【発明の詳細な説明】
プロテイノイド担体並びにその製造方法および使用方法
本出願は、1992年6月15日出願で放棄された米国特許出願第07/898,9
09号の一部継続出願である、1992年7月27日出願の米国特許出願第07/92
0,346号の一部継続出願である、1993年6月14日出願の米国特許出願第08
/076,803号の一部継続出願である。発明の分野
本発明は、プロテイノイドおよびそれから製造されるプロテイノイド担体に関
する。プロテイノイド担体は活性薬剤を遊離可能な状態で被包し、延長された保
存期間および/または光安定性を有する。そのようなプロテイノイド担体の製造
方法もまた開示される。発明の背景
医薬および治療薬の利用可能な送達態様は、しばしば生体が有する化学的もし
くは生理的障害またはその両方によって極めて制限される。たとえば、そのよう
な多くの薬剤の経口的送達は、もし化学的および物理化学的障害、たとえば消化
管内の極端なpH、強力な消化酵素との接触、および該活性成分に対する胃腸壁
の非透過性がなければ、選択ルートとなるであろう。経口投与が適切でないこと
が分かっている多数
の薬剤では、とりわけ生物学的に活性なペプチドおよび蛋白(たとえばインシュ
リン)が知られている。これらの薬剤は、酸加水分解および/または蛋白分解酵
素によって消化管内で急速に破壊される。
これら攻撃をうけやすい薬剤のための有効な経口的送達方法および送達システ
ムを開発するために、多数の研究が行われた:
(a)腸壁透過性を高めるためのアジュバント(例えば、レゾルシノールおよび
非イオン性界面活性剤ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびn−ヘキサデ
シルポリエチレンエーテル)の同時投与;
(b)酵素分解を避けるための酵素抑制物質の同時投与、例えば、膵トリプシン
インヒビター、ジイソプロピルフルオロホスフェート(DEF)およびトラシロ
ール;
しかしながら、薬剤送達システムにおけるこのような物質の使用は以下のよう
ないずれかの理由によって制限される:
(a)有効な量を用いた場合のそれら物質固有の毒性;
(b)それら物質による活性成分保護または活性成分吸収促進の失敗;
(c)それら物質の薬剤との不利な反応。
薬剤送達システムとしてのリポゾームもまた報告された。それは、被包された
薬剤の周りに脂質層を提供する。ヘパリンを含むリポゾームの使用は米国特許第
4239754号に開示され、さらに幾つかの研究がインシュリン含有リポゾー
ムの使用について実施された(例えば、Patelら、1976,FEBS Letters
62:p60;Hashimotoら、1979,Endocrinol.Japan 26:p337)。し
かしながら、リポゾームの使用はまだ開発段階にあり、以下を含む問題がなお存
在する:
(a)低い安定性;
(b)不適切な保存期間;
(c)低分子量(<30000)の含有物に制限される;
(d)製造の困難性;
(e)含有物との不利な反応。
より最近では、微小球体を形成する合成アミノ酸ポリマーつまりプロテイノイ
ドが、医薬品の被包用に報告された。例えば、米国特許第4925673号(’
673号特許、この文献は参照によって本出願に含まれる)は、そのような微小
球体構築物並びにその調製と使用について開示している。’673特許はまた、
胃腸管または血中に送達するために薬剤を被包する微小球体について開示してい
る。
’673特許に記載されているプロテイノイド微小球体がその使用目的につい
て有用である一方、プロテイノイド微小球体の物理化学的性状(例えば、光感受
性、保存期間および胃腸管のいろいろな場所における選択的溶解性)は改善の余
地がある。さらに、この技術分野では、より広範囲の活性成分(例えば極性薬剤
)を被包することができる微小球体が望まれている。
’673号特許で用いられているプロテイノイド調製方法では、高分子量(MW
)(>1000ダルトン)と低分子量(≦1000ダルトン)のペプチド様ポリマーの分
離が困難な複合体混合
物を生じる。のみならず、この方法は少量の低分子量プロテイノイドを生じるが
、これは微小球体形成分画である。したがって、プロテイノイド調製方法の改良
がまた望まれる。
したがって、当該技術分野においては改良プロテイノイド担体並びにその改良
調製方法が望まれる。
発明の目的
本発明の目的は、光分解と時間経過による分解の少なくとも1つについて強化
された安定性を有する、送達システムとしてのプロテイノイド担体を形成するプ
ロテイノイドを提供することである。
本発明のまた別の目的は、種々の条件(例えばpH)下でより選択的な溶解性
をもつプロテイノイド担体を形成するプロテイノイドを提供することである。
本発明のさらに別の目的は、胃腸管の特定部分で選択的に遊離される生物学的
に活性な薬剤を被包するプロテイノイド担体を提供することである。
本発明のさらなる目的は、それがなければ冑腸管での吸収が悪い医薬の生体利
用性を高めるプロテイノイド担体を提供することである。
本発明のまた別の目的は、望ましいプロテイノイド担体の収量を改善し、さら
に特定の性質を有するプロテイノイド担体を製造する改良された方法を提供する
ことである。
本出願で明白となるこれらの目的および利点は、以下に開示する発明によって
達成されることが分かった。発明の要旨
本発明は、改良されたプロテイノイド担体並びにその製造および使用の方法に
関する。
約250と約2400ダルトンの間の範囲の分子量をもち、さらにアミノ酸が
限定されているプロテイノイドは、光分解および/または時間経過による分解に
対する安定性が改善されたプロテイノイド担体の製造に有用である。このプロテ
イノイドは以下から成る群から選ばれるペプチドポリマーを含む:
(i)チロシンとフェニルアラニンから成る群から選ばれる少なくとも1個の第
一のモノマーと、グルタミン酸、ピログルタミン酸、グルタミンおよびアスパラ
ギン酸から成る群から選ばれる少なくとも1個の第二のモノマーとから製造され
るペプチドポリマー;及び
(ii)チロシンとフェニルアラニンから成る群から選ばれる少なくとも1個の
第一のモノマーと、グルタミン酸、ピログルタミン酸、グルタミンおよびアスパ
ラギン酸から成る群から選ばれる少なくとも1個の第二のモノマーと、リシン、
アルギニンおよびオルニチンから成る群から選ばれる少なくとも1個の第三のモ
ノマーとから製造されるペプチドポリマーであって、該プロテイノイドは微小球
体および/またはマイクロカプセルを形成し、さらに選択pH領域で溶解する。
本発明のプロテイノイド分子は、約2個から約20個のアミノ酸残基、好まし
くは約2個から約8個のアミノ酸残基を
含み、約250から約2400ダルトン、好ましくは約250から約600ダル
トン、最も好ましくは約250から400ダルトンの間の範囲の分子量を有する
。
このプロテイノイド担体は、医薬、色素試薬および化粧品成分を含む広範囲の
含有物を遊離できるように被包し、運搬するための送達システムとして有用であ
る。このプロテイノイド担体は、通常経口的には投与できない感受性の高い医薬
を胃腸管の目的の領域で選択的に遊離するための経口的送達システムとして特に
有用である。また本発明では、このような組成を含む投与ユニット形態が意図さ
れている。図面の説明
図1は、分子量分布を、実施例3で述べるようなNCA法で調製したポリ(As
p.Bz-co-Phe)ポリマーのモノマー濃度の関数として表す。
図2は、分子量分布を、実施例5で述べるようなDPPA法で調製したポリ(
Asp.Bz)ポリマーのモノマー濃度の関数として表す。
図3は、実施例5で述べるようなDPPA法で調製したポリ(Asp.Bz)ポリマ
ーの収量に対する反応持続時間の影響を示す。
図4は、実施例5で述べるようなDPPA法で調製したポリ(Asp.Bz)ポリマ
ーの分子量における温度の影響を表す。
図5は、実施例5で述べるようなDPPA法で調製したポリ(Asp.Bz)ポリマ
ーの分子量における[DPPA]/[M]
のモル比変化の影響を表す。
図6は、実施例9で述べるウェスタンイムノブロット分析のx線フィルム写真
である:精製ネズミmAb9BG5、2μg(レーン1);1mg(レーン2)
;0.25μg(レーン3);被包化工程後の空のプロテイノイド担体上清、m
Ab無し(レーン4);空のプロテイノイド担体ペレット(レーン5);被包化
工程後のプロテイノイド担体被包化mAb上清(レーン6);およびプロテイノ
イド担体被包化mAbペレット。レーンMWは基準分子量マーカーを含む。
図7は、実施例10で述べるサンプルのウェスタンイムノブロット分析のx線
フィルム写真である。
図8(a−c)は、実施例11で述べるようなELISAの条件下で固定レオ
ウイルス3型およびVLSHに結合する血清蛋白量を表す。「空球体」は空のプ
ロテイノイド担体(mAb 9BG5無し)を経口的に投与された動物を指し、「mAb
球体」はmAb9BG5被包化プロテイノイド担体を経口的に投与された動物を
指し、「IV」は非被包化mAb9BG5を静注投与された動物を指し、「経口
」は、非被包化mAb9BG5を経口投与された動物を指す。
図9は、実施例11で述べるように、0.85Nクエン酸塩−0.5%ゴム中
(図9(a))または燐酸緩衝食塩水(図9(b))中で連続的に希釈した精製
mAbと固定レオウイルス3型およびVLSH蛋白を用い、慣用のELISA手
法で結合するmAbを表す。
図10は、実施例15で述べるように、プロテイノイド担
体被包化エリトロポエチン(EPO)(15μgEPO/kg体重)および被包
化EPO(15μgEPO/kg体重)を投与されたラットから採取したラット
血清中で検出されたEPOレベルを表す。
図11は、実施例15で述べるように十二指腸近位部に直接エリトロポエチン
(50μg/kg)または被包化エリトロポエチン(50μg/kg)のいずれ
かを投与したラットのEPO血清レベルを表す。血清エリトロポエチンレベルは
エリトロポエチン酵素免疫アッセーキットで時間について測定した。
図12は、実施例15で述べるように被包化もしくは非被包化エリトロポエチ
ン(100μg/kg)のいずれかを胃管により経口投与されるか、または2μ
g/kgもしくは10μg/kgのいずれかを皮下注射されたラットのEPO血
清レベルを表す。血清エリトロポエチンレベルはエリトロポエチン酵素免疫アッ
セーキットで時間について測定した。
図13は、実施例17で述べるように、サケカルシトニンプロテイノイド担体
(0.25mgカルシトニン/kg体重)の経口投与後のシノモルガスモンキー
における血清カルシウム変化を表す。結果は血清カルシウムの基礎値からの絶対
変化として表されている。データは平均+/−SEMを表している。**血清カル
シウムレベルは基礎値とは顕著に異なる。
図14は、実施例18で述べるように、サケカルシトニンプロテイノイド担体
(0.60mg/kg体重)をラットに経口投与した後の血清カルシウム変化を
表す。結果は血清カ
ルシウムの基礎値からの絶対変化として表されている。データは平均+/−SE
Mを表している。**血清カルシウムレベルは、対応する時間におけるコントロー
ルと比較して顕著に異なる。
図15は、実施例18で述べるように、サケカルシトニンまたはカルシトニン
プロテイノイド担体(3μg/kg体重)をラットに十二指腸投与した後の血清
カルシウム変化を表す。結果は血清カルシウムの基礎値からの絶対変化として表
されている。データは平均+/−SEMを表している。**図示した時間における
非被包化コントロールとは顕著に異なる。
図16は、実施例20で述べるように、プロテイノイド担体被包化第IX因子
(FIX sph PO)の経口投与および第IX因子溶液の静脈内投与(FIX IV)後の凝
固時間を表す。
図17は、実施例21で述べるように、プロテイノイド担体被包化第IX因子
(FIX sph PO)および第IX因子(FIX)溶液(FIX unencap PO)の経口投与ま
たは第IX因子溶液の静脈内投与(FIX IV)後の凝固時間を表す。
図18は、α−インターフェロン(IFN)およびIFNプロテイノイド担体を
擬似胃液(SGF)中で保温した後に残存する無傷のIFNの%を表す。
図19は、0.08N HCl中でIFNおよびIFNプロテイノイド担体を
保温した後残存する無傷のIFNの%を表す。
