JPH0898680A - ルシフェラーゼの製造方法 - Google Patents
ルシフェラーゼの製造方法Info
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- JPH0898680A JPH0898680A JP18564195A JP18564195A JPH0898680A JP H0898680 A JPH0898680 A JP H0898680A JP 18564195 A JP18564195 A JP 18564195A JP 18564195 A JP18564195 A JP 18564195A JP H0898680 A JPH0898680 A JP H0898680A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 ゲンジボタル（Luciola cruciata) ルシ
フェラーゼの製造方法であって、その精製工程において
エチレングリコールを使用することを特徴とする該方
法。 【効果】 ゲンジボタルルシフェラーゼを完全に純化さ
れた形態で取得できる。
フェラーゼの製造方法であって、その精製工程において
エチレングリコールを使用することを特徴とする該方
法。 【効果】 ゲンジボタルルシフェラーゼを完全に純化さ
れた形態で取得できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、酸素分子によるル
シフェリンの酸化を触媒するルシフェラーゼの製造方法
に関する。
シフェリンの酸化を触媒するルシフェラーゼの製造方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、ゲンジボタル（Luciola cruciat
a）由来のルシフェラーゼは、不安定であるために精製
に成功していないのが実情である〔蛋白質 核酸 酸
素、第32巻、第10号、第44〜59頁、特に第47頁（第1234
〜1249頁、特に第1237頁）（1987）〕。ルシフェラーゼ
は、ＡＴＰの定量等に極めて有効に用いることができ
る。
a）由来のルシフェラーゼは、不安定であるために精製
に成功していないのが実情である〔蛋白質 核酸 酸
素、第32巻、第10号、第44〜59頁、特に第47頁（第1234
〜1249頁、特に第1237頁）（1987）〕。ルシフェラーゼ
は、ＡＴＰの定量等に極めて有効に用いることができ
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ゲンジボタ
ル由来のルシフェラーゼの製造方法を提供することを目
的とする。
ル由来のルシフェラーゼの製造方法を提供することを目
的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等は、
このような実情に鑑み鋭意検討した結果、ゲンジボタル
尾部からルシフェラーゼを単離精製することに成功し、
本発明を完成した。すなわち本発明は、下記の理化学的
性質： 作用 下記の酵素反応式で示されるように酸素分子によるルシ
フェリンの酸化を触媒する酵素である； ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 → オキシルシフェリン＋ＡＭＰ＋ピロリン酸＋ＣＯ2 ＋光
このような実情に鑑み鋭意検討した結果、ゲンジボタル
尾部からルシフェラーゼを単離精製することに成功し、
本発明を完成した。すなわち本発明は、下記の理化学的
性質： 作用 下記の酵素反応式で示されるように酸素分子によるルシ
フェリンの酸化を触媒する酵素である； ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 → オキシルシフェリン＋ＡＭＰ＋ピロリン酸＋ＣＯ2 ＋光
【０００５】基質特異性 ＡＤＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ及びＧＴＰには作用しない； 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 至適ｐＨは、ルシフェリンを基質とした場合、ｐＨ８．
０〜９．５である（図１参照）；安定ｐＨ範囲は、ｐＨ
６．５〜９．０である（図２参照）；
０〜９．５である（図１参照）；安定ｐＨ範囲は、ｐＨ
６．５〜９．０である（図２参照）；
【０００６】作用適温の範囲 ０〜５０℃である； ｐＨ、温度等による失活の条件 ｐＨ５．０以下及び１１．０以上で４時間後完全に失活
する；ｐＨ７．８において、温度５０℃、１５分間の熱
処理により完全に失活する；を有するルシフェラーゼの
製造方法であって、その精製工程においてエチレングリ
