ５３ａｓが変異型Ｍ−８タンパ
ク質とは異なる立体配置を有しているために、ＤＮＡ結
合のような機能的特性はＭ−８タンパク質の研究からは
予測することができず、直接試験をしなければならな
い。
【００４７】上記の研究から予測される多量体化ドメイ
ンにおける交代に加えて、ｐ５３ａｓはセリン３８９に
位置するカゼインキナーゼIIリン酸化／５．８ｓｒＲＮ
Ａ結合部位を失っている。変異によるセリン−３８９の
リン酸化部位の損失はｐ５３抗増殖活性の存在をなくす
（Milne et al., (1992), "Mutation of the caseinkin
aseII phosphorylation site abolishes the anti-prol
iferative activityof p53", Nucleic Acids Res. 20,
5565-5570; Bischoff et al., (1992), "Human p53 inh
ibits growth in Schizosaccharomyces pombe", Mol. a
nd Cell. Biol. 12, 405-411; Nigro et al., (1992),
"Human p53 and CDC2Hs genes combine to inhibit the
proliferation of Saccharomyces cerevisiae", Mol.
and Cell. Biol. 12, 1357-1365 ）。Hupp et al., sup
raは、Ｃ末端において作用する因子が、保存されたＣ末
端セリンにおけるリン酸化、そのカルボキシル末端エピ
トープへのＰＡｂ４２１抗体の結合、および最後の３０
個のカルボキシル末端のアミノ酸のタンパク質加水分解
によるまたは設計された損失を含むような、野性型ｐ５
３のＤＮＡ結合能力の活性化にとって重要であることを
示した。さらに、熱ショックタンパク質（Hainaut et a
l., supra ）またはｍｄｍ２（Momand etal. (1992),
"The mdm-2 oncogene product forms a complex with t
he p53 protein and inhibits p53-mediated transacti
vation", Cell 69, 1237-1245 ）のような他の細胞性タ
ンパク質への結合を仲介するｐ５３タンパク質の領域
を、直接的または間接的に変化させることが多分可能で
あろう。
ンにおける交代に加えて、ｐ５３ａｓはセリン３８９に
位置するカゼインキナーゼIIリン酸化／５．８ｓｒＲＮ
Ａ結合部位を失っている。変異によるセリン−３８９の
リン酸化部位の損失はｐ５３抗増殖活性の存在をなくす
（Milne et al., (1992), "Mutation of the caseinkin
aseII phosphorylation site abolishes the anti-prol
iferative activityof p53", Nucleic Acids Res. 20,
5565-5570; Bischoff et al., (1992), "Human p53 inh
ibits growth in Schizosaccharomyces pombe", Mol. a
nd Cell. Biol. 12, 405-411; Nigro et al., (1992),
"Human p53 and CDC2Hs genes combine to inhibit the
proliferation of Saccharomyces cerevisiae", Mol.
and Cell. Biol. 12, 1357-1365 ）。Hupp et al., sup
raは、Ｃ末端において作用する因子が、保存されたＣ末
端セリンにおけるリン酸化、そのカルボキシル末端エピ
トープへのＰＡｂ４２１抗体の結合、および最後の３０
個のカルボキシル末端のアミノ酸のタンパク質加水分解
によるまたは設計された損失を含むような、野性型ｐ５
３のＤＮＡ結合能力の活性化にとって重要であることを
示した。さらに、熱ショックタンパク質（Hainaut et a
l., supra ）またはｍｄｍ２（Momand etal. (1992),
"The mdm-2 oncogene product forms a complex with t
he p53 protein and inhibits p53-mediated transacti
vation", Cell 69, 1237-1245 ）のような他の細胞性タ
ンパク質への結合を仲介するｐ５３タンパク質の領域
を、直接的または間接的に変化させることが多分可能で
あろう。
【００４８】細胞周期中にｐ５３およびｐ５３ａｓタン
パク質の免疫反応性が異なって発現していることから、
各々は異なる機能を有していることが示唆される。おそ
らくｐ５３は、選択的スプライシングによって２つの機
能的に異なるタンパク質を生成する転写因子のクラスに
属することが証明されるかもしれない（Foulkes et a
l., (1992), "More is better: activators and repres
sors from the same gene", Cell 68, 411-414）。例え
ば、（プロモーターおよびエンハンサー領域に結合する
ことによって免疫グロブリンの転写を調節する）ｍＴＦ
Ｅ３因子の場合は、より長いおよびより短いタンパク質
形態が存在する。より短い形態においては、両親媒性ら
せんを形成することが予測されるアミノ酸は存在せず、
転写活性化活性は影響を受ける。ヘテロ二量体化するそ
のような因子の能力は、標的遺伝子の発現の調節の可能
性を増幅する。
パク質の免疫反応性が異なって発現していることから、
各々は異なる機能を有していることが示唆される。おそ
らくｐ５３は、選択的スプライシングによって２つの機
能的に異なるタンパク質を生成する転写因子のクラスに
属することが証明されるかもしれない（Foulkes et a
l., (1992), "More is better: activators and repres
sors from the same gene", Cell 68, 411-414）。例え
ば、（プロモーターおよびエンハンサー領域に結合する
ことによって免疫グロブリンの転写を調節する）ｍＴＦ
Ｅ３因子の場合は、より長いおよびより短いタンパク質
形態が存在する。より短い形態においては、両親媒性ら
せんを形成することが予測されるアミノ酸は存在せず、
転写活性化活性は影響を受ける。ヘテロ二量体化するそ
のような因子の能力は、標的遺伝子の発現の調節の可能
性を増幅する。
【００４９】腫瘍抑制における野性型ｐ５３ａｓの活性
を測定することは重要であろう。ｐ５３の初期のクロー
ンには変異が潜んでいたために、当初は腫瘍遺伝子（on
cogene）であると考えられていたが、野性型ｐ５３のク
ローニングにより腫瘍抑制遺伝子としてのその役割が認
識されている（Finlay et al., supra; and Eliyahuet
al., supra ）。野性型ｐ５３を変異型立体配置に至ら
せるという変異型ｐ５３タンパク質の能力は、優性ネガ
