JPH0880163A - 特異的抗体を含む魚介類用飼料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 抗生物質の代替となる、安価かつ大量に得る
ことができる魚類感染症に対する予防効果を有する魚介
類飼料を提供する。 【構成】 蚕の体内で発現させた、魚介類感染症の病原
体に特異性を有する抗体を配合した魚介類用飼料。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、蚕の体内で発現させ
た、魚介類の感染症の病原体に対し特異性を有する抗体
を配合した魚介類用飼料に関する。本発明の魚介類用飼
料を与えれば、当該病原体の効力を低下もしくは消滅さ
せることにより感染症から魚介類を防護することができ
る。

【０００２】

【従来の技術】近年の海洋における漁獲高の急激な減少
は、人口の爆発的増加と相俟って、世界中の関係者に大
きな衝撃を与えている。一方、魚介類の養殖技術の進歩
も著しく、わが国では、漁業総生産額の２６％、およそ
一年間に百数十万トン(７０００億円)の収穫があるが、
一方、養殖魚介はその病気の種類も広範囲にわたり、し
かも被害の大部分は、細菌性疾病によって占められてい
る。その歩留は、ハマチ、ヒラメなどで約６０％と低
く、ブリでは魚病被害額は１００億円にも達している。
その改善対策の一つとして、魚介類の感染症の予防ある
いは治療に対する要望が高まっている。

【０００３】魚介類の感染症の例を挙げれば、滑走細菌
性、ノカルジア症、エドワードジェラ症、連鎖球菌症、
パラコロ症、ビブリオ症、ひれ赤症、赤点病、エロモナ
ス感染症、腸管白濁症、せつそう病、リンホシステイス
症、類結節症などがある。これらの感染症は、サケ、マ
ス、ブリ、タイ、ヒラメ、エビ、ウナギ、アユ、コイ、
カキ、ホタテなどの魚介類の成育期あるいは成魚期に多
く見られ、特に養殖魚介の場合、その感染速度が速く、
しかも一度の感染により大量の魚介類が被害を受ける。
これらの防除対策として、鮮度の悪い餌の投与を避け
る、高密度飼育を避ける。一旦、病気が発生した場合に
は、死亡魚を速やかに除去するなどの管理が行われてい
るが十分とはいえない。また従来より使用されている薬
剤としては、オキソリン酸、ナリジクス酸、ニトロフラ
ン類、アスコルビン酸誘導体、ベンゾチアジン誘導体、
ベンゾヘテロ環化合物、ペプチド組成物、漢方生薬、鶏
卵抗体、及び抗生物質のテトラサイクリン類、エリスロ
マイシン、マルチオマイシン、サフェナマイシンなどが
使用もしくは研究開発されている。しかし病原菌が同定
されながら、有効な治療薬のないものも多く、優れた予
防、治療薬の開発が待たれている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】抗生物質による魚介類
の感染症の予防における問題点の一つは、使用した抗生
物質の魚介類中への残存である。多くの消費者は抗生物
質で処置された魚介類の残存抗生物質に対し危惧の念を
抱いている。また抗生物質はウイルスに対する効果や細
菌の耐性の問題もあり、これらの代わる予防、治療法の
開発が望まれている。

【０００５】抗生物質に代わる魚介類の予防、治療にお
いて魚介類病原ウイルスに対し特異性を有する抗体が研
究されている。例えば、特開平３−１５３９６では、特
定の魚類病原ウイルス抗原で免疫した哺乳動物の免疫細
胞と骨髄腫細胞とを融合して得たハイブリドーマを培養
することにより、魚類病原ウイルスに対し特異性を有す
るモノクロナール抗体を作り使用している。しかし、こ
の方法では、抗体の大量生産が困難であり、かつ高価な
ため、その工業的利用は難しい。また、特公平５−４２
９０１では、魚類感染症の病原体を抗原として過免疫し
た鶏の産生する鶏卵中の、当該病原体に対して特異的に
作用する鶏卵抗体を用いている。すなわち、卵を用いる
ことにより大量、かつ安価に抗体を得ようとしたもので
あるが、通常一匹の免疫鶏から１年間におよそ４０gの
抗体が得られる程度であり、工業的製造法としては実現
が難しく、生産効率の向上が望まれている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、蚕の体内で発
現させた魚介類感染症の病原体に特異性を有する抗体を
配合した魚介類用飼料に関する。蚕の体内で特異的抗体
を発現させる場合の有利な点としては以下のことが挙げ
られる。すなわち、蚕の飼育、取扱には、長年蓄積され
た技術と経験があり、ほぼ自動的に安定して生産ができ
る。従って、その価格も安価で、大量入手が可能であ
る。蚕の卵から成虫にいたる期間は約２０日と短く、一
年間でおよそ１８回の生産が可能である。蚕の飼育には
巨大な設備空間を必要とせず、高密度飼育が可能であ
る。その上、蚕の抗体産生効率は、１頭当り十数mgから
数十mgと高く、空間・時間当りの収率において他に匹敵
するものがない。例えば、免疫鶏を用いる鶏卵抗体作成
法と比較して、ケージ飼い鶏舎と同面積の蚕室を利用し
た場合で、１０倍以上、免疫ウサギから得られる免疫抗
体作成法と同様条件で比較して、数百倍以上の生産が年
間当りで可能となる。更に、体内に抗体を蓄積した蚕は
そのまま乾燥、又は乾燥粉末にして魚介類用の飼料にす
ることができるなど、工業的製造方法として効率的かつ
経済的なことである。もちろん、必要に応じて抽出、精
製などの操作により得た純度の高い抗体を用いることも
できる。従って、蚕を用いる抗体の製造方法は工業的に
みて極めて優れているにもかかわらず、蚕の体内で発現
した抗体を用いる魚介類用飼料は未だ知られていない。
なお、本明細書において「蚕」という語には、蚕の卵、
幼虫、さなぎ、成虫のいずれもを含む。