コールを使用することを特徴とする該方法である。
する；ｐＨ７．８において、温度５０℃、１５分間の熱
処理により完全に失活する；を有するルシフェラーゼの
製造方法であって、その精製工程においてエチレングリ
コールを使用することを特徴とする該方法である。
【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
製造方法として、具体的には以下の方法が挙げられる。
本発明に用いられるゲンジホタルとしては、自然界より
採集したもの、あるいは人工的に養殖したもの等如何な
るものでもよく、そして、ゲンジボタル尾部には、ルシ
フェラーゼが多量に存在するためにゲンジボタル尾部は
ルシフェラーゼ分離源として好適である。
製造方法として、具体的には以下の方法が挙げられる。
本発明に用いられるゲンジホタルとしては、自然界より
採集したもの、あるいは人工的に養殖したもの等如何な
るものでもよく、そして、ゲンジボタル尾部には、ルシ
フェラーゼが多量に存在するためにゲンジボタル尾部は
ルシフェラーゼ分離源として好適である。
【０００８】そして、緩衝液に、ゲンジボタルを添加し
て粉砕し、粉砕物を得る。緩衝液としては、ルシフェラ
ーゼを失活させるものでなければ、如何なるものでもよ
く、例えば、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン−塩酸
緩衝液、グリシン・塩化ナトリウム−水酸化ナトリウム
緩衝液、リン酸緩衝液等にそれぞれ10％飽和となる如く
硫酸アンモニウムを添加したもの等が挙げられる。
て粉砕し、粉砕物を得る。緩衝液としては、ルシフェラ
ーゼを失活させるものでなければ、如何なるものでもよ
く、例えば、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン−塩酸
緩衝液、グリシン・塩化ナトリウム−水酸化ナトリウム
緩衝液、リン酸緩衝液等にそれぞれ10％飽和となる如く
硫酸アンモニウムを添加したもの等が挙げられる。
【０００９】粉砕手段としては、乳鉢及び乳棒を用いる
方法、ホモゲナイザー、ワーリングブレンダー、フレン
チプレス等を用いる方法等が挙げられる。次いで、粉砕
物より通常の遠心分離あるいは濾過処理等により残渣を
除去して、粗酵素液を得るか、これに必要により凍結乾
燥法、アルコール沈澱法、アセトン沈澱法などを適宜選
択して実施することにより粗酵素粉末を得る。
方法、ホモゲナイザー、ワーリングブレンダー、フレン
チプレス等を用いる方法等が挙げられる。次いで、粉砕
物より通常の遠心分離あるいは濾過処理等により残渣を
除去して、粗酵素液を得るか、これに必要により凍結乾
燥法、アルコール沈澱法、アセトン沈澱法などを適宜選
択して実施することにより粗酵素粉末を得る。
【００１０】上記粗酵素液もしくは粗酵素粉末よりさら
に精製酵素標品を得るには、例えばセファデックス、ウ
ルトロゲルもしくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法、
イオン交換体を用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミド
ゲル等を用いる電気泳動法、ヒドロキシアパタイトを用
いる吸着溶出法、庶糖密度勾配遠心法等の沈降法、アフ
ィニティクロマト法、分子ふるい膜もしくは中空糸膜等
を用いる分画法等を適宜選択し、組合わせて実施するこ
とにより、精製された酵素標品を得ることが出来る。
に精製酵素標品を得るには、例えばセファデックス、ウ
ルトロゲルもしくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法、
イオン交換体を用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミド
ゲル等を用いる電気泳動法、ヒドロキシアパタイトを用
いる吸着溶出法、庶糖密度勾配遠心法等の沈降法、アフ
ィニティクロマト法、分子ふるい膜もしくは中空糸膜等
を用いる分画法等を適宜選択し、組合わせて実施するこ
とにより、精製された酵素標品を得ることが出来る。
【００１１】上記の製造方法より得られた酵素の理化学
的性質を以下に記載する。 作用：下記の酵素反応式で示されるように酸素分子に
よるルシフェリンの酸化を触媒する酵素である。
的性質を以下に記載する。 作用：下記の酵素反応式で示されるように酸素分子に
よるルシフェリンの酸化を触媒する酵素である。
【００１２】
【化１】
【００１３】基質特異性：ＡＤＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ及