図20は、擬似腸液(SIF)中でIFNおよびIFNプロテイノイド担体を保
温した後残存する無傷のIFNの%を表す。
図21は、ヘパリンまたはプロテイノイド/ヘパリン(両方とも水溶液)を与
えたラットの凝血時間を表す。データは6匹のラットの平均を示す。データは平
均+/−SEMを示す。
図22は、USPヘパリンまたはヘパリンプロテイノイド担体(両方ともクエ
ン酸中で)を十二指腸投与したラットの凝血時間を表す。各時間点は12匹のラ
ットの平均を示す。データは平均+/−SEMを示す。
図23は、ヘパリンスパイク空プロテイノイド担体またはヘパリンプロテイノ
イド担体を経口投与したラットの凝血時間を表す。各時間点は12匹のラットの
平均を示す。データは平均+/−SEMを示す。
図24は、M1プロテイノイド担体と非被包化M1とを対照して経口的に免疫
したラットの平均力価を表す。各群の反応動物のみの平均である。
図25は、HA−NA微小球体と非被包化HA−NAとを対照して経口的に免
疫したラットのHA−NA力価を表す。発明の詳細な説明
本明細書で引用したすべての特許および参照文献は、本明細書に参照によって
含まれる。一致しない場合には、定義および解釈を含み本明細書が優先する。
本発明は、分子量が約250から約2400ダルトンで限定されたアミノ酸組
成を有するプロテイノイドは、既知の反応を修飾し、さらに開始物質を選択する
ことによって得るこ
とができるという発見から得られた。これらのプロテイノイドは、光分解および
時間経過による分解の少なくとも1つに対して極めて強化された安定性をもつプ
ロテイノイド担体を形成する。さらに、そのようなプロテイノイドから調製され
たプロテイノイド担体は、不安定なポリペプチド、例えばインシュリン、α−イ
ンターフェロン、カルシトニン、抗原(例えばインフルエンザウイルスM1蛋白
)および第IX因子を含む、より広範囲の医薬を運搬し、従来のプロテイノイド
微小球体と比較して、冑腸管のいろいろな部分で選択的な遊離性を示すことがで
きる。
本発明の組成は、鳥類、霊長類等の哺乳類、特にヒト、昆虫等のいかなる動物
にも、生物学的に活性な薬剤を投与するのに有用である。
本発明のプロテイノイドは以下から成る群から選ばれるペプチドポリマーを含
む:
(i)チロシンとフェニルアラニンとから成る群から選ばれる少なくとも1個の
第一のモノマーと、グルタミン酸、ピログルタミン酸、グルタミンおよびアスパ
ラギン酸から成る群から選ばれる少なくとも1個の第二のモノマーとから製造さ
れるペプチドポリマー;及び
(ii)チロシンとフェニルアラニンとから成る群から選ばれる少なくとも1個
の第一のモノマーと、グルタミン酸、ピログルタミン酸、グルタミンおよびアス
パラギン酸から成る群から選ばれる少なくとも1個の第二のモノマーと、リシン
、アルギニンおよびオルニチンから成る群から選ばれる少なく
とも1個の第三のモノマーからと製造されるペプチドポリマーであって、該プロ
テイノイドは微小球体および/またはマイクロカプセルを形成し、さらに選択p
H領域で溶解する。
本発明のプロテイノイド分子は、約2個から約20個のアミノ酸残基、好まし
くは約2個から約8個のアミノ酸残基を含み、さらに、250から約2400ダ
ルトンの間、好ましくは約250から約600の間、最も好ましくは約250か
ら400ダルトンの間の範囲の分子量を有する。
本明細書において用いるアミノ酸という術語は、自然発生的及び合成アミノ酸
を含む、少くとも一つの遊離アミン基を有するいかなるカルボキシル酸をも含む
。好ましいアミノ酸はα−アミノ酸であり、好ましくは自然発生的α−アミノ酸
であるが、非α−アミノ酸も同様に有用である。
本発明において、アミノ酸またはペプチドの成分として使用する好ましい自然
発生的アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シ
トルリン、システイン、シスチン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロ
イシン、ロイシン、リジン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、プロ
リン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、オキシプロリ
ン、γ−カルボキシグルタミン酸、又はO−ホスホセリンである。最も好ましい
アミノ酸は、アルギニン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、チロシン、及
びバリンである。
本発明において、アミノ酸またはペプチドの成分として使用する好ましい非自
然発生的アミノ酸は、β−アラニン、フ
ェニルグリシン、α−アミノブチル酸、γ−アミノブチル酸、4−(4−アミノ
フェニル)ブチル酸、α−アミノイソブチル酸、ε−アミノカプロン酸、7−ア
ミノヘプタン酸、β−アスパラギン酸、アミノ安息香酸、(アミノメチル)安息
香酸、アミノフェニル酢酸、アミノ馬尿酸、γ−グルタミン酸、システイン(A
CM)、ε−リジン、ε−リジン(A−Fmoc)、メチオニンスルホン、ノル
ロイシン、ノルバリン、オルニチン、d−オルニチン、p−ニトロフェニルアラ
ニン、ヒドロキシプロリン、及びチオプロリンである。
本発明を実施するのに有用なアミノ酸は以下の化学式で表わされる:
R2は化学式−R3−C−を有し、式中R3は、C1〜C24のアルキル、C1〜C2 4
のアルケニル、フェニル、ナフチル、(C1〜C10のアルキル)フェニル、(C1
〜C10のアルケニル)フェニル、(C1〜C10のアルキル)ナフチル、(C1〜
C10のアルケニル)ナフチル、フェニル(C1〜C10のアルキル)、フェニル(
C1〜C10のアルケニル)、ナフチル(C1〜C10のアルキル)、及びナフチル(
C1〜C10のアルケニル)であり;
R3はC1〜C4のアルキル、C1〜C4のアルケニル、C1〜C4のアルコキシ、
−OH、−SH、及び−CO2R5又はこ
れらの組合せと任意に置換することができ;
R5は、水素、C1〜C4のアルキル、又はC1〜C4のアルケニルであり;
R3は、酸素、窒素、硫黄、又はこれらの組合せによって任意に中断してもよ
く;
R4は水素、C1〜C4のアルキル、又はC1〜C4のアルケニルである。
フェニル基又はナフチル基は任意に置換することができる。適当な置換の例と
しては、C1〜C6のアルキル、C1〜C6のアルケニル、1〜6の炭素原子を有す
るアルコキシ、ヒドロシキ、チオ、又はCO2R6(R6は水素、C1〜C6のアル
キル、C1〜C6のアルケニル)であるが、これらに限定されるものではない。
本発明にしたがってプロテイノイド分子から調製されたプロテイノイド担体は
、プロテイノイド中の第二および第三のモノマーの選択および量にしたがって、
特異的酸性または塩基性pH範囲で選択的溶解性を示す。
例えば腸管の遠位端部分で認められるようなアルカリpHの環境下で選択的に
溶解できるプロテイノイド担体は、塩基可溶性プロテイノイドから製造される。
これらのプロテイノイドは、反応混合物中の開始モノマーとして、グルタミン酸
、グルタミン、ピログルタミン酸およびアスパラギン酸から成る群から選ばれる
少なくとも1個の第二のモノマーを含む。塩基可溶性プロテイノイドは、約7.
2から約11.0の間の範囲のpHでは、大部分が陰イオンとして存在し可溶性
で
ある。約7.0以下のpHでは、このプロテイノイドの大部分は陽子付加され水
に不溶性である。
同様に、酸性pHの環境下(例えば胃)で選択的に可溶性であるプロテイノイ
ド担体は、酸可溶性プロテイノイドから製造できる。この場合、このプロテイノ
イドは、プロテイノイド反応混合物中に開始モノマーとして、グルタミン酸、ピ
ログルタミン酸、グルタミンおよびアスパラギン酸から成る群から選ばれる少な
くとも1個の第二のモノマー並びに、リシン、アルギニンおよびオルニチンから
成る群から選ばれる少なくとも1個の第三のモノマーを含む。約1から約7の範
囲のpHで、塩基可溶性プロテイノイドは主に陽イオンとして存在し可溶性であ
る。約7.2より上のpHで、このプロテイノイドは大部分が陽子を失い水に不
溶性になる。
酸可溶性プロテイノイドのpHおよび可溶性特性は、プロテイノイドの合成中
に付加される最後のアミノ酸のpH及び可溶性に大きく(完全にではないが)左
右される。例えば、塩基性アミノ酸(例えば、リシン、アルギニンおよびオルニ
チンから成る群から選ばれる第三のモノマー)の酸可溶性プロテイノイド中への
組入れは、プロテイノイドのpI(等電点のpH)を上昇させる。
本発明のプロテイノイドは、’673号特許で開示された条件下で適切なアミ
ノ酸の混合物を加熱して熱縮合反応によって製造できる。18個ものアミノ酸を
用いる’673号特許の方法と比べて、前述の各群から選ばれる少なくとも1個
のアミノ酸をもつ2個から5個の特異的アミノ酸の混合物に
よって、特定のpH領域で選択的可溶性をもつプロテイノイド担体が高い収量で
得られる。
熱縮合反応の実施に際して、テトラメチレンスルホン(高い沸点の不活性な極
性溶媒)を包含することによって低分子量プロテイノイドの収量(>80%)が
最大になることが分かった。溶媒を省略すると高収量の低分子量プロテイノイド
は産生されない。これは、おそらくこれら溶媒中のアミノ酸モノマーの低い溶解
性、および/またはこの反応条件の下でのモノマーと溶媒との避けられない副反
応による。
一般に、個々のアミノ酸は、テトラメチレンスルホン(スルホラン)を含む反
応フラスコに加えられる。このフラスコは、アルゴンまたは窒素ガスの不活性雰
囲気下で既に約130℃から約200℃、好ましくは約175℃から195℃の
範囲の温度に加熱されている。各々の添加後、アミノ酸のタイプおよび添加順序
にしたがい、溶液を約10分から約5時間の範囲で撹拌する。
上記のようにアミノ酸混合物を約190℃の温度まで加熱すると、反応が生じ
、水、アンモニアおよび二酸化炭素が副産物として発生する。水が形成されるに
したがい反応から除去し、水の発生が停止したとき反応を終了させる。その後、
プロテイノイドを激しく撹拌しながら過剰の水で反応を停止させることによって
、反応溶液から沈殿させる。約1時間撹拌した後、プロテイノイドを濾過によっ
て集め、水で洗浄し、真空下で乾燥させる。
誘導アミノ酸を用いる化学縮合法もまた、それによって分
子量のより強力な制御が可能になるので、本発明のプロテイノイド製造に有用で
ある。一般に、そのような反応は、開始剤とともにより低い反応温度で誘導され
る。特に、N−カルボキシα−アミノ酸無水物(NCA)法およびアジ化ジフェ
ニルホスホリル(DPPA)法(N.Nishiら、199、Makro-mol.Chem.192:PP1
789-1798)によって製造される低分子量プロテイノイドは、特定pH領域で選択
的可溶性を有するプロテイノイド担体を形成することが分かった。
NCA法は、α−アミノ酸エステルのN−カルボキシアンハイドライドの製造
、その後の開始剤として低分子量アミンを用いる重合化反応を含む。非NCA誘
導アミノエステル(例えば、α−メチルチロシンエステル)は、多くの有機溶媒
(例えばテトラヒドロフラン、THF)中で安定でかつ可溶性である有効な開始
剤であることが分かった。開始剤としてのアミノ酸の使用は、おそらくそれらの
有機溶媒中での貧弱な可溶性と低い安定性のためにこれまで知られていなかった
。NCA反応は純度の高いプロテイノイドを高収量で生じる。
DPPA法は、DPPAと低分子量アミンの存在下でα−アミノ酸のベンジル
エステルの直接縮合およびそれに続く、プロテイノイド産物に含まれる保護ベン
ジル基のアルカリ加水分解による除去を含む。アルカリ加水分解に代わって触媒
性水素付加が用いられる場合は、極めて高い純度及び収量の低分子量プロテイノ
イドが得られる。
上記の方法のいずれかによって得られるプロテイノイドは、
活性な薬剤をマイクロカプセル化するために直ちに用いることができる。またこ
のプロテイノイドを慣用的な方法で濃縮または乾燥させ将来の使用に備えて保存
してもよい。
本発明のプロテイノイドは以下のように精製される:
粗プロテイノイドを室温(例えば25℃)で水でスラリー化する。一方、この温
度で、スラリーのpHを酸可溶性プロテイノイドにはアルカリ水溶液(例えば4