【０００７】本発明者らは、蚕の体内で魚介類の病原体
に対し特異性を有する抗体を発現させることにより、工
業的に安価、大量に魚介類の感染症に対し、予防効果を
持つ魚介類用飼料を製造しようとして鋭意研究努力の結
果、当該感染症に対し有効な効果を発揮することを見出
し、本発明に到達した。

【０００８】本発明で使用する魚介類感染症の病原体に
特異性を有する蚕の体内で発現した抗体としては、該抗
体を発現した蚕そのまま、蚕を乾燥、あるいは乾燥粉末
としたもの、又は精製操作を施したものなどいずれの形
態のものでも良い。

【０００９】魚介類感染症の病原体を具体的に例示すれ
ば、滑走細菌性を引き起こすFlexibacter maritimus、
ビブリオ症を引き起こすVibrio anguillarum、類結節症
を引き起こすPasteurella piscicida、パラコロ病を引
き起こすEdwardsiella tarda、せっそう病を引き起こす
Aeromonas salmonicida、連鎖球菌症を引き起こすEnter
ococcus seriolicida、ノカルジア症を引き起こすNocar
dia seriolae、鰭赤病を引き起こすAeromonas hydrophi
la、冷水病を引き起こすFlexibacter psychrophilusな
どがある。このように魚類感染症の病原体が分離されて
いるものについては、それらを適当な培地で培養するこ
とにより得られる一種又は二種以上の病原体の懸濁液を
抗原として用い、当該病原体に特異的性を有する抗体を
得れば良い。また、これら菌体あるいはウイルス表面の
抗原決定基を精製し抗原としてもよい。病原体が確定さ
れていないものに対しては、魚類の感染症の罹患部ホモ
ジネートが抗原となる。またそれらから分離された細菌
群及びウイルス群も抗原となる。

【００１０】蚕の体内で抗体を発現させる方法について
は特に制限されるものではないが、次のような方法が例
示される。まず抗原で免疫した哺乳動物の免疫細胞とガ
ン細胞とを融合して得たハイブリドーマから、抗体遺伝
子がコードされたメッセンジャーＲＮＡを精製する。得
られたメッセンジャーＲＮＡを鋳型にして相補ＤＮＡを
調製し、これを蚕のバキュロウイルスの遺伝子に組み込
む。このようにして得た組み換えウイルスを蚕に感染さ
せ、蚕の体内で抗体を産生させる。蚕を体内でのウイル
スによる抗体の産生速度は驚異的に大きく、接種後、短
時間のうちに蚕１頭当り十数mgから数十mgにものぼる抗
体を産生することができる。蚕の体内で発現させるとい
う抗体の生産方法は、通常の哺乳動物、あるいは鶏を免
疫して得られる抗体の産生方法、すなわち、抗原を接種
された動物が抗体を産生する方法とは全く異なり、蚕そ
のものはウイルスの増殖の場を提供するだけである。蚕
の体内に接種されたウイルスの時間・空間当りの抗体産
生能力は画期的なものであり、工業的に見て極めて重要
な感染症に対し予防及び治療効果を持つ魚介類用飼料に
関する発明である。

【００１１】以上のようにして得られた蚕には多くの抗
体が含有されている。この蚕をそのまま乾燥して、乾燥
蚕の粉末として、及び／又は蚕より精製した抗体を、必
要に応じて、ビタミン、ミネラル類、蛋白、脂肪、多糖
類など通常の魚介類用飼料に用いる原料と配合すること
により、魚介類の病原体に対し特異性を有する本発明の
抗体を配合した魚介類用飼料が得られる。

