JPH0898681A - ルシフェラーゼの製造方法 - Google Patents
ルシフェラーゼの製造方法Info
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- JPH0898681A JPH0898681A JP18564295A JP18564295A JPH0898681A JP H0898681 A JPH0898681 A JP H0898681A JP 18564295 A JP18564295 A JP 18564295A JP 18564295 A JP18564295 A JP 18564295A JP H0898681 A JPH0898681 A JP H0898681A
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- solution
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- luciferin
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 ヘイケボタル(Luciola lateralis) ルシ
フェラーゼの製造方法であって、その精製工程において
エチレングリコールを使用することを特徴とする該方
法。 【効果】 ヘイケボタルルシフェラーゼを完全に純化さ
れた形態で取得できる。
フェラーゼの製造方法であって、その精製工程において
エチレングリコールを使用することを特徴とする該方
法。 【効果】 ヘイケボタルルシフェラーゼを完全に純化さ
れた形態で取得できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、酸素分子によるル
シフェリンの酸化を触媒するルシフェラーゼの製造方法
に関する。
シフェリンの酸化を触媒するルシフェラーゼの製造方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、ヘイケボタル(Luciola laterali
s) 由来のルシフェラーゼは、不安定であるために精製
に成功していないのが実情である〔蛋白質、核酸、酸
素、第32巻、第10号、第44〜59頁、特に第47頁 (第1234
〜1249頁、特に第1237頁)(1987)〕。ルシフェラーゼ
は、ＡＴＰの定量等に極めて有効に用いることができ
る。
s) 由来のルシフェラーゼは、不安定であるために精製
に成功していないのが実情である〔蛋白質、核酸、酸
素、第32巻、第10号、第44〜59頁、特に第47頁 (第1234
〜1249頁、特に第1237頁)(1987)〕。ルシフェラーゼ
は、ＡＴＰの定量等に極めて有効に用いることができ
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明はヘイケボタル
由来のルシフェラーゼの製造方法を提供することを目的
とする。
由来のルシフェラーゼの製造方法を提供することを目的
とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等は、
このような実情に鑑み鋭意検討した結果、ヘイケボタル
尾部からルシフェラーゼを単離精製することに成功し、
本発明を完成した。すなわち本発明は、下記の理化学的
性質： 作用 下記の酵素反応式で示されるように酸素分子によるルシ
フェリンの酸化を触媒する酵素である； ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 → オキシルシフェリン＋ＡＭＰ＋ピロリン酸＋ＣＯ2 ＋光
このような実情に鑑み鋭意検討した結果、ヘイケボタル
尾部からルシフェラーゼを単離精製することに成功し、
本発明を完成した。すなわち本発明は、下記の理化学的
性質： 作用 下記の酵素反応式で示されるように酸素分子によるルシ
フェリンの酸化を触媒する酵素である； ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 → オキシルシフェリン＋ＡＭＰ＋ピロリン酸＋ＣＯ2 ＋光
【０００５】基質特異性 ＡＤＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ及びＧＴＰには作用しない； 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 至適ｐＨは、ルシフェリンを基質とした場合、ｐＨ７．
５〜９．５である（図１参照）；安定ｐＨ範囲は、ｐＨ
６．０〜１０．５である（図２参照）； 作用適温の範囲 ０〜５０℃である；
５〜９．５である（図１参照）；安定ｐＨ範囲は、ｐＨ
６．０〜１０．５である（図２参照）； 作用適温の範囲 ０〜５０℃である；
