JPH0898684A - 新規ヒアルロニダーゼ - Google Patents
新規ヒアルロニダーゼInfo
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- JPH0898684A JPH0898684A JP20745795A JP20745795A JPH0898684A JP H0898684 A JPH0898684 A JP H0898684A JP 20745795 A JP20745795 A JP 20745795A JP 20745795 A JP20745795 A JP 20745795A JP H0898684 A JPH0898684 A JP H0898684A
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- JP
- Japan
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- hyaluronic acid
- cancer tissue
- chondroitin sulfate
- hyaluronidase
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヒト子宮体癌組織の培養上清から、ヒアルロ
ン酸、修飾−コンドロイチン硫酸等を基質とするドデシ
ル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等
を用いて、新規ヒアルロニダーゼ（ＨＡａｓｅ）を分離
した。本発明のＨＡａｓｅは，ｐＨ３．５〜ｐＨ７．５
の範囲においてヒアルロン酸を分解し、コンドロイチン
硫酸を分解しない。 【効果】 本発明のＨＡａｓｅは、脳水腫、心筋梗塞等
の医薬品、薬物添加剤、およびヒアルロニダーゼ阻害剤
の探索等に有用である。
ン酸、修飾−コンドロイチン硫酸等を基質とするドデシ
ル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等
を用いて、新規ヒアルロニダーゼ（ＨＡａｓｅ）を分離
した。本発明のＨＡａｓｅは，ｐＨ３．５〜ｐＨ７．５
の範囲においてヒアルロン酸を分解し、コンドロイチン
硫酸を分解しない。 【効果】 本発明のＨＡａｓｅは、脳水腫、心筋梗塞等
の医薬品、薬物添加剤、およびヒアルロニダーゼ阻害剤
の探索等に有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なヒアルロニダー
ゼに関し、詳細には医薬品、医薬部外品、またはこれら
のスクリーニング等のために有用な新規ヒアルロニダー
ゼに関する。
ゼに関し、詳細には医薬品、医薬部外品、またはこれら
のスクリーニング等のために有用な新規ヒアルロニダー
ゼに関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ヒア
ルロニダーゼ（以下、「ＨＡａｓｅ」と略記する）は、
ヒアルロン酸を低分子化する酵素に与えられた総称で、
（１）ヒアルロン酸・コンドロイチン・コンドロイチン
硫酸のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニド結合を加
水分解するエンドヘキソサミニダーゼ型酵素（ＥＣ
３．２．１．３５）、（２）ヒアルロン酸のβ−Ｄ−グ
ルクロニド結合を加水分解するエンドグルクロニダーゼ
型酵素（ＥＣ ３．２．１．３６）、（３）ヒアルロン
酸のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニド結合を脱離
的に分解するエンドグルコサミン開裂型酵素（ＥＣ
４．２．２．１）、（４）ヒアルロン酸・コンドロイチ
ン・コンドロイチン硫酸のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキ
ソサミニド結合を脱離的に分解するエンドヘキソサミン
開裂型の酵素等の異なる型のものが知られている。これ
らはそれぞれ反応の最終産物も異なっているが、いずれ
もムコ多糖の構造研究や、同定・定量の試薬として広く
利用されてきた。
ルロニダーゼ（以下、「ＨＡａｓｅ」と略記する）は、
ヒアルロン酸を低分子化する酵素に与えられた総称で、
（１）ヒアルロン酸・コンドロイチン・コンドロイチン
硫酸のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニド結合を加
水分解するエンドヘキソサミニダーゼ型酵素（ＥＣ
３．２．１．３５）、（２）ヒアルロン酸のβ−Ｄ−グ