【００１２】蚕の体内で産生させた魚介類の病原体に対
し特異性を有する抗体の配合量は、その魚類感染症の病
原体に対する特異性、抗体価などにより適宜決定され
る。

【００１３】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳しく説明する
が、本発明はこれらの実施例にのみ制限されるものでは
ない。 実施例１ ビブリオ属細菌に対する特異的抗体を体内に
持つ蚕の作成 ビブリオ症の病原菌であるビブリオ・アングイラムを海
水サイトファーガ培地で２５℃、４８時間培養後、０．
５％ホルマリンで不活性化した。８週令のメスのＢＡＬ
Ｂ／c系マウスに５０μgの不活性化病原菌をフロインド
の完全アジュバント(Ｄifco社製)と共に腹腔内に注射し
た。その後２週間おきに同量の細菌で追加免疫を行い、
抗ビブリオ血中抗体価が充分に上昇した時点でマウスを
解剖した。脾臓から無菌的に取り出した２×１０⁸個の
脾細胞と対数増殖期にある２×１０⁷個のマウスミエロ
ーマ細胞Ｓp２／Ｏ−Ａg１４(大日本製薬(株)より購入)
とを混合し、ポリエチレングリコール(分子量１５０
０、ベーリンガーマンハイム(株)製)により融合させ
た。

【００１４】次いで、融合細胞を１０％ウシ胎児血清追
加ＤＭＥＭ培地(ＧibcoＢＲＬ(株)製)に１００μＭヒポ
キサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１５μＭチミ
ジンを含む培地(以下、ＨＡＴ培地と称す)を用い、３７
℃にて５％炭酸ガスインキュベーター中で１４日間培養
した。ＨＡＴ培地中で増殖してきたハイブリドーマの培
養上清を５０μlずつ取り、ビブリオ・アングイラルム
(１０μg／ml)をコーティングした９６穴マイクロプレ
ートに分注し、ＥＬＩＳＡ法によりビブリオ菌に特異的
なモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマをスク
リーニングした。得られた陽性ハイブリドーマは、限界
希釈法により２回クローニングした。

【００１５】抗ビブリオ抗体を産生するハイブリドーマ
(４×１０⁸個)からＩnvitrogenn社製)のThe fast track
mＲＮＡ isolation kitを用いてｍＲＮＡを抽出した。
抽出したmＲＮＡ(１−５μg)を鋳型にして、Ｐharmaceu
tical社製のTime Saver^TMcＤＮＡ synthesis kitを用い
てcＤＮＡを合成し、プラスミドpＵＣ１１９のＥcoＲＩ
部位にクローニングした。クローニングしたcＤＮＡの
断片を、バキュロウイルストランスファーベクターのポ
リヘドリンプロモーターの下流にクローニングした。得
られたトランスファーベクターとハイブリッドバキュロ
ウイルスをヨトウガ由来の培養細胞(ＩＰＬＢ−Ｓf２１
ＡＥ)あるいは蚕由来の培養細胞(Ｂm−Ｎ)にトランスフ
ェクションしてリコンビナントウイルスを得た。

【００１６】リコンビナントウイルスを蚕の幼虫、さな
ぎあるいは蛾に注射し２５℃で５日間放置後、これに１
０倍量のリン酸緩衝液を加えて粉砕し抗体原液とした。
この原液をリン酸緩衝液を用いて２倍段階希釈を行い、
沈降反応法、凝集反応法、オクタローニー法などにより
凝集抗体価を測定した。原液の凝集抗体価は２⁸であっ
た。

【００１７】実施例２ 蚕の加熱殺菌及び乾燥条件の検
討 実施例１で得られた原液を、加熱温度、５０,５５,６
０,６３,７０℃にて、３０分間処理したところ、６５℃
までは凝集抗体価の低下は認められなかったが、７０℃
では凝集抗体価は２⁷に低下した。また、スプレードラ
イ法による乾燥を通常の条件(送風温度、入口１５０
℃、出口８０℃)で行ったところ凝集抗体価の低下は認
められなかった。

【００１８】実施例３ 実施例２で得られた抗体を配合
した飼料の効果 実施例２で得られたビブリオ・アングイラルム菌に対す
る抗体を含有する蚕の乾燥粉末(凝集抗体価:２¹¹)６０
重量％、いか粉末１５重量％、オキアミ粉末１５重量
％、各種ビタミン混合物５重量％、アルギン酸ナトリウ
ム５重量％に適当量の水を加えて混合し、湿式造粒後、
乾燥し、魚介類用飼料を調製した。対照飼料としては、
特異的抗体を含まない蚕乾燥粉末を用いて同様の混合比
の魚介類用飼料を調製して用いた。