びＧＴＰには作用しない。 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは、ルシフェリ
ンを基質とし、25mMグリシルグリシンのｐＨをｐＨ6.5
〜11.5迄変化させ、温度３０℃で反応させ、20秒間発光
量（フォトン数）を測定した場合、図１に示す如くｐＨ
8.0 〜9.5 であり、また安定ｐＨ範囲は、ルシフェリン
を含有する緩衝液（ｐＨ4.6 〜8.0 ：25mMリン酸緩衝
液、ｐＨ8.0 〜11.5：25mMグリシン・塩化ナトリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液をそれぞれ使用。なお、それぞ
れの緩衝液には10％飽和となる如く硫酸アンモニウムを
添加したものである。）に酵素を添加し、温度０℃で４
時間作用させた場合、図２に示す如く、6.5 〜9.0 であ
る。なお、図２において、●でつないだ線、△でつない
だ線は、それぞれ25mMリン酸緩衝液、及び25mMグリシン
・塩化ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液を使用した
場合の活性を示す。
びＧＴＰには作用しない。 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは、ルシフェリ
ンを基質とし、25mMグリシルグリシンのｐＨをｐＨ6.5
〜11.5迄変化させ、温度３０℃で反応させ、20秒間発光
量（フォトン数）を測定した場合、図１に示す如くｐＨ
8.0 〜9.5 であり、また安定ｐＨ範囲は、ルシフェリン
を含有する緩衝液（ｐＨ4.6 〜8.0 ：25mMリン酸緩衝
液、ｐＨ8.0 〜11.5：25mMグリシン・塩化ナトリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液をそれぞれ使用。なお、それぞ
れの緩衝液には10％飽和となる如く硫酸アンモニウムを
添加したものである。）に酵素を添加し、温度０℃で４
時間作用させた場合、図２に示す如く、6.5 〜9.0 であ
る。なお、図２において、●でつないだ線、△でつない
だ線は、それぞれ25mMリン酸緩衝液、及び25mMグリシン
・塩化ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液を使用した
場合の活性を示す。
【００１４】力価の測定法 25mMグリシルグリシン（ｐＨ7.8 ）８ml、硫酸マグネシ
ウム溶液〔25mMグリシルグリシン（ｐＨ7.8 ）に硫酸マ
グネシウムを0.1 Ｍとなる如く添加した溶液〕0.5 ml及
びルシフェリン溶液〔25mMグリシルグリシン（ｐＨ7.8
）にルシフェリンを１mMとなる如く添加した溶液〕0.8
mlを混合してルシフェリン混合液を調製する。
ウム溶液〔25mMグリシルグリシン（ｐＨ7.8 ）に硫酸マ
グネシウムを0.1 Ｍとなる如く添加した溶液〕0.5 ml及
びルシフェリン溶液〔25mMグリシルグリシン（ｐＨ7.8
）にルシフェリンを１mMとなる如く添加した溶液〕0.8
mlを混合してルシフェリン混合液を調製する。
【００１５】このようにして得たルシフェリン混合液 4
00μl 及び測定するルシフェラーゼ10μl を混合したも
のに、ＡＴＰ溶液〔25mMグリシルグリシン（ｐＨ7.8)に
ＡＴＰを10mMとなる如く添加したもの。〕80μl を注入
すると同時に、ルミノメーター（アロカ社製、ルミネッ
センスリーダ ＢＬＲ−201)により発生するフォトン数
を20秒間積算して求める。
00μl 及び測定するルシフェラーゼ10μl を混合したも
のに、ＡＴＰ溶液〔25mMグリシルグリシン（ｐＨ7.8)に
ＡＴＰを10mMとなる如く添加したもの。〕80μl を注入
すると同時に、ルミノメーター（アロカ社製、ルミネッ
センスリーダ ＢＬＲ−201)により発生するフォトン数
を20秒間積算して求める。
【００１６】作用適温の範囲 ｐＨ7.8 のもとに、各温度で反応させ20秒間発光量（フ
ォトン数）を測定した場合、０〜50℃の範囲内にある。 ｐＨ、温度などによる失活の条件 (イ) ｐＨによる失活の条件 ｐＨ5.0 以下及びｐＨ11.0以上で４時間後完全に失活す
る。 (ロ) 温度による失活の条件 ｐＨ7.8 において、温度50℃、15分間の熱処理により完
全に失活する。
ォトン数）を測定した場合、０〜50℃の範囲内にある。 ｐＨ、温度などによる失活の条件 (イ) ｐＨによる失活の条件 ｐＨ5.0 以下及びｐＨ11.0以上で４時間後完全に失活す
る。 (ロ) 温度による失活の条件 ｐＨ7.8 において、温度50℃、15分間の熱処理により完
全に失活する。
【００１７】
【実施例】次に、本発明を実施例を挙げて更に詳細に説