ルクロニド結合を加水分解するエンドグルクロニダーゼ
型酵素（ＥＣ ３．２．１．３６）、（３）ヒアルロン
酸のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニド結合を脱離
的に分解するエンドグルコサミン開裂型酵素（ＥＣ
４．２．２．１）、（４）ヒアルロン酸・コンドロイチ
ン・コンドロイチン硫酸のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキ
ソサミニド結合を脱離的に分解するエンドヘキソサミン
開裂型の酵素等の異なる型のものが知られている。これ
らはそれぞれ反応の最終産物も異なっているが、いずれ
もムコ多糖の構造研究や、同定・定量の試薬として広く
利用されてきた。
【０００３】一方、ＨＡａｓｅは、脳水腫、心筋梗塞等
の急性期の処置に医薬品として使用され、また皮下投与
用もしくは胸膜滲出の局所療法用の薬剤の添加剤として
も用いられてきた。さらにＨＡａｓｅは、ＨＡａｓｅの
活性を阻害する作用を有する物質の探索上においても有
用である。ヒアルロン酸は、人体の細胞間隙に水分を保
持し、また組織内にゼリー状のマトリックスを形成して
細胞を保持したり、皮膚の潤滑性と柔軟性を保ち、機械
的障害による外力や細菌の感染を防止する働きがある。
ところが、ＨＡａｓｅはかかるヒアルロン酸を分解する
活性を有する。従ってヒアルロン酸を分解するＨＡａｓ
ｅの活性を抑制する物質は、皮膚の肌荒れ、小ジワ、か
さつきなどを防ぎ、しっとり感を保つ薬剤、化粧品とな
り得る可能性がある。このようにＨＡａｓｅには様々な
利用法が提案されているが、その全ての機能が解明され
たわけではなく、またさらに新しいＨＡａｓｅの出現も
待ち望まれていた。
の急性期の処置に医薬品として使用され、また皮下投与
用もしくは胸膜滲出の局所療法用の薬剤の添加剤として
も用いられてきた。さらにＨＡａｓｅは、ＨＡａｓｅの
活性を阻害する作用を有する物質の探索上においても有
用である。ヒアルロン酸は、人体の細胞間隙に水分を保
持し、また組織内にゼリー状のマトリックスを形成して
細胞を保持したり、皮膚の潤滑性と柔軟性を保ち、機械
的障害による外力や細菌の感染を防止する働きがある。
ところが、ＨＡａｓｅはかかるヒアルロン酸を分解する
活性を有する。従ってヒアルロン酸を分解するＨＡａｓ
ｅの活性を抑制する物質は、皮膚の肌荒れ、小ジワ、か
さつきなどを防ぎ、しっとり感を保つ薬剤、化粧品とな
り得る可能性がある。このようにＨＡａｓｅには様々な
利用法が提案されているが、その全ての機能が解明され
たわけではなく、またさらに新しいＨＡａｓｅの出現も
待ち望まれていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、新規ＨＡ
ａｓｅを見出すべく探索を進めてきた結果、ヒト子宮体
癌組織の培養上清に新規なＨＡａｓｅが産生されること
を初めて見出し、本発明を完成するに至った。すなわち
本発明の要旨は、下記の理化学的性質を有するヒト子宮
体癌組織由来のヒアルロニダーゼに存する。 基質特異性：ｐＨ３．５〜７．５の範囲においてヒアル
ロン酸を分解し、ｐＨ３．５〜７．５の範囲においてコ
ンドロイチン硫酸を分解しない 至適ｐＨ：ｐＨ５．０付近 等電点：８．８ また、本発明のヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を基
質とするドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において測定した分
子量が約９４キロダルトンであることが確認された。以
下、本発明につき詳細に説明する。
ａｓｅを見出すべく探索を進めてきた結果、ヒト子宮体
癌組織の培養上清に新規なＨＡａｓｅが産生されること
を初めて見出し、本発明を完成するに至った。すなわち
本発明の要旨は、下記の理化学的性質を有するヒト子宮
体癌組織由来のヒアルロニダーゼに存する。 基質特異性：ｐＨ３．５〜７．５の範囲においてヒアル
ロン酸を分解し、ｐＨ３．５〜７．５の範囲においてコ
ンドロイチン硫酸を分解しない 至適ｐＨ：ｐＨ５．０付近 等電点：８．８ また、本発明のヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を基
質とするドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において測定した分
子量が約９４キロダルトンであることが確認された。以
下、本発明につき詳細に説明する。
【０００５】本発明の新規ＨＡａｓｅは、ヒト子宮体癌