0%水酸化ナトリウムおよび10%重炭酸ナトリウム水溶液)を用いて約pH8
に調節する。塩基可溶性プロテイノイドには、酸性水溶液(例えば10%酢酸溶
液)を用いてスラリーを酸性pHに調節する。続いて、混合物を濾過し、濾過塊
を多量の水で洗浄する。その後洗浄液と濾液を合わせ真空中で蒸発乾燥させプロ
テイノイドを得る。必要な場合には、この工程を所望の純度レベルのプロテイノ
イドが得られるまで繰り返す。
所望の場合は、プロテイノイドは、シリカゲルまたはアルミナ(移動相として
メタノールまたはプロパノールを用いる);イオン交換樹脂(移動相として水を
用いる);逆相カラム支持体(移動相としてトリフルオロ酢酸/アセトニトリル
混合物を用いる)を含む固体支持体を有するカラムで分画してさらに精製するこ
とができる。プロテイノイドはまた、低分子量夾雑物を除去するためにプロパノ
ールまたはブタノールのような低級アルコールで抽出して精製することができる
。
プロテイノイド担体は、以下のように精製プロテイノイドから製造できる:
プロテイノイドを脱イオン水で約75から約200mg/m
lの間、好ましくは約100mg/mlの濃度で、約25℃から約60℃の間、
好ましくは約40℃の温度で溶解する。溶液中に残存する微粒子物は慣用的な方
法(例えば濾紙上での重力濾過)で濾過して除去できる。
その後、約40℃の温度を維持しながら、約1Nから約2Nの間、好ましくは
約1.7Nの酸濃度を含む酸水溶液(また約40℃)とプロテイノイド溶液を混
合する。さらに、生じた混合物を、光学顕微鏡で観察しながら、微小球体および
マイクロカプセル形成のために有効な時間40℃で保温する。本発明を実施する
に際して、好ましい添加順序は、プロテイノイド溶液を酸水溶液に加えることで
ある。
適切な酸は、(a)プロテイノイドに不利な影響(例えば化学的分解)を与え
ない;(b)微小球体またはマイクロカプセル形成を妨害しない;(c)微小球
体またはマイクロカプセルの含有物の被包化を妨害しない;および(d)含有物
と不利な反応を生じない、いずれの酸も含む。本発明で使用する好ましい酸は、
酢酸、クエン酸、塩酸、燐酸、リンゴ酸およびマレイン酸を含む。
本発明実施において、プロテイノイド担体安定化用添加剤は、微小球体または
マイクロカプセル形成工程前に、好ましくは酸水溶液またはプロテイノイド溶液
に含まれる。そのような添加物の存在は、溶液中のプロテイノイド担体の安定性
と分散性を高める。
この添加物は、約0.1から5%(w/v)の間、好ましくは約0.5%(w
/v)の濃度で用いることができる。適
切な(しかしこれに限定されるわけではないが)安定化用添加剤の例は、アラビ
アゴム、ゼラチン、ポリエチレングリコールおよびポリリシンである。
その後、プロテイノイド担体は直ちに用いるか、または4℃で保存、または凍
結乾燥して室温もしくはそれ以下で乾燥下で保存する。
上記の条件において、担体は中空又は中実なマトリックス形式の微小球体を形
成し、含有物は、担体マトリックス、或いは液体又は固体の含有物を被包するカ
プセル形式の微小球体内に分配される。担体微小球体が、前述の酸水溶液中の薬
剤等の可溶性材料の存在下において形成される場合、この材料は微小球体内に組
み込まれる。このようにして、経口では通常生物学的利用能が低い、ペプチド、
蛋白質、多糖類、並びに抗菌剤等の配合有機分子等の薬理学的に活性な材料を組
み込むことができる。微小球体内に組み込むことのできる薬剤の量は、微小球体
形成溶液中の薬剤の濃度、並びに含有物の担体に対する親和性等の多くの要因に
よって決まる。
上記の条件下では、プロテイノイド分子は、直径が10ミクロンより小さいプ
ロテイノイドマイクロカプセルまたはプロテイノイド微小球体を含む球状プロテ
イノイド担体を形成する。本明細書で定義するように、「微小球体」とは、明確
な内部空洞を持たない球状の均質な網目状構造である。「マイクロカプセル」と
は、中空または空洞を形成するプロテイノイド壁をもつ球状構造を指す。プロテ
イノイド担体が可溶性物質(例えば医薬)の存在下で上記の酸水溶液中で形成さ
れる場合、この物質は、このマイクロカプセルの中空内に被包され、球状構造に
よって区切られたプロテイノイド壁内に閉じ込められるか、または微小球体構造
中のプロテイノイド分子マトリックス内に捕捉されると考えられる。このように
して、経口投与では生体利用度が低い薬学的に活性な物質、例えばペプチド、蛋
白および多糖類並びに荷電有機分子(例えばキノロンまたは抗微生物剤)を、被
包または捕捉することができる。プロテイノイド担体によって被包または捕捉で
きる医薬の量は、被包化溶液中の薬剤の濃度を含む多数の因子に左右される。
本発明のプロテイノイド担体は、薬学的に無害で活性薬剤の生理学的および生
物学的特性に変化を与えない。さらに、この被包化工程は活性薬剤の薬理学的特
性に変化を与えない。いずれの薬理学的に活性な適切な薬剤もプロテイノイド担
体内に被包化されるが、一方、それがなければ標的ゾーンに到達する前に動物体
内で遭遇する条件で破壊されるか、または効果が減少し、さらに冑腸管でほとん
ど吸収されないような医薬の送達に特に価値がある。
本発明のプロテイノイド担体は、それ自体では胃腸管粘膜をゆっくり通過する
か、または全く通過できないか、および/または胃腸管の酸や酵素の化学的切断
を受け易い一定の薬剤(例えば小型ペプチドホルモン)の経口投与に特に有用で
ある。そのような薬剤の非限定的な例は、ヒトまたはウシの成長ホルモン、イン
ターフェロンおよびインターロイキン−II、カルシトニン、心房性ナチュレチ
ック因子、抗原、モ
ノクローナル抗体および第IX因子、ビタミンK依存血液凝固プロ酵素を含む。
本明細書に開示される担体と共に使用するのに適した生物学的に活性な薬剤と
しては、それ自身では冑腸粘膜を通過できない、又はゆっくりとしか通過できず
、及び/又は胃腸管内において酸及び酵素による化学的分裂を受けやすい、ペプ
チド、特に小型ペプチドホルモン;多糖類及び特にムコ多糖類混合物;炭水化物
;脂質;又はその組合せを挙げることができるが、これに限定されるものではな
い。その例として、ヒト成長ホルモン;牛成長ホルモン;成長ホルモン放出ホル
モン;インターフェロン;インターロイキン−I;インシュリン;ヘパリン、特
に低分子量ヘパリン;カルシトニン;エリトロポエチン;心房性ナチュレティッ
ク因子(atrial naturetic factor);抗原;モノクローナル抗体;ソマトスタ
チン;アドレノコルチコトロピン;ゴナドトロピン放出ホルモン;オキシトシン
;バソプレッシン;クロモリンナトリウム(ナトリウム又はジソディウムクロモ
グリケート(di-sodium cromoglycate);バンコマイシン;デフェロキサミン(
DFO);又はその組合せを挙げることができるが、これに限定されるものでは
ない。
また本発明の担体は、農薬等の他の活性薬剤を送達するのに使用することもで
きる。
組成物中の活性薬剤の量は代表的には、薬理学的又は生物学的に有効な量であ
る。しかしながら、この組成物をカプセル、タブレット、又は液体等の投与ユニ
ット形態で用いる場
合には、投与ユニット形態が、多数の担体/生物学的活性薬剤組成物を包含する
か、若しくは分割された薬理学的又は生物学的に有効な量を包含するので、この
量は薬理学的又は生物学的に有効な量よりも少なくてもよい。総有効量は、全体
として、生物学的に活性な薬剤を薬理学的又は生物学的に活性な量を含む累積的
ユニットによって投与される。
投与ユニット形態はまた、賦形剤;希釈剤;崩壊剤;滑沢剤;可塑剤;着色料
;及び水、1,2−プロパンジオール、エタノール、オリーブオイル、又はその
組合せを含むがこれに限定されない投与ビヒクルのいずれを含んでいてもよい。
薬剤の被包または捕捉に使用する特定のプロテイノイドの選択は以下に含まれ
る因子の数に依存する:
(1)薬剤の酸性度または塩基性度;
(2)遊離のための胃腸管標的領域;
(3)一定pH領域での薬剤の可溶性;
(4)被包効率;
(5)薬剤とプロテイノイドとの相互反応。
例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシンおよびフェニルアラニンか
ら製造されたプロテイノイドは、特にヘパリンのような多糖類の被包化に適して
いる。
選択的pH可溶性に加え、プロテイノイド担体の粒子サイズは、胃腸管の標的
領域での活性薬剤の放出を決定するために重要な役割を果たす。約≦0.1ミク
ロンから約10ミクロンの間、好ましくは約5.0ミクロンから約0.1ミクロ
ンの間の直径をもち、被包化または捕捉された活性薬剤を含
むプロテイノイド担体は、十分に小さく、冑腸管内の標的領域で活性薬剤を有効
に放出する。>10ミクロンの大きなプロテイノイド担体は経口送達系ではあま
り効果的ではないことが多い。
プロテイノイドを活性薬剤を含む水または水溶液と接触させることによって形
成されたプロテイノイド担体のサイズは、種々の物理的または化学的パラメータ
ー、例えば被包化溶液のpH、浸透圧または塩濃度を操作することによって、さ
らに被包化工程で用いる酸を選択することによって制御することができる。
プロテイノイドの可溶性特性およびプロテイノイド担体の粒子サイズの両方を
適合させることによって、高度に酸性の胃(通常のpHは約2から約6)で安定
であるが腸の遠位部で溶解する塩基可溶性プロテイノイドから、活性剤含有プロ
テイノイド担体を製造することができる。そのようなシステムは、それがなけれ
ば胃腸管で急速に破壊されるような、ペプチドホルモン(例えばインシュリン)
および多糖類(例えばヘパリン)の経口投与に適している。それらはまた、冑の
刺激物、例えばアスピリンから胃を保護するために適している。そのようなアス
ピリン含有プロテイノイド担体を経口的に投与するとき、それらは、慣用の腸溶
皮被覆アスピリンよりはるかに迅速に冑腸管粘膜を通過し、アスピリンを放出す
る。通常被覆アスピリンは、まず冑を通過し続いて腸溶皮が溶解した後腸から血
流に入らなければならない。
弱塩基性条件(pH約8)で安定で、酸性条件(約2から
5のpH)で活性剤を放出する酸可溶性プロテイノイドからシステムを製造する
こともまた可能である。そのようなシステムは、カルシウム調節剤のような医薬
の静脈内投与およびドパミンまたはガンマ−アミノブチル酸のためのレドックス
担体システムに適している。
本発明のプロテイノイド担体は、錠剤、ペレット剤、カプセルおよび食用油の
ような液体に懸濁するに適した顆粒剤の形状で、固体として単独で経口的に投与
することができる。同様に、プロテイノイド担体は、1つまたは2つ以上の生理
学的に適した担体または賦形剤を含む経口投与可能な組成物として製剤化できる
。これらの組成物は慣用の成分、例えばゼラチン、ポリビニルピロリドン、およ
び澱粉やメチルセルロースのような充填剤を含むことができる。
本発明のプロテイノイド担体は注射によって投与することもできる。
以下の実施例は本発明を詳述するためで、本発明の範囲を制限しようとするも
のではない。
実施例1:
熱縮合反応による塩基可溶性プロテイノイドの製造
750mlのテトラメチレンスルホンを撹拌しながら4リットルフラスコ中で
不活性窒素ガスの中で190℃に加熱した。294gのグルタミン酸を添加し、
混合物を30分加熱した。266gのアスパラギン酸を加え、混合物をできる限
り迅速に190℃に加熱し、そのまま15分保持した。36
2gのチロシンを加え、混合物を190℃で3時間加熱した。330gのフェニ
ルアラニンを加え、混合物を190℃で1時間半加熱した。続いて、この熱い融
解物を激しく撹拌しながら5リットルの水に注ぎ入れた。約1時間撹拌後、混合
物を濾過し、濾液を捨てた。塊を5リットルの水で再びスラリー化し、濾過し、
塊をさらにもう一度5リットルの水でスラリー化した。このスラリーのpH(2
5℃)を40%水酸化ナトリウムを用いて8に調節した。混合物を濾過し、塊を
少量の水で洗った。洗浄液と濾液を合わせ、真空中で蒸発乾燥させGlu/Asp/Tyr/
Pheプロテイノイドを得た。
付録A、BおよびCは、熱縮合法によって調製した他のプロテイノイドの例を
記載する。
実施例2:
熱縮合反応による酸可溶性プロテイノイドの製造
750mlのテトラメチレンスルホンを撹拌しながら4リットルフラスコ中で