【０００６】ｐＨ、温度等による失活の条件 ｐＨ５．０以下及び１２．０以上で４時間後完全に失活
する；ｐＨ７．８において、温度５５℃、１５分間の熱
処理により完全に失活する； 熱安定性 温度４０℃、１５分間の処理で７８．３％の残存酵素活
性を有し、温度５０℃、８分間の処理でも６％の残存酵
素活性を有する； を有するルシフェラーゼの製造方法であって、その精製
工程においてエチレングリコールを使用することを特徴
とする該方法。
する；ｐＨ７．８において、温度５５℃、１５分間の熱
処理により完全に失活する； 熱安定性 温度４０℃、１５分間の処理で７８．３％の残存酵素活
性を有し、温度５０℃、８分間の処理でも６％の残存酵
素活性を有する； を有するルシフェラーゼの製造方法であって、その精製
工程においてエチレングリコールを使用することを特徴
とする該方法。
【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
製造方法として、具体的には以下の方法が挙げられる。
本発明に用いられるヘイケボタルとしては、自然界より
採集したもの、あるいは人工的に養殖したもの等如何な
るものでもよく、そして、ヘイケボタル尾部には、ルシ
フェラーゼが多量に存在するためにヘイケボタル尾部は
ルシフェラーゼ分離源として好適である。
製造方法として、具体的には以下の方法が挙げられる。
本発明に用いられるヘイケボタルとしては、自然界より
採集したもの、あるいは人工的に養殖したもの等如何な
るものでもよく、そして、ヘイケボタル尾部には、ルシ
フェラーゼが多量に存在するためにヘイケボタル尾部は
ルシフェラーゼ分離源として好適である。
【０００８】そして、緩衝液に、ヘイケボタルを添加し
て粉砕し、粉砕物を得る。緩衝液としては、ルシフェラ
ーゼを失活させるものでなければ、如何なるものでもよ
く、例えば、トリス (ヒドロキシ) アミノメタン−塩酸
緩衝液、グリシン・塩化ナトリウム−水酸化ナトリウム
緩衝液、リン酸緩衝液等にそれぞれ10％飽和となる如く
硫酸アンモニウムを添加したもの等が挙げられる。
て粉砕し、粉砕物を得る。緩衝液としては、ルシフェラ
ーゼを失活させるものでなければ、如何なるものでもよ
く、例えば、トリス (ヒドロキシ) アミノメタン−塩酸
緩衝液、グリシン・塩化ナトリウム−水酸化ナトリウム
緩衝液、リン酸緩衝液等にそれぞれ10％飽和となる如く
硫酸アンモニウムを添加したもの等が挙げられる。
【０００９】粉砕手段としては、乳鉢及び乳棒を用いる
方法、ホモゲナイザー、ワーリングブレンダー、フレン
チプレス等を用いる方法等が挙げられる。次いで、粉砕
物より通常の遠心分離あるいは濾過処理等により残渣を
除去して、粗酵素液を得るか、これに必要により凍結乾
燥法、アルコール沈澱法、アセトン沈澱法などを適宜選
択して実施することにより粗酵素粉末を得る。
方法、ホモゲナイザー、ワーリングブレンダー、フレン
チプレス等を用いる方法等が挙げられる。次いで、粉砕
物より通常の遠心分離あるいは濾過処理等により残渣を
除去して、粗酵素液を得るか、これに必要により凍結乾
燥法、アルコール沈澱法、アセトン沈澱法などを適宜選
択して実施することにより粗酵素粉末を得る。
【００１０】上記粗酵素液もしくは粗酵素粉末よりさら
に精製酵素標品を得るには、例えばセファデックス、ウ
ルトロゲルもしくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法、
イオン交換体を用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミド
ゲル等を用いる電気泳動法、ヒドロキシアパタイトを用
いる吸着溶出法、蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法、アフ
ィニティクロマト法、分子ふるい膜もしくは中空糸膜等
を用いる分画法等を適宜選択し、組合わせて実施するこ
とにより、精製された酵素標品を得ることが出来る。
に精製酵素標品を得るには、例えばセファデックス、ウ
ルトロゲルもしくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法、
イオン交換体を用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミド
ゲル等を用いる電気泳動法、ヒドロキシアパタイトを用
いる吸着溶出法、蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法、アフ
ィニティクロマト法、分子ふるい膜もしくは中空糸膜等
を用いる分画法等を適宜選択し、組合わせて実施するこ
とにより、精製された酵素標品を得ることが出来る。