ティブ形質転換遺伝子としてのその潜在力をカバーして
いなかった（Milner, 1984, supra.; および Milner et
al., (a) (1991), "Cotranslation of activated muta
nt p53 with wild type drives the wild-type p53 pro
tein into the mutant conformation", Cell 65, 765-7
74) 。さらに、変異体ｐ５３それ自体は野性型ｐ５３を
有しない細胞内で形質転換活性を有していて、これは増
殖の調節におけるｐ５３の直接の活性を示唆している
（Wolf et al., (1984), "Reconstitution of p53 expr
ession in a nonproducer Ab- MuLV-transformed cell
line by transfection of a functional p53 gene",Cel
l 38, 119-126）。Milner (b) (1991), "The role of p
53 in the normalcontrol of cell proliferation", Cu
rrent Opinion in Cell Biology 3, 282-286は、ｐ５３
がｐ５３の立体配置に依存して細胞周期の調節において
ポジティブおよびネガティブな機能を有していることを
提案した。細胞周期の進行の調節またはアポプトシス
（apoptosis ）の誘発におけるｐ５３のポジティブまた
はネガティブな機能は選択的スプライシングによって生
成されたｐ５３の異なる生理的変異体の相対的発現に基
づくのかもしれないと推測できる。ＤＮＡ結合、転写の
活性化、細胞の形質転換、細胞周期停止およびアポプト
シスにおける野性型ｐ５３およびｐ５３ａｓの異なる機
能的活性を比較するための研究が、これらの可能性を試
験するためには必要であろう。
を測定することは重要であろう。ｐ５３の初期のクロー
ンには変異が潜んでいたために、当初は腫瘍遺伝子（on
cogene）であると考えられていたが、野性型ｐ５３のク
ローニングにより腫瘍抑制遺伝子としてのその役割が認
識されている（Finlay et al., supra; and Eliyahuet
al., supra ）。野性型ｐ５３を変異型立体配置に至ら
せるという変異型ｐ５３タンパク質の能力は、優性ネガ
ティブ形質転換遺伝子としてのその潜在力をカバーして
いなかった（Milner, 1984, supra.; および Milner et
al., (a) (1991), "Cotranslation of activated muta
nt p53 with wild type drives the wild-type p53 pro
tein into the mutant conformation", Cell 65, 765-7
74) 。さらに、変異体ｐ５３それ自体は野性型ｐ５３を
有しない細胞内で形質転換活性を有していて、これは増
殖の調節におけるｐ５３の直接の活性を示唆している
（Wolf et al., (1984), "Reconstitution of p53 expr
ession in a nonproducer Ab- MuLV-transformed cell
line by transfection of a functional p53 gene",Cel
l 38, 119-126）。Milner (b) (1991), "The role of p
53 in the normalcontrol of cell proliferation", Cu
rrent Opinion in Cell Biology 3, 282-286は、ｐ５３
がｐ５３の立体配置に依存して細胞周期の調節において
ポジティブおよびネガティブな機能を有していることを
提案した。細胞周期の進行の調節またはアポプトシス
（apoptosis ）の誘発におけるｐ５３のポジティブまた
はネガティブな機能は選択的スプライシングによって生
成されたｐ５３の異なる生理的変異体の相対的発現に基
づくのかもしれないと推測できる。ＤＮＡ結合、転写の
活性化、細胞の形質転換、細胞周期停止およびアポプト
シスにおける野性型ｐ５３およびｐ５３ａｓの異なる機
能的活性を比較するための研究が、これらの可能性を試
験するためには必要であろう。
【００５０】実験操作方法 細胞 ２９１株は新生ＢＡＬＢ／ｃＲＯＳマウス上皮から得た
ものであり（West Seneca Laboratory, Roswell Park C
ancer Institute ）、生体外および生体内における分化
および形態に関して「正常」である（Kulesz-Martin et
al., (1985)supra.; Kulesz-Martin et al. (1991),
"Tumor progression of murine epidermal cells after
treatment in vitro with 12-0-tetradecanoylphorbol
-13-acetate or retinoic acid", Cancer Research 51,
4701-4706; Schneider et al.,(1993), "7,12-dimethy
lbenz[α]anthracene-induced mouse keratinocyte tra
nsformation without Harvey ras protooncogene mutat
ions", J. Invest. Dermatology, in press ）。細胞
を、Ｃａ2+濃度を減少させるためにchelex-100樹脂（Bi
o-Rad, Rockville Center, NY ）で処理した５％（Ｖ／
Ｖ）胎児子牛血清、未必須アミノ酸、１０％（Ｖ／Ｖ）
マウス皮膚線維芽細胞ならし培地、１０ｎｇ／ｍｌのＥ
ＧＦ（UBI, Lake Placid, NY）、１％（Ｖ／Ｖ）抗生物
質−抗菌物質（１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μ
／ｍｌのストレプトマイシン硫酸塩および０．２５μｇ
／ｍｌのアンホテリシンＢ溶液、GIBCO, Grand Island,
NY ）および０．０２から０．０４ｍＭのＣａ2+を追加
した、ＣａＣｌ2 なしのアール（Earle)の塩を含むイー
グルの最小必須培地（ＬＣと命名）中で成長させた。２
９１細胞を記載されているように生体外で７，１２−ジ
メチルベンズ〔α〕アントラセンに露出した後に、２９
１の腫瘍細胞誘導体（291.03RAT および291.05RAT ）を
扁平腫瘍細胞から単離した（Kulesz-Martin et al., (1
986), "Retinoicacid enhancement of an early step i
n the transformation of mouse epidermal cells In V
itro", Carcinogenesis 7, 1425-1429; Kulesz-Martin
et al., (1991) supra; Kulesz-Martin et al., (1983)