組織から、目的とするＨＡａｓｅの物理的、化学的性質
を利用した各種の処理操作に従い分離・精製することが
できる。すなわち、通常の蛋白沈殿剤による処理、塩
析、限外ろ過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲルろ
過）、遠心分離、電気泳動、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマ
トグラフィー、吸着クロマトグラフィー、透析法、これ
らの組合わせ等の処理操作が挙げられる。具体的には、
ヒト子宮体癌組織の培養上清から、ヒアルロン酸、下記
参考例記載の修飾−コンドロイチン硫酸等を基質とする
ゲル電気泳動等を用いてＭＡＲＫＵＳＷＧＵＮＴＥＮＨ
ＯＮＥＲ他、Ｍａｔｒｉｘ Ｖｏｌ．１２，３８８〜３
９６（１９９２）の方法に従って分離することができ
る。
組織から、目的とするＨＡａｓｅの物理的、化学的性質
を利用した各種の処理操作に従い分離・精製することが
できる。すなわち、通常の蛋白沈殿剤による処理、塩
析、限外ろ過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲルろ
過）、遠心分離、電気泳動、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマ
トグラフィー、吸着クロマトグラフィー、透析法、これ
らの組合わせ等の処理操作が挙げられる。具体的には、
ヒト子宮体癌組織の培養上清から、ヒアルロン酸、下記
参考例記載の修飾−コンドロイチン硫酸等を基質とする
ゲル電気泳動等を用いてＭＡＲＫＵＳＷＧＵＮＴＥＮＨ
ＯＮＥＲ他、Ｍａｔｒｉｘ Ｖｏｌ．１２，３８８〜３
９６（１９９２）の方法に従って分離することができ
る。
【０００６】ゲル電気泳動用担体の合成は、従来のポリ
アクリルアミドゲルを調製する方法（Ｌａｅｍｍｌｉ，
Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５（１
９７０））に準じて行うことができる。即ち、アクリル
アミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを含む
水溶液にヒアルロン酸又は修飾−コンドロイチン硫酸を
加えて、例えば冷暗所に一昼夜置くなどして均一に混合
し、これを重合開始剤、例えば過硫酸塩、過酸化ベンゾ
イル等の過酸化物、アゾビスイソブチロニトリル等のア
ゾ化合物や酸化剤と還元剤よりなるレドックス開始剤を
用いて重合する。また、重合促進剤として、Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンを添加して
もよい。アクリルアミドに対するＮ，Ｎ’−メチレンビ
スアクリルアミドの使用量は、一般のポリアクリルアミ
ドゲルに使用されている程度であり、ヒアルロン酸又は
修飾−コンドロイチン硫酸の使用量は、通常１〜２０μ
ｇ／ｍｌの範囲から選ばれる。また、重合反応は、所望
の大きさの担体に適したセル中で行う。
アクリルアミドゲルを調製する方法（Ｌａｅｍｍｌｉ，
Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５（１
９７０））に準じて行うことができる。即ち、アクリル
アミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを含む
水溶液にヒアルロン酸又は修飾−コンドロイチン硫酸を
加えて、例えば冷暗所に一昼夜置くなどして均一に混合
し、これを重合開始剤、例えば過硫酸塩、過酸化ベンゾ
イル等の過酸化物、アゾビスイソブチロニトリル等のア
ゾ化合物や酸化剤と還元剤よりなるレドックス開始剤を
用いて重合する。また、重合促進剤として、Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンを添加して
もよい。アクリルアミドに対するＮ，Ｎ’−メチレンビ
スアクリルアミドの使用量は、一般のポリアクリルアミ
ドゲルに使用されている程度であり、ヒアルロン酸又は
修飾−コンドロイチン硫酸の使用量は、通常１〜２０μ
ｇ／ｍｌの範囲から選ばれる。また、重合反応は、所望
の大きさの担体に適したセル中で行う。
【０００７】このようにして調製したヒアルロン酸混合
又は修飾−コンドロイチン硫酸結合ポリアクリルアミド
ゲルを担体として使用し、ヒト子宮体癌組織の培養上清
を該培養上清中に含まれる酵素が基質を分解しない条件
で電気泳動する。次いで、泳動後の担体を必要に応じて
緩衝液等で洗浄した後、通常の酵素反応条件下に置き、
酵素反応後の担体を、アルシャンブルーやトルイジンブ