【００１１】上記の製造方法より得られた酵素の理化学
的性質を以下に記載する。 作 用：下記の酵素反応式で示されるように酸素分子
によるルシフェリンの酸化を触媒する酵素である。
的性質を以下に記載する。 作 用：下記の酵素反応式で示されるように酸素分子
によるルシフェリンの酸化を触媒する酵素である。
【００１２】
【化１】
【００１３】基質特異性：ＡＤＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ及
びＧＴＰには作用しない。 至適 pＨ及び安定 pＨ範囲：至適 pＨは、ルシフェリ
ンを基質とし、25mMグリシルグリシンの pＨを pＨ6.5
〜11.5迄変化させ、温度30℃で反応させ、20秒間発光量
(フォトン数) を測定した場合、図１に示す如くpＨ7.5
〜9.5 であり、また安定 pＨ範囲は、ルシフェリンを
含有する緩衝液(pＨ4.6 〜8.0 ：25mMリン酸緩衝液、 p
Ｈ8.0 〜11.5：25mMグリシン・塩化ナトリウム−水酸化
ナトリウム緩衝液をそれぞれ使用。なお、それぞれの緩
衝液には10％飽和となる如く硫酸アンモニウムを添加し
たものである。) に酵素を添加し、温度０℃で４時間作
用させた場合、図２に示す如く、6.0 〜10.5である。な
お、図２において、●でつないだ線、△でつないだ線
は、それぞれ25mMリン酸緩衝液、及び25mMグリシン・塩
化ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液を使用した場合
の活性を示す。
びＧＴＰには作用しない。 至適 pＨ及び安定 pＨ範囲：至適 pＨは、ルシフェリ
ンを基質とし、25mMグリシルグリシンの pＨを pＨ6.5
〜11.5迄変化させ、温度30℃で反応させ、20秒間発光量
(フォトン数) を測定した場合、図１に示す如くpＨ7.5
〜9.5 であり、また安定 pＨ範囲は、ルシフェリンを
含有する緩衝液(pＨ4.6 〜8.0 ：25mMリン酸緩衝液、 p
Ｈ8.0 〜11.5：25mMグリシン・塩化ナトリウム−水酸化
ナトリウム緩衝液をそれぞれ使用。なお、それぞれの緩
衝液には10％飽和となる如く硫酸アンモニウムを添加し
たものである。) に酵素を添加し、温度０℃で４時間作
用させた場合、図２に示す如く、6.0 〜10.5である。な
お、図２において、●でつないだ線、△でつないだ線
は、それぞれ25mMリン酸緩衝液、及び25mMグリシン・塩
化ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液を使用した場合
の活性を示す。
【００１４】力価の測定法：25mMグリシルグリシン(p
Ｈ7.8)８ml、硫酸マグネシウム溶液〔25mMグリシルグリ
シン(pＨ7.8)に硫酸マグネシウムを0.１Ｍとなる如く添
加した溶液〕0.5ml 及びルシフェリン溶液〔25mMグリシ
ルグリシン(pＨ7.8)にルシフェリンを１mMとなる如く添
加した溶液〕0.8ml を混合してルシフェリン混合液を調
製する。
Ｈ7.8)８ml、硫酸マグネシウム溶液〔25mMグリシルグリ
シン(pＨ7.8)に硫酸マグネシウムを0.１Ｍとなる如く添
加した溶液〕0.5ml 及びルシフェリン溶液〔25mMグリシ
ルグリシン(pＨ7.8)にルシフェリンを１mMとなる如く添
加した溶液〕0.8ml を混合してルシフェリン混合液を調
製する。
【００１５】このようにして得たルシフェリン混合液400
μｌ及び測定するルシフェラーゼ10μｌを混合したもの
に、ＡＴＰ溶液〔25mMグリシルグリシン(pＨ7.8)にＡＴ
Ｐを10mMとなる如く添加したもの。〕80μｌを注入する
と同時に、ルミノメーター (アロカ社製、ルミネッセン
スリーダ ＢＬＲ−201)により発生するフォトン数を20
秒間積算して求める。 作用適温の範囲：pＨ7.8 のもとに、各温度で反応さ
せ20秒間発光量 (フォトン数) を測定した場合、０〜50
℃の範囲内にある。
μｌ及び測定するルシフェラーゼ10μｌを混合したもの
に、ＡＴＰ溶液〔25mMグリシルグリシン(pＨ7.8)にＡＴ
Ｐを10mMとなる如く添加したもの。〕80μｌを注入する
と同時に、ルミノメーター (アロカ社製、ルミネッセン
スリーダ ＢＬＲ−201)により発生するフォトン数を20
秒間積算して求める。 作用適温の範囲：pＨ7.8 のもとに、各温度で反応さ
せ20秒間発光量 (フォトン数) を測定した場合、０〜50
℃の範囲内にある。
【００１６】 pＨ、温度等による失活の条件： （イ）ｐＨによる失活の条件 pＨ5.0 以下及び pＨ12.0以上で４時間後完全に失活す
る。 （ロ）温度による失活の条件 pＨ7.8 において、温度55℃、15分間の熱処理により完
全に失活する。