明する。 〔実施例〕25mMトリス（ヒドロキシ）アミノメタン−塩
酸緩衝液に、１mMエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム
及び２mMフェニルメチルスルフォニルフルオリドを添加
し、更に硫酸アンモニウムを10％飽和となる如く添加し
て得た混液（ｐＨ7.8 ）15mlに、ゲンジボタル〔（株）
西武百貨店より購入〕の尾部150 匹分を添加し、ヒスコ
トロン〔（株）日音医理科器械製作所製〕を用いて破壊
したものを、12,000r.p.m.で20分間遠心分離処理し、上
清（粗酵素溶液）14.5mlを得た。
明する。 〔実施例〕25mMトリス（ヒドロキシ）アミノメタン−塩
酸緩衝液に、１mMエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム
及び２mMフェニルメチルスルフォニルフルオリドを添加
し、更に硫酸アンモニウムを10％飽和となる如く添加し
て得た混液（ｐＨ7.8 ）15mlに、ゲンジボタル〔（株）
西武百貨店より購入〕の尾部150 匹分を添加し、ヒスコ
トロン〔（株）日音医理科器械製作所製〕を用いて破壊
したものを、12,000r.p.m.で20分間遠心分離処理し、上
清（粗酵素溶液）14.5mlを得た。
【００１８】このようにして得た粗酵素溶液を常法によ
り硫酸アンモニウムを用いて塩析し、30％〜60％飽和で
生成した沈澱を30,000r.p.m.で10分間遠心分離処理し、
その沈澱を25mM混合液〔少量の25mMトリス（ヒドロキ
シ）アミノメタン−塩酸緩衝液に、１mMエチレンジアミ
ン４酢酸２ナトリウム及び10％飽和となる如く硫酸アン
モニウムを添加して得た溶液（ｐＨ7.8 ）〕に溶解させ
て溶液を得た。
り硫酸アンモニウムを用いて塩析し、30％〜60％飽和で
生成した沈澱を30,000r.p.m.で10分間遠心分離処理し、
その沈澱を25mM混合液〔少量の25mMトリス（ヒドロキ
シ）アミノメタン−塩酸緩衝液に、１mMエチレンジアミ
ン４酢酸２ナトリウム及び10％飽和となる如く硫酸アン
モニウムを添加して得た溶液（ｐＨ7.8 ）〕に溶解させ
て溶液を得た。
【００１９】次いで、この溶液を、上記25mM混合液で平
衡化されたウルトロゲル（Ultrogel）ＡｃＡ34（ＬＫＢ
社製）カラム中を通過させてゲル濾過クロマトグラフィ
ーを行い活性区分を得た。このようにして得た区分を、
リン酸緩衝液〔10mMリン酸１水素ナトリウム−リン酸２
水素ナトリウム溶液に、0.1 Ｍ塩化ナトリウム及びエチ
レングリコール10％（Ｖ／Ｖ）を添加した緩衝液〕を用
いて透析を行い、得られた溶液を、10mMリン酸緩衝液で
平衡化されたヒドロキシ−アパタイトＨＰＬＣ（東洋曹
達工業社製、ＴＳＫgel ＨＡ−1000）カラムに吸着さ
せ、10〜100 mM迄のリン酸緩衝液（ｐＨ7.5 ）によるリ
ニアグラジエント（Liner Gradient）溶出を行うことに
より純化されたゲンジボタル由来のルシフェラーゼ活性
区分200 μl 〔酵素活性：3.5×102 キロカウント（Kco
unt）〕を得た。
衡化されたウルトロゲル（Ultrogel）ＡｃＡ34（ＬＫＢ
社製）カラム中を通過させてゲル濾過クロマトグラフィ
ーを行い活性区分を得た。このようにして得た区分を、
リン酸緩衝液〔10mMリン酸１水素ナトリウム−リン酸２
水素ナトリウム溶液に、0.1 Ｍ塩化ナトリウム及びエチ
レングリコール10％（Ｖ／Ｖ）を添加した緩衝液〕を用
いて透析を行い、得られた溶液を、10mMリン酸緩衝液で
平衡化されたヒドロキシ−アパタイトＨＰＬＣ（東洋曹
達工業社製、ＴＳＫgel ＨＡ−1000）カラムに吸着さ
せ、10〜100 mM迄のリン酸緩衝液（ｐＨ7.5 ）によるリ
ニアグラジエント（Liner Gradient）溶出を行うことに
より純化されたゲンジボタル由来のルシフェラーゼ活性
区分200 μl 〔酵素活性：3.5×102 キロカウント（Kco
unt）〕を得た。
【図１】 本発明の製造方法により得られる酵素の至適
ｐＨ域を示す図である。
ｐＨ域を示す図である。
【図２】 本発明の製造方法により得られる酵素の安定
ｐＨ範囲を示す図である。
ｐＨ範囲を示す図である。
Claims (1)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質： 作用 下記の酵素反応式で示されるように酸素分子によるルシ