【００１９】ビブリオ・アングイラルム菌を人為感染さ
せた体重５から１０gのハマチ２００匹を、１００匹づ
つ２群に分け、１群はビブリオ・アングイラルム菌に対
する特異的抗体含有飼料で飼育し、他群はその対照飼料
で飼育した。飼育は２００lアクリル水槽に人工海水を
いれ、循環ろ過しながら行った。飼育温度を２３から２
５℃に保ち、両群の死亡率を２０日間観察した。

【００２０】感染方法は、海水サイトファーガ培地で２
５℃、４８時間培養したビブリオ・アングイラルム菌を
人工海水で１×１０⁶個／mlになるように希釈し、その
５００l中に通気下、ハマチ２００匹を５分間浸漬し
た。人為感染したハマチは１００匹づつ２群に分け、一
方は特異的抗体を含む飼料で、また他方は対照飼料でそ
れぞれ飼育し、２０日間死亡率を観察した。２０日間の
死亡率は、対照飼料群で５５％、ビブリオ・アングイラ
ルム菌に対する特異的抗体含有飼料で２３％であった。
以上の結果より、魚介類の飼育において、魚介類の感染
症に対する特異的抗体を含有する飼料の使用は、対応す
る感染症に対して予防効果を有することが示された。

【００２１】実施例４ 実施例１で得られたビブリオ・アングイラルム菌に対す
る抗体を含有する蚕の乾燥粉末(凝集抗体価は、２¹¹)６
kg、イカ粉末１．５kg、オキアミ粉末１．５kg、各種ビ
タミン混合物０．５kgおよびアルギン酸ナトリウム０．
５kgに適当量の水を加えて混合し、湿式造粒後、乾燥
し、飼料９．７kgを得た。

【００２２】実施例５ ウナギのパラコロ病の病原菌、エドワードジェラ菌のホ
ルマリン死菌を抗原として、実施例１と同操作で得られ
たエドワードジェラ菌に対する特異的抗体を含有する蚕
の乾燥粉末(凝集抗体価は、２¹¹)１５kg、タラ肝油０．
５kg、イカ粉末３kg、オキアミ粉末３kg、各種ビタミン
混合物０．５kg及びアルギン酸ナトリウム０．５kgに適
当量の水を加えて混合し、スプレードライ法により粉末
化した。これにより、ウナギのパラコロ病の病原菌、エ
ドワードジェラ菌に対し特異的抗体を含有するウナギ稚
魚期用飼料１０．１kgを得た。

【００２３】実施例６ コイのカラムナリス病の病原菌フレキシバクター・カラ
ムナリス菌のホルマリン死菌を抗原として、実施例１と
同操作でフレキシバクター・カラムナリス菌に対する特
異的抗体を含む蚕のサナギを得た。このサナギ１０kgを
５０℃で２から１０時間乾燥し、乾燥サナギ２kgを得
た。本品はこのまま特異的抗体含有魚介類飼料として用
いることができる。

【００２４】

【発明の効果】本発明の魚介類飼料は、魚介類感染症に
特異性を有する抗体を含有するため、当該魚介類感染症
に対する予防効果を発揮する。従来から使用されている
化学薬品系及び抗生物質系の予防薬並びに治療薬の一部
あるいは全部を本発明の魚介類用飼料を用いることによ
り代替することができる。更に、本発明に用いる蚕は、
魚介類用飼料として栄養価も高く、感染症の予防、治療
の際の栄養補給の観点からも評価されるものである。蚕
の飼育並びに絹糸の生産には数千年の歴史があるが、魚
介類感染症に特異性を有する抗体を蚕の体内で発現さ
せ、魚介類用飼料に配合し、魚介類感染症に対する予防
に使用し、成功したのは本発明者らが初めて達成したも
のである。本発明の方法は、魚介類感染症に特異性を有
する抗体を配合した魚介類用飼料の安価、高効率の工業
的大量生産方法である。

フロントページの続き (72)発明者 林 加恵子 京都府京都市左京区下鴨東高木町25−６ (72)発明者 工藤 謙一 奈良県大和高田市幸町６−３−718

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 蚕の体内で発現させた、魚介類感染症の
   病原体に特異性を有する抗体を配合した魚介類用飼料。
2. 【請求項２】 魚介類感染症の病原体に特異性を有する
   抗体が、ウイルスにより蚕の体内で発現させたものであ
   る請求項１記載の魚介類用飼料。
3. 【請求項３】 魚介類感染症の病原体に特異性を有する
   抗体を体内で発現させた蚕をそのまま乾燥し、もしくは
   乾燥粉末として、あるいは精製して配合した請求項１記
   載の魚介類用飼料。