不活性窒素ガスの中で190℃に加熱する。294gのグルタミン酸を添加し、
混合物を30分加熱する。362gのチロシンを加え、混合物を190℃で3時
間加熱する。330gのフェニルアラニンを加え、混合物を190℃で1時間半
加熱する。266gのアルギニンを加え、混合物をさらに1時間半加熱する。続
いて、この熱い融解物を激しく撹拌しながら5リットルの水に注ぎ入れる。約1
時間撹拌後、混合物を濾過し、濾液を捨てる。塊を5リットルの水で再びスラリ
ー化し、濾過し、塊をさらにもう一度5リ
ットルの水でスラリー化する。このスラリーのpH(25℃)を10%酢酸溶液
を用いて5に調節する。混合物を濾過し、塊を少量の水で洗う。洗浄液と濾液を
合わせ、真空中で蒸発乾燥させプロテイノイドを得る。
添付書類A、BおよびCは、熱縮合法によって調製した他のプロテイノイドの
例を記載する。
実施例3:
アミン開始剤を用いたNCA法によるプロテイノイドの製造
本実施例は、Asp.Bz、Glu.Bz、PheおよびTyr成分から成るコポリペプチドを製
造するNCA法を説明する。これらアミノ酸のNCAモノマーは報告された方法
にしたがって製造した。
反応は、開始剤としてベンジルアミン(BzNH2)または4−メチルベンジルア
ミン(MeBzNH2)を用いテトラヒドロフラン(THF)またはジクロロメタン中で室
温で実施した([M]=10%)。生じたコポリマーの性状決定は”HNMRお
よびGPCで実施した。得られた結果は表1に挙げる。
表1に示すように、第二のモノマーとしてAspおよび/またはGluを有し、第一
のモノマーとしてPheおよび/またはTyrを有するプロテイノイドが、[M]/[
I]=5の比率でBzNH2で開始した重合反応から高収量で得られた(No.2-1
から2-7)。
ポリ(Asp.Bz-co-Phe)のGPC曲線(図1)から1.91の多分散性が決定
された。同様な分子量分布が他のコポリマ
ーについて観察された。
多分散性は、本明細書では、サンプルの分子量分布と定義される。この分布は
、分子の数(Mn)で割った分子量(MW)に由来する数値で表される値を割り当て
られている。ホモポリマーの多分散性値は、分子量と分子数が等しいので1であ
る。多分散性値が1のいずれのポリマーも非常に狭い分布をもつと考えられる。
多分散性値が1.6から1.7であるポリマーは、中程度の分布をもつと考えら
れる。2.0−2.1の多分散性値をもつポリマーは広い分布を有すると考えら
れる。
Asp.BzのNCAの同種重合反応およびAsp.Bz、Glu.Bz、PheおよびTyrのNCA
の異種重合反応はまた、開始剤としてMeBzNH2を用いて実施した(No.2-11
、2-15および2-16)。同様な結果がBzNH2によって開始した反応について得
られた。
実施例4:
開始剤としてα−メチルチロシンエステルを
用いるNCA法によるプロテイノイドの製造
本実施例は、開始剤としてα−メチルチロシンエステル(Tyr.Me)を用いるN
CA重合反応の実施方法を説明する。反応条件は、実施例4で述べたものと本質
的には同じであるが、テトラヒドロフラン(THF)溶媒が用いられた点が異なる
。結果は表2に挙げる。
Tyr.Meによる開始は非常に速く(No.2-17から2-20)、すべてのNCAが2時
間後には変換されることが分かった。GPCのデータから、ポリマーの分子量は
[M]/[Tyr.Me]の比が増すにつれ増加し多分散性は極めて狭いことが認めら
れた。ポリマー中のTyr.Me残基の存在は、1HNMRスペクトルによって確認し
た。結論として、Tyr.Meはアミノ酸NCAの重合反応のための新規で効果的な開
始剤である。
サンプル番号2−13は、β−アラニンで開始し、無水琥珀酸で停止させた重
合反応を表す。β−アラニンは、ほとんどの有機溶媒に不溶であるので、反応は
還流THF中で実施した。結果として、得られたポリマーの多分散性は、Tyr.Me
で開始したポリマーのそれより広かった。
実施例5:
DPPA法(#1)によるプロテイノイドの製造
これは、種々の重合条件((a)、(b)、(c)および(d))で、基材と
してDPPAおよびトリエチルアミン(TEA)の存在下でAsp.Bzの直接重縮合の
実施例である。このポリマーの分子量は、多分散性と同様各々の事例においてG
PCによって調べた。ポリマーはIRおよびNMR分光測定によって特性を調べ
た。
Asp.Bzは、以下のようにL−アスパラギン酸のエステル化によって製造した:
L−アスパラギン酸(26.6g、0.2モル)を500mlの丸底フラスコ中
の300mlの蒸留したばかりのベンジルアルコールに懸濁し、続いて45ml
の濃縮塩酸(12N)を加えた。混合物を激しく撹拌しながら60℃まで30分
加熱した。その後、反応溶液を室温まで冷却した。トリエチルアミン(約56m
l)を加え溶液を中和した(pH約7)。粗生成物を濾過で集め、エタノールと
アセトンで洗浄した。真空中で乾燥させ、熱水中で2度結晶化させた。18gの
生成物が得られた(%収量=44%)。融点=217℃。
市販のDPPAはさらに精製することなく用いた。TEAは使用前に蒸留した
。重合反応の溶媒は慣用的な方法で精製した。Asp.Bzの直接重縮合反応はDPP
AおよびTEAの存在下でモノマーのジメチルホルムアミド(DMF)溶液を撹拌
して実施した。混合物は0−10℃で1時間撹拌し、その後室温で2日間撹拌し
た。生じたポリマーを大量の水で沈殿させ、濾過で集め、続いて真空中で乾燥さ
せた。
a.モノマー濃度の影響
表3に挙げたものは、室温で2日間DMF中でAsp.Bzを重合させた結果である
。ポリ(Asp.Bz)はこれら直接重縮合反応から高収量で得られた。このポリマー
の分子量はモノマーの濃度[M]に依存することが分かった。広い分布をもつ低
分子量ポリマーは、低い[M]で得られた(図2、曲線A)。他方、[M]が0
.2g/ml以上のとき、二相性分子量分布をもつポリマーが得られた(図2、
曲線B)。低分子量オリゴマー(−1000)は、末端アミノとβ−カルボキシ
ル基との間の分子内停止によるかもしれない。THF/メタノールから数回の再
沈殿を行った後、高分子量(Mn=22000)の狭い多分散性(Mw/Mn=1
.68)のポリマーが、[M]=1g/mlで調製したポリマー混合物から上手
く分離された。分離はまた、バイオビーズを用いてGPCカラムで実施した。
b.反応時間と温度の影響
生成されるポリマーの収量は反応時間とともに増加する:5時間で75%変換
、4日で95%(図3、曲線A)。生成されるポリマーの分子量はまた、開始相
における時間とともに増加し(4時間まで)、その後ほぼ定常となった(図4)
。重合反応は温度の上昇とともに低下した(図3、曲線B)。60℃と80℃で
得られたポリマーは黄色でTHFに不溶であるが、DMFおよびDMSOに可溶
である。これは、アスパラギン酸の熱重縮合の間に発生することが報告されたイ
ミ
ド環の形成によるものかもしれない。
C.モル比[DPPA]/[M]と[TEA]/[M]の影響
ポリマーの収量と分子量のモル比[DPPA]/[M]並びに[TEA]/[
M]に対する依存を調べた(表4)。最も高い収量は、[DPPA]/[M]が
1.3、[TEA]/[M]が2.3で得られた(図5)。これらの観察結果は
Nishiらが報告した結果と一致する。より大きな分子量生成物は、それぞれ[D
PPA]/[M]=1.3−2.0および[TEA]/[M]=2.0−3.0
の範囲で得られた。
d.溶媒の影響
種々の溶媒における重合反応の比較を表5に示す。この表から、ポリマーの収
量と分子量は用いる溶媒によって影響を
受けることが分かる。より高い収量がDMFで得られ、一方、より大きい分子量
はTHF中および塊状重合で得られた。他方、ジオキサン中での重合は低分子量
生成物を生じ、したがって好ましい。
実施例6:
DPPA法(#2)によるプロテイノイドの製造
DPPAの存在下でのAsp.Bzと他のアミノ酸モノマー、例えばγ−ベンジルグ
ルタメート(Glu.Bz)、β−アラニン(Ala)、フェニルアラニン(Phe)、O−
ベンジルチロシン(Tyr.OBz)との共重合をAsp.Bzの同種重合反応(実施例5)
と同じ工程を用いて実施した。表6に示すように、ランダム共重合(アミノ酸)
が高収量(>77%)で得られた。これは、DPPAを用いるアミノ酸の共重合
反応は、コポリペプチド合成に有用なアプローチであること示している。二相性
分子量
分布がまた、Asp.Bzの同種重合反応と同様にこれらの場合でも観察された。
実施例7:
DPPA法により生成される
プロテイノイドの還元的脱ベンジル化
本実施例は、触媒的水素付加によるポリ(Asp.Bz)およびポリ(Glu.Bz)のベ
ンジル保護基の除去のための好ましい方法を説明する。
ポリマーの水素付加は以下の方法にしたがって実施した:THF/メタノール
(1:1、v/v)中のポリマー溶液に活性炭素上のPd(10%)をポリマー
重量の1/10の量で加えた。空気を窒素で置き換えた後、水素ガスをこの系に
導入し、バルーンとともに維持した。反応混合物を室温で一
晩撹拌した。濾過で触媒を除き、さらに溶液を濃縮した後、混合物を大量の石油
エーテルに注ぎ入れ、ポリマーを沈殿させた。得られたポリマーを続いて真空中
で乾燥させた。
水素付加の完了はポリマーの1HNMRで確認した。ほとんどの場合、有用な
水溶性ポリマーが生成された。水素付加は、ベンジル基の除去について効果的で
清浄な方法である。
実施例8:
Glu、AsD、Tvr、Pheプロテイノイドをもつ
空のプロテイノイド担体の製造
本実施例は、空プロテイノイド担体の製造および洗浄方法を説明する。
方法
1.試薬:
a.実施例1で述べたように調製したプロテイノイド粉末
b.無水クエン酸(USP)
c.アラビアゴムNF
d.脱イオン水
e.氷酢酸
2.装置:
a.pHメーター
b.水浴、40℃
3.溶液の調製:
a.プロテイノイド溶液−100mgのプロテイノイドを1mlの脱イオン水(
またはその倍数)に溶解する。ワッ
トマン(Whatman)#1濾紙で濾過(必要な場合)し、40℃の水浴中で保持す
る。これを溶液Aとする。
b.0.5%アラビアゴム含有1.7Nクエン酸−5gのアラビアゴムと109
gのクエン酸を1リットルの脱イオン水に溶解する。40℃で保温。これを溶液
Bとする。
4.プロテイノイド担体の製造
a.40℃の水浴中で溶液Bを手でかきまぜながら、溶液Aの全てを溶液Bに1
段階で迅速に加える。
実施例9:
ネズミIgGモノクローナル抗体含有プロテイノイド担体の製造
本実施例は、抗レオウイルスモノクローナル抗体(mAb)9BG5(レオウ
イルス3型のシグマ−1遺伝子産物(ヘマグルチニン、HA3)に対して作製さ
れたmAb)の被包化を説明する。HA3は、レオウイルス3型のための細胞表
面受容体に結合し、mAb9GB5はウイルスのこの受容体との結合を妨害する
。
マウスIgGモノクローナル抗体9BG5は、ウイリアムズらの記載(W.V.Wi
lliamsら、1991、J.Biol.Chem.266(8):pp5182-5190)の他に本明細書に引用
した文献にしたがい、精製レオウイルス3型調製物(W.V.Williamsら、1988、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA,85:pp6488-6492)を用いて調製および精製した。本
実施例で用いた精製9BG5は、燐酸緩衝食塩水(pH7.2)中で1.5mg
/mlの蛋白濃度を有していた。
mAb 9BG5を被包するプロテイノイド担体は、0.85Nのクエン酸中
の最終濃度がGlu/Asp/Tyr/Pheプロテイノイド(反応混合物中のGlu,Asp,Tyr,
Pheのモル比は1:1:1:1)は50mg/ml、mAbは0.7mg/ml、アラ
ビアゴムは0.5%で製造した。
空のプロテイノイド担体は、mAbを除いて他は同じ最終濃度を含むように製造
した。mAb入りと空のプロテイノイド担体調製物の2組の部分標本(0.5m
l)を5000rpmで遠心した。ペレットと上清を凍結し、抗体被包化効率を
決定するためにウェスタンブロットで分析した。
図6は、精製mAb 9BG5、空のプロテイノイド担体(mAbの添加無し
)、および9BG5含有プロテイノイド担体のウェスタンブロット分析のx−線