supra ）。腫瘍細胞を、ならし化またはＥＧＦがなく
天然の胎児子牛血清および１．４ｍＭのＣａ2+を含むと
いう点を除けば上記と同じ最小必須培地（ＨＣと命名）
中で成長させた。Moshe Oren博士から得た変異型ｐ５３
のゲノミッククローンを含むプラスミド (pmMTval135-2
3)によってがん細胞291.03RAT をトランスフェクトする
ことによってクローン１１９を得た。それは、３７℃で
主に野性型ｐ５３の立体配置を発現している（未発表の
結果）。
ものであり（West Seneca Laboratory, Roswell Park C
ancer Institute ）、生体外および生体内における分化
および形態に関して「正常」である（Kulesz-Martin et
al., (1985)supra.; Kulesz-Martin et al. (1991),
"Tumor progression of murine epidermal cells after
treatment in vitro with 12-0-tetradecanoylphorbol
-13-acetate or retinoic acid", Cancer Research 51,
4701-4706; Schneider et al.,(1993), "7,12-dimethy
lbenz[α]anthracene-induced mouse keratinocyte tra
nsformation without Harvey ras protooncogene mutat
ions", J. Invest. Dermatology, in press ）。細胞
を、Ｃａ2+濃度を減少させるためにchelex-100樹脂（Bi
o-Rad, Rockville Center, NY ）で処理した５％（Ｖ／
Ｖ）胎児子牛血清、未必須アミノ酸、１０％（Ｖ／Ｖ）
マウス皮膚線維芽細胞ならし培地、１０ｎｇ／ｍｌのＥ
ＧＦ（UBI, Lake Placid, NY）、１％（Ｖ／Ｖ）抗生物
質−抗菌物質（１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μ
／ｍｌのストレプトマイシン硫酸塩および０．２５μｇ
／ｍｌのアンホテリシンＢ溶液、GIBCO, Grand Island,
NY ）および０．０２から０．０４ｍＭのＣａ2+を追加
した、ＣａＣｌ2 なしのアール（Earle)の塩を含むイー
グルの最小必須培地（ＬＣと命名）中で成長させた。２
９１細胞を記載されているように生体外で７，１２−ジ
メチルベンズ〔α〕アントラセンに露出した後に、２９
１の腫瘍細胞誘導体（291.03RAT および291.05RAT ）を
扁平腫瘍細胞から単離した（Kulesz-Martin et al., (1
986), "Retinoicacid enhancement of an early step i
n the transformation of mouse epidermal cells In V
itro", Carcinogenesis 7, 1425-1429; Kulesz-Martin
et al., (1991) supra; Kulesz-Martin et al., (1983)
supra ）。腫瘍細胞を、ならし化またはＥＧＦがなく
天然の胎児子牛血清および１．４ｍＭのＣａ2+を含むと
いう点を除けば上記と同じ最小必須培地（ＨＣと命名）
中で成長させた。Moshe Oren博士から得た変異型ｐ５３
のゲノミッククローンを含むプラスミド (pmMTval135-2
3)によってがん細胞291.03RAT をトランスフェクトする
ことによってクローン１１９を得た。それは、３７℃で
主に野性型ｐ５３の立体配置を発現している（未発表の
結果）。
【００５１】抗体 ｐ５３に対するマウスモノクローナル抗体はＰＡｂ４２
１、ＰＡｂ２４０およびＰＡｂ２４６であった（Oncoge
ne Science, Uniondale, NY ）。イソタイプ（ＩｇＧ2a
（ＰＡｂ４２１およびＰＡｂ２４０）およびＩｇＧ
1 （ＰＡｂ２４６、Becton/Dickinson, Mountain View,
CA ）を血清対照として使用した。ラビットポリクロー
ナル抗体ＣＭ５はDavid Lane博士からの譲受品であっ
た。ｐ５３ａｓに特異的な末端の１７アミノ酸（図１Ｂ
を参照）に対する抗ペプチド抗体を以下のようにして作
製した。ｐ５３ａｓに対する１７アミノ酸ペプチドをＲ
ＰＣＩバイオポリマー（Biopolymer）機関によって合成
し、ＨＰＬＣおよび質量スペクトルによって純度が９０
から９５％であり、アミノ酸配列決定により正確である
ことを確かめた。免疫前血清の回収の後に、ニュージー
ランド白雌ラビットを、百日咳ワクチンの筋肉内注入と
同時に、複数の部位において５００μｇのペプチドと完
全フロイントアジュバンド（ＦＣＡ）を皮内に注入する
ことによって免疫した（RPCI Springville Laboratorie
s ）。３週間後に、さらに２５０μｇのペプチドを不完
全フロイントアジュバンド（ＦＩＡ）とともに３週間の
間、１週間ごとに投与した。４．４ｍｇのｐ５３ａｓペ
プチドを製造業者の指示に従ってアミノリンク（AminoL
ink ）カラム（Pierce, Rockford, IL）に結合すること
によって、ｐ５３ａｓ抗ペプチドをアフィニティー精製
した。硫酸アンモニウム（４０％）で沈澱した免疫前の
血清を対照として使用した。ＥＬＩＳＡ分析における細
胞またはペプチドとの免疫反応に先立って、ｐ５３ａｓ
ペプチド（図１に示す配列）または未関連ペプチド（配
列：GRNDCIIDKIRRKNCD）とともに室温で２時間抗体（重
量比で１：１）をインキュベートすることによって競合
分析を行った。
１、ＰＡｂ２４０およびＰＡｂ２４６であった（Oncoge
ne Science, Uniondale, NY ）。イソタイプ（ＩｇＧ2a
（ＰＡｂ４２１およびＰＡｂ２４０）およびＩｇＧ
1 （ＰＡｂ２４６、Becton/Dickinson, Mountain View,
CA ）を血清対照として使用した。ラビットポリクロー
ナル抗体ＣＭ５はDavid Lane博士からの譲受品であっ
た。ｐ５３ａｓに特異的な末端の１７アミノ酸（図１Ｂ
を参照）に対する抗ペプチド抗体を以下のようにして作
製した。ｐ５３ａｓに対する１７アミノ酸ペプチドをＲ
ＰＣＩバイオポリマー（Biopolymer）機関によって合成
し、ＨＰＬＣおよび質量スペクトルによって純度が９０
から９５％であり、アミノ酸配列決定により正確である
ことを確かめた。免疫前血清の回収の後に、ニュージー
ランド白雌ラビットを、百日咳ワクチンの筋肉内注入と
同時に、複数の部位において５００μｇのペプチドと完
全フロイントアジュバンド（ＦＣＡ）を皮内に注入する
ことによって免疫した（RPCI Springville Laboratorie
s ）。３週間後に、さらに２５０μｇのペプチドを不完
全フロイントアジュバンド（ＦＩＡ）とともに３週間の
間、１週間ごとに投与した。４．４ｍｇのｐ５３ａｓペ
プチドを製造業者の指示に従ってアミノリンク（AminoL