る。 （ロ）温度による失活の条件 pＨ7.8 において、温度55℃、15分間の熱処理により完
全に失活する。
【００１７】 耐熱性 精製した本酵素 100キロカウント(Kcount)含有する酵素
液 100μｌ〔10％(V/V) エチレングリコール、0.1 Ｍ N
aCl 及び0.2 ％(W/V) アルブミンを含有する60mMリン酸
緩衝液(pＨ7.5)〕を、温度40℃で15、30及び60分間保持
して残存する酵素活性を測定した結果を、表１に示し
た。なお、対照としてゲンジボタル及びアメリカホタル
のルシフェラーゼについても上記と同様にして残存酵素
活性を測定した結果を合せて表１に示した。
液 100μｌ〔10％(V/V) エチレングリコール、0.1 Ｍ N
aCl 及び0.2 ％(W/V) アルブミンを含有する60mMリン酸
緩衝液(pＨ7.5)〕を、温度40℃で15、30及び60分間保持
して残存する酵素活性を測定した結果を、表１に示し
た。なお、対照としてゲンジボタル及びアメリカホタル
のルシフェラーゼについても上記と同様にして残存酵素
活性を測定した結果を合せて表１に示した。
【００１８】
【表１】
【００１９】上表より明らかな如く、本発明は、対照に
比し著しく耐熱性を有するルシフェラーゼであることが
判る。
比し著しく耐熱性を有するルシフェラーゼであることが
判る。
【００２０】
【実施例】次に、本発明を実施例を挙げて更に詳細に説
明する。 〔実施例〕25mMトリス (ヒドロキシ) アミノメタン−塩
酸緩衝液に、１mMエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム
及び２mMフェニルメチルスルフォニルフルオリドを添加
し、更に硫酸アンモニウムを10％飽和となる如く添加し
て得た混液(pＨ7.8)15mlに、ヘイケボタル〔(株)西武百
貨店より購入〕の尾部200 匹分を添加し、ヒスコトロン
〔(株)日音医理科器械製作所製〕を用いて破壊したもの
を、12,000r.p.m.で20分間遠心分離処理し、上清 (粗酵
素溶液) 14.5mlを得た。
明する。 〔実施例〕25mMトリス (ヒドロキシ) アミノメタン−塩
酸緩衝液に、１mMエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム
及び２mMフェニルメチルスルフォニルフルオリドを添加
し、更に硫酸アンモニウムを10％飽和となる如く添加し
て得た混液(pＨ7.8)15mlに、ヘイケボタル〔(株)西武百
貨店より購入〕の尾部200 匹分を添加し、ヒスコトロン
〔(株)日音医理科器械製作所製〕を用いて破壊したもの
を、12,000r.p.m.で20分間遠心分離処理し、上清 (粗酵
素溶液) 14.5mlを得た。
【００２１】このようにして得た粗酵素溶液を常法によ
り硫酸アンモニウムを用いて塩析し、30％〜70％飽和で
生成した沈澱を30,000r.p.m.で10分間遠心分離処理し、
その沈澱を25mM混合液〔少量の25mMトリス (ヒドロキ
シ) アミノメタン−塩酸緩衝液に、１mMエチレンジアミ
ン４酢酸２ナトリウム及び10％飽和となる如く硫酸アン
モニウムを添加して得た溶液(pＨ7.8)〕に溶解させて溶
液を得た。
り硫酸アンモニウムを用いて塩析し、30％〜70％飽和で
生成した沈澱を30,000r.p.m.で10分間遠心分離処理し、
その沈澱を25mM混合液〔少量の25mMトリス (ヒドロキ
シ) アミノメタン−塩酸緩衝液に、１mMエチレンジアミ
ン４酢酸２ナトリウム及び10％飽和となる如く硫酸アン
モニウムを添加して得た溶液(pＨ7.8)〕に溶解させて溶
液を得た。
【００２２】次いで、この溶液を、上記25mM混合液で平
衡化されたウルトロゲル(Ultrogel)ＡcＡ34(ＬＫＢ社
製）カラム中を通過させてゲル濾過クロマトグラフィー
を行い活性区分を得た。このようにして得た区分を、リ
ン酸緩衝液〔10mMリン酸１水素ナトリウム−リン酸２水
素ナトリウム溶液に、0.1 Ｍ塩化ナトリウム及びエチレ
ングリコール10％(V/V) を添加した緩衝液〕を用いて透
析を行い、得られた溶液を、10mMリン酸緩衝液で平衡化
されたヒドロキシ−アパタイトＨＰＬＣ（東洋曹達工業
社製、ＴＳＫgel ＨＡ−1000) カラムに吸着させ、10〜
100mM 迄のリン酸緩衝液(pＨ7.5)によるリニアグラジエ
ント (Liner Gradient) 溶出を行うことにより純化され
たヘイケボタル由来のルシフェラーゼ活性区分 180μｌ
〔酵素活性：2.4 ×102 キロカウント〕を得た。
衡化されたウルトロゲル(Ultrogel)ＡcＡ34(ＬＫＢ社
製）カラム中を通過させてゲル濾過クロマトグラフィー
を行い活性区分を得た。このようにして得た区分を、リ