フィルムである。この分析は、特異的にmAb 9BG5と反応する抗マウスI
gGを用いてイムノブロットによって実施した。レーンは以下と対応する:
レーン サンプル
1 2μgの9BG5 mAb
2 1μgの9BG5
3 0.25μgの9BG5
MW 分子量マーカー
4 被包化後の空のプロテイノイド担体上清
5 空のプロテイノイド担体ペレット
6 被包化後のmAb含有上清
7 mAb含有プロテイノイド担体ペレット
データは、9BG5プロテイノイド担体はペレット中に約40%のmAbを含
み、残りの60%はプロテイノイド担体中に取り込まれず、上清に残ることを示
している。空のプロテイノイド担体は、予想通り上清にもペレット中にも抗体を
含んでいなかった。
純粋なmAbの相対的移動度(分子量)は、プロテイノイド担体中のmAbよ
りもわずかに異なっていた。これは被包化工程は0.8Mの塩溶液を用いたので
、サンプル中の塩濃度の違いによる可能性が最も高い。
実施例10:
被包化ネズミmAb 9BG5をもつプロテイノイド担体
の安定化における添加物の影響
担体形成に必要なmAbの濃度および最適担体形成条件を決定するために、添
加剤ありと添加剤無しについて、種々のプロテイノイド担体製剤をスクリーニン
グした。
被包化プロテイノイド担体を調製するために用いたmAb 9BG5調製物は
、燐酸緩衝食塩水中で約2mg/mlの蛋白濃度を有していた。
最終プロテイノイド濃度は50mg/ml、アラビアゴム(「gum」)またはゼ
ラチン(「gel」)は5%(w/w)であった。すべてのプロテイノイド担体は0
.85Nのクエン酸中で調製した。空の担体はコントロールとして使用するため
に含まれ、それらはmAbを除いて同じ態様で調製した。プロテイノイド担体懸
濁物の2組(0.5ml)の部分標本を5000rpmで遠心した。分析の前に
ペレットと上清を凍結
した。
表7は調製したサンプルを挙げる。括弧内の数字は添加mAbの量を示す。
mAb含有プロテイノイド担体の統合性に対する凍結融解の抵抗性を調べるた
めに、2組のペレットのそれぞれの対のうちの1つを0.85Nのクエン酸0.
25mlに穏やかに再懸濁して洗浄した。ペレットを非洗浄ペレットに続いて分
析し、mAbが洗浄で失われるか否かを調べた。
実施例9で述べたように慣用のウェスタンブロッティングで分析した。ペレッ
トを0.05N NaOHを含むドデシル硫酸ナトリウム中に溶解し、還元状態
で分析した(mAbを50kDaと25kDaのバンドに分解する)。上清の部
分標本(50μl)を非還元状態で分析した(無傷の150kDa mAbは除
いて)。これは、後に残るmAbが変性しているか無傷かを別々に決定するため
に実施した。
図7のウェスタンブロットのx−線フィルムから分かるように、サンプル9お
よび10、並びに11および12のペレットは、5から10μgの間のmAbを
含んでいる。洗浄サンプルは顕著な量のmAbを失わなかったが、これは、プロ
テイノイド担体は凍結融解後無傷のままであることを示唆している。
サンプル9および11の上清は顕著な量のmAbを持たないが、これは、取り
込まれなかった物質は調製中に失われたことを示している。
サンプル17は、洗浄後に失われるいくらかの被包化mAbを有していた(No
.18参照)。この球体調製物は、凍結融解耐性ではなかった。さらに、サンプ
ル17の上清について、分子量150kDaのバンドは、顕著な量のmAbがプ
ロテイノイド形成後取り残されることを示している。
これらの結果に基づき、mAbは無傷のままであり、したがって、被包化工程
はmAbを分解しないようにみえる。空のプロテイノイド担体コントロールは、
それらはmAbを含んでいないので、予想通りいずれのバンドも生じなかった。
実施例11:
被包化ネズミモノクローナル抗体の効力
本実施例では、mAb 9BG5プロテイノイド担体調製物と非被包化mAb
9BG5をラットで評価した。実施例9で述べたように調製したmAb 9BG
5(1mg/ml)をGlu/Asp/Tyr/Pheプロテイノイド(反応混合物中のGlu
、
Asp、TyrおよびPheのモル比は1:1:1:1)を担体製剤中にアラビアゴムとともに被
包した。mAbプロテイノイド担体懸濁物は0.85Nクエン酸−0.5%ゴム
中に0.25mg/mlのmAbおよび50mg/mlのプロテイノイドを含ん
でいた。空のプロテイノイド担体は同様に調製したが、mAbは含まれていない
。mAbの30%が被包されることが分かったので、mAbプロテイノイド担体
は0.075mg/mlのmAbを含んでいると算定され、この数値を投与量決
定に用いた。このmAbプロテイノイド担体を顕微鏡的に調べたが、十分に均質
な調製物であることが分かった。
動物への投与には、適切な量のプロテイノイド担体を5000rpmで15分
遠心し、ペレットを0.85Nクエン酸−0.5%ゴムの1.0mlに再懸濁し
た。
精製mAb溶液(0.85Nクエン酸−0.5%ゴム中のmAb 0.95m
g/ml)を胃管経由経口投与のために用いた。この溶液を投与前に40℃に予
め加温した。静脈投与のためには、精製mAb溶液(燐酸緩衝食塩水中のmAb
、1mg/ml)を用いた。
本実験で用いた量および投与経路は以下の通りである:
1.空のプロテイノイド担体(mAb無し):50mgの空のプロテイノイド担
体を含む1ml、胃管による経口投与(ラット#2312と2313)。
2.mAb 9BG5プロテイノイド担体:3.7mg mAb/kgラット体重
を胃管による経口投与(ラット#2287、2288、2290および2291
)。
3.非被包化mAb 9BG5:0.73mg/kgラット体重を静脈内投与(
ラット#2292、2293および2311)。
4.非被包化mAb 9BG5:3.7mg/kgラット体重を胃管による経口
投与(ラット#2314および2315)。
基線用血液サンプル(1ml量)を投与直前(”0”時)に各ラットから採取
した。投与後、血液サンプルを1時間、6時間および24時間で採取した。血液
サンプルは直ちに処理し血清を−20℃で凍結した。
実験動物から得た融解血清を3組一体として、多穴(ウェル)プレートに固定
した精製レオウイルス3型およびVLSH二量体ペプチドを用いて慣用のELI
SA技術で調べた(W.V.Williamsら、1991、J.Biol.Chem.,266(8):pp5182-5
190)。コントロールプレートは、固定レオウイルスおよびVLSHペプチドを含
まないウェルを有するが、それらにmAb(1mg/ml)を添加した。VLS
Hペプチド(W.V.Wil-liamsら、上掲書、表1)はVLペプチドの合成変種で、
後者は87.92.6抗体の軽鎖可変CDR II領域部分に対応する。87.9
2.6抗体は、レオウイルス3型受容体とmAb 9BG5に対してそれぞれイ
ディオタイプおよび抗イディオタイプとして作用する(W.V.Williamsら、上掲
書)。各ウェルの結合蛋白含有量は標準的な蛋白法、例えば、ローリー(Lowry
)法で測定し、各多穴プレートの結果はそれぞれ図8(a−c)に示す。
図8(a−c)は、蛋白濃度測定で検出した固定レオウイルス3型およびVL
SHに結合した血清蛋白レベルを示す。これらの図は、投与24時間後の結合蛋
白の血清レベルはmAbプロテイノイド担体を経口投与した動物および非被包化
mAbを静脈内に投与した動物について最も高かった。より低い結合血清蛋白は
非被包化mAbを経口投与された動物で認められた。空のプロテイノイド担体(
mAb無し)を投与された動物から採取した血清では、このアッセー条件下では
予想通り特異的血清IgGは認められなかった。
図9は、固定レオウイルス3型およびVLSH蛋白を用いた慣用のELISA
工程で結合するmAbを示す。0.85Nクエン酸−0.5%ゴム(図9(a)
)または燐酸緩衝食塩水(図9(b))で処理した段階希釈mAbを用いた。図
は、結合蛋白レベルは燐酸緩衝液中のmAbよりもクエン酸緩衝液中のmAbの
場合が高いことを示している。本発明に拘らず、結合強化はクエン酸−蛋白結合
による三次元構造の変化に起因すると考えられる。
要約すれば、mAbの血清レベルは、結合蛋白の吸着によって示されるように
、被包化mAbを経口的に投与された動物、または非被包化mAbを静脈投与さ
れた動物の方が、非被包化mAbを経口的に投与された動物よりも高かった。
実施例12:
ヘパリン含有プロテイノイド担体の製造
本実施例はヘパリンプロテイノイド担体の調製とクリーニ
ングの方法を説明する。
工程
1.試薬:
a.実施例1で述べたように調製したプロテイノイド粉末
b.ヘパリン
c.無水クエン酸(USP)
d.アラビアゴムNF
e.脱イオン水
f.乾燥剤
g.液体窒素
2.装置:
a.磁気撹拌装置
b.ビュレット
c.顕微鏡
d.医療用遠心機
e.透析膜チューブ(スペクトラム社製6、10mm、排除分子量50000
)
f.pHメーター
g.凍結乾燥機(Labconco #75035)
h.凍結乾燥用フラスコ(150−300ml)
i.回転シェル付フリーザー
j.イソプロパノール/ドライアイス浴または液体窒素
k.モーターおよび乳棒
l.保存用容器(500ml)
m.エッペンドルフピペット(0−100μl)
n.透析チューブ用プラスチック封入装置(スペクトラム社製)
o.0.45μmアクロディスク付2ml注射筒
3.溶液の調製:
a.プロテイノイド溶液A*(80mg/ml):
160mgプロテイノイドを1mlの脱イオン水に溶解。0.45μmアク
ロディスク装着2ml注射筒を用いてこのプロテイノイド溶液を10ml試験管
内に濾過し、40℃に維持。
b.溶液B(1%ゴム入り1.7Nクエン酸):
10gのアラビアゴムと109gのクエン酸を1リットルの脱イオン水に溶
解。
c.溶液C(ヘパリン溶液):
溶液Bに150mg/mlでヘパリンを溶解、40℃に維持する。
*またはその倍数
4.プロテイノイド担体の調製:
a.40℃の水浴中で溶液Aを全て溶液Cに迅速に加え、その間ゆっくりと溶液
Cを手で撹拌する。
5.ヘパリンプロテイノイド担体の透析:
被包化プロテイノイド担体中のクエン酸はその後の凍結乾燥工程を阻害するこ
とが分かった。したがって、クエン酸溶液で調製したプロテイノイド担体被包化
物は、好ましくは5%酢酸溶液に対して少なくとも4回透析溶液を交換し少なく
とも2時間透析し、交換工程によってクエン酸を除去する。
したがって、
a.注射筒(針無し)で懸濁物を透析チューブに移し、プラスチック封入装置で
封止する。チューブは70%以上満たしてはならない。
b.表面に沈殿および/または凝集した一切の非晶質物質は廃棄する。
c.プロテイノイド担体懸濁物を酢酸溶液に対して透析する(プロテイノイド担
体懸濁物1mlにつき20mlの酢酸を用いる)。その間、酢酸溶液を磁気撹拌
装置で撹拌する。
d.1時間毎に酢酸溶液を取換える。全体で3時間透析を続ける。
6.凍結乾燥:
a.50%トレハロース(シグマケミカル社製、セントルイス、ミズーリー、US
A)1容を9容の透析プロテイノイド担体に添加する。約190rpmで回転す
るように調整し、液体窒素浴に沈めたシェルフリーザーを用いて、凍結乾燥フラ
スコ中でプロテイノイド担体をフラッシュ凍結する。
b.24時間または自己冷却がみられないことによって乾燥が明らかとなるまで
凍結乾燥させる。
c.乾燥プロテイノイド担体の重量を記録する。
d.モーターと乳棒で微粉末となるまですりつぶす。 e.褐色容器にプロテイ
ノイドを移し、乾燥剤とともに封をし室温で保存する。
7.再懸濁:
a.凍結乾燥粉末の重量を計り、粉末中のプロテイノイド量を算出する。
b.0.85Nのクエン酸水溶液を凍結乾燥粉末に40℃で添加する。溶液中の
最終プロテイノイド濃度は80mg/mlである。
実施例13:
インシュリン含有プロテイノイド担体の調製
本実施例は、インシュリンプロテイノイド担体の調製方法を説明する。
方法
1.試薬:
a.プロテイノイド担体
b.無水クエン酸(USP)
c.ゼラチン(USP)
d.ブタインシュリン(ノボノルディスク)
e.脱イオン水(USP)
2.装置:
a.水浴
b.0.2ミクロンアクロディスクフィルター
c.滅菌注射筒(10cc)
d.所望量のプロテイノイド担体溶液のための適切な容量のガラスまたはプラ
スチック容器
3.溶液の調製:
a.5.0%ゼラチン入り1.7Nクエン酸:
脱イオン水1mlにつき109mg無水クエン酸と50mgゼラチンの割合
で所望の容量**に溶解し、40℃の水浴中でゼラチンが完全に溶解するまで保温
する。これは後で使用するために調製し、40℃で保存できる。
b.インシュリン溶液:
40℃で、5%ゼラチン入り1.7Nクエン酸1mlに12mgインシュリ
ンの割合で所望の容量に溶解する。
c.プロテイノイド溶液:
室温で脱イオン水1mlにつき100mgのプロテイノイドの割合で所望の
容量に溶解する。注射筒と0.2ミクロンのアクロディスクを用いて溶液を濾過
し、清澄な液体とし40℃の水浴中で保温する。5bを参照。
4.プロテイノイド担体の調製:
a.最終的に所望量のプロテイノイド担体を製造するために十分な等容量のプロ
テイノイド溶液とインシュリン溶液を合わせる。
b.濾過したプロテイノイド溶液を迅速にインシュリン溶液に40℃で加え、そ
の間、同時かつ定常的にインシュリン溶液を撹拌し完全に混合させる。
**プロテイノイドおよびインシュリン溶液は、所望の最終微小球溶液の全量の
1/2で各々調製される。
実施例14:
エリトロポエチン含有プロテイノイド担体の製造方法
プロテイノイド担体におけるヒトエリトロポエチン(EPO)の被包化を実施
例13で述べた態様と同じように実施した。EPOはジェネティックインスティ
チュート(Genetic Institute)(ケンブリッジ、マサチューセッツ、USA;現在
はアムジェンコープ(Amgen Corp)(サウザンド・オークス、カリフォルニア、USA
)より入手可能)から入手した。Gln/Asp/Tyr/Pheプロテイノイド(プロテイ
ノイド反応混合物中でGln、Asp、TyrおよびPheのモル比1:1:1:1)の溶液および
1%ゴム入り1.7Nクエン酸中の150μg/mlのEPO溶液を、EPO含
有プロテイノイド担体調製に用いた。
実施例15:
エリトロポエチン含有プロテイノイド担体の評価
本実施例では、EPO含有プロテイノイド担体(実施例14で述べたように調
製)をラットで調べた。EPO実験の概要は下記に示す。
150−200gのラットをケタミン(8.5mg/kg)およびソラジン(3.75mg/k
g)の筋肉注射で麻酔した。続いてラットに非被包化エリトロポエチンまたは被
包化エリトロポエチンのいずれかを胃管で経口投与した。簡単に記せば、8フレ
ンチネラトンカテーテルを、カテーテルの10cmマークが門歯と同じ位置にな
るまでラットの食道に挿入する。被検溶液またはコントロール溶液を注射筒に吸
い上げ、カテーテルに繋ぐ。動物を直立に保持し、溶液をラットの胃に送り込む
。実験結果は図10−12に纏める。
図10は、Gln/Asp/Tyr/Pheプロテイノイド担体被包化EPO(15μg EPO/kg
体重)および被包化EPO(15μg EPO/kg体重)を投与したラットからt=0.
5、1および2時間で採取したラット血清中に検出されたエリトロポエチン(EP
O)レベルを表す。血清エリトロポエチンレベルは、エリトロポエチン酵素免疫
アッセーキット(アムジェン(Amgen)、サウザンドオークス、カリフォルニア、U
SA)を用いて時間に対して測定した。結果は、エリトロポエチンプロテイノイド
担体を投与したラットのEPO血清レベルは、非被包化物質を投与したラット(
コントロール)と比較して全ての時点で相対的に高かった。t=2時間では、E
POレベルは、エリトロポエチンプロテイノイド担体を投与したラットでは約3
00pg/ml血清で、一方、コントロールラットはEPOレベルは検出できな
かった。
図11は、エリトロポエチン(50μg/kg)またはGln/Asp/Tyr/Pheプロテイノ
イド(反応混合物中のGln、Asp、TyrおよびPheのモル比は1:1:1:1)担体被包化
エリトロポエチン(50μg/kg)のいずれかを十二指腸基部に直接投与したラット
のEPO血清レベルを表す。血清エリトロポエチンレベルは、上記のエリトロポ
エチン酵素免疫アッセーキットで時間に対して測定した。結果は、エリトロポエ
チンプロテイノイド担体を投与したラットのEPO血清レベルは2時間の範囲に
わたって、1時間につき約50pg/mlの速度で定常的に上昇した。反対に、
非被包化EPOを投与したラット(コントロール)では、EPOレベルは投与後
1時間で最高値100pg
/mlに達し、2時間終了時には約50pg/mlまで定常的に減少した。
図12は、Gln/Asp/Tyr/Pheプロテイノイド(反応混合物中のGln、Asp、Tyrお
よびPheのモル比は1:1:1:1)担体被包化または非被包化エリトロポエチン(100
μg/kg)を胃管で経口投与したラット、または2μg/kgもしくは10μg/
kgのいずれかを皮下注射したラットのEPO血清レベルを示す。血清エリトロ
ポエチンレベルは上記のエリトロポエチン酵素免疫アッセーキットで時間に対し
て測定した。結果は、経口的にエリトロポエチンプロテイノイド担体を投与した
ラット(#640−645)のEPO血清レベルは、非被包化物質を与えられた
ラット(EPO)と比較してt=2時間まで相対的に高かった。
本実施例で得られた結果は、プロテイノイド被包化はEPOの経口的生体利用
性を顕著に改善することを立証した。
実施例16:
カルシトニン含有プロテイノイド担体の調製
プロテイノイド担体内のサケカルシトニンの被包化は実施例13と同じ態様で
実施した。カルシトニン(血清カルシウム濃度を減少させるために主に骨に作用
するペプチドホルモン)は、サンド(Sandz)(バーゼル、スイス)から入手し
た。カルシトニンプロテイノイド担体は、実施例13で述べたように、Gln/Asp/
Tyr/Pheプロテイノイド(プロテイノイド反応混合物で用いられるGln、Asp、Tyr
およびPheのモル比は1:1:1:1)の水溶液100mg/mlと1%アラビゴム含有
1.
7Nクエン酸溶液中のカルシトニン150μg/ml溶液とを1:1の容積比で
混合して調製した。カルシトニン被包化効率は約40%であった。カルシトニン
濃度は、カルシトニンプロテイノイド担体を60%アセトニトリル水溶液に溶解
後、HPLCで直接測定した。
実施例17:
カルシトニン含有プロテイノイド担体のサルでの評価
本実施例では、カルシトニンプロテイノイド担体(実施例16で述べたように
調製)はシノモルガスモンキーで効果を調べた。体重4−5kgの雄のシノモル
ガスモンキーを一晩絶食させ、麻酔(約10mg/kgの塩酸ケタミン)し、投
薬および血液採取のため霊長類用拘束イスに固定した。カルシトニンプロテイノ
イド担体の経口投与を1回(0.25mg/kg体重)のみ鼻管カテーテルにより胃管経
由で4匹のサルのそれぞれに実施した。投薬量決定は、投薬の朝に測定した体重
に基づいて行った。血液サンプルは伏在静脈カテーテルによりプロテイノイド担
体投与前をt=0として開始し1時間間隔で投与後1から7時間まで、血清カル
シウム測定のために採取した。経口的カルシトニン投与に続く低カルシウム反応
は薬理学的反応のインデックスとして用いた。血清カルシウム濃度は慣用的なO
−クレゾールフタレインコンプレクソン法によって定量した。
図13は、マイクロカプセル化カルシトニンの鼻管胃管経由投与後にシノモル
ガスモンキーで得られた反応を示す。血清カルシウムの基準濃度から顕著な変化
が認められた。投薬
後6時間で、血清カルシウム濃度は13μg/mlまで減少した。顕著な薬理反
応は、カルシトニンプロテイノイド担体の投与後7時間でもなお明白であった。
実施例18:
カルシトニン含有プロテイノイド担体のラットにおける評価
本実施例では、実施例16にしたがって調製したカルシトニンプロテイノイド
担体の効果を、体重が100−150gの絶食させた雄のスプラークドーリーラ
ット(Spraque Daw-ley rats)で調べる。カルシトニンプロテイノイド担体およ
びカルシトニンを胃管経口投与または十二指腸注射のいずれかによって投与した
。ラットを以下の群に分けた:
1.カルシトニンプロテイノイド担体:60μgカルシトニン/kg体重を冑管
により経口投与(ラット3匹);
2.カルシトニンプロテイノイド担体:3μgカルシトニン/kg体重を十二指
腸内投与(ラット3匹);
3.カルシトニン:60μgカルシトニン/kg体重を胃管経口投与(ラット3
匹)(コントロール);
4.カルシトニン:3μgカルシトニン/kg体重を十二指腸投与(ラット3匹
)(コントロール)。
ラットの胃管経口投与を実施する。カルシトニンプロテイノイド担体を投薬直
前に調製し、1群および2群の各々にプロテイノイド担体懸濁物の適切な投薬量
を与える。3群および4群は非被包化カルシトニン(プロテイノイド担体無し)
を与える。約0.5mlの血液を、投薬直前(”0”時間)、並びに投薬後1、
2、および3時間で各ラットの尾動脈から
連続的に採取する。血液サンプルの血清は、血清カルシウム濃度測定のために−
20℃に保存する。
図14は、ラットに経口的に投与したマイクロカプセル化カルシトニンおよび
非被包化カルシトニンについての血清濃度−時間曲線である。ラットの実験結果
は、プロテイノイド被包化カルシトニンを非被包化賦形剤コントロール群と比較
したとき薬理反応に顕著な上昇(すなわち、血清カルシウムレベルの減少)があ
ることを明らかにする。投薬後1時間で血清カルシウム濃度は、コントロール群
のわずか6.5μg/mlの減少と比べ、被包化カルシトニンを投与したラット
では23μg/mlも減少した。さらに、反応は用量依存性であった(結果は示
さず)。
被包化もしくは非被包化カルシトニンのラット十二指腸注射の結果は図15に
示す。結果は、被包化調製物について血清カルシウムレベルの時間依存性減少を
示す。コントロール群は反応しなかった。十二指腸投与後1時間で、カルシトニ
ンプロテイノイド担体群の血清カルシウムレベルは18μg/ml減少し、一方
非被包化カルシトニンでは変化はなかった。これらの結果は、プロテイノイド被
包化によってカルシトニンの膜通過輸送は強化されることを示している。
本実施例および実施例17で得られた結果は、プロテイノイド被包化はカルシ
トニンの経口的生体利用性を顕著に改善するという証明を提供する。これらのデ
ータはまた経口的薬剤送達システムは種依存性ではないことを示唆している。
実施例19:
第IX因子含有プロテイノイド担体の調整と評価
第IX因子はビタミンK依存血液凝固プロ酵素(MW56kD)である。第I
X因子欠乏(血友病Bとして知られている)は、25000人の男子の約1人に
発生する。今日まで、この疾患の治療は第IX因子の静脈内投与によって実施さ
れていたが、最近の報告では皮下注射による補充の試みが詳述されている(Thom
pson 1986,Blood,67(3):pp565-572)。
プロテイノイド担体内の第IX因子(FIX)の被包化は、実施例13の工程
にしたがって、Glu/Asp/Tyr/Pheプロテイノイド(プロテイノイド反応混合物で
用いられるGlu、Asp、TyrおよびPheのモル比は1:1:1:1)の脱イオン水溶液10
0mg/mlとFIXの水溶液とを混合(1:1、v/v)して調製した。2つ
のプロテイノイド担体懸濁物を調製し、実施例20および21で述べたように別
々にインビボで効果を調べた。
FIXプロテイノイド担体懸濁物Aは、50mg/mlのプロテイノイドと、
4%酢酸、2%アラビアゴム、0.2%PEG14(ユニオンカーバイド、ダン
ベリー、CN、USAより入手可能)、及び14mM塩化カルシウム含有500U/
mlのFIX(FIXはアメリカ赤十字、、ロックビル、メリーランド、USAか
ら入手可能)溶液(最終pH3.81)とを含む。
第二の懸濁物、FIXプロテイノイド担体懸濁物Bは、50mg/mlのプロ
テイノイドと、3.8%酢酸、1.5%アラビアゴム、0.15%PEG14、
及び11mM塩化カ
ルシウム含有116U/mlのFIX溶液(最終pH4.58)とを含む。
FIXプロテイノイド担体調製物の安定性はインビトロでの短時間について調
べた。FIXを被包する蛋白担体は、光学顕微鏡とレーザー光分散で調べた。プ
ロテイノイド担体懸濁物の一部分を1.5時間に渡って30分ごとに取り出し、
FIXプロテイノイド担体を4500×gで遠心して分離し、部分的活性化トロ
ンボプラスチン時間(APTT)アッセー緩衝液(0.05Mヒスチジン−0.