ink ）カラム（Pierce, Rockford, IL）に結合すること
によって、ｐ５３ａｓ抗ペプチドをアフィニティー精製
した。硫酸アンモニウム（４０％）で沈澱した免疫前の
血清を対照として使用した。ＥＬＩＳＡ分析における細
胞またはペプチドとの免疫反応に先立って、ｐ５３ａｓ
ペプチド（図１に示す配列）または未関連ペプチド（配
列：GRNDCIIDKIRRKNCD）とともに室温で２時間抗体（重
量比で１：１）をインキュベートすることによって競合
分析を行った。
【００５２】酵素結合免疫吸収分析（ＥＬＩＳＡ） Nunc-Immuno MaxiSorb９６穴プレート（Nunc, Denmark
）を、１５ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．
６）中の５０ｎｇ／穴のｐ５３ａｓペプチドで被覆し
た。ＰＢＳ中で２％ＢＳＡ（KPL, Gaithersburg, MD ）
で３７℃で１時間ブロッキングした後、抗−ｐ５３モノ
クローナル抗体、抗−ｐ５３ａｓ抗体（ペプチドに対し
てアフィニティー精製したもの）または免疫前血清対照
（Pre-I ）を１／５０から１／６４０，０００に希釈
し、１００μの容量で穴に添加した。二次抗体はペルオ
キシダーゼ結合ヤギ抗ラビット免疫グロブリン（DAKO,
Carpinteria, CA ）を１／１０００で使用した。ＴＭＢ
ペルオキシダーゼ基質系溶液（KPL,Gaithersburg, MD
）を添加し、発色を４ＭのＨ2 ＳＯ4 を使用して４分
後に終止させた。４５０ｎｍにおける吸収をBioTek プ
レート読み取り機（Winooski,VT）を使用して検出し
た。
）を、１５ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．
６）中の５０ｎｇ／穴のｐ５３ａｓペプチドで被覆し
た。ＰＢＳ中で２％ＢＳＡ（KPL, Gaithersburg, MD ）
で３７℃で１時間ブロッキングした後、抗−ｐ５３モノ
クローナル抗体、抗−ｐ５３ａｓ抗体（ペプチドに対し
てアフィニティー精製したもの）または免疫前血清対照
（Pre-I ）を１／５０から１／６４０，０００に希釈
し、１００μの容量で穴に添加した。二次抗体はペルオ
キシダーゼ結合ヤギ抗ラビット免疫グロブリン（DAKO,
Carpinteria, CA ）を１／１０００で使用した。ＴＭＢ
ペルオキシダーゼ基質系溶液（KPL,Gaithersburg, MD
）を添加し、発色を４ＭのＨ2 ＳＯ4 を使用して４分
後に終止させた。４５０ｎｍにおける吸収をBioTek プ
レート読み取り機（Winooski,VT）を使用して検出し
た。
【００５３】免疫蛍光 細胞を１００％の冷エタノールに浸透させ、ＰＡＢ（Ｐ
ＢＳ＋０．１％Na−アザイド＋０．５％ＢＳＡ）＋０．
０５％Tween 20中で１０分間再水和させ、５％の正常ヤ
ギ血清（Vector Labs, Burlingame, CA ）で固定し、次
いで、１０μｇ／ｍｌの各モノクローナル抗−ｐ５３抗
体ＰＡｂ４２１、２４０または２４６または対照イソタ
イプ血清ＩｇＧ2aまたはＩｇＧ1 に４℃で一晩露出し
た。モノクローナル抗体に対する二次抗体は、フルオレ
セインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ヤギ抗マウ
ス免疫グロブリン（FisherBiotech, Pittsburgh, PA ）
の１／３００の希釈物であった。アフィニティー精製ラ
ビットポリクローナル抗−ｐ５３ａｓまたは対照として
の硫酸アンモニウム画分免疫前血清を７μｇ／ｍｌで使
用し、次いで１／３００のテキサスレッド結合ヤギ抗ラ
ビット免疫グロブリン（Oncogene Science）を使用し
た。カバースリップをスライドに付着させるためにFluo
rSave 水性固定剤（Calbiochem, LaJolla, CA ）を使用
した。蛍光は外発光体を備えたニコン・ラボフォト（La
bophot）顕微鏡を使用して観察した。顕微鏡写真をニコ
ンＵＦＸ−ＩＩＡ自動カメラシステムを使用して取っ
た。
ＢＳ＋０．１％Na−アザイド＋０．５％ＢＳＡ）＋０．
０５％Tween 20中で１０分間再水和させ、５％の正常ヤ
ギ血清（Vector Labs, Burlingame, CA ）で固定し、次
いで、１０μｇ／ｍｌの各モノクローナル抗−ｐ５３抗
体ＰＡｂ４２１、２４０または２４６または対照イソタ
イプ血清ＩｇＧ2aまたはＩｇＧ1 に４℃で一晩露出し
た。モノクローナル抗体に対する二次抗体は、フルオレ
セインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ヤギ抗マウ
ス免疫グロブリン（FisherBiotech, Pittsburgh, PA ）
の１／３００の希釈物であった。アフィニティー精製ラ
ビットポリクローナル抗−ｐ５３ａｓまたは対照として
の硫酸アンモニウム画分免疫前血清を７μｇ／ｍｌで使
用し、次いで１／３００のテキサスレッド結合ヤギ抗ラ
ビット免疫グロブリン（Oncogene Science）を使用し
た。カバースリップをスライドに付着させるためにFluo
rSave 水性固定剤（Calbiochem, LaJolla, CA ）を使用
した。蛍光は外発光体を備えたニコン・ラボフォト（La
bophot）顕微鏡を使用して観察した。顕微鏡写真をニコ
ンＵＦＸ−ＩＩＡ自動カメラシステムを使用して取っ
た。
【００５４】免疫沈降 集密前の培養細胞（約５〜１０×１０6 細胞／１００ｍ
ｍペトリ皿）を、２％（Ｖ／Ｖ）透析牛血清を含みメチ
オニンを含まない最小必須培地中で３７℃で４時間２０
０μＣｉのＬ−〔35Ｓ〕メチオニン（１１２０Ｃｉ／mm
ol）とともにインキュベートした。標識細胞を１％（Ｖ
／Ｖ）ノニデット（nonidet ）Ｐ−４０、１５０ｍＭの
ＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８）、１ｍＭのフェ
ニルメチルスルホニルフルオリドを含む緩衝液中で４℃
で３０分間溶解し、１０，０００×ｇで１０分間遠心し
た。上清をホルマリンで固定したスタフィロコッカス・
オレウス（Staphylococcus aureus ）細胞（イムノプリ
シピチン, BRL, Gaithersburg, MD ）またはプロテイン
Ａ−セファロース（Pharmacia, Piscataway, NJ ）で予
め洗浄した。等量の放射活性（２×１０7 ｃｐｍ）に対
応する容量の溶解物を、マウス（murine）ｐ５３または
イソタイプに対する抗体または血清対照とともに４℃で
１６時間、ＮＥＴ／Ｇｅｌ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣ
ｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．
４）、０．０５％のＮＰ−４０、０．０２５のＮａＮ3
および０．２５％のゼラチン）中でインキュベートし
た。免疫複合体をイムノプリシピチンまたは５ｍｇのプ
ロテイン−ＡセファロースＣＬ−４Ｂ（Pharmacia ）と
ともに４℃で２時間免疫沈降させ、１０，０００×ｇで
１０分間遠心した。ペレットをＮＥＴ／Ｇｅｌ緩衝液で