ン酸緩衝液〔10mMリン酸１水素ナトリウム−リン酸２水
素ナトリウム溶液に、0.1 Ｍ塩化ナトリウム及びエチレ
ングリコール10％(V/V) を添加した緩衝液〕を用いて透
析を行い、得られた溶液を、10mMリン酸緩衝液で平衡化
されたヒドロキシ−アパタイトＨＰＬＣ（東洋曹達工業
社製、ＴＳＫgel ＨＡ−1000) カラムに吸着させ、10〜
100mM 迄のリン酸緩衝液(pＨ7.5)によるリニアグラジエ
ント (Liner Gradient) 溶出を行うことにより純化され
たヘイケボタル由来のルシフェラーゼ活性区分 180μｌ
〔酵素活性：2.4 ×102 キロカウント〕を得た。
【図１】 本発明の製造方法による得られる酵素の至適
pＨ域を示す図である。
pＨ域を示す図である。
【図２】 本発明の製造方法による得られる酵素の安定
pＨ範囲を示す図である。
pＨ範囲を示す図である。
Claims (1)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質： 作用 下記の酵素反応式で示されるように酸素分子によるルシ
フェリンの酸化を触媒する酵素である； ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 → オキシルシフェリン＋ＡＭＰ＋ピロリン酸＋ＣＯ2 ＋光 基質特異性 ＡＤＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ及びＧＴＰには作用しない； 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 至適ｐＨは、ルシフェリンを基質とした場合、ｐＨ７．
５〜９．５である；安定ｐＨ範囲は、ｐＨ６．０〜１
０．５である； 作用適温の範囲 ０〜５０℃である； ｐＨ、温度等による失活の条件 ｐＨ５．０以下及び１２．０以上で４時間後完全に失活
する；ｐＨ７．８において、温度５５℃、１５分間の熱
処理により完全に失活する； 熱安定性 温度４０℃、１５分間の処理で７８．３％の残存酵素活
性を有し、温度５０℃、８分間の処理でも６％の残存酵
素活性を有する； を有するルシフェラーゼの製造方法であって、その精製
工程においてエチレングリコールを使用することを特徴
とする該方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18564295A JPH0898681A (ja) | 1995-07-21 | 1995-07-21 | ルシフェラーゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18564295A JPH0898681A (ja) | 1995-07-21 | 1995-07-21 | ルシフェラーゼの製造方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63088246A Division JPH088864B2 (ja) | 1988-04-12 | 1988-04-12 | ルシフェラーゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0898681A true JPH0898681A (ja) | 1996-04-16 |
Family
ID=16174349
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18564295A Pending JPH0898681A (ja) | 1995-07-21 | 1995-07-21 | ルシフェラーゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0898681A (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57102186A (en) * | 1980-12-12 | 1982-06-25 | Modrovich Ivan Endre | Production of stabilized urease solution |
-
1995
- 1995-07-21 JP JP18564295A patent/JPH0898681A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57102186A (en) * | 1980-12-12 | 1982-06-25 | Modrovich Ivan Endre | Production of stabilized urease solution |
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