01M NaCl−0.1%ウシ血清アルブミン−0.01%トゥイーン(TWEEN
)40、pH7.47)に溶解し、可溶性FIXとプロテイノイドを遊離させる
。APTTによるFIX活性の定量は、FIX標準物(0.025、0.05、
0.1U/ml)と”空”プロテイノイド担体懸濁物の両方をコントロールとし
て用いた。APTTアッセーキットは市販されている(例えば、シグマダイアグ
ノスティックス(Sigma Diagnostics)(セントルイス、ミズーリー、USA))。
上記の分析に基づき、強い安定性をもつFIXプロテイノイド担体がより高い
pH(例えばペは4.9)でFIXを被包化することによって得られることが分
かった。さらに、被包化効率は利用可能FIX単位の約20%で、活性レベルは
、FIXプロテイノイド担体ペレットが約4℃で保存される場合、少なくとも1
.5時間一定である。
実施例20:
FIX含有プロテイノイド担体(A)のラットにおける評価
この実施例では、FIXプロテイノイド担体A(実施例19のように調製)を
雄のスプラークドーリーラット(平均体重300g)で調べた。適切な量の懸濁
物を4500×gで遠心し、FIX蛋白担体を沈殿させる。これを動物に投薬す
るために続いて同じ緩衝液に再懸濁した。ラットは以下のように2群に分けた:
1.経口用FIXプロテイノイド担体(FIX sph PO):2709U FIX/k
g体重を胃内投与(ラット4匹);
2.静注用FIX(プロテイノイド担体無し)(FIX IV):200U/kg体重
を静脈内注射、32匹のラットに0.11 NaCl−0.02Mクエン酸ナト
リウム(pH6.85)中のFIX0.7mlを尾静脈注射により投与。
FIXプロテイノイド担体懸濁物および溶液は投薬直前に調製する。各ラット
から1mlの血液を投薬直前(”0”時間)並びに投薬後1、2および4時間で
採取した。クエン酸塩抗凝固剤を血液に添加し、血液サンプルから得た血漿を−
70℃で保存した。
血漿サンプルを、FIX凝固不全血漿を用いて修飾APTTアッセーによって
調べた(アッセーキットはオルトダイアグノーシス(Ortho Diagnosis)(ラリ
タン、ニュージャージー、USAから入手可能)。後の凝固時間値から個々の基準
値(0時間値)を差し引いて凝固時間の変化を算出した。図16に示したデータ
は、与えられた群の平均値である。基準値以下の値は外来FIXの存在を示す。
図16に示すように、顕著な量のFIXが、FIXプロテイノイド担体の経口
投与を介して血液に送られた。相対的な血漿値は、FIXプロテイノイド担体群
で低いが、0.5、1.0および2.0時間における凝固時間の減少は顕著であ
る。これはIV投与の約14倍を用いた経口投与で達成される。さらにまた、第
IX因子は酸感受性(pH5.0、37℃で半減期は約1時間未満である)蛋白
であるので、これらの結果は興味深いものである。本実施例のFIXプロテイノ
イド担体は、pH3.81で調製中利用可能なFIX単位の14.8%が被包化
された。この結果はFIXプロテイノイド担体は胃腸管で活性を維持し、送達を
促進させることを支持する。
実施例21:
FIX含有プロテイノイド担体(B)のラットにおける評価
本実施例では、実施例19で述べたように調製したFIXプロテイノイド担体
懸濁物Bを雄のスプラークドーリーラット(平均体重300g)で調べた。再懸
濁FIXプロテイノイド担体は実施例20で述べたように調製した。ラットは以
下のように2つの群に分ける:
1.経口用FIXプロテイノイド担体(FIX sph PO):1006U FIX/k
g体重を胃内投与(ラット5匹);
2.静脈内投与用FIX(プロテイノイド担体無し)(FIX IV):185U/k
g体重を静脈注射により投与。3匹のラットに0.11 NaCl−0.02M
クエン酸ナトリウム(pH6.85)中のFIX0.3mlを尾静
脈注射により投与;
3.経口用FIX(プロテイノイド担体無し)(FIX unencap PO):2760U
FIX/kg体重を胃内投与。4匹のラットに3.8%酢酸(pH6.85)
含有食塩水中のFIX1.0mlを投与。
FIXプロテイノイド担体懸濁物および溶液を投薬直前に調製した。血漿サン
プルを採取し、実施例20で述べたようにアッセーした。その後の凝固時間値か
ら個々の基準(0時間)値を差し引いて、凝固時間における変化を算出した。図
17に示すデータは与えられた群の平均値である。基準以下の値は外来FIXの
存在を示している。FIXプロテイノイド担体(pH4.58で調製)は23.
1%のFIX単位を被包化した。
図17に示すように、IV投与量のわずか5倍の経口投与量で、顕著な経口的
薬剤送達が認められた。さらに、IV投与レベルの15倍で投与された天然FI
X(pH6.85)では、血漿中に検出可能レベルの外来FIXを認めることは
できなかった。
したがって、本実施例および実施例20で示された結果は、経口的FIX送達
はFIXプロテイノイド担体の使用によって達成できることを支持している。こ
れらのプロテイノイド担体は、胃腸間通過および血流へのFIX送達に際して、
適切にFIXを保護するようである。
実施例22:
α−インターフェロン(IFN)含有
プロテイノイド担体の調製
本実施例では、胃腸間擬似条件下での酵素的分解に対するプロテイノイド担体
の保護能力を評価するために実験を行った。プロテイノイド担体中のIFNのイ
ンビトロ安定性を、0.08N HCl中のペプシンを含む擬似胃液(SGF)
および燐酸緩衝液中のパンクレアチンを含む擬似腸液(SIF)で調べた。試薬
および安定性アッセー工程は”合衆国ファーマコポシア(United States Pharma
copocia)”(XXII巻,1990,pp1788-1789)に記載されている。
IFN含有プロテイノイド担体の調製
プロテイノイド担体内へのIFNの被包化は実施例13で述べたものと同じ態
様で実施した。α−IFNは多数の販売元から入手できる。市販IFN製品はロ
フェロン−A(Rofe-ron-A)(ホフマンラロシュ[Hoffman LaRoche])を含む
。IFNプロテイノイド担体は、Glu/Asp/Tyr/Pheプロテイノイド(プロテイノ
イド反応混合物で用いられるGlu、Asp、TyrおよびPheのモル比は1:1:1:1)の水
溶液と、5%ゼラチン添加1.7Nクエン酸溶液を含むIFN溶液とで調製した
。IFNプロテイノイド担体懸濁物は、80mg/mlプロテイノイド、600
μg/mlのIFNおよび2.5%ゼラチン(pH3.0)を含んでいた。
IFNプロテイノイド担体のSGF中での安定性
SGF(2ml)を1mlのIFNプロテイノイド担体懸濁物に加えた。この
溶液を振盪しながら40℃で保温し、”合衆国ファーマココピア(U.S.Pharmac
ocopia)”(上掲書)
に記載されているようにSGF添加後段階的に部分標本を採取した。等容量の停
止液(燐酸緩衝液中のペプスタチンA)をサンプル採取後直ちに各部分標本に加
え、酵素分解を停止し、プロテイノイド担体を開放する。続いて、全サンプル中
のIFN濃度をHPLCで決定した。比較として、SGF中のIFN単独の安定
性を調べた。この実験はプロテイノイド無しで上記のように実施した。別のコン
トロールとして、IFNプロテイノイド担体の安定性を0.08N HCl中で
調べた。
IFN含有プロテイノイド担体のSIF中の安定性
SIF(2ml)を1mlのIFNプロテイノイド担体に加えた。この溶液を
振盪しながら40℃で保温し、”合衆国ファーマココピア”(上掲書)に記載さ
れているように連続的にサンプルを採取した。等容量の停止液(燐酸緩衝液中の
アプロチニンおよびトリプシン/キモトリプシン阻害剤)をサンプル採取後直ち
に各部分標本に加え、酵素分解を停止した。IFN濃度をHPLCで決定した。
SIF中のIFN単独の安定性を調べるために、600μgのIFNを0.8
5Nクエン酸または0.01Mの燐酸緩衝液に溶解した。SIF(2ml)を1
mlのIFN溶液に加えた。この溶液をサンプルして上記のように分析した。
結果と考察
(a)SGF中でのプロテイノイド担体の保護効果
図18に示すように、SGFで1時間保温した後、約50%のIFNが無傷で
残った。SGFで6時間保温した後、約
20%のIFNが分解されなかった。予想通り、IFN単独(プロテイノイド担
体無し)では、20分以内でSGF中のペプシンで完全に破壊されることが分か
った。
0.08N HCl中で単独IFNを用いて別のコントロールを実施した。I
FN単独ではペプシン無しのSGF中で安定であった(0.08N HCl)。
2時間保温した後、わずかに減少しただけであった。これは、IFNはpH1.