ルー等の発色試薬で発色させる。培養上清中に含まれる
酵素がポリアクリルアミドゲルに固定した基質を分解す
ると、分解された部分のみが発色せず白く抜けて検出さ
れるので、これにより該酵素の活性及び分子量を同定す
ることができる。かくして得られた酵素が本発明のＨＡ
ａｓｅである。また、酵素反応時のｐＨを種々変化させ
てＨＡａｓｅ活性を測定することによって、本発明酵素
の至適ｐＨを確認することができる。
又は修飾−コンドロイチン硫酸結合ポリアクリルアミド
ゲルを担体として使用し、ヒト子宮体癌組織の培養上清
を該培養上清中に含まれる酵素が基質を分解しない条件
で電気泳動する。次いで、泳動後の担体を必要に応じて
緩衝液等で洗浄した後、通常の酵素反応条件下に置き、
酵素反応後の担体を、アルシャンブルーやトルイジンブ
ルー等の発色試薬で発色させる。培養上清中に含まれる
酵素がポリアクリルアミドゲルに固定した基質を分解す
ると、分解された部分のみが発色せず白く抜けて検出さ
れるので、これにより該酵素の活性及び分子量を同定す
ることができる。かくして得られた酵素が本発明のＨＡ
ａｓｅである。また、酵素反応時のｐＨを種々変化させ
てＨＡａｓｅ活性を測定することによって、本発明酵素
の至適ｐＨを確認することができる。
【０００８】
【発明の効果】本発明のＨＡａｓｅは新規な酵素であ
り、従来のＨＡａｓｅと同様、脳水腫、心筋梗塞等に対
する医薬品として、薬物の添加剤として、またＨＡａｓ
ｅの活性を阻害する物質の探索上有用である。
り、従来のＨＡａｓｅと同様、脳水腫、心筋梗塞等に対
する医薬品として、薬物の添加剤として、またＨＡａｓ
ｅの活性を阻害する物質の探索上有用である。
【０００９】
【実施例】以下、本発明につき具体的な実施例を挙げて
説明するが、その要旨を越えない限り以下に限定される
ものではない。 参考例 サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸（Ｉ）（分子量４
０，０００〜４８，０００；４−硫酸：６−硫酸＝１：
５）の還元末端を、Ｒ．Ｈ．Ｒａｊａ ｅｔ ａｌ．
（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３９，１６８−１７
７（１９８４））の方法に従ってＮａＢＨ4で還元し、
ＮａＩＯ4で部分酸化し、エチレンジアミンを用いてア
ミノ化して反応物を得た。反応物は４℃の透析で精製し
た。精製した還元末端アミノ化コンドロイチン硫酸（I
V） １００ｍｇを２ｍｌの蒸留水に溶かし、１ｍｌの
エタノールを加えた。混合物は、４０℃で２時間、アリ
ルグリシジルエーテル １ｍｌとインキュベートし、４
℃で蒸留水に対して透析を行った後、凍結乾燥した。こ
うして修飾−コンドロイチン硫酸（Ｖ）を得た。以上の
合成経路を図１に示す。
説明するが、その要旨を越えない限り以下に限定される
ものではない。 参考例 サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸（Ｉ）（分子量４
０，０００〜４８，０００；４−硫酸：６−硫酸＝１：
５）の還元末端を、Ｒ．Ｈ．Ｒａｊａ ｅｔ ａｌ．
（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３９，１６８−１７
７（１９８４））の方法に従ってＮａＢＨ4で還元し、
ＮａＩＯ4で部分酸化し、エチレンジアミンを用いてア
ミノ化して反応物を得た。反応物は４℃の透析で精製し
た。精製した還元末端アミノ化コンドロイチン硫酸（I
V） １００ｍｇを２ｍｌの蒸留水に溶かし、１ｍｌの
エタノールを加えた。混合物は、４０℃で２時間、アリ
ルグリシジルエーテル １ｍｌとインキュベートし、４
℃で蒸留水に対して透析を行った後、凍結乾燥した。こ
うして修飾−コンドロイチン硫酸（Ｖ）を得た。以上の
合成経路を図１に示す。
【００１０】実施例１ １ｍｍ厚の８％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−
ポリアクリルアミドゲルを調製した。このゲルの作成時
に、４℃で一昼夜保存したヒアルロン酸（鶏冠由来，分
子量８２４，０００）１ｍｇ／ｍｌを、最終濃度が１７
μｇ／ｍｌとなるように加えた。一方、ヒト子宮体癌組
織の培養上清（名古屋大学の玉腰浩司博士より分譲）１
５μｌにＳＤＳおよびＬａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｎａｔｕ
ｒｅ，２２７，６８０−６８５（１９７０））を加え、
上記ゲルに供した。
ポリアクリルアミドゲルを調製した。このゲルの作成時