洗浄し、８５℃で５から１５分間加熱し１０，０００×
ｇで１０分間遠心することによってローディング緩衝液
（２％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、１０％（Ｖ／Ｖ）グリセロー
ル、１２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．８）、０．００１
％（Ｗ／Ｖ）ブロモフェノールブルー）中に溶出した。
上清を、４％スタッキングゲル（１２５ｍＭのトリス塩
酸（ｐＨ６．８）、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ）および
１０％の分離ゲル（３７５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．
８）、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ）から成る変性ポリア
クリルアミドゲル上に充填し、泳動緩衝液（１２５ｍＭ
のトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１９２ｍＭのグリシン、
０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ）中で３５ｍＡで電気泳動を
行った。ゲルを７．５％（Ｖ／Ｖ）酢酸／２５％（Ｖ／
Ｖ）メタノール中で固定し、増強溶液（NEN, Boston, M
A ）中に浸し、乾燥し、増強スクリーンを使用して−８
０℃でＸＡＲフィルム（Kodak, Rochester, NY）に感光
させた。
ｍペトリ皿）を、２％（Ｖ／Ｖ）透析牛血清を含みメチ
オニンを含まない最小必須培地中で３７℃で４時間２０
０μＣｉのＬ−〔35Ｓ〕メチオニン（１１２０Ｃｉ／mm
ol）とともにインキュベートした。標識細胞を１％（Ｖ
／Ｖ）ノニデット（nonidet ）Ｐ−４０、１５０ｍＭの
ＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８）、１ｍＭのフェ
ニルメチルスルホニルフルオリドを含む緩衝液中で４℃
で３０分間溶解し、１０，０００×ｇで１０分間遠心し
た。上清をホルマリンで固定したスタフィロコッカス・
オレウス（Staphylococcus aureus ）細胞（イムノプリ
シピチン, BRL, Gaithersburg, MD ）またはプロテイン
Ａ−セファロース（Pharmacia, Piscataway, NJ ）で予
め洗浄した。等量の放射活性（２×１０7 ｃｐｍ）に対
応する容量の溶解物を、マウス（murine）ｐ５３または
イソタイプに対する抗体または血清対照とともに４℃で
１６時間、ＮＥＴ／Ｇｅｌ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣ
ｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．
４）、０．０５％のＮＰ−４０、０．０２５のＮａＮ3
および０．２５％のゼラチン）中でインキュベートし
た。免疫複合体をイムノプリシピチンまたは５ｍｇのプ
ロテイン−ＡセファロースＣＬ−４Ｂ（Pharmacia ）と
ともに４℃で２時間免疫沈降させ、１０，０００×ｇで
１０分間遠心した。ペレットをＮＥＴ／Ｇｅｌ緩衝液で
洗浄し、８５℃で５から１５分間加熱し１０，０００×
ｇで１０分間遠心することによってローディング緩衝液
（２％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、１０％（Ｖ／Ｖ）グリセロー
ル、１２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．８）、０．００１
％（Ｗ／Ｖ）ブロモフェノールブルー）中に溶出した。
上清を、４％スタッキングゲル（１２５ｍＭのトリス塩
酸（ｐＨ６．８）、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ）および
１０％の分離ゲル（３７５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．
８）、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ）から成る変性ポリア
クリルアミドゲル上に充填し、泳動緩衝液（１２５ｍＭ
のトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１９２ｍＭのグリシン、
０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ）中で３５ｍＡで電気泳動を
行った。ゲルを７．５％（Ｖ／Ｖ）酢酸／２５％（Ｖ／
Ｖ）メタノール中で固定し、増強溶液（NEN, Boston, M
A ）中に浸し、乾燥し、増強スクリーンを使用して−８
０℃でＸＡＲフィルム（Kodak, Rochester, NY）に感光
させた。
【００５５】アクチノマイシンＤによる処理 カバースリップ上の細胞を０．２５ｎＭまたは０．５ｎ
ＭのアクチノマイシンＤ（Sigma, St. Louis, MO）また
は０．２％アセトンで４８時間処理するが、これはプレ
ーティング後２４時間後に始め、上記したように間接免
疫蛍光によって染色した。流動細胞計測法または細胞Ｒ
ＮＡの単離のために、約２から４×１０ 6 細胞／ｃｍ2
を１５０ｍｍプレートに接種し、７０％集密まで生育さ
せ、回収前に４８時間０．５ｎＭのアクチノマイシンＤ
で処理した。
ＭのアクチノマイシンＤ（Sigma, St. Louis, MO）また
は０．２％アセトンで４８時間処理するが、これはプレ
ーティング後２４時間後に始め、上記したように間接免
疫蛍光によって染色した。流動細胞計測法または細胞Ｒ
ＮＡの単離のために、約２から４×１０ 6 細胞／ｃｍ2
を１５０ｍｍプレートに接種し、７０％集密まで生育さ
せ、回収前に４８時間０．５ｎＭのアクチノマイシンＤ
で処理した。
【００５６】ノーザンブロット分析 ＲＮＡをグアニジン／塩化セシウム抽出によって約７０
から１００％集密の細胞から単離し、前記したようにノ
ーザンブロット分析のためのジエチルピロカルボネート
処理水に溶解した（Han et al. (1990), "Altered leve
ls of endogenous retrovirus-like sequence (VL30) R
NA during mouse epidermal cell carcinogenesis", Mo
l. Carcinogenesis 3:75-82 ）。Ｐ５３−４２２の５０
０塩基対のPst I 断片をｐ５３の検出のために使用し
（Oren et al. (1983), "Molecularcloning of a cDNA
specific for the murine p53 cellular tumor antige
n",Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 56-59 ）、ｐＡ
６の８４０ｂｐのEcoRI-SalI断片をＲＮＡローディング