フェリンの酸化を触媒する酵素である； ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 → オキシルシフェリン＋ＡＭＰ＋ピロリン酸＋ＣＯ2 ＋光 基質特異性 ＡＤＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ及びＧＴＰには作用しない； 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 至適ｐＨは、ルシフェリンを基質とした場合、ｐＨ８．
０〜９．５である；安定ｐＨ範囲は、ｐＨ６．５〜９．
０である； 作用適温の範囲 ０〜５０℃である； ｐＨ、温度等による失活の条件 ｐＨ５．０以下及び１１．０以上で４時間後完全に失活
する；ｐＨ７．８において、温度５０℃、１５分間の熱
処理により完全に失活する； を有するルシフェラーゼの製造方法であって、その精製
工程においてエチレングリコールを使用することを特徴
とする該方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18564195A JPH0898680A (ja) | 1995-07-21 | 1995-07-21 | ルシフェラーゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18564195A JPH0898680A (ja) | 1995-07-21 | 1995-07-21 | ルシフェラーゼの製造方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62300022A Division JPH088863B2 (ja) | 1987-11-30 | 1987-11-30 | ルシフェラーゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0898680A true JPH0898680A (ja) | 1996-04-16 |
Family
ID=16174332
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18564195A Pending JPH0898680A (ja) | 1995-07-21 | 1995-07-21 | ルシフェラーゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0898680A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014533520A (ja) * | 2011-11-23 | 2014-12-15 | プロメガ コーポレイションＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | 膜貫通輸送を監視するための組成物および方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57102186A (en) * | 1980-12-12 | 1982-06-25 | Modrovich Ivan Endre | Production of stabilized urease solution |
-
1995
- 1995-07-21 JP JP18564195A patent/JPH0898680A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57102186A (en) * | 1980-12-12 | 1982-06-25 | Modrovich Ivan Endre | Production of stabilized urease solution |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014533520A (ja) * | 2011-11-23 | 2014-12-15 | プロメガ コーポレイションＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | 膜貫通輸送を監視するための組成物および方法 |
| JP2017060521A (ja) * | 2011-11-23 | 2017-03-30 | プロメガ コーポレイションＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | 膜貫通輸送を監視するための組成物および方法 |
| US9738921B2 (en) | 2011-11-23 | 2017-08-22 | Promega Corporation | Compositions and methods for monitoring transmembrane trafficking |
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