に、４℃で一昼夜保存したヒアルロン酸（鶏冠由来，分
子量８２４，０００）１ｍｇ／ｍｌを、最終濃度が１７
μｇ／ｍｌとなるように加えた。一方、ヒト子宮体癌組
織の培養上清（名古屋大学の玉腰浩司博士より分譲）１
５μｌにＳＤＳおよびＬａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｎａｔｕ
ｒｅ，２２７，６８０−６８５（１９７０））を加え、
上記ゲルに供した。
【００１１】電気泳動は、室温で行った。泳動後、ゲル
は室温で１時間、２．５％ トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）
Ｘ−１００で洗浄した。ゲルは新鮮なバッファー（５
０ｍＭ クエン酸−Ｎａ2ＨＰＯ4および０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ（ｐＨ５．０，６．０，７．５）、あるいは０．
１Ｍ ＨＣＯＯＨ−ＨＣＯＯＮａおよび０．１５ＭＮａ
Ｃｌ（ｐＨ３．５））を用いて、３７℃、１６時間イン
キュベートした後、３７℃で２時間、０．１ｍｇ／ｍｌ
プロナーゼ溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、プロナーゼはストレプトマイセス グライセ
ウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）由
来のもので、ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏｒｐ社より購
入）で処理した。インキュベートしたゲルは、２０％
エタノール−１０％ 酢酸で２０分間洗浄し、０．５％
アルシャンブルー（Ａｌｃｉａｎ ｂｌｕｅ）を含む
２０％ エタノール−１０％ 酢酸で１時間染色した
後、２０％ エタノール−１０％ 酢酸で洗浄した。結
果を図２（ａ）に示す。ｐＨ３．５〜７．５の範囲内に
おいて、９４キロダルトン付近に明瞭なバンドが観測さ
れた。そして同バンドは、特にｐＨ５．０付近において
高いヒアルロン酸分解活性を有することも確認された。
は室温で１時間、２．５％ トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）
Ｘ−１００で洗浄した。ゲルは新鮮なバッファー（５
０ｍＭ クエン酸−Ｎａ2ＨＰＯ4および０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ（ｐＨ５．０，６．０，７．５）、あるいは０．
１Ｍ ＨＣＯＯＨ−ＨＣＯＯＮａおよび０．１５ＭＮａ
Ｃｌ（ｐＨ３．５））を用いて、３７℃、１６時間イン
キュベートした後、３７℃で２時間、０．１ｍｇ／ｍｌ
プロナーゼ溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、プロナーゼはストレプトマイセス グライセ
ウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）由
来のもので、ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏｒｐ社より購
入）で処理した。インキュベートしたゲルは、２０％
エタノール−１０％ 酢酸で２０分間洗浄し、０．５％
アルシャンブルー（Ａｌｃｉａｎ ｂｌｕｅ）を含む
２０％ エタノール−１０％ 酢酸で１時間染色した
後、２０％ エタノール−１０％ 酢酸で洗浄した。結
果を図２（ａ）に示す。ｐＨ３．５〜７．５の範囲内に
おいて、９４キロダルトン付近に明瞭なバンドが観測さ
れた。そして同バンドは、特にｐＨ５．０付近において
高いヒアルロン酸分解活性を有することも確認された。
【００１２】実施例２ 実施例１において、ヒアルロン酸の代わりに参考例で調
製した修飾−コンドロイチン硫酸を用い、ゲル中の最終
濃度が８．５μｇ／ｍｌとなるように加えたこと以外は
同様にして、ヒト子宮体癌組織の培養上清の電気泳動を
行った。結果を図２（ｂ）に示す。ｐＨ３．５〜７．５
の範囲内においては、特に特徴的なバンドは何ら認めら
れなかった。以上の結果から、９４キロダルトンのタン
パクはヒアルロン酸に対して作用し、コンドロイチン硫
酸に対しては全く作用しない、ヒアルロニダーゼ活性を
有していることが判明した。
製した修飾−コンドロイチン硫酸を用い、ゲル中の最終
濃度が８．５μｇ／ｍｌとなるように加えたこと以外は
同様にして、ヒト子宮体癌組織の培養上清の電気泳動を
行った。結果を図２（ｂ）に示す。ｐＨ３．５〜７．５
の範囲内においては、特に特徴的なバンドは何ら認めら