のための対照として７ＳのＲＮＡ検出のために使用した
（Balmain et al., (1982), "Cloning and characteriz
ation of the abundant cytoplasmic 7S RNA from the
mouse cells", Nucleic Acids, Res., 10, 4259-427
7）。プローブをマルチプライム標識キット（Amersham,
Arlington Heights, IL ）を使用するランダムプライ
マー法によって〔α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰで標識した。３
２Ｐ−標識プローブを１〜２×１０6 cpm/mlの最終濃度
で使用した。ｐ５３ＲＮＡの存在量の相違は、７ＳのＲ
ＮＡに関して調整した後に、感光フィルムの強度によっ
て定量した（Fastscan computing densitometer, Molec
ular Dynamics, Sunnyvale, CA）。
から１００％集密の細胞から単離し、前記したようにノ
ーザンブロット分析のためのジエチルピロカルボネート
処理水に溶解した（Han et al. (1990), "Altered leve
ls of endogenous retrovirus-like sequence (VL30) R
NA during mouse epidermal cell carcinogenesis", Mo
l. Carcinogenesis 3:75-82 ）。Ｐ５３−４２２の５０
０塩基対のPst I 断片をｐ５３の検出のために使用し
（Oren et al. (1983), "Molecularcloning of a cDNA
specific for the murine p53 cellular tumor antige
n",Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 56-59 ）、ｐＡ
６の８４０ｂｐのEcoRI-SalI断片をＲＮＡローディング
のための対照として７ＳのＲＮＡ検出のために使用した
（Balmain et al., (1982), "Cloning and characteriz
ation of the abundant cytoplasmic 7S RNA from the
mouse cells", Nucleic Acids, Res., 10, 4259-427
7）。プローブをマルチプライム標識キット（Amersham,
Arlington Heights, IL ）を使用するランダムプライ
マー法によって〔α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰで標識した。３
２Ｐ−標識プローブを１〜２×１０6 cpm/mlの最終濃度
で使用した。ｐ５３ＲＮＡの存在量の相違は、７ＳのＲ
ＮＡに関して調整した後に、感光フィルムの強度によっ
て定量した（Fastscan computing densitometer, Molec
ular Dynamics, Sunnyvale, CA）。
【００５７】流動細胞計測法 １００％の冷エタノールとともに懸濁液中に浸透させた
細胞を、抗−ｐ５３ａｓのための２次抗体がフィコエリ
トリン（ＰＥ）結合ヤギ抗ラビットＩｇＭおよびＩｇＧ
（FisherBiotech, Pittsburgh, PA ）とした点を除き間
接免疫蛍光に関して上記したのと同じように抗−ｐ５３
抗体に露出した。Hoechst 33342 （１μｇ／ｍｌ、ビス
ベンズイミドＨ、Calbiochem, La Jolla, CA）をＤＮＡ
含量の検出のための流動分析の１時間前に添加した。分
析は、２００ｍＷ、４８８ｎｍでレーザーを放出する一
次レーザーと５０ｍＷ、３５０ｎｍでレーザーを放出す
る二次レーザーを有するFACSTAR+ デュアル５ワットア
ルゴンレーザーシステム（Becton Dickinson Immunocyt
ometry Systems, San Jose, CA）上で行った。ＰＥおよ
びHoechst 放出物を、各々５７５＋／−１３ｎｍおよび
４２４＋／−２２ｎｍのバンドの広さを有する任意のフ
ィルターを通過させた。流動細胞計測データは、Becton
Dickinson標準捕捉ソフトウェアを使用して得て、細胞
の密集および破片を排除し、単一細胞の事象のみを回収
した。データはLysis IIソフトウェアを使用して分析し
た（Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San
Jose,CA）。
細胞を、抗−ｐ５３ａｓのための２次抗体がフィコエリ
トリン（ＰＥ）結合ヤギ抗ラビットＩｇＭおよびＩｇＧ
（FisherBiotech, Pittsburgh, PA ）とした点を除き間
接免疫蛍光に関して上記したのと同じように抗−ｐ５３
抗体に露出した。Hoechst 33342 （１μｇ／ｍｌ、ビス
ベンズイミドＨ、Calbiochem, La Jolla, CA）をＤＮＡ
含量の検出のための流動分析の１時間前に添加した。分
析は、２００ｍＷ、４８８ｎｍでレーザーを放出する一
次レーザーと５０ｍＷ、３５０ｎｍでレーザーを放出す
る二次レーザーを有するFACSTAR+ デュアル５ワットア
ルゴンレーザーシステム（Becton Dickinson Immunocyt
ometry Systems, San Jose, CA）上で行った。ＰＥおよ
びHoechst 放出物を、各々５７５＋／−１３ｎｍおよび
４２４＋／−２２ｎｍのバンドの広さを有する任意のフ
ィルターを通過させた。流動細胞計測データは、Becton
Dickinson標準捕捉ソフトウェアを使用して得て、細胞
の密集および破片を排除し、単一細胞の事象のみを回収
した。データはLysis IIソフトウェアを使用して分析し
た（Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San
Jose,CA）。
【００５８】表１は、in situ の間接免疫蛍光によって
検出されたアクチノマイシンＤに対する291.05RAT がん
細胞の応答を示す。（番号を付けた）２個の実験が示さ
れている。細胞をカバースリップ上に載せ、指示されて
いる濃度（ｎＭ）のアクチノマイシンＤまたは溶媒
（０．２％アセトン）に４８時間露出し、次いでｐ５３
抗体で染色した。全細胞に対する百分率としてのポジテ
ィブ細胞の見積もりをスリップ当たりの全細胞の観察に
基づいて行った（１０の対照、ｐ５３ａｓについての実
験当たり８から１０の処理したスリップ；４の対照、Ｐ
Ａｂ４２１についての実験当たり２から４の処理化；２
の対照およびＰＡｂ２４６についての実験当たり２の処
理化；免疫前およびＩｇＧ対照）。ポジティブ細胞の百
分率の範囲を２個の独立した実験に関して示す。表２
は、ｐ５３抗体反応性によるマウス上皮細胞の細胞周期
分布を示す。細胞を０．５ｎＭのアクチノマイシンＤま
たは溶媒に２日間露出し、採取し、図７および実験操作
に記載したように染色した。示されているデータは、１
２本の別々のチューブ（Ｒ４ネガティブ細胞または全細
胞）、６本のチューブ（抗−ｐ５３ａｓ）または３本ず