2のHCl中で6時間までは寧ろ安定であることを示唆している(図19)。
これらの結果は、プロテイノイド担体はIFNのペプシン消化を遅らせ、一方
IFN単独では胃の中で20分以上残存することはできないことを示唆している
。これらの観察は、蛋白薬剤の胃の中での酵素消化に対するプロテイノイド担体
の保護能力を示している。
(b)SIF中のプロテイノイド担体の保護効果
図20に示すように、IFNプロテイノイド担体は、SIF中でIFN単独(
プロテイノイド無し)よりもはるかに安定であった。pH7.4においてIFN
単独の場合は、SIFと保温したとき10分以内に完全に分解した。しかしなが
ら、IFN/プロテイノイド担体の約70%がSIF中で6時間後も残存したが
、これは、プロテイノイド担体によって顕著な安定性が提供されることを示して
いる。
IFN単独ではpH7.4よりpH3でSIF中でわずかに安定性が増した。
SIFでpH3で6時間保温した後、約10%のIFNが残存した。pH3にお
けるSIF中でのI
FNの安定性は、腸のプロテアーゼの酵素活性を抑制すると思われるpHの低さ
に起因する。
実施例23:
ヘパリン含有プロテイノイド担体のラットでの評価
本実施例では、プロテイノイド担体が保護能力のために必要とされるか、また
は(1)プロテイノイド(可溶性プロテイノイドで担体形ではない)を用いるこ
とができるか、もしくは(2)担体への薬剤積載のまた別の方法(例えば治療用
化合物を予め形成したプロテイノイド担体と保温する)を使用することができる
かを確認するために、実験を行った。
ヘパリン含有プロテイノイド担体の調製
プロテイノイド担体へのヘパリンの被包化を実施例12と同じ方法で実施した
。ヘパリン(局方)を用いたが、この物質は、イーライリリー(Eli Lilly)(
インジアナポリス、USA)を含む種々の販売元から入手できる。ヘパリンプロテ
イノイド担体は、Glu/Asp/Tyr/Phe/Orn0.5プロテイノイド(プロテイノイド反応
混合物で用いられるGlu、Asp、Tyr、Phe、Ornのモル比は1:1:1:1:0.5)の脱イオ
ン水溶液150mg/m1と、1.7Nクエン酸溶液及び0.5%アラビアゴム
を含むヘパリン水溶液20mg/mlとの1:1容量比を用いて、実施例12の
方法にしたがって調製した。ヘパリンプロテイノイド担体懸濁液は、実施例12
で述べたように酢酸溶液中で透析した。続いて、ヘパリンプロテイノイド担体は
、4800×g(15分)で遠心し、修飾Azure A法(Gundryら、Amer.
J.Surgery,1984,148:pp191-194)を用いて、
ペレットおよび上清を分析することによって全てのヘパリンを測定した。プロテ
イノイドは、0.1N NaOHでプロテイノイド担体を溶解し、294nmで
の吸収を測定することによって測定した。
ヘパリン−スパイク空プロテイノイド担体の調製
ヘパリンプロテイノイド担体のために上記で述べた同じ方法(ただしヘパリン
は含まない)にしたがって、空のプロテイノイド担体を調製した。凍結乾燥した
空プロテイノイド担体を、20mg/mlの濃度のヘパリンを含む0.85Nク
エン酸および0.5%ゴムに再懸濁した。プロテイノイド担体とともに分離され
たヘパリンの量は上記のように測定した。
実験工程
体重が約350gの雄のスプラークドーリーラットに胃管経口投与および十二
指腸内(ID)注射(幽門括約筋のすぐ前方および十二指腸内)による投薬を実
施した。ラットに経口的またはIDで以下の1つを投薬した:凍結乾燥ヘパリン
プロテイノイド担体、ヘパリン−スパイク空プロテイノイド担体、プロテイノイ
ド/ヘパリン水溶液、ヘパリン含有0.85Nクエン酸および0.5%ゴム、並
びにヘパリン単独水溶液。経口投与およびID注射の両方の実験において、ヘパ
リン:プロテイノイドの重量比は一定であった。経口実験での全ヘパリン投与量
は100mg/kg体重で、ID注射実験では50mg/kgであった。プロテ
イノイド投与量は胃管経口投与では40mg/kgで、ID注射では20mg/
kgであった。投薬容積は約0.3から0.5mlであった。
約0.5mlの血液を各ラットの尾動脈から連続的に、投薬直前(”0”時間)
並びに投薬後1、2および3時間で採取した。ヘパリン活性測定のために血液サ
ンプルからの血清を−20℃に保存した。
結果と考察
得られた結果は、ヘパリン単独並びに可溶性プロテイノイドとヘパリン(両方
共水溶液、経口的またはID注射により投与)では、APTT値を上昇させるに
十分な量でGI管から吸収されないらしいということを示唆している(図21)
。十二指腸に直接投与したときのみ、ヘパリンクエン酸液は幾分APTT値上昇
させる。
ヘパリンプロテイノイド担体は最も高いAPTT値を示したが、これは、十二
指腸内に直接投与したとき同様、経口的に投薬した場合もヘパリンの吸収を増加
させることを示している(図22および23)。一方、ヘパリンスパイク空プロ
テイノイド担体は、ヘパリンプロテイノイド担体で認められた活性よりも低い活
性を示したが(図23)、基準値を越えるAPTT上昇を示した。両タイプのプ
ロテイノイド担体は、クエン酸/ヘパリンで認められたAPTT値上昇よりもは
るかに高いAPTT値上昇を示した。
本実施例で得られた結果は、実験の範囲内では可溶性プロテイノイドは検出可
能な活性を示さなかったので、このプロテイノイド系では、観察されたようなヘ
パリン吸収の増加にはプロテイノイド担体が必要であることを示唆している。
実施例24:
M1−含有プロテイノイド担体の調製と評価
本実施例では、インフルエンザウイルス抗原含有プロテイノイド担体を調製し
、ラットで評価した。
M1プロテイノイド担体の調製
プロテイノイド担体内へのMIの被包化は、実施例13で述べたのと同じ態様
で実施した。M1蛋白(インフルエンザウイルスの主要内部成分)は、カナダ生
物学局、薬物理事会(Drug Directorate,Health Protection Branch,Bureau o
f Biologics,Ottawa,Ontario Canada)より寄贈されたブタインフルエンザワ
クチンを精製して得た。このワクチンは高収量組換え体株X−53Aaで製造さ
れた。この株では、そのHAおよびNAは親株A/NJ/11/76(H1N1
)に由来し、その内部蛋白(M1を含む)は親株A/PR/8/34に由来する
(R.B.Coucら、1983、Ann.Rev.Micro-biol.,37:pp529-549;B.R.Murphy 1
982,Infec.Immun.,36:pp1102-1108)。M1はカンらの記載(Khanら、1982 J
.Clin.Microbiol.,16:pp813-820)にしたがって精製した。M1プロテイノイ
ド担体は、Glu/Asp/Tyr/Pheプロテイノイドの100mg/ml脱イオン水溶液
および1.7Nクエン酸と5%アラビアゴム中のM1蛋白溶液(pH2.0)1
0mg/mlの等容量を混合(40℃で)して調製した。懸濁液中の最終M1濃
度は1.0mg/mlであった。
HA−NA含有プロテイノイド担体と非被包化抗原の調製
HA−NA抗原はギャラガーらの方法にしたがって分離した(Gallagherら、1
984 J.Clin.Microbiol.,20:pp80-93)。
インフルエンザウイルス(A/PR8/34)を90000Gで60分遠心した。ウイル
スペレットを7.5%オクチルグルコシドを含む0.05M酢酸緩衝液(pH7
.0)で可溶化し、同じ条件で再度遠心した。得られた上清は、SDS−PAG
Eで決定したところ、約90%のHAと10%のNAを含んでいた。
HA−NAプロテイノイド担体は、M1をHA−NAで置き換えながら、M1
プロテイノイド担体のためのものと同じプロトコールにしたがって調製した。懸
濁物中のHA−NAの最終濃度はまた1.0mg/mlであった。
”空”プロテイノイド担体は、M1/クエン酸/ゴム溶液の代わりに1.7N
クエン酸/ゴム溶液を用いる修飾を行いながら、M1プロテイノイド担体につい
て述べた同じ方法にしたがって調製した。
非被包化抗原、M1およびHA−NAは1.7Nクエン酸、10mg/mlア
ラビアゴム中で同じ最終濃度の1mg/mlに希釈した。
実験工程
雄のスプラークドーリーラット(体重約350g)を本実施例では用いた。経
口投薬は胃管で行った。1群がそれぞれ5匹のラットから成る4群(皮下コント
ロール群は4匹)に以下のように投薬した:1群にはラット当たり1mgのM1
プロテイノイド担体(1ml)を経口的に投与した。2群には”空”プロテイノ
イド担体をラット当たり1mg経口投与した。3群にはラット当たり”空”担体
の非被包化M1 1
mgを投与した。3群にはラット当たり1mgの非被包化M1 1mlを投与し
、4群にはラット当たり25μgのM1(0.3ml)を皮下(SC)に投与し
た。血液サンプル(300μl)を、投薬前並びに投薬後1、2、3、および4
時間(抗原分析のため)で、さらに投薬後14、28および42日(抗体分析の
ため)で各ラットの尾の血管から採取した。TRIS(SDS無し)中の皮下コ
ントロール−M1用溶液を167μg/mlの濃度に希釈した。等量のフロイン
ト完全アジュバント(FCA,シグマ)を加え、混合物を完全に均質化した。混合
物中のM1の最終濃度は83.3μg/mlであった。皮下投与用HA−NA溶
液は、TRIS−SDS緩衝液の代わりに燐酸緩衝液を用いた点を除き同じ態様
で調製した。
HA−NAプロテイノイド担体投与に際しては、以下の修飾を行いながら、同
じ免疫および採血スケジュールに従った:全てのラットに最初の経口投与後42
日にHA−NAプロテイノイド担体(250pg/ラット)の経口追加免疫を実
施し、この追加免疫投薬後14日に再び血液サンプルを採取した。サンプルから
得た血清を分析まで−20℃で保存した。
抗M1および抗HA−NA特異的IgG血清をカーンらの記載したELISA
法(Khanら、1982,J.Clin.Microbiol.,16:pp813-820)で分析した。
結果と考察
血漿サンプル中の抗原を測定するための試みは成功しなかった。M1抗原は、
投薬1−4時間後に採取されたラットの
血漿サンプル中で、皮下投与群コントロールを含む全ての群において検出できな
かった。
”空”プロテイノイド担体を経口的に投薬したラットの血漿サンプルは、EL
ISA分析では、M1またはHA−NA抗原のいずれに対しても顕著な抗体を示
さなかった(表8)。予想通り、25μgのM1またはHA−NA抗原のいずれ
か(FCAとともに)を皮下に投与したラットは、M1の場合は54000−3
30000の範囲、HA−NAの場合は176750−909000の範囲の力
価で劇的な抗体反応を生じた(表8)。
M1プロテイノイド担体を投与した5匹のラットの3匹から得た血漿はM1抗
原に対する顕著な一次反応を示した。これら3匹のラットの全ては、非被包化M
1を投与されたラットの全てが<30であったことと比較して、投薬後わずか1
4日で760から2150の範囲の力価を示した(表8)。プロテイノイド担体
を投与された群の力価は42日までに1150−5200に増加した(図24)
。
非被包化HA−NAで免疫した6匹のラットのうち4匹は中等度の抗HA−N
A IgG反応を示し、力価は3400−17675であったが、一方、HA−
NAプロテイノイド担体を投薬された6匹のラットのうち2匹は顕著な反応を示
した(図25)。しかしながら、反応ラットの力価は、コントロールで得られた
力価より少なくとも8倍高かった。経口投薬後42日で実施したHA−NAプロ
テイノイド担体の経口的追加免疫後、数匹のラットはより高い力価を示したが、
ほとんどは力価に顕著な増加を示さなかった。
これらの結果は、M1プロテイノイド担体の単回投与で投薬後わずか2週間で
M1に対する顕著なIgG反応を誘発することができるが、一方、同じ全投与量
のM1(プロテイノイド無し)では検出可能な抗体反応を生じなかった。同様に
、HA−NAプロテイノイド担体の単回投与でこの実験で用いたラットの33%
に反応を誘発した。この反応は非被包化HA−NAを投薬したラットより8倍高
かった。
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フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
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CH,CN,CZ,DE,DK,ES,FI,GB,G
E,HU,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LK
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J,TT,UA,US,UZ,VN