れなかった。以上の結果から、９４キロダルトンのタン
パクはヒアルロン酸に対して作用し、コンドロイチン硫
酸に対しては全く作用しない、ヒアルロニダーゼ活性を
有していることが判明した。
【００１３】実施例３ 以下の条件による２次元電気泳動にて、９４キロダルト
ンタンパク質の等電点を求めた。
ンタンパク質の等電点を求めた。
【００１４】
【表１】 １次元目： 上部ゲル（１ｍｍ厚の３％ アクリルアミドゲル） ３０％アクリルアミド−０．８％ビスアクリルアミド ０．２ ｍｌ ４０％グリセリン ０．２５ｍｌ 蒸留水 １．５３ｍｌ ペルオキソ二硫酸アンモニウム（過硫酸アンモニウム） （１００ｍｇ／ｍｌ） ２０ μｌ Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン １．２５μｌ 等電点電気泳動ゲル（１ｍｍ厚の６％ アクリルアミドゲル） ３０％アクリルアミド−０．８％ビスアクリルアミド ２．０ ｍｌ ４０％グリセリン ２．０ ｍｌ 蒸留水 ５．５ ｍｌ アンフォライン（ＬＫＢ社），ｐＨ３．５〜１０ ０．５ ｍｌ ペルオキソ二硫酸アンモニウム（過硫酸アンモニウム） （１００ｍｇ／ｍｌ） ４０ μｌ Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン ７．０ μｌ ランニングバッファー カソード溶液：２０ｍＭ ＮａＯＨ アノード溶液：１０ｍＭ Ｈ3ＰＯ4
【００１５】
【表２】 サンプルバッファー 等電点電気泳動ゲル溶液： ３０％アクリルアミド−０．８％ビスアクリルアミド ２．０ ｍｌ ４０％グリセリン ２．０ ｍｌ 蒸留水 ５．５ ｍｌ アンフォライン（ＬＫＢ社），ｐＨ３．５〜１０ ０．５ ｍｌ に、さらに４０％グリセリンを等量加えたもの サンプル 子宮体癌組織培養上清 １０μｌ マーカー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社） ５μｌ 泳動条件 ４００Ｖ、２時間３０分、０℃
【００１６】
【表３】 ２次元目： 分離ゲル（０．１７ｍｇ／ｍｌヒアルロン酸含有、１ｍｍ厚の３％ アクリ ルアミドゲル） ３０％アクリルアミド−０．８％ビスアクリルアミド ２．２４ｍｌ １．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）−０．４％ ＳＤＳ ２．１０ｍｌ １ｍｇ／ｍｌ ヒアルロン酸水溶液 １．４４ｍｌ 蒸留水 ２．５９ｍｌ ペルオキソ二硫酸アンモニウム（過硫酸アンモニウム） （１００ｍｇ／ｍｌ） ８４ μｌ Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン ２．１０μｌ ランニングバッファー ０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ ０．１９２Ｍ グリシン（ｐＨ８．３）−０．１％ ＳＤＳ サンプルバッファー Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液 サンプル 等電点電気泳動上の子宮体癌組織培養上清 泳動条件 ２０ｍＡ、１時間４０分
【００１７】洗浄 ２．５％ トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ） Ｘ−１００で１
時間 インキュベーション ３７℃で１６時間（ｐＨ５．０） プロテアーゼ処理 ０．１ｍｇ／ｍｌ プロナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ
Ｃｏｒｐ社）で、３７℃、２時間 固定 ２０％ エタノール−１０％ 酢酸で２０分間 染色 ２０％ エタノール−１０％ 酢酸に溶かした０．５％
アルシャンブルー（Ａｌｃｉａｎ ｂｌｕｅ）で１時
間 脱色 ２０％ エタノール−１０％ 酢酸で１時間を２回 この結果、本発明のＨＡａｓｅの等電点は、８．８であ
ることが確認された。
時間 インキュベーション ３７℃で１６時間（ｐＨ５．０） プロテアーゼ処理 ０．１ｍｇ／ｍｌ プロナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ
Ｃｏｒｐ社）で、３７℃、２時間 固定 ２０％ エタノール−１０％ 酢酸で２０分間 染色 ２０％ エタノール−１０％ 酢酸に溶かした０．５％
アルシャンブルー（Ａｌｃｉａｎ ｂｌｕｅ）で１時
間 脱色 ２０％ エタノール−１０％ 酢酸で１時間を２回 この結果、本発明のＨＡａｓｅの等電点は、８．８であ
ることが確認された。
【図１】修飾−コンドロイチン硫酸の合成経路を示す図