つのチューブ（ＰＡｂ４２１およびＰＡｂ２４６）にお
ける２×１０6 個の染色した細胞に基づいて、各抗体に
関してポジティブな細胞の百分率の平均および標準偏差
である。結果は、同じ細胞調製物の２個の別々の実験お
よび２個の染色の代表である。Ｇ０／Ｇ１対Ｇ２／Ｍお
よび＞Ｇ２／Ｍにおける細胞の百分率はある一つの型の
細胞の範囲内においては実験間で一致した。
検出されたアクチノマイシンＤに対する291.05RAT がん
細胞の応答を示す。（番号を付けた）２個の実験が示さ
れている。細胞をカバースリップ上に載せ、指示されて
いる濃度（ｎＭ）のアクチノマイシンＤまたは溶媒
（０．２％アセトン）に４８時間露出し、次いでｐ５３
抗体で染色した。全細胞に対する百分率としてのポジテ
ィブ細胞の見積もりをスリップ当たりの全細胞の観察に
基づいて行った（１０の対照、ｐ５３ａｓについての実
験当たり８から１０の処理したスリップ；４の対照、Ｐ
Ａｂ４２１についての実験当たり２から４の処理化；２
の対照およびＰＡｂ２４６についての実験当たり２の処
理化；免疫前およびＩｇＧ対照）。ポジティブ細胞の百
分率の範囲を２個の独立した実験に関して示す。表２
は、ｐ５３抗体反応性によるマウス上皮細胞の細胞周期
分布を示す。細胞を０．５ｎＭのアクチノマイシンＤま
たは溶媒に２日間露出し、採取し、図７および実験操作
に記載したように染色した。示されているデータは、１
２本の別々のチューブ（Ｒ４ネガティブ細胞または全細
胞）、６本のチューブ（抗−ｐ５３ａｓ）または３本ず
つのチューブ（ＰＡｂ４２１およびＰＡｂ２４６）にお
ける２×１０6 個の染色した細胞に基づいて、各抗体に
関してポジティブな細胞の百分率の平均および標準偏差
である。結果は、同じ細胞調製物の２個の別々の実験お
よび２個の染色の代表である。Ｇ０／Ｇ１対Ｇ２／Ｍお
よび＞Ｇ２／Ｍにおける細胞の百分率はある一つの型の
細胞の範囲内においては実験間で一致した。
【表１】 表１．間接免疫蛍光によって検出しうる291.05RAT 上皮腫瘍細胞のアクチノマイ シンＤに対する応答 ｐ５３ポジティブ細胞（％） 処理 ＰＡｂ４２１ ＰＡｂ２４６ αｐ５３ａｓ １．アセトン ５−７ ２−３ １−６ アクチノＤ 0.5nM ７２−７５ ５７−６０ ４０−６０ ２．アセトン ６−８ ３−５ １−５ アクチノＤ 0.25nM ２５−５０ ４０ ３−５ アクチノＤ 0.5nM ７０−８０ ７０−８０ １５−２０
【表２】 表２．ｐ５３抗体反応性によるマウス上皮細胞の流動細胞計測法による細胞周期 分布細胞 処理 段階 (-)細胞 αp53as PAb421 PAb246 291LC アセトン ＞G2/M 0.6±0.2 33±6 4±0.6 0.3±0.2 G2/M 18±1 43±7 30±3 34±2 S 11±1 9±2 14±3 11±1 G0/G1 70±1 15±2 52±1 48±1 %全細胞 100±0.2 0.5±0.2 8±2 3±0.2 291LC アクチノＤ ＞G2/M 0.3±0.2 3±2 0.5±0.1 0.3±0.2 G2/M 9±2 30±2 10±1 11±1 S 8±0.9 10±1 8±0.4 9±0.5 G0/G1 83±2 56±4 82±1 80±1 %全細胞 100±0.6 2±0.8 36±3 12±1 05RAT アセトン ＞G2/M 1±0.4 23±6 8±1 6±0.5 G2/M 19±2 30±5 32±4 29±1 S 22±2 25±5 24±7 19±3 G0/G1 58±3 23±3 36±5 46±2 %全細胞 97±4 1±0.4 2±0.6 10±2 05RAT アクチノＤ ＞G2/M 1±0.4 3±3 1±1 0.8±0.1 G2/M 15±3 40±5 27±5 26±1 S 20±2 28±6 24±5 25±1 G0/G1 64±4 28±4 48±1 48±1 %全細胞 93±9 1±0.4 10±0.1 23±1
【図１】ｐ５３タンパク質によるＤＮＡ結合の活性化に
ついての提唱された機構の図解
ついての提唱された機構の図解
【図２】ｐ５３ａｓタンパク質の活性のための提唱され
た機構の図解
た機構の図解
【図３】選択的スプライシングによって導入された変化
を示すｐ５３タンパク質のドメイン地図
を示すｐ５３タンパク質のドメイン地図
【図４】ＥＬＩＳＡによって検出された抗−ｐ５３ａｓ
血清およびアフィニティー精製抗体のｐ５３ａｓペプチ
ドとの反応性のグラフ
血清およびアフィニティー精製抗体のｐ５３ａｓペプチ
ドとの反応性のグラフ
【図５】５３ｋｄタンパク質の抗ｐ５３ａｓ免疫沈降
【図６】ｐ５３ａｓ抗原活性の核局在を示す免疫蛍光フ
ィールド
ィールド
【図７】増殖している（ＬＣ）または分化している（Ｈ
Ｃ）未形質転換親２９１細胞からの、および291.03RAT
（０３ＲＡＴ）がん細胞または変異型ｐ５３（バリン−
１３５）をトランスフェクトしたその誘導クローン１１
９からのｐ５３の競合免疫沈降
Ｃ）未形質転換親２９１細胞からの、および291.03RAT
（０３ＲＡＴ）がん細胞または変異型ｐ５３（バリン−
１３５）をトランスフェクトしたその誘導クローン１１
９からのｐ５３の競合免疫沈降
【図８】アクチノマイシンＤによる処理後の291.05RAT
がん細胞中のｐ５３ＲＮＡのノーザンブロット
がん細胞中のｐ５３ＲＮＡのノーザンブロット
【図９】291.05RAT がん細胞中におけるｐ５３（ＰＡｂ
４２１）およびｐ５３ａｓ抗原活性の発現
４２１）およびｐ５３ａｓ抗原活性の発現
【図１０】291.05RAT がん細胞中におけるｐ５３（ＰＡ
ｂ４２１）およびｐ５３ａｓ抗原活性の発現
ｂ４２１）およびｐ５３ａｓ抗原活性の発現
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年９月５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐ５３タンパク質によるＤＮＡ結合の活性化に
ついての提唱された機構の図解
ついての提唱された機構の図解
【図２】ｐ５３ａｓタンパク質の活性のための提唱され
た機構の図解
た機構の図解
【図３】選択的スプライシングによって導入された変化
を示すｐ５３タンパク質のドメイン地図
を示すｐ５３タンパク質のドメイン地図
【図４】ＥＬＩＳＡによって検出された抗−ｐ５３ａｓ
血清およびアフィニティー精製抗体のｐ５３ａｓペプチ
ドとの反応性のグラフ
血清およびアフィニティー精製抗体のｐ５３ａｓペプチ
ドとの反応性のグラフ
【図５】電気泳動による５３ｋｄタンパク質の抗ｐ５３
ａｓ免疫沈降の写真である
ａｓ免疫沈降の写真である
【図６】ｐ５３ａｓ抗原活性の核局在を示す免疫蛍光フ
ィールドの顕微鏡写真
ィールドの顕微鏡写真
【図７】増殖している（ＬＣ）または分化している（Ｈ
Ｃ）未形質転換親２９１細胞からの、および２９１．０
３ＲＡＴ（０３ＲＡＴ）がん細胞または変異型ｐ５３
（バリン−１３５）をトランスフェクトしたその誘導ク
ローン１１９からの電気泳動によるｐ５３の競合免疫沈
降の写真である
Ｃ）未形質転換親２９１細胞からの、および２９１．０
３ＲＡＴ（０３ＲＡＴ）がん細胞または変異型ｐ５３
（バリン−１３５）をトランスフェクトしたその誘導ク
ローン１１９からの電気泳動によるｐ５３の競合免疫沈
降の写真である
【図８】アクチノマイシンＤによる処理後の２９１．０
５ＲＡＴがん細胞中の電気泳動によるｐ５３ＲＮＡのノ
ーザンブロットの写真である
５ＲＡＴがん細胞中の電気泳動によるｐ５３ＲＮＡのノ
ーザンブロットの写真である
【図９】２９１．０５ＲＡＴがん細胞中におけるｐ５３
（ＰＡｂ４２１）およびｐ５３ａｓ抗原活性の発現
（ＰＡｂ４２１）およびｐ５３ａｓ抗原活性の発現
【図１０】２９１．０５ＲＡＴがん細胞中におけるｐ５
３（ＰＡｂ４２１）およびｐ５３ａｓ抗原活性の発現
３（ＰＡｂ４２１）およびｐ５３ａｓ抗原活性の発現
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 15/02 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9358−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｄ 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＵ 39/395 Ｄ Ｎ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ
Claims (19)
- 【請求項１】 哺乳類の正常細胞に存在し、少なくとも
タンパク質のカルボキシ末端の最後の５０アミノ酸まで
は同じ哺乳類の既知の正常な成長調節タンパク質ｐ５３
と本質的に同一であるｐ５３ａｓと命名されるタンパク
質に対して特異的な抗体。 - 【請求項２】 ｐ５３ａｓタンパク質がＳＰＮＣの末端
配列を有している請求項１に記載の抗体。 - 【請求項３】 ｐ５３ａｓタンパク質がＳＰＰＣを含む
末端配列を有している請求項１に記載の抗体。 - 【請求項４】 抗体がポリクローナル抗体である請求項
１に記載の抗体。 - 【請求項５】 抗体がポリクローナル抗体である請求項
２に記載の抗体。 - 【請求項６】 抗体がポリクローナル抗体である請求項
３に記載の抗体。 - 【請求項７】 抗体がモノクローナル抗体である請求項
１に記載の抗体。 - 【請求項８】 抗体がモノクローナル抗体である請求項
２に記載の抗体。 - 【請求項９】 抗体がモノクローナル抗体である請求項
３に記載の抗体。 - 【請求項１０】 哺乳類の正常細胞に存在し、少なくと
もタンパク質のカルボキシ末端の最後の５０アミノ酸ま
では同じ哺乳類の既知の正常な成長調節タンパク質ｐ５
３と本質的に同一であるｐ５３ａｓと命名される精製タ
ンパク質。 - 【請求項１１】 哺乳類のｐ５３ａｓタンパク質中に存
在し、ｐ５３ａｓタンパク質とｐ５３タンパク質を区別
する特定のカルボキシル末端領域と同一であるｐ５３ａ
ｓペプチドと命名される精製ペプチド。 - 【請求項１２】 動物のｐ５３ａｓのｃＤＮＡ配列を含
むプラスミド。 - 【請求項１３】 ｐ５３ａｓ配列の一部がその動物から
の野性型ｐ５３遺伝子の一部と同一である請求項１２に
記載のプラスミド。 - 【請求項１４】 ｐ５３ａｓがマウスのｐ５３ａｓであ
る請求項１２に記載のプラスミド。 - 【請求項１５】 ｐ５３ａｓの動物ｃＤＮＡ配列を含む
ウイルスベクター。 - 【請求項１６】 ベクターがバキュロウイルスベクター
である請求項１５に記載のウイルスベクター。 - 【請求項１７】 ｐ５３ａｓ配列の一部が動物からの野
性型ｐ５３遺伝子の一部と同一である請求項１６に記載
のウイルスベクター。 - 【請求項１８】 ｐ５３ａｓがマウスのｐ５３ａｓであ
る請求項１５に記載のウイルスベクター。 - 【請求項１９】 ｐ５３ａｓがマウスのｐ５３ａｓであ
る請求項１６に記載のウイルスベクター。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10049693A | 1993-08-02 | 1993-08-02 | |
| US19595294A | 1994-02-11 | 1994-02-11 | |
| US08/195952 | 1994-02-11 | ||
| US08/100496 | 1994-02-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| JP (1) | JPH0899998A (ja) |
| CA (1) | CA2128833C (ja) |
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| US5688918A (en) * | 1993-08-02 | 1997-11-18 | Health Research, Inc. | p53as protein and antibody therefor |
| EP0806478A3 (en) * | 1996-05-10 | 1999-06-09 | Health Research, Inc. | p53as Protein and antibody therefor |
| US6072034A (en) * | 1997-11-22 | 2000-06-06 | Duke University | Gene product over expressed in cancer cells |
| US6350615B1 (en) | 1996-11-22 | 2002-02-26 | Duke University | Gene product over expressed in cancer cells |
| US5912142A (en) * | 1996-11-22 | 1999-06-15 | Duke University | Gene product over expressed in cancer cells |
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| KR970005049B1 (ko) * | 1990-07-16 | 1997-04-11 | 더 리젠츠 오브 더 유니벌시티 오브 캘리포니아 | 바쿨로비루스 발현 시스템, 이 벡터 시스템을 포함하는 이종성 무척추동물 숙주세포, 상기 시스템에 의해 생산되는 가용성의 정제된 야생형 망막아세포종 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드의 생산 방법 |
-
1994
- 1994-08-01 EP EP94610042A patent/EP0652232B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-01 DK DK94610042T patent/DK0652232T3/da active
- 1994-08-01 CA CA002128833A patent/CA2128833C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-08-01 DE DE69433274T patent/DE69433274T2/de not_active Expired - Fee Related
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