面である。
面である。
【図２】（ａ）本発明のＨＡａｓｅを、ヒアルロン酸を
基質とするＳＤＳ−ＰＡＧＥにて検出した結果を示す図
面である。図中、レーン１、２、３、４は、それぞれｐ
Ｈ３．５、５．０、６．０、７．５における電気泳動パ
ターンを表す。（ｂ）本発明のＨＡａｓｅを、修飾−コ
ンドロイチン硫酸を基質とするＳＤＳ−ＰＡＧＥにて検
出した結果を示す図面である。図中、レーン１、２、
３、４は、それぞれｐＨ３．５、５．０、６．０、７．
５における電気泳動パターンを表す。
基質とするＳＤＳ−ＰＡＧＥにて検出した結果を示す図
面である。図中、レーン１、２、３、４は、それぞれｐ
Ｈ３．５、５．０、６．０、７．５における電気泳動パ
ターンを表す。（ｂ）本発明のＨＡａｓｅを、修飾−コ
ンドロイチン硫酸を基質とするＳＤＳ−ＰＡＧＥにて検
出した結果を示す図面である。図中、レーン１、２、
３、４は、それぞれｐＨ３．５、５．０、６．０、７．
５における電気泳動パターンを表す。
Claims (2)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するヒト子宮体
癌組織由来のヒアルロニダーゼ。 基質特異性：ｐＨ３．５〜７．５の範囲においてヒアル
ロン酸を分解し、ｐＨ３．５〜７．５の範囲においてコ
ンドロイチン硫酸を分解しない 至適ｐＨ：ｐＨ５．０付近 等電点：８．８ - 【請求項２】 ヒアルロン酸を基質とするドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において
測定した分子量が約９４キロダルトンであることを特徴
とする請求項１記載のヒアルロニダーゼ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20745795A JP3732258B2 (ja) | 1994-07-22 | 1995-07-21 | 新規ヒアルロニダーゼ |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6-171206 | 1994-07-22 | ||
| JP17120694 | 1994-07-22 | ||
| JP20745795A JP3732258B2 (ja) | 1994-07-22 | 1995-07-21 | 新規ヒアルロニダーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0898684A true JPH0898684A (ja) | 1996-04-16 |
| JP3732258B2 JP3732258B2 (ja) | 2006-01-05 |
Family
ID=26494003
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20745795A Expired - Fee Related JP3732258B2 (ja) | 1994-07-22 | 1995-07-21 | 新規ヒアルロニダーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3732258B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004100961A1 (ja) | 2003-05-19 | 2004-11-25 | Seikagaku Corporation | 硫酸基転移酵素阻害剤 |
| CN103370179A (zh) * | 2011-02-14 | 2013-10-23 | 大学共同利用机关法人自然科学研究机构 | 透光性多晶材料及其制造方法 |
-
1995
- 1995-07-21 JP JP20745795A patent/JP3732258B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004100961A1 (ja) | 2003-05-19 | 2004-11-25 | Seikagaku Corporation | 硫酸基転移酵素阻害剤 |
| CN103370179A (zh) * | 2011-02-14 | 2013-10-23 | 大学共同利用机关法人自然科学研究机构 | 透光性多晶材料及其制造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3732258B2 (ja) | 2006-01-